curs 3 2013 pdf

Structura genomului uman

� Genom:

�setul haploid de cromozomi din gameti

�ansamblul genelor din organism

�ansamblul complex al secventelor de ADN

Structura genomului uman

� Cantitatea totală de ADN din celulele umane diploide este de 7 picograme (3,2Gb)

� Alcătuit din:� genom nuclear

� genom mitocondrial

Exonii � SecvenŃe transcrise în ARN mesager precursor şi păstrate

în ARNm matur,

� Codifică DOMENII (subunităţi polipeptidice distincte) ale proteinelor din care fac parte, având funcţii specifice

� Nr exonilor e variabil

� Lungima medie 150 pb,

� Gene diferite pot avea exoni identici,

Intronii

� SecvenŃe transcrise în ARN mesager precursor dar îndepărtate ulterior din ARNm matur,

� I = E – 1

� Lungime variabilă, neconcordantă cu cea exonilor (sute-mii de pb),

� Aproape toŃi încep cu dinucleotidul 5'-GT şi se termină cu 3'-AG.

Rolul intronilor

Nu doar pasiv, de spaŃiatori !!1. Guvernează procesul de prelucrare a ARN

premesager în ARNm matur,

2. Pot funcŃiona ca transpozoni

3. Intervin în reglarea expresiei genice,

4. MenŃin şi coordonează diferenŃierea celulară şi tisulară.

Heterogenitatea secvenŃelor ADN

1. ADN nerepetitiv

2. ADN moderat repetitiv

3. ADN înalt repetitiv

ADN nerepetitiv (60%)

� Este alcătuit din secvenŃe unice/genom sau în număr foarte mic de exemplare,

� 60% din cantitatea de ADN

� Frecvent la nivelul eucromatinei (regiunile transcripţional active),

� 2% din ADN nerepetitiv --> exonii,

� Restul este necodant, cu fcţ. necunoscute, situat la nivelul � intronilor sau

� intragenic

ADN moderat repetitiv (30%)

� Este alcătuit din secvenŃe scurte de 300-1000 pb,

� Repetate de zeci şi sute de mii de ori,

� Dispersate în genom,

� Pot forma “familii” de secvenŃe înrudite,

� Se pot transcrise în ARN,

� Ex: secvenŃele transpozabile � LINE (long interspersed repeted sequences), � SINE (short interspersed repeted sequences)� .

ADN înalt repetitiv (10%)

� Alcătuit din secvenŃe foarte scurte de 2-200 pb,

� Repetate în tandem de milioane de ori,

� NU se transcriu,

Clasificarea secvenŃelor repetitive (IHGSC 2001)

Clase de secvenţe repetitive- constituie aprox 50% din schiţa genomului uman

1. Transpozonii (repetiŃii dispersate).

2. Pseudogene (copii inactive ale unor gene).

3. RepetiŃii de secvenŃe simple (SSR).

4. DuplicaŃii segmentare ale unor blocuri.

5. Blocuri repetate în tandem (ADN satelit), la nivelul centromerului, telomerelor, consticŃiilor secundare.

IHGSC- Intrenational Human Genome Sequencing Consortium

Elemente genetice mobile=TRANSPOZONI

� SecvenŃe ADN capabile să îşi schimbe localizarea în genom,

� 45% din secvenŃele repetitive din genomul uman deriva din elemente genetice mobile,

� La om se împart în două categorii:� Transpozoni,

� Retrotranspozoni.

Transpozonii

� SecvenŃe de ADN copiate prin transpoziŃie mediată de ADN,

� Rari la om,

� Structura transpozonului include şi genele ce codifică enzimele necesare inserŃiei

Transpozonii

� capacitate de a se deplasa dintr-o pozitie cromozomiala in alta (transpozitie)

� restructurarea secventelor nucleotidice din situsul donor cat si a celor din situsul receptor.

� Consecintele lor difera in functie de sediul transpozitiei: � la nivelul unor secv. reglatoare-modificarile mutationle ale

produsilor genici sunt de ordin cantitativ,

� modific secv codificatoare- det sinteza unor proteine modificate calitativ.

� Exista 2 mari familii de transpozoni:

1. Include transpozonii care se deplaseaza ca atare, � sub forma de secvente ADN

2. Transpozoni a căror migrare se realizeaza prin intermediul transcriptelor ARN� retrotranspozoni

Transpozonii

Retrotranspozonii

� marea majoritate a elementelor mobile la om,

� transpoziŃia se realizează prin intermediul ARN,

� Structură variată: � De origine virală, posedă RT

� Retrotranspozonii (LINE 1),� Retrovirusurile endogene.

� De origine nonvirală, � folosesc RT altor elemente� form din secv. care nu codifica proteine implic in transpozitie

� familia ALU

Retrotranspozonii

� clasa elementelor virale -retrovirusi-� genomul -cateva mii de pb,

� contin 3 gene (gag, pol,env.

� Regiunea codificatoare e flancata de repetari terminale lungi (long terminal repeats) LTR

� clasa elem nonvirale -form din secv. care nu codifica proteine implic in transpozitie.

� In genomul uman sunt 2 familii de transpozoni, denumite in fct de lungimea element care le alc.� LINES (long interspersed sequences)

� SINES (short interspersed sequences)

� Etapa esentiala a deplasarii retrotranspozonilor = conversia transcriptelor ARN in ADN dc.

� Conversia -efectuata de RT � catalizeaza sinteza pe matrita reprezentata de transcriptul ARN, a

unei monocatene ADN (ADN complementar).

� Rezulta un hibrid ADN-ARN� reverstranscriptaza degradeaza componenta ARN a

heteroduplexului dupa care functionand ca ADN polimerazadependenta de ADN, intervine in replicarea ADNmc.

� Se formeaza ADN dc, care va fi integrat intr-o alta regiune a genomului

� recombinarea - catalizata de integraza, enzima codificata (ca si reverstranscriptaza) de o gena a retrotranspozonului, corespondenta a genei pol din genomul virusilor ARN.

Elemente genetice mobile

La om sunt de patru feluri:

� LINEs (long interspersed nuclear elements) (6 kb, familia L1) -17% din genomul nostru, contin gena reverse-transcriptase-like

� SINEs (short interspersed nuclear elements) (100-400 pb, familia Alu); nu au gena reverse-transcriptase-like

� Retrotranspozonii LTR;

� Transpozonii ADN fosili.

Elemente genetice mobile

Sunt implicate în diferite procese:

� Modificarea structurii şi funcŃiei unei gene (LINE-hemofilie, SINE (Alu)-NF),

� Transferul unor exoni sau copii de gene,

� Realizarea “punctelor fragile”.

Pseudogene

• Copii nefuctionale ale secv. codante,

• reprez o proportie mica a genomului

• Pseudogene:

• Clasice (direct DNA to DNA duplicates)• Procesate (copies that are reverse transcribed

back into the genome from RNA and therefore lack introns)

• “numts –nuclear pseudogene of mitocondrial origin

RepetiŃii de secvenŃe simple (SSR)

� Formează aprox. 3% din genom,

� Mecanism: devierile de împerechere în cursul replicării,

� Sunt reprezentate de:- microsateliŃi,- minisateliŃi

MicrosateliŃii (STR)

� SecvenŃe de 1-13 pb,� repetiŃia în tandem a unui dinucleotid- AC, AT -

VNDR,� Structură polimorfă, distribuŃie uniformă în genom.

� Sursele variabilităŃii în ceea ce privește nr de repetări ai unei secvenţe date sunt considerate a fi:

� erorile ADN polimerazei,� Schimburile între cromatidele surori (SCE), � Crossing-over inegal.

Microsateliti (STR)

� în genomul uman exista peste 30000 microsateliti

� Caracteristic: marea variabilitate a numarului de copii prezente la un locus (≈100)

MinisateliŃii

� SecvenŃe ADN de 14-65 pb, repetate în tandem,

� Dispersate în toŃi cromozomii, � cu excepŃia X şi Y,

� Ocupă situsuri specifice - LOCI

� Sunt consideraţi hipervariabili (VNTR- variable number of tandem repeats),

� AplicaŃii practice: amprenta ADN- fingerprint DNA.

MinisateliŃii

� se gasesc in eucromatina (in ADN extra genic dar si in introni, )

� Caracteristica o reprezinta marea variabilitate a numarului de copii prezente la un locus

DuplicaŃii segmentare ale unor blocuri

� Lungimea blocurilor rezultate din duplicaţii segmentare =10-300 kb,

� Localizări pe acelaşi cromozom sau pe cromozomi diferiŃi,

� Alcătuiesc 5% din genomul uman,

� ApariŃie recentă.

ADN satelit

� Blocuri repetate în tandem la nivelul:� centromerului,

� telomerelor,

� consticŃiilor secundare.

Rolul ADN repetitiv (1)

� Organizarea şi stabilizarea structurii cromozomiale,

� Ordonarea şi distribuŃia cromozomilor în diviziune,

� Formarea nucleoscheletului,

� IniŃierea proceselor recombinaŃionale,

Rolul ADN repetitiv (2)

� Rol arhitectural- reprezentând situsuri de legare pentru proteinele armăturii cromozomiale.

� remodelarea genomului prin rearanjări-“Junk” ADN � ADN repetitiv -ipoteza ca aceasta forma a materialului

genetic ar putea reprezenta incercările esuate de formare a unor secvente noi din cele preexistente (junk ADN)

� Reprezintă markeri paleontologici,

� Instrumente de diagnostic/testare în genetica medicală, criminalistică.

POLIMORFISMELE GENETICE

� 2 genomuri umane - identice între ele în proporŃie de 99,9%.

� 0,1% conŃine variante genetice sau alele ale uneisecvenŃe de ADN- şi care a rezultat în urma unormutaŃii.

� Când anumite variante genetice – alele – suntfrecvente şi se găsesc la > 1 % din populaŃia generală

polimorfisme genetice.

� alelele cu o frecvenŃă < 1% = variante rare.

� diferenŃierea lor de mutaŃii,

� Mutatii-implică per se un efect negativ asupra proteineişi, respectiv, asupra caracterului fenotipic corespunzator,

� In prezent exista tendinŃa unificării tuturor acestortermeni sub denumirea largă de variante genetice.

� Polimorfismele genetice :� responsabile pentru cea mai mare parte din diversitatea şi

individualitatea fenotipică în cadrul speciei umane,

� pot fi localizate oriunde în genom, atât în interiorul genelor, cât şi în regiunile intergenice,

� numai acele polimorfisme existente la nivelul genelor au potenŃialul de a asocia modificări fenotipice.

� interes teoretic - în studiile de genetică populaŃională

� Identificarea polimorfismelor umane s-a dovedit a avea numeroase aplicaŃii practice; � în transfuzii sanguine şi transplante,

� identificarea de persoane,

� stabilirea paternităŃii,

� diagnosticul genotipic indirect prin folosirea unor markerigenetici.

POLIMORFISME PROTEICE

� Primele polimorfisme � analiza aşa-numitelor antigene de grup sanguin, precum cele din

sistemele ABO şi Rh.

� Ulterior au fost evidenŃiate şi alte polimorfisme antigenice, prin studiul :� unor sisteme mai rare de grup sanguin (MNSs, Xg etc) şi,

� mai recent, a sistemului HLA, considerat cel mai polimorfic sistem genetic uman.

� Prin studiul mobilităŃii electroforetice, activităŃii enzimatice şi a diferitelor proprietăŃi fizico-chimice s-a evidenŃiat polimorfismul unor:� proteine serice (haptoglobina, transferina, alfa-1-antitripsina,

imunoglobulinele, ceruloplasmina etc),

� al unor enzime eritrocitare (fosfatza acidă-1, G6PD, esteraza D, fosfoglucomutaze), serice (colinesteraza-1, etc), tisulare (alcool dehidrogenaza, acetil-transeraza hepatică, etc)

� Datorită numărului mare de sisteme polimorfice (>30) si de variante în fiecare sistem, se pot realiza un număr imens de combinaŃii şi fiecare individ posedă o combinaŃie specifică de variante, este un unicat biologic.

� fiecare persoană (exceptând gemenii monozigoŃi) are o structură genetică unică.

Ex.

� Polimorfismul sistemulului de grup sanguin ABO

� Polimorfismul sistemului de grup sanguin Rh

� Polimorfismul Alfa1-antitripsinei

POLIMORFISME ADN

� analiza la nivel proteic permite identificarea uneiminorităŃi a polimorfismelor genetice şi anume a aceloracare determină modificarea secvenŃei aminoacizilor.

� în interiorul genelor există “variaŃii genetice sinonime”, care nu pot fi identificate pe baza modificărilorfenotipice.

� variaŃii de secvenŃă nucleotidică din regiunileintergenice� frecvenŃa acestor polimorfisme intergenice o depăşeste pe cea din

interiorul genelor,

tipuri de polimorfisme ADN

� Cea mai simpla formă - polimorfismele mononucleotidice (SNP – single nucleotide polymorphism).

� polimorfismele existente la nivelul unor repetiŃii nucleotidice simple (1-6 nucleotide) care intră în componenŃa microsateliŃilor sau polimorfismele prezente la nivelul minisateliŃilor.

� Toate aceste tipuri de variaŃii în secvenŃa ADN se corelează cu polimorfismul lungimii fragmentelor de restricŃie (RFLP)

POLIMORFISMUL LUMGIMII FRAGMENTELOR DE RESTRICŢIE

� Enzimele de restricŃie (ER) recunosc o secvenŃă nucleotidică specifică şi secŃionează ADN la acest nivel.

� Clivarea moleculei de ADN cu o anumită enzimă de restricŃie "fragmentează" ADN într-un număr definit de fragmente, de o anumită lungime, corespunzătoare distanŃei dintre două situsuri de restricŃie.

� Modificările de secvenŃă nucleotidică �abolirea unui SR, crearea unui situs nou sau schimbarea “distanŃei” dintre două situsuri (prin deleŃie sau inserŃie nucleotidică) � modifica lungimea FR (Southern blot).

� Aceste variaŃii ale ADN au fost numite polimorfisme ale lungimii fragmentelor de restricŃie – RFLPs (restriction fragment length polymorphisms; “reflips”).

� Fragmentele de lungimi diferite constituie alele codominante ale locusului ADN respectiv.

� În practică, RFLPs se folosesc în diagnosticul genotipic indirect deoarece anumite alele ale unui locus marker se pot transmite strâns înlănŃuite cu o alelă mutantă .

Polimorfisme

� Polimorfism = variaŃii ereditare în structura nucleotidelor sau cromozomilor (ex. cromozomul Y)

Polimorfisme mononucleotidice (SNP)

� SNP:� Alterarea unei singure baze� Prezent la cel puŃin 1% din populaŃie� Cea mai frecventă formă de variaŃie din genomul uman

� În medie un nucleotid la aproximativ 300 este diferit

� Majoritatea sunt în regiunile necodante (heterocromatina inactiva genic si intronii)


� Responsabile de :� Diversitatea fenotipică interindividuală

� avantaje selective ??

� eforturi considerabile pentru caracterizarea şi cartografierea lor

� Au fost identificate peste 4 milioane de SNP

SNP

� forma cea mai frecventă a polimorfismelor ADN � în medie 1 la 1000 baze,

� dar frecvenŃa poate fi mai înaltă în anumite regiuni precum insulele CpG – 1 la 100).

� SNP situate în regiunile intergenice sau cele sinonime din cadrul genelor nu sunt supuse selecŃiei naturale.

� Pe de altă parte, modificarile nonsinonime pot fi supuse unor asemenea efecte, iar persistenŃa lor în populaŃie poate reflecta o serie de avantaje selective şi poate explica o bună parte din diversitatea fenotipică existentă în populaŃia umană.

metode de identificare a SNP

� tehnica RFLP -evidenŃierea efectului indirect pe care asemenea SNP îl pot avea asupra unor SR ale ER utilizate(apariŃia sau anularea unor situsuri de restricŃie �FR diferite).

� Utilizarea enzimelor de restricŃie permite însă acoperireaunei mici părŃi (sub 5%) din întreaga secvenŃă a ADN uman şi, de aceea, a fost necesară dezvoltarea unortehnici noi, precum electroforeza in gel cu gradient denaturant (DGGE), analiza heteroduplexurilor, microcipuri şi secvenŃierea.

HărŃi ale SNP (SNP maps)

� SecvenŃierea unui nr mare de persoane

� Comparare secvenŃelor ptr identificarea SNP

� Având în vedere acest fapt s-au depus eforturi considerabile pentru cartografierea şi caracterizarea acestor polimorfisme.

�

� Alcătuirea unei hărŃi a genomului uman cu toate SNP posibile


� Utilizate în prezent pentru:�Localizarea genelor de susceptibilitate pentru

caracterele multifactoriale� Ex gena ApoE asociată cu B Alzheimer - 2 SNP, trei variante

alelice � HTA-

� Farmacogenetica –individualizarea tratamentului fiecarui pacient în funcŃie de individualitatea sa genetică. � un rol major în aceste studii îl are în special identificarea şi

înŃelegerea efectelor pe care asemenea SNP le au asupra modularii activităŃii enzimelor implicate în metabolizarea medicamentelor.

� Cercetarile privind evoluŃia speciei umane din punct de vedere biologic (similitudinea cu alte specii) şi istoric (migraŃia populaŃiilor).

Baze de date

� International HapMap Project website.http://www.hapmap.org .

� NCBI Reference Assembly. Single nucleotide polymorphism.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ .

curs 3 2013 pdf

Documents