curs 14_diagnostic de laborator in afectiunile mediate imun_2013
TRANSCRIPT
Immunology 2013. Science can solve problems
Diagnostic de laborator în afecțiunile
mediate imunCurs 14
Immunology 2013. Science can solve problemsImmunology 2013. Science can solve problems
Obiective
• Înțelegerea diferențelor dintre tehnicile imunologice utilizate
pentru diagnosticul afecțiunilor imune și cele folosite pentru
evaluarea afecțiunilor fără implicare imună
• Înțelegerea principiilor care stau la baza procedurilor imunologice
folosite în diagnosticul imunologic de laborator
• Descrierea tehnicilor imunologice relevante care evaluează diverși
parametri ai sistemului imun înnăscut și dobândit, organizate în
teste de screening, teste funcționale și teste specializate
• Identificarea utilității diagnostice a procedurilor imunologice în
condiții clinice specifice, care includ imunodeficiențele, bolile
alergice și bolile autoimune
• Dobândirea unei estimări a viitoarelor testări diagnostice imune și
a importanței acestora în diagnosticul precoce și terapia adecvată
Immunology 2013. Science can solve problems
Cuprins
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată
2. Evaluarea imunității înnăscute
3. Evaluarea imunității dobândite
4. Diagnosticul de laborator al afecținilor alergice
5. Diagnosticul de laborator al bolilor autoimune
Immunology 2013. Science can solve problems
- Teste ale funcției sistemului imun înnăscut (evaluarea
fagocitelor, celulelor cu rol mediator, NK și complementul)
- Teste ale funcției sistemului imun dobândit (activitatea
limfocitelor T și B)
Clasificarea testelor imunologice încearcă să ofere un algoritm
practic pentru diagnostic în funcție de complexitatea acestora:
1. Teste primare (screening)
2. Teste secundare (funcționale)
3. Teste terțiare (specializate)
Sunt folosite împreună cu alte proceduri clinice sau de laborator
pentru testarea funcției imune în diferite stadii diagnostice de
boală
Bolile autoimune, alergiile, astmul, transplantul de organe și de
măduvă osoasă hematogenă, procesele maligne limfoide, cu
plasmocite sau tumorile solide, imunodeficiențele primare și
secundare
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată
Immunology 2013. Science can solve problems
Categorie Componentă Primar
(screening)
Secundar
(funcțional)
Terțiar
(specializat)
Sistem imun înnăscut
Fagocite Mo/Macrofage
Neutrofile
Eozinofile
Celule dendritice
Hemoleucograma Aderență
Chemotaxie
Fagocitoză
Activitate
bactericidă
Molecule de
adeziune
Chemokine
Preluarea
particulelor
Oxidaza NADPH
Specii reactive
ale oxigenului
(ROS)
Celule cu rol
mediator
Mastocite
Bazofile
Hemoleucogramă
tisulară
Triptaza Histamina,
prostaglandine,
leukotriene
Celule NK Perforine /
granzime
ADCC
CD3- /
CD16+CD56+
Activitate citolitică Perforine
Funcția
complementul
ui
C1-C9 CH50, C3, C4 Opsonic (C3b)
Anafilatoxina (C3a,
C5a)
Chemotactic (C5a)
Citolitic (C5-9)
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată
Immunology 2013. Science can solve problems
Categorie Componentă Primar
(screening)
Secundar
(funcțional)
Terțiar
(specializat)
Sistem imun dobândit
Funcția
limfocitelor B
Limfocite Hemoleucograma
IgM, IgG, IgA, IgE
IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4
Imunofenotipare
CD19, CD20
Răspuns specific
la anticorpi pre-
/post
Funcția
limfocitelor T
Limfocite Hemoleucogramă
Imunofenotipare
diferențială
CD3+/CD4+
CD3+/CD8+
Testarea
hipersensibilității
de tip întârziat in
vitro
Teste de
limfoproliferare in
vivo la antigen și
mitogen
Analiza
citokinică
Activitatea
citolitică
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată
Immunology 2013. Science can solve problems
1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție
imună modificată
Descoperirile majore ale secolului XX cu cel mai mare impact asupra
diagnosticului imunologic:
- Tehnologia hibridoamelor
• Kohler și Milstein (1975)
• producerea in vitro a unor cantități crescute de anticorpi
omogeni cu o singură specificitate antigenică – anticorpi
monoclonali
-Flowcitometria (FCM) – fluorescent activated cell sorting (FACS)
• tehnologie pentru identificarea moleculară
• utilizarea anticorpilor monoclonali
• detectarea și caracterizarea diferitelor celule și molecule ale
sistemului imun
• epidemia SIDA în 1981 – recunoașterea și măsurarea
limfocitelor T CD4+ (diagnostic, tratament, follow-up al
pacienților infectați cu HIV)
• evaluarea afecțiunilor limfoproliferative, imunodeficiențelor
și alte boli mediate imun
Immunology 2013. Science can solve problems
Considerații generale asupra pacienților suspectați cu
imunodeficiențe primare sau secundare
Suspiciune de imunodeficiență
primară (PID)
Antecedente heredocolaterale
Infecții
Tipul agentului infecțios
Localizarea și frecvența infecțiilor
Eșecul antibioterapiei în eradicarea
infecției
Severitatea infecției
Anomalii congenitale
Valori ale parametrilor de laborator
Autoimunitate
Incidența crescută a proceselor
maligne
Condiții clinice asociate
imunodeficiențelor primare (PID)
Infecții
Neobișnuit de severe
Recurente
Agenți patogeni neobișnuiți
Infecții ale sinusurilor
Malabsorpție
Autoimunitate
Boală reumatoidă
Sindroame lupus-like
Abcese, leziuni tegumentare
Diaree cronică
Vindecare incompletă a rănilor
Reacții adverse la vaccinurile vii
Absența ganglionilor limfatici/amigdale
Absența timusului pe Rx
Immunology 2013. Science can solve problems
Considerații generale asupra pacienților suspectați cu
imunodeficiențe primare sau secundare
Agenți infecțioși asociați PID
Deficitul de anticorpi
Hemophilus influenzae
Streptococcus pneumonie
Giardia lamblia
Specii de Cryptosporidium
Enterovirusuri
Deficit al imunității celulare
sau combinată
Candida albicans
Pneumocystis carinii (jiroveci)
Specii de Mycobacterium
Cytomegalovirus
Virus Epstein-Barr
Virus Varicella
Enterovirusuri
Agenți infecțioși asociați PID
Deficit al fagocitelor/fagocitozei
Specii Pseudomonas
Specii Klebsiella
Staphylococcus aureus
Serratia marcescens
Specii Nocardia
Specii Aspergillus
Deficit complement sau ale
componentelor complementului
Neisseria meningitides
Neisseria gonorrhoeae
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscuteIstoric medical
Tipuri de agenți patogeni
Recurența infecțiilor
Rezultate hemoleucogramă și diagnostic diferențial
Evaluarea flowcitometrică a
subpopulațiilor limfocitare
Limfocite B Limfocite T
Cantitație imunoglobuline
Izohemaglutinine
(anti-A, anti-B)
Electroforeza proteinelor
serice
Răspuns la
imunizare specifică
Răspuns la
anticorpi
Examinare
țesut limfoid
Test limfoproliferare
in vitro
Răspuns DHT la
antigene
Producerea de citokine
specific-antigenice
(FCM, ELISA)
Examinare
țesut limfoid
PMN
Testarea fenotipică (FCM)
CD18/CD11
Teste funcționale
Fagocitoză,
chemotaxie,
bactericidie
Efecte respiratorii
NBT, DHR
Complement
CH50
C3, C4
AH50
Cantitație componente C
Nefelometrie
Testarea
funcțională
componente C
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.1. Evaluarea funcției fagocitelor
- Ce? Monocite circulante, macrofage tisulare, celule mieloide circulante
(neutrofile) – fagocitoză, activitate intracelulară bactericidă, inflamație;
celule prezentatoare de antigen (APC)
- Când? Infecții bacteriene recurente
- Cum? Cantitativ și calitativ
Când suspectăm o disfuncție fagocitară?
- Infecții cutanate – S. aureus
- Gingivită
- Afecțiuni periodontale
- Ulcerații orale
Anomalii neutrofilice relevante din punct de vedere clinic:
- Neutropenie
- Anomalii de aderență și locomoție neutrofilică
- Anomalii ale formării granulelor intracitoplasmatice
- Anomalii ale funcției fagocitare
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
Defecte cantitative ale fagocitelor
Tipul de celulă Defect al
sistemului imun
înnăscut
Exemple Manifestări
clinice
Defect al
numărului de
neutrofile
Neutropenie Congenital,
infecțios, malign,
boli autoimune
Creșterea
susceptibilității la
infecții bacteriene
Defect al
numărului de
macrofage
Splenectomie
Splenectomie
funcțională
Îndepărtarea
chirurgicală a
splinei ca urmare a
unui traumatism
Anemia sickle-cell
(siclemia)
Creșterea
susceptibilității la
infecții bacteriene
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
Defecte calitative ale fagocitelor
Componentă Defect al sistemului
imun înnăscut
Exemple Manifestări clinice
Granule primare și
secundare
Defecte de formare și de
conținut ale granulelor
Sindrom
Chediak-Higashi
Albinism parțial, lizozomi
uriași, NK și CTL,
scăderea traficului
lizozomal, infecții
bacteriene recurente
Oxidaza NADPH Defecte ale
metabolismului oxidativ
Boală
granulomatoasă
cronică
Formarea granuloamelor,
creșterea susceptibilității la
infecții bacteriene și fungice
Defecte de adeziune
leucocitară (LAD)
Defecte ale aderenței și
chemotaxiei datorate
mutațiilor integrinei,
care duc la defecte ale
CD18 și CD15,
absența/scăderea
adeziunii leucocitare și
migrarea celulară
Deficit de
adeziune
leucocitară tip 1
(LAD1)
Întârzierea separării
cordonului ombilica,
ulcerații tegumentare,
periodontită, leucocitoză
Interferon / IL-12 Defecte ale căii
interferon / IL-12
BCG Susceptibilitate la infecții
cu Salmonella și
mycobacterium
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
Defectul fagocitar Exemple Analize de laborator
Afecțiuni ale celulelor
mieloide
Neutropenie congenitală
severă
Neutropenia ciclică
Neutropenia X-lincată
Neutropenie persistentă și blocarea
maturării detectate prin studii la nivelul
BM
Neutropenie intermitentă care necesită
determinări seriate (la intervale de 2-3
săptămâni)
Expresie WASP alterată (FCM) sau studii
de mutageneză
Defecte ale formării
granulelor și
conținutului
Sindrom Chediak-Higashi
Sindrom Griscelli tip 2
Incluziuni lizozomale gigantice la nivelul
granulocitelor (albinism parțial)
Neutropenie fără incluziuni citoplasmatice
(albinism parțial)
Defecte ale adeziunii
leucocitare
LAD1
LAD2
LAD3
/- CD18 și CD11 (FCM); leucocitoză
persistentă
Fenotip Bombay, absența expresiei CD15
Analize mutaționale
Defecte ale căilor de
semnalizare citokinice
Sindromul hiper-IgE
Interferon -/IL-12
IgE > 2000 IU/ml, Th17, deficit de STAT
Defecte moleculare ale căii Interferon -
/IL-12, detectate prin FCM
Defecte ale
metabolismului
oxidativ
Granulomatoză cronică Defecte evidențiate prin DHR sau NBT
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.2. Evaluarea funcției celulelor cu rol mediator
- celulele cu rol mediator sunt: bazofile, mastocite și eozinofile (au și
activitate fagocitară)
- au fost identificate 2 tipuri de mastocite:
mucoasa intestinală și țesutul peretelui alveolar – conțin doar triptază
[MC(T)]
tegumentul normal și submucoasa intestinală – conțin triptază și
chimază [MC(TC)]
triptaza este crescută în reacțiile anafilactice și mastocitoză (valoare
diagnostică ca marker al acestor afecțiuni)
- Histamina
mediator vasoactiv potent stocat ca moleculă pre-formată în granulele
citoplasmatice ale bazofilelor și mastocitelor
eliberată împreună cu alți mediatori ai inflamației (leukotriene) în
reacții de hipersensibilitate tip I (imediată)
eliberarea bazofilică de histamină (BHR) - test cantitativ de potență
alergenică (ingestia unui alergen alimentar) și model in vitro de studiu
al factorilor declanșatori ai eliberării mediatorului din bazofile
- Peptidul cationic eozinofilic (ECP) – nivel crescut în spută, ser și secreții
nazale ale pacienților cu infecții parazitare, rinită alergică, astm
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.3. Evaluarea funcției celulelor NK
- Rol important în apărarea anti-tumorală și anti-virală apoptoză (direct
- perforine și granzime; indirect - precipitarea IgG și inducerea ADCC =
antigen-dependent cellular cytoxicity)
- Când suspectăm o disfuncție a NK?
NK în sângele periferic la pacienții cu AIDS, infecții recurente cu
virusul herpetic
NK + CTL sunt asociate cu un răspuns inflamator incontrolabil
indus de infecție injurie multiplă de organe = limfohistiocitoză
hemofagocitică (HLH); un tip de HLH este sindromul limfoproliferativ
X-lincat (XLP) = răspuns imun anormal la infecția cu EBV deces în
cazul în care nu se efectuează transplant de măduvă osoasă
- Investigații de laborator?
imunofenotipare (FCM)
teste de citotoxicitate – eliberarea de 51Cr la 4 ore
evaluarea flowcitometrică intracelulară pentru molecule defective în
XPL1 și XPL2: SLAM-associated protein (SAP), X-linked inhibitor of
apoptosis (XIAP)
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.4. Evaluarea funcției complementului
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.4. Evaluarea funcției complementului
Immunology 2013. Science can solve problems
2. Evaluarea imunității înnăscute
2.4. Evaluarea funcției complementului
Când suspecăm o disfuncție a complementului?
Disfuncțiile complemetului sunt rare (0,03% din populație)!!
- Pacienți cu afecțiuni autoimune
- Pacienți cu infecții recurente
- Pacienți cu angioedem cronic recurent
Calea clasică (C1q, C1r, C4 și C2) – simptome lupus eritematos autoimun-
like, cu infecții recurente sino-pulmonare
Defecte ale C3 – infecții bacteriene recurente cu Streptococcus penumoniae
Defecte ale căii lectinei – infecții acute recurente ale tractului respirator,
mai ales la copii (S. Pneumoniae și N. meningitidis), precum și creșterea
incidenței bolii reumatismale
Defecte ale căii alternative – infecții recurente cu N. Meningitidis
Cum evaluăm funcția complementului?
-Complementul hemolitic total – CH50 (calea clasică)
-Funcția căii alternative – AH50
-Nefelometria – prezența și cantitatea componentelor complemetului, dar nu
determină funcția acestora
Immunology 2013. Science can solve problems
3. Evaluarea imunității dobândite
Standard – imunofenotipare flowcitometrică (FCM)
- Limfocite T citotoxice (CD3+CD8+)
- Limfocite T helper (CD3+CD4+)
- NK (CD16+CD56+)
- Limfocite B (CD19+) (4-10% limfocite)
3.1. Evaluarea funcție limfocitelor B
Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor B?
- Agamaglobulinemia X-lincată (Bruton, 1952)
- Infecții repetate cauzate de microorganisme comune încapsulate: S.
Pneumoniae, S. Aureus, H. Influenzae tip b, N. meningitidis
- Diaree (25% din pacienții) asociată cu infecții cu Giardia lamblia
- Pacienți care nu răspund la imunizarea specifică – tetanos/difteria,
vaccinul anti-H. Influenza tip b (vaccin cu virus atenuat), vaccinul anti-
polio (vaccin cu virus viu administrat oral)
Immunology 2013. Science can solve problems
3. Evaluarea imunității dobândite
3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B
Evaluarea de laborator a funcției limfocitelor B
Testarea limfocitelor B se face prin teste in vivo - vaccinare
Vaccinurile proteice (tetanos) – evaluează răspunsul imun dependent de
limfocitele T
Vaccinurile polizaharidice (Pneumovax) – evaluează răspunsul imun
independent de limfocitele T
Antigenele recall – anticorpii produși au făcut switching-ul de clasă (IgG)
Neoantigene – antigenul este nou pentru sistemul imun; anticorpii produși
sunt de tip IgM la prima vaccinare și de tip IgG la a doua vaccinare
Immunology 2013. Science can solve problems
3. Evaluarea imunității dobândite
3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B
Teste de screening
- CBC (complete blood count = hemoleucograma)
- Nivelul de imunoglobuline – nefelometrie (IgM, IgG, IgA) și IgE
(ELISA); niveluri < 300 mg/dl la adolescení/adulți și < 95%
valoare de referință la copii deficit imunoglobulinic
- Electroforeza proteinelor serice
- Determinarea anticorpilor naturali anti-grup sanguin
(izohemaglutinine)
- Imunizarea pacientului cu vaccin proteic (tetanos/difteria) și
vaccin polizaharidic (vaccinul penumococic) și determinarea
titrului anticorpilor înainte și la 3-4 săptămâni de la imunizare
Teste specifice
- Flowcitometrie (CD19+, CD20+)
- Teste in vitro de stimulare a proliferării cu agenți mitogeni (PHA,
LPS, Concavalina A)
Immunology 2013. Science can solve problems
3. Evaluarea imunității dobândite
3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T
Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor T?
- diaree, infecții recurente cu agenți patogeni oportuniști (Candida albicans,
Pneumocystis jiroveci, CMV), infecții bacteriene cu localizări multiple,
infecții persistente, în ciuda tratamentului corespunzător
- erupții cutanate
- noduli limfatici nepalpabili, absența timusului (atenție! Stressul poate
induce reducerea imaginii Rx a timusului în 50% cazuri)
Evaluarea de laborator a funcției limfocitelor T
- Teste de screening
- Teste specifice
Immunology 2013. Science can solve problems
3. Evaluarea imunității dobândite
3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T
Nivelul testului
diagnostic
Investigații
Teste de screening CBC
Testare HIV
Imunofenotipare limfocitară
Testare cutanată a hipersensibilității de tip întârziat
Teste specifice Proliferarea limfocitelor T (agenți mitogeni)
Producția de citokine limfocitare (ELISA)
Evaluare flowcitometrică a proteinelor de suprafață sau
intracitoplasmatice – CD40L (CD154 pe suprafața
limfocitelor T activate), lanțul g al IL-2R (CD132), MHC-I,
lanțul a al IL-7R (CD127), lanțurile CD3, WASP (Wiskott-
Aldrich syndrome protein)
Teste enzimatice: adenozin deaminaza
FISH pentru deleția 22q11
Analiza repertoriului TCR
Analize mutaționale