STREPTOCOCCACEAE

VASILICA UNGUREANU

MINIDEFINITIEMicroorganismele desemnate clasic ca aparţinând familiei Streptococcaceae, reprezinta un vast ansamblu heterogen de coci :

� sferici sau ovali,� gram(+), aşezaţi in lanţţţţuri de diferite lungimi sau în perechi,� imobili sau rareori mobili,� nesporulaţi,� pretentioşi nutritiv,� aerobi, cresterea poate fi favorizata de atm. de CO2, facultativ anaerobi,� catalazo- si oxidazo-negativi, nu reduc nitratii� fermenteaza glucoza cu producere de ac. lactic, fara gaz.

CLASIFICARE(1)

1. Dupa aspectul hemolizei:

- streptococii ß-hemolitici – coloniile sunt înconjurate de o zona bine delimitata de hemoliza completă; diametrul coloniilor, variabil în functie de grupul antigenic, este de 4-5 ori mai mic decât diametrul zonei de hemoliza – gr. A, C, G

- streptococii α`- hemolitici – coloniile sunt înconjurate de o hemolizăβ incompletă, bordată de o zonă îngustă de β-hemoliză–gr. B

- streptococii α - hemolitici - coloniile sunt înconjurate de o zona de înverzire a mediului, prin hemoliza parţială a hematiilor asociată cu reducerea Hb. eritrocitare -streptococii viridans şi S. pneumoniae.

- streptococii γ-hemolitici – streptococii nehemolitici – enterococii şi unii streptococi orali

CASIFICARE (2)

2. Pe baza prezentei sau absentei antigenului specific de grup(poliozidul C din peretele celular, cu exceptia grupului D la care antigenul specific este acidul glicerol-teicoic) streptococii se împart în :

- Streptococi grupabili – Rebeca Lancefield : grupele A–W, cu exceptia literelor I si J

- Streptococi negrupabili – lipsiti de antigenul specific de grup.

3. Pe baza caracterelor biohimice

se realizeaza diagnosticul de specie al streptococilor

CLASIFICARE (3)

3. Pe baza puterii patogene

3.1 Streptococii patogeni : predomina specii patogene pentru om si diferite animale Au semnificatie clinica deosebita pentru om.

- SGA , Str. pyogenes – β-hemolitic, patogen prin excelenta pentru om.- SGB, Str. agalactiae – α`-hemolitic, cu importanta deosebita în patologia materno-fetala.- SGC, ββββ-hemolitic, determina infectii similare celor post S. pyogenes; speciadysgalactiae cu subspeciile dysgalactiae si equisimilis (poate avea antigen de gr A,C,G); specia equi cu subspeciile equi si zooepidemicus, având ca habitat variate animale si omul.

- SGG, Str. canis- ββββ-hemolitic, determina infectii similare celor post S. pyogenes având ca habitat variate animale.

3.2. Streptococi comensali – apartin florei normale a mucoaselor org. uman:

- streptococii orali (comensali ai orofaringelui)- streptococii de grup D (comensali ai intestinului)

3.3. Acesti germeni comensali pot deveni, in anumite circumstante, patogeni oportunisti, putand fi responsabili de infectii ca septicemii sau endocardite

CARACTEREMORFOTINCTORIALE

� Coci gram (+), sferici sau ovoizi, dispusi în perechi (pneumococii) sau în lanturi lungi (din culturi în mediul lichid) sau mai scurte (din culturi pe mediul solid).

� Din prelevatele patologice pneumococii se prezinta sub forma cocilor gram (+), ovoizi sau lanceolati, dispusi în diplo, înconjurati de capsula.

� În culturi vechi pot deveni coci gram (-).

� În mediile de cultura deficitare streptococii pot prezenta anomalii morfologice : coloratia gram va putea releva coci gram (+) si gram (-), celulele pot fi grupate în lanturi si pot prezenta aspecte normale, cocoide si ovalare, precum si forme bacilare

sau chiar globuloase.

STREPTOCOCI- CARACTERE MORFOTINCTORIALE

CARACTERE DE CULTURA

1.Aspectul cresterii :

1.1. pe mediile solide : - colonii S (smooth) : mucoide, matt si glossy – determinatede tulpini în ordinea scaderii virulentei

- colonii R(rough)-determinate de tulpini mai putin virulente1.2. în mediile lichide : streptococii cresc - cu depozit si supernatant clar

- cu depozit si tulburare omogena a mediului (în cazul tulpinilor f. virulente sau streptococilor de grup B si D).

2. Aspectul hemolizei:

2.1. Pe geloza-sânge de oaie streptococii dezvolta :- hemoliza ß (gr. A,C,G si uneori D)- hemoliza α` (gr. B)- hemoliza α (str. viridans, pneumococii, streptococii din gr. D)- hemoliza γ (str. nehemolitici – gr. D)

2.2. Pe geloza cu sânge de cal unii streptococi γ-hemolitici pot determina hemoliza β.

CARACTERE MORFOTINCTORIALE SI DE CULTURA - SH

CARACTERE BIOCHIMICEAceste caractere sunt importante pentru identificarea streptococilor negrupabili si a enterococilor, ca de ex. :

- fermentarea zaharurilor- hidroliza amidonului- hidroliza argininei- hidroliza esculinei- cresterea pe mediu cu bila–esculina ( 40% bila)- cresterea pe mediu cu 6,5% Na Cl- dezvoltarea pe mediu cu trifenil tetrazolium clorid (TTC)- dezvoltarea pe mediu cu telurit de K

STRUCTURA CELULEI STREPTOCOCICE

FACTORII DE PATOGENITATE

1. Componente endogene

� Capsula – factor major de patogenitate si virulenta: impiedica fagocitoza; unele tulpini secreta o cantitate mai mare de capsula – acestea fiind in mod particular mai virulente (coloniile au aspect mucos)

� Proteinele de suprafata (M, R, T), dintre care proteina M: - cel mai important factor de virulenta - joaca rol in aderenta la mucoase sau tegumente, inhiba fagocitoza. - pe baza prot. M SGA sunt impartiti in peste 100 tipuri. - determina formarea de anticorpi protectori specifici de tip

2. Componente exogene

� Toxinele eritrogene A, B si C (speA, speB si speC) – responsabile de eruptia din scarlatina; au proprietati de superantigene, stimuland limfocitele policlonale sa elibereze citochine sau alti mediatori ai inflamatiei- provocand sindromul socului toxic sau scarlatina maligna

� Streptolizinele Osi S- hemolizine care determina hemliza ß pe geloza sange;SLO determina formarea anticorpilor ASLO, imp in dg inf cu SGA

� Streptokinaza, streptodornazele, hyaluronidaza - imp. factori de invazie

INFECTII DETERMINATE DE STREPTOCOCI

1. Infectii neinvazive

�Faringitele/anginele – cele mai frecvente, la copil de la 4 ani si adolescenti�Scarlatina- angina str acompaniata de eruptie determinata de toxina eritrogena�Impetigo- inf cutanata, care poate fi det si de S. aureus sau de asocierea acestora

2. Infectii invazive

�Erizipelul – leziune cutanata, insotita si de pasajul sanguin al germenelui, dandu-i astfel caracterul invaziv; caracterizat prin frecventa recidivelor si posibilitatea invadarii org = septicemie�Celulita extensiva sau fasciita necrozanta-leziune profunda cu necroza tisulara, se poate insoti cu sindr socului toxic, adesea mortal�Septicemie – cu punct de plecare pulmonara sau genitala(septicemia puerperala)�Sindromul socului septic- asociat cu tulpini care secreta toxine eritrogene- numite si super antigene. Este mortal in 90% din cazuri, in ciuda tratamentului instituit

3. Complicatii poststreptococice tardive nesupurative : - RAA - GNA

INFECTII STREPTOCOCICE

INFECTII INVAZIVE STREPTOCOCICE

Streptococcus agalactiae : streptococul ß-hémolitic de grup B

�Important in patologia materno-fetala : determina la n-n - sindr timpuriu (in primele ore de la nastere - 7 zile) –

inf resp severa cu insuficienta respiratorie; - sindr tardiv- (intre 7 zile -3 luni de viata) - meningita cu

prognostic sever

�Infectia neonatala este o urgenta terapeutica; prognosticul sever al acestora justifica urmarirea portajului vaginal la femeia gravida si un tratament preventiv

�La adult poate determina infectii cutanate, urinare, genitale, uneori insotite de septicemie, in special la organismele tarate imunologic

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE (1)

1 - Habitat si putere patogena

�Este o specie patogena virulenta, desi exista in stare de portaj la nivelul mucoaselor rino-faringiene intr-un procent destul de crescut in populatia umana�Determina o serie de infectii ca: otite, sinuzite, pneumonie, pleurezie, meningita, septicemie�Pneumococul este izolat din diferite prelevate: sputa, LCR, secr otica sau sinuzala, sange etc

2 - Factori de patogenitate

�Capsule: pn poseda o capsula PZ, antigenica; pe baza acestei capsule sunt impartiti in peste 90 serotipuri, cu importanta epidemiologica si in prepararea vaccinurilor pneumococice �Pneumolizina - imp factor de patogenitate

3 – Classification

�Pn fac parte din grupul streptococilor orali, deosebindu-se de streptococii viridans prin puterea lor inalt patogena si alte caracteristici biologice si biochimice

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE (2)

1.IDENTIFICARE

�Caractere morfotinctoirale: coci sferici sau ovoizi, dispusi in diplo sau in lanturi, inconjurati de o capsula

�Caractere de cultura – pe geloza sange determina colonii inconjurate de o αhemoliza, asemanatoare str viridans

�Caractere biologice::::−−−− testul la optochin – diferentiaza pn de str viridans−−−− testul bilolizei

�Caractere antigenice : pe baza PZ capsular se poate identifica serotipul pn

�Sensibilitate la antibiotice : un procent mare de pn sunt R la penicilina si alte beta-lactamine

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE –CARACTERE MORFOTINCTORIALE

STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE

Hemoliza αααα Test la optochin

ALTI STREPTOCOCI ORALI

� Anumite specii de streptococi sunt comensale ale mucoaselor orofaingiene, genitale si intestinale.

�Plecand de la aceste porti de intrare acesti streptococi pot deveni patogeni oportunisti, putand provoca pneumopatii cu detresa respiratorie la bolnavi imunodepresati, sau endocardite subacute la persoane cu valvulopatii cardiace.

�Aceste infectii severe necesita un dg etiologic (izolarea tulpinii bacteriene, identificarea de spp pe baza caracterelor morfologice, de cultura, biochimice etc) si determinarea sensibilitatii la antibiotice.

�Unele specii : S. mutans et S. sobrinus – sunt responsabile de carii dentare

LES AUTRES STREPTOCOQUES ORAUX

STREPTOCOCII DE GRUP D

�Sunt comensali ai intestinului uman si la anumite animale

�Uneori sunt izolati din produse lactate sau alte produse agro-alimentare.

�Acest grup contine mai multe specii, a caror clasificare este in curs de actualizare.

�Printre speciile numite pana acum cativa ani S bovis, se disting actual speciile: - S. gallolyticus – izolata dintr-o endocardita asociata unui cancer de colon- S. infantarius (prima tulpina izolata din scaunul copiilor, apoi mai frecvent din endocardite ale adultilor) - S. bovis / S. equinus - cel mai adesea de origine animala

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (1)IZOLAREA SH

A. Prelevarea produselor patologice

1. In infectiile determinate de streptococii ß-hemolitici (SH) produsele patologice ce pot fi recoltate sunt f. variate :

- exsudat faringian si nazal- sputa- l.c.r., lichid pleural, pericardic, peritoneal, periarticular- puroi- secretii vaginale, conjunctivale si auriculare- urina- sânge etc.

2. Prelevarea este diferentiata pentru fiecare produs patologic în parte, cu respectarea normelor de asepsie.

3. Recoltarea exsudatului faringian se efectueaza cu ajutorul unui tampon de vata montat pe o tija de lemn, sticla sau metal inoxidabil – steril.

4. Sputa necesita o preparare obligatorie : 2-3 spalari în ser fiziologic steril pentru îndepartarea florei de asociatie oro-faringiana.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (2)

B. Transportul produselor patologice, cand însamântarea nu se poate faceimediat sau în timp de 2 – 4 h dupa prelevare, se realizeaza cu ajutorul unui mediu de transport, selectiv si de îmbogatire ( bulion care contine azid de Na si cristal violet, la care se adauga în momentul folosirii 5% sânge). Este un mediu în care produsele patologice se pot mentine pâna la 2 zile; înainte de însamântare pe geloza sânge se incubeaza 3-4 h la 37oC

C. Examenul direct al produsului patologic- examenul macroscopic (ex. : sputa, pentru a fi luata în lucru, trebuie sa prezinte particule muco-purulente, fibrinoase, cu sau fara striatii sanghinolente etc.)- examenul microscopic : - nu este obligatoriu pentru exs. faringian pentru ca nu ne poate da informatii asupra prezentei streptococilor ß-hemolitici, însa se poate face diagnosticul diferential cu angina difterica, fusospirilara sau candida.

- este obligatoriu pentru produsele prelevate din situsuri anatomice, care în mod normal sunt sterile (l.c.r., lichid pleural, lichid articular etc. ), si din diferitele puroaie.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (3)D. Cultura

– Însamântarea se face direct pe geloza cu 5% sânge de berbec sau cal –pentrumajoritatea produselor patologice, sau în bulion de hemocultura pentru sânge.– Incubarea se face în aerobioza; pentru produsele patologice recoltate din situsuri mai profunde se prefera incubarea în atmosfera de CO2; timpul de incubare : 18 – 24 h, la 35 – 37oC.

E. Citirea :

• prezenta unor colonii cu diametrul de 0,5 mm, transparente, înconjurate de o zona bine delimitata de hemoliza totala (ß-hemoliza), al carei diametru este de 3-4 ori mai mare decât diametrul coloniei ( streptococi de grup A, C sau G)• prezenta unor colonii cu diametrul de 1-2 mm, opace, gri-laptoase, bombate, cu o margine regulata, înconjurate de o hemoliza ß incompleta ( flu, estompata) (streptococi de grup B)

E. Izolarea în cultura pura

– Coloniile descrise mai sus se repica si se însamanteaza pe geloza sânge în vederea obtinerii unei culturi pure, folosita mai departe pentru identificare

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (4)IDENTIFICAREA

Pe baza urmatoarelor caractere :

1. Caractere de cultura- pe geloza sânge : colonii descrise mai sus- în mediu lichid : crestere cu depunere la fundul tubului, supernatantul ramânând limpede (pentru str. de grup A, C si G); streptococii de grup B cresc cu tulburarea supernatantului. Tulburarea mediului se mai produce si în cazul tulpinilor de streptococi ß-hemolitici foarte virulenti.

2. Caractere morfotinctoriale :

Coci gram (+), sferici sau ovoizi, dispusi în lanturi lungi ( din culturi în mediul lichid) sau mai scurte ( din culturi pe mediul solid).

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (5)

3. Identificarea preliminara

3.1. Testul la bacitracina este un test screening pentru diferentierea prezumtiva astreptococilor de grup A de ceilalti streptococi ß-hemolitici, stiind ca streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracina, iar cei non-A sunt rezistenti. Poate fi detectata sensibilitate la bacitracina si la anumite tulpini de streptococi ß-hemolitici de grup non-A (C si G ).

3.2. Testul CAMP (dupa numele autorilor : Christie, Atkins si Munch-Petersen).Majoritatea streptococilor de grup B produc o proteina difuzibila (factorul CAMP) care actioneaza sinergic cu ß-lizina stafilococica si determina liza completa a hematiilor de berbec sau de bou din mediul de cultura.

3.3. Testul PYR – identifica streptococii de grup A mai specific si tot asa de sensibil ca si testul la bacitracina. Substratul PYR (L-pyrrolidonyl-ßnaphtylamida) este hidrolizat de 100% din streptococii de grup A, dar de nici unul din streptococii non-A. Enterococii dau de asemenea testul PYR pozitiv.

3.4. Testul SXT (sulfamethoxazol-trimethoprim) este un test de sensibilitate, folositpentru diferentierea prezumtiva a streptococilor de grup A si B de ceilalti streptococi b-hemolitici. Majoritatea streptococilor de grup A si B sunt rezistenti la SXT atunci când culturile sunt incubate în atmosfera normala.

TEST LA BACITRACINA

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (6)

4. Identificarea definitiva (pe baza caracterelor antigenice)4.1. Identificarea de grup

Rebecca Lancefield a facut împartirea streptococilor în grupuri, notate cu literele alfabetului (de la A la W, cu exceptia literelor I si J), pe baza polizaharidului (poliozid C) din peretele celulei streptococice, exceptând streptococii de grup D al caror antigen specific de grup este acidul glicerol teicoic si care se afla in profunzimea celulei.

Poate fi realizata prin metode diferite :4.1.1.Reactia de precipitare interfaciala ( în inel)

- se efectueaza cu ajutorul serurilor hiperimune specifice pentru grupurile A, B, C, G etc. si a extractului antigenic.

4.1.2. Reactia de aglutinare pe lama – este o reactie rapida si specifica pentru serogruparea streptococilor ß-hemolitici apartinând grupurilor A, B, C, D, F siG. Pentru aceasta pot fi efectuate doua metode de aglutinare:

• Latex – agutinarea ( LA)• Coaglutinarea (CoA)

4.2. Identificarea de tipImportanta epidemiologica - pentru cunoasterea :

- circulatiei germenilor într-o anumita perioada si zona;- filiatiei cazurilor într-un focar streptococic.

SEROGRUPAREA SH PRIN REACTIA LATEX-AGLUTINARE

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (7)

4.2.1.Serotiparea streptococilor de grup A

• Serotipajul M : se realizeaza prin reactia de precipitare în tuburi capilare,între antigenul M (extras prin metoda Lancefield), si serul hiperimun

specific anti M (peste 80 tipuri M).

• Serotipajul T : se realizeaza prin reactia de aglutinare pe lama întreserurile hiperimune specifice anti T (~ 30 tipuri) si aceeasi suspensie

bacteriana obtinuta pentru identificarea serogrupului streptococic, care adat o reactie pozitiva cu reactivul CoA pentru grupul A.

4.2.2.Serotiparea streptococilor de grup B (S. agalactiae)

Se poate realiza prin doua metode :- Precipitare în inel

- CoA

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (7)SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE

� Streptococii beta-hemolitici sunt sensibili la penicilina si celelalte beta-lactamine

� Tratament alternativ – eritromicina - in cazul pacientilor alergici la penicilina

� Au aparut rezistente la eritromicina

METODE MOLECULARE PENTRUCARACTERIZAREA STREPTOCOCILOR

ß-HEMOLITICI ( S. pyogenes=SGA)− Tiparea emm – tipare moleculara realizata prin amplificarea PCR si secventierea

regiunii variabile 5` a genelor emm, gene care codifica proteina M

- MLST (Multilocus Sequence Typing) – o metoda de caracterizare a tulpinilor

bacteriene, utilizand secvente ale fragmentelor interne a sapte gene “housekeeping”;

furnizeaza un important marker epidemiologic.

- PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) – realizeaza analiza profilului de

restrictie a ADN cromozomal prin electroforeza in gel de agaroza sub actiunea

unui camp electric pulsat. Instrument de investigare a relatiilor genetice intre

tulpini bacteriene apartinand aceleiasi specii.

- Detectarea factorilor de virulenta la S. pyogenes : detectarea genelor care

codifica eritrotoxinele (speA, B, C, F, G, H, J, K, ssa si smeZ)

- Detectarea genelor de rezistenta la antibiotice prin hibridizarea AND cu sonde

specifice, PCR cu amorse specifice.

DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC1. Investigarea raspunsului imun umoral

1.1.Decelarea anticorpilor fata de antigenele exocelulare:ASLO si Anti DN-aza B, �metodele cele mai frecvent folosite, care au la baza o reactie de neutralizare, caracterizate princapacitatea anticorpilor din serul de bolnav de a neutraliza efectul biologic activ al antigenului corespunzator, care nu va mai actiona asupra substratului introdus în reactie. �Titrarea acestor anticorpi are importanta diagnostica în infectiile acute streptococice, ca si în puseele acute ale complicatiilor tardive nesupurative, decelarea Ac. ASLO având si valoare prognostica si de evaluare a eficacitatii tratamentului, iar Ac. anti DN-aza B au valoare diagnostica în infectiile streptococice cutanate si în complicatiile acestora – GNA. �Mai putin utilizata este decelarea celorlalti Ac. antiproteine exocelulare: anti Hialuronidaza, anti Streptokinaza si anti NAD-aza.

1.2.Decelarea anticorpilor fata de antigene streptococice endocelulare:ac. anti M, anti MAP si anti ACHO.

Metodele cele mai utilizate pentru titrarea acestor anticorpi sunt : Lx A si HAP; nivele crescute ale acestor anticorpi sunt întâlnite în special în complicatiile tardive poststreptococice, sustinând teoriile privind patogenia autoimuna a acestor complicatii.

2. Decelarea raspunsului imun celular la diverse antigene streptococice endo- si exocelulare –

prin metode in vitro sau in vivo – nu este realizata decât în scop de cercetare sau în cadrul unor contexte esentiale clinice (alergie sau sindroame cronice).