cultura plantelor in vitro
DESCRIPTION
pentru downloadTRANSCRIPT
INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURIVEGETALE
Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a
biotehnologieiîn viaţa omului, în toate domeniile de activitate. Cu ajutorul
metodelor biotehnologice s-aufăcut progrese uriaşe în crearea de noi genotipuri de
plante şi rase de animale cu însuşirifavorabile şi cu randamente sporite faţă de
materialul de la care s-a plecat.Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima
jumătate de secol s-a făcut, în principal, pe organisme simple ca mod de organizare
(bacterii, drojdii, alge, etc.), organismeunicelulare. Odată cu abordarea
organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunileacumulate anterior erau
valabile şi dacă existau şi alte procese specifice modului complex deorganizare.
Cunoscându-se comportamentul organismelor simple, cercetătorii au început să
segândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau chiar
celule. Problemacare a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de
la prelevarea de pe plantamamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai
departe până la regenerarea(refacerea) unei noi plante.Ajungerea la cultura in vitro
nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar mult timp şi multe cercetări,
la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat.În 1882, Sachs a fost cel care a
elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizeazăsubstanţele ce determină
formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primeleîncercări de
culturi de ţesuturi au fost făcute în 1902, de către Haberland, din nefericire,
fărărezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule şi ţesuturi încep să
apară din anul1922, când Knudson reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee in
vitro
Iar Robbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale.Pe baza
conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţineinformaţia
genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, înanul
1
1952 Morel şi Martin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe
mediiaseptice a explantelor meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in
vitro a acestora plante sănătoase, libere de viroze, pornind de la plante mamă
contaminate cu diferite viroze.În acest mod se produce material de plantat
devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritmimposibil de imaginat prin utilizarea
tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitându-se şi degenerarea soiurilor
din cauza infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă.În anul 1962,
după mulţi ani de studii şi încercări, Murashige şi Skoog, au reuşit săelaboreze un
mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici modificări – poate
fiutilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi.Reuşita experienţelor
lui Coking în 1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor dinmezofil foliar, a
făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producereade
hibrizi somatici.Anul 1966 este considerat drept începutul etapei moderne a
cercetărilor privind culturade explante vegetale in vitro.
Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea detehnici eficiente în
generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu ajutorul
protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali
transmiţătoride gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la acţiunea unor agenţi
stresanţi cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.Atât
pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro
suntfolosite în special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat
de multiplicareaspeciilor arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru
realizarea de noi genotipuri saumai ales pentru regenerarea celor create prin
inginerie genetică.
2
CULTURILE IN VITRO
1. DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞIAPLICABILITATE
1.1. Definiţie
În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale,
încondiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe,
părţi deorgane, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o
multitudine de factori şi estevizibilă în momentul în care explantul
creşte.Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care
sedesprinde de pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile
pe un mediuartificial de cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în
funcţie de scopul urmărit.Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai
multe plante - neoplantule), prinstimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi
frunzele) şi a rădăcinii, sau poate formacalus, prin stimularea înmulţirii
nediferenţiate a celulelor.Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule
întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a
regenera una sau mai multe planteidentice cu planta donor.Totipotenţa, este
însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de aforma o plantă
identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în
practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest
caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă
parte gradului mare despecializare al acelor celule.Astfel, s-a demonstrat practic
că, într- plantă matură, celulele specializate careconstituie ţesuturile, de exemplu:
traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la carelipseşte citoplasma şi
nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptulcă întreaga
informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.La
plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi
3
pierdcapacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă,
anumite zone în careactivitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi
formarea aproape continuă de noicelule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni,
poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolămică şi nucleu mare dispus central şi
prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cudenumirea de meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi
grosimea plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini.
1.2 Caracteristicile culturilor in vitro
Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau
porţiunimari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc
explante mici, deordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti),
explante care în condiţiinormale de cultură nu ar reuşi să crească opunând
rezistenţă agenţilor patogeni şisintetizându-şi singure substanţele nutritive
necesare.Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer
respectateurmătoarele condiţii:-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o
bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic
uşor accesibil explantelor;
-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în
limiteleoptime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele
acestora şi scopulurmărit;-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii
organelor prin utilizareacorespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere;-
asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro
, prin dezinfecţiamaterialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură,
precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril,
folosind instrumentar sterilizat prin flambare.
4
1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro
Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitroau răspuns afirmativ,
suntutilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară,
industria uşoară,etc. În agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile
de ţesuturi şi celule suntfolosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone
valoroase, pentru ameliorareaspeciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei
horticole, pentru obţinerea de metaboliţisecundari.Avantajele culturii in vitro sunt
multiple, dintre care amintim:-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri,
hibrizi sau clone valoroase pornindde la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic,
se asigură o multiplicare exponenţială, princare în circa 6 luni se pot obţine 1
milion de plante;-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme,
material mai viguros, precoce şi productiv;-necesită spaţii mici de cultură şi se
valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura peverticală pe 3-5 nivele
suprapuse;-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte
explante de ţesuturigenerative (cu n cromozomi);-dă posibilitatea obţinerii
hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro , hibrizi careîn condiţii normale
sunt imposibil de obţinut;-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;-se
evită efectul sezonier de pepinieră;-se pot obţine seminţe artificiale;-se pot obţine
plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;-asigură multiplicarea
clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normalede cultură;-asigură
păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenziferme de
multiplicare.Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura
in vitro şi care,deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.Există însă şi câteva
impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea înmasă a plantelor, cum
ar fi:-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate
5
indispensabileactivităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare;-necesitatea
unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro
;-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de
producţie;-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care
nu răspundla metodele cunoscute de multiplicare;-există riscul apariţiei şi
multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţiisoiurilor;
creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe
altoiri altoiulîncepe să prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru
propagare prin butăşire.La culturile in vitro , s-au observat fenomene similare la
meristeme. Prima frunzuliţăce se formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă
a meristemului la viţă de vie arecaracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă,
de asemenea, şi la orhidee meristemeledezvoltă, în cultura in vitro , protocorm
identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizareaobservată este deseori obţinută
din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multesubculturi pentru a obţine
aceste efect, în funcţie de specie.Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată
supresiei de informaţii citoplasmaticesau datorită diminuării considerabile a
acestora determinând astfel posibilitatea regenerării denoi celule. Mecanismele
exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplincunoscute. Se pare că
citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nuacţionează
singure.Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci
când plantele donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în
ritmul defuncţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un
echilibru optim culturii in vitro .Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la
plante aflate în stadiul de senescenţă,dar rezultatele sunt în general slabe sau
incomplete.
6
2.Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului
Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se
poatedistinge un stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt
diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele
lemnoase, au eşuat atuncicând s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din
meristeme prelevate de pe ramuri învegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a
pornit de la meristeme prelevate din muguridorminzi.De-a lungul unui ciclu anual,
echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvaraorganele cresc şi analizele
relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor,giberelinelor şi
citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare
sediminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e
surprinzător faptulcă explantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate
ale vegetaţiei, vor darăspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de
mediu.De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în
vederemicropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a
înrădăcina uşor atuncicând sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie, în special
dacă sunt excizate în perioada devegetaţie, când concentraţia de auxină este
maximă.La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro , pentru
realizarearejuvenilizării se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă,
unui tratament cutemperaturi scăzute, unui regim de lumină particular sau unui
tratament cu fitohormoni pentrumodificarea echilibrului lor intern în vederea
stimulării rizogenezei.
2.1.Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor
După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După
tipulde organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în
considerare douăcazuri:
7
Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul
mugurilor,apexurilor caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai
utilizate pentru iniţiereaunei culturi de ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi
ridică cele mai puţine probleme,generând cu uşurinţă, în condiţiile unui mediu de
cultură adecvat, structuri organizate (deexemplu, organe). Dacă mediul de cultură
nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantuluişi conduce la dediferenţierea
celulelor, generând calus.Utilizarea acestui tip de explante este similară unei
microbutăşiri şi este tehnica celmai des folosită atunci când se urmăreşte
micropropagarea pe scară largă a unei specii.Interesant de amintit este faptul că
explantele posedă un fel de memorie a tipului decreştere ce l-au prezentat in vivo ,
acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase.La mai multe plante la
care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite dinramuri laterale
au generat plante cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor planteculcate la
pământ şi nu erecte. Unele cercetări au evidenţiat faptul că această
„memorie”aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.2.Explantele
constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină,frunze, flori
şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completăcu
scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din
noucapacitatea organogenică.Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a
dovedit că toate părţile plantei suntcapabile să urmeze procesul dediferenţierii
conducând spre o nouă organizare structurală. Dar,în acest caz, diferenţele între
specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma,sunt capabile să
regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen,
ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis , la care
rezultatenotabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele specii sunt
total recalcitrante,nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele
amintite, iar la unele conifere s-areuşit obţinerea de propaguli doar din
8
cotiledoane.În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe
specii, dinfragmente de limb foliar şi tulpini tinere.
2.2 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora
Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu
câtexplantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai
determinant şimediul de cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor
de dimensiuni micidirecţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor, deoarece
explantul este receptiv lasubstanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii
de creştere existenţi.Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau
un mugure (solzii protectori sunt înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă
pentru care mediul va favorizacreşterea, sau în cazul diferenţierii axilare, va bloca
creşterea apicală. Pentru meristemele cetrebuie să aibă dimensiuni foarte mici,
există o mărime minimă ce conţine domulmeristematic cu două primordii foliare.
Sub această mărime supravieţuirea explantului estefoarte dificilă şi pierderile sunt
mari, peste această dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun ,
însă în detrimentul eliminării virusurilor.Dimensiunile explantelor variază între 5 şi
10 mm, ceea ce corespunde uneimanipulări uşoare a materialului vegetal, sub
aspectul excizării sau prelevării, fasonării şiinoculării acestora. De exemplu, prin
cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multefragmente de peţiol de
Saintpaulia , de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm
au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri
derezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au format doar rădăcini. Fără
îndoială, în ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol,
pe când în cazulfragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi
fitohormonii endogeni.Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi:
epidermal, cortical, parenchimmedular, dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai
9
regenerativ tip de ţesut este cel epidermal.Ţesuturile corticale şi cambiale prezintă
de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori înstadiul de calus. Parenchimul
medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare
perfectă între regulatorii de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care afolosit
măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine şi
citochinine.Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă
orientarea regenerăriispre stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini),
calusogenic sau reproductiv. Acestexperiment confirmă ipoteza unei activităţi
crescute a fitohormonilor asupra explantelor dedimensiuni reduse.Cel mai mic
explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi
mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce
plante,dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.
2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ
Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro
estemenţinerea viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se
poate observa,după fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor
ce vin în contact directcu mediul de cultură, fenomen datorat oxidării substanţelor
fenolice sintetizate în mediu,oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale.
Mai mult, celulele moarte pot diminua sauanula schimburile dintre explant şi
mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a
explantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin
imersiaexplantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric
în proporţie de0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea acestuia sau prin
adiţia în mediul de cultură aunor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi
cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).Odată
10
rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie denatura
sa, în direcţia dorită de operator.
2.4. Explante cu structură rudimentară
Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.Prima metodă
constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură
afitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga
şicitochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică.După iniţierea pe acest tip de
mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza explantelor. Este de
dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarecedacă acest calus
creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unuidezechilibru
între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După
formareacalusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o rană) se
formează primafrunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc
elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe
acelaşi tip de mediu la unele speciiornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două
medii succesive, la speciile lemnoase. Primulmediu va iniţia creşterea, putând fi
utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu unnod (microbutăşire). Al
doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolilacetic), serveşte
ca mediu de înrădăcinare ( Actinidia , măr, numeroase specii lemnoase).
Cultura plantelor superioare in vitro
Posibilitatea de a cultiva celule izolate şi, mai ales, de a realiza culturi de
protoplaşti, permite unele manipulări genetice (fuziuni celulare, transfer de gene),
imposibil de realizat în alte condiţii.
Practicarea culturii in vitro presupune existenţa unui spaţiu amenajat şi
echipat în acest scop, a unor vase din sticlă sau material plastic, a mediilor de
11
cultură adecvate şi, desigur, a materialului biologic, sub formă de celule, ţesuturi,
organe sau plante. Asepsia (absenţa microorganismelor) este o condiţie sine qua
non a reuşitei fiecărei culturi in vitro. Deoarece mediile nutritive folosite cu
această ocazie le oferă condiţii foarte bune de dezvoltare, bacteriile şi ciupercile
invadează culturile in
vitro într-un timp foarte scurt dacă nu se asigură asepsia spaţiilor de transfer,
vaselor de cultură, mediului, instrumentelor şi materialului biologic adecvat. După
J. Huang (1982), sursele de infecţie pot fi:
- aerul, care conţine o mare cantitate de microorganisme sub formă de spori;
- ţesutul vegetal, la suprafaţa căruia se pot găsi ciuperci şi/sau bacterii;
- corpul uman, care vehiculează pe piele sau prin aerul expirat numeroase
microorganisme.
Sterilizarea se poate realiza prin două tipuri de metode:
- fizice, folosind vapori de apă sub presiune (121°C), aer uscat fierbinte
(180°C) ori iradierea (raze ultraviolete sau gamma) - metode care distrug
microorganismele - sau efectuând filtrarea sub presiune, care elimină
microorganismele al căror diametru depăşeşte 0,22 microni;
- chimice, care constau în tratamente cu compuşi sterilizanţi, cum sunt
hipocloritul de sodiu sau calciu, alcoolul, clorura mercurică, diversele produse
bactericide şi fungicide.
Pentru funcţionarea eficientă a unui laborator de culturi in vitro, este nevoie
de spaţii repartizate, amenajate şi echipate corespunzător pentru executarea
următoarelor activităţi:
12
►prepararea mediilor de cultură;
►pregătirea, prin spălare şi sterilizare, a sticlăriei necesare pentru prepararea
mediilor şi realizarea culturilor;
►depozitarea sticlăriei, substanţelor chimice, mediilor nutritive,
etc.;
►iniţierea şi transferul culturilor;
► incubarea culturilor, în condiţii de temperatură controlată (17- 27°C) şi
fotoperioadă.
Dotarea minimă a unui asemenea laborator include:
- lupe binoculare;
- microscoape inversate;
- balanţe de precizie (0,01 g) şi analitice (0,0001 g);
- pH-metru;
- autoclave;
- maşini de spălat sticlăria;
- etuve pentru sterilizat sticlăria;
- dulapuri climatizate;
- mese cu flux de aer laminar, orizontal sau vertical;
- frigidere, congelatoare;
- aparate pentru distilat şi demineralizat apa.
13
Cultura in vitro poate fi practicată în vase de sticlă sau din material plastic de
forme şi mărimi diferite. Vasele din sticlă utilizabile atât pentru prepararea
mediilor cât şi pentru cultură sunt cele existente în cele mai multe laboratoare:
baloane Erlenmayer, pahare Berzelius, pipete, cilindrii gradaţi, baloane cotate,
vase Petri. Vasele de cultură din sticlă nu trebuie să elibereze cationi toxici. Din
această cauză, se recomandă folosirea celor confecţionate din sticlă Pyrex sau
borosilicat (Badea, E„ 2001).
Deşi scumpe, vasele de cultură din material plastic au început să
înlocuiască vasele de sticlă, deoarece prezintă numeroase avantaje. Calitatea
materialului face posibilă atât confecţionarea unor recipiente foarte variate ca
formă şi dimensiuni, absolut adaptate cerinţelor, cât şi sterilizarea acestora la
121°C. în laboratoarele comerciale, se recurge însă şi la borcane din sticlă
obişnuită, folosite în mod curent pentru ambalarea alimentelor.
Pregătirea sticlăriei ocupă un loc important în activitatea unui laborator de
cultură in vitro. Din această cauză, spaţiul destinat spălării şi sterilizării trebuie
echipat corespunzător, cu surse de apă deionozată, distilată şi bidistilată, ca şi cu
14
Figura 12. Vase de cultură şi sticlărie de laborator
diferite tipuri de etuve. Sticlăria uscată se sterilizează prin expunerea la aer
fierbinte (180°C), timp de 2-3 ore, în etuve. O serie de alte materiale (filtre, apă
distilată, capace din material plastic, dopuri din bumbac sau tifon) se sterilizează
prin autoclavare (cu vapori de apă sub presiune), timp de 15-20 de minute, la
121°C (Badea, E., 2001).-
2.4.1. Medii de cultură in vitro
Un mediu de cultură in vitro are o componentă anorganică, constituită din săruri
minerale şi o componentă organică, ce include carbo- hidraţi, vitamine şi substanţe
reglatoare ala creşterii. Mediile folosite pentru culturi statice conţin şi un agent
gelifiant, care de obicei, este agarul. Apa folosită pentru prepararea mediilor
trebuie să fie purificată, deionizată, distilată, filtrată. Diferiţi cercetători au studiat
cerinţele de elemente minerale ale ţesuturilor cultivate şi au elaborat medii cu
compoziţii bine definite care le poartă numele: White, Murashige şi Skoog,
Gamborg, Schenck şi Hildenbrandt, Nitsch, etc.
Componenta anorganică a mediilor de cultură in vitro include elementele
esenţiale pentru creşterea plantelor, la care se adaugă uneori, aluminiul şi nichelul.
în funcţie de cantităţile care se găsesc în diferitele formule de mediu, acestea se
împart în:
- macroelemente (N, P, K, S, Mg, Ca)
- microelemente (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo, Al, I, Fe).
Toate elementele sunt incluse în mediu sub formă de săruri, alese îndeosebi
după criteriul solubilităţii.
Componenta organică. Celulele şi ţesuturile cultivate in vitro nu sunt
autotrofe, adică nu sunt capabile să sintetizeze carbohidraţi prin asimilarea CO2 în
15
timpul fotosintezei. Din această cauză, în mediile în care sunt cultivate trebuie
introdusă zaharoză, într-o concentraţie de 2- 3%. In culturile de celule sau de
ţesuturi in vitro, absenţa sau insuficienţa unor vitamine constituie tot atâţia factori
limitativi ai creşterii, drept pentru care în mediile de cultură se adaugă în mod
curent tiamină (B1) - 0,1-10,0 mg/l, acid nicotinic (PP) - 0,1-5,0 mg/l, piridoxină
(B6) - 0,1-1,0 mg/l. Se mai utilizează biotina (H), cholina, acidul folie (M), acidul
pantotenic, riboflavina (B2) şi, frecvent, m-inositolul. Dintre cele cinci clase de
reglatori de creştere (fitohormoni sau hormoni vegetali) existenţi în plante, numai
două - auxinele şi citochininele - se folosesc în mod frecvent. Mult mai rar se
recurge la gibereline şi extrem de rar la acidul abscisic (Schrott, M., 1995).
Fitohormonii orientează procesele de dezvoltare in vitro. De exemplu, tipul
de morfogeneză dintr-o cultură depinde de concentraţiile auxinelor şi
citochininelor şi de raportul dintre aceste categorii de hormoni. Mai precis, o
valoare mare a raportului auxină/citochinină favorizează rizogeneza, embriogeneza
şi calusogeneza, iar o valoare mică - proliferarea mugurilor axilari şi
organogeneza, directă sau indirectă. Au fost semnalate însă şi cazuri în care
răspunsurile culturilor in vitro la apprtul de fitohormoni în mediu nu au fost cele
aşteptate. De exemplu, s-a constatat că, la unele specii lăstărirea axilară este
favorizată de prezenţa auxinei în cantităţi ce depăşesc nivelul citochininei,
formarea căluşului fiind indusă numai de auxine (Gegenbach, B., 1975).
Auxinele - AIA, AIB (acidul indolil butiric), ANA (acidul naftil acetic) sau
2,4-D (acidul 2,4 diclorofenoxiacetic) - sunt folosite în concentraţii de 0,01-10,0
mg/l. Citochininele - kinetina, BAP (benzii aminopurina), 2IP (2 izopentenil
adenina) şi zeatina - sunt adiţionate în mediu în cantităţi ce oscilează între 1 şi 10
mg/l. Giberelinele nu sunt esenţiale pentru cultura plantelor in vitro. In general, ele
induc alungirea intemodurilor şi creşterea meristemelor. De asemenea, se folosesc
16
frecvent pentru germinarea embrionilor, deoarece induc ieşirea din latenţă.
Tabelul 4
Compoziţia celor mai importante medii folosite pentru cultura in vitro
Compoziţia MS Nitsch Bs
Gamborg
Schenk şi
HildebranSăruri minerale
KNO3 1900 950 2500 2500NH4NO3 1650 720 - -(NH4)? - - 134 -
CaCI?.2H70 440 220 150 200NH4H2PO4 - - - 300MgS04.H20 370 185 250 400
Na - 150 - -kh,po4 170 68 - -
FeS04.7H20 27,8 27,8 27,8 15Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 20
MnS04.4H?0 22,3 25 13,2 13,2H3BO3 6,2 10 3 5
ZnS04.7H20 8,6 10 2 1Kl 0,83 - 0,75 1
Na? 0,25 0,25 0,25 0,1CUS04.5H20 0,025 0,025 0,025 0,2CaCI2.6H20 0,025 - 0,025 0,1Vitaminem-lnositol 100 100 100 100Thiamina 0,1 0,5 100 5Piridoxina 0,5 0,5 10 0,5
Acid 0,5 5 10 5Biotina - 0,05 - -
Acid folie - 0,5 - -Glicina 2 2 - -
Zaharoză 30000 20000 30000 30000
De obicei, tipul de cultură şi implicit de explant, determină tipurile şi
concentraţiile hormonilor ce vor fi folosiţi. De exemplu, explantele care
sintetizează auxina nu mai necesită adiţionarea în mediu a acestui hormon pentru
alungirea şi/sau diviziunea celulelor (Wess, L., 2000).
Din acest punct de vedere, pot exista următoarele tipuri de culturi:
17
- culturi care nu necesită nici un hormon;
- culturi care au nevoie numai de auxine;
- culturi care au nevoie numai de citochinine;
-culturi care au nevoie atât de auxine, cât şi de citochinine.
Celulele cultivate sunt capabile să sintetizeze toţi aminoacizii necesari. Totuşi,
includerea unor aminoacizi în mediul de cultură, separat sau în amestecuri, poate
favoriza creşterea, deoarece constituie o sursă de azot mai accesibilă celulelor
decât aportul de azot anorganic. Creşterea in vitro poate fi stimulată şi prin
adăugarea în mediul de cultură a unor extracte organice, hidrolizate proteice,
endosperm lichid din nuci de cocos, extracte de drojdii, de cartof şi tomate, etc.
Marea lor variabi- litate, de la o sursă la alta, limitează însă folosirea acestor
extracte la cazurile în care nu au fost obţinute rezultate pozitive cu medii definite
chimic.
Agarul - un polizaharid extras din algele genului Gelidium - este cel mai
folosit agent de gelificare a mediilor de cultură, deoarece se dizolvă în apă la 90°C,
iar prin răcire sub 40°C formează un gel transparent, mai mult sau mai puţin solid,
în funcţie de concentraţie, puritate, marcă şi pH. Soluţia de agar poate fi turnată,
pipetată, dar odată gelifi- cată, trebuie reîncălzită (la microunde sau în bain-marie),
pentru a se li- chefia din nou. Concentraţia agarului în mediile de cultură in vitro
este de 5-10 g/l.
Prepararea mediului de cultură necesită sticlărie curată, apă de calitate
corespunzătoare, substanţe chimice pure şi o atentă dozare a tuturor
componentelor. Este o etapă esenţială, erorile de preparare a mediului de cultură
fiind printre cauzele majore ale eşecurilor.
18
Mediile de cultură se pot prepara astfel:
- din amestecuri de săruri, sub formă de pudră, preambalate (producători:
K.C. Biological Inc. şi Gibco Inc. din S.U.A., Flow Laboratory, din Scoţia);
- din soluţii stoc, de zece sau de o sută de ori mai concentrate (în funcţie de
solubilitatea substanţei şi de concentraţia finală în mediul de cultură), păstrate în
frigider, la 4-5°C;
- cântărind, una câte una şi dizolvând sărurile prevăzute în reţeta tipului de
mediu dorit.
înainte de .sterilizare, după adăugarea zaharozei şi a hormonilor
termostabili, se ajustează valoarea pH la cote cuprinse între 5,0 şi 6,5. Sterilizarea
componentelor termostabile se face prin autoclavare, iar cea a componentelor
termolabile, prin filtrare sub presiune pozitivă. Mediile şi apa distilată pot fi
autoclavate la 121°C şi un timp variabil în funcţie de volum: 20 de minute pentru
volume de 20-50 ml, 25 de minute în cazul volumelor de 250-500 ml şi 35 de
minute pentru volume de 500-5000 ml. Presiunea nu trebuie să depăşească 1
atmosferă, pentru a nu favoriza descompunerea zaharozei sau a altor componente.
Prin filtrare, se sterilizează vitaminele, aminoacizii, extractele vegetale, enzimele,
unii hormoni (AIA, GA3), antibioticele. Se pot utiliza filtre de unică folosinţă,
ataşate la o seringă ce conţine lichidul. Pentru volume mai mari, se pot folosi filtre
la care se adaugă membrane filtrante standard existente pe piaţă. în asemenea
cazuri, filtrul se ataşează la un vas colector. Unitatea filtrantă se sterilizează prin
autoclavare. Soluţia sterilizată se adaugă în mediul de cultură care a fost autoclavat
şi răcit (la 45-50°C), cu o pipetă sterilă. Volumul de lichid trebuie să conţină
cantităţile prevăzute de reţeta pentru soluţia finală.
Tabelul 5
19
Tratamente aplicate pentru sterilizare_
Orga Pretratamente Tratamente PosttratameSemin
ţe
imersia în alcool (70%)
timp de 10-20 de
secunde
Imersia în
soluţie de
Ca(CIO)2
Trei spălări
cu apă
distilată Fruct
e,
Spălarea cu vată
îmbibată în alcool
(70%)
Imersia în
soluţie de
NaClO (2%),
m ti m
Tulpi
na
Spălarea cu apă
curentă; ştergerea cu
vată îmbibată în alcool
Imersia în
soluţie de
NaClO (2%),
m jj “
Organe
de re-
zervă
Spălarea timp
îndelungat cu apă
curentă
Imersia în
soluţie de
NaClO (2%),
“ w "
Frunz
e
Ştergerea fetei
superioare cu alcool
Imersia în
soluţie de
Şase spălări
cu apă
Pregătirea materialului vegetal presupune eliminarea bacteriilor, ciupercilor
şi altor microorganisme, toate acestea necesitând o sterilizare de suprafaţă
completă, fără a afecta însă integritatea materialului vegetal. în general, materialul
vegetal provenit din câmp este extrem de greu de sterilizat. Din această cauză, se
recurge frecvent la obţinerea lui în laborator, asigurându-se un mediu aseptic încă
din faza de germinare.
Un protocol standard de sterilizare include următoarele etape:
- spălarea cu apă curentă;
- imersia într-o soluţie sterilizantă (hipoclorit de sodiu sau de calciu);
- spălarea cu apă distilată sterilă.
De obicei, contaminările devin vizibile după 7-10 zile. Există însă
contaminanţi interni care nu se manifestă timp de mai multe subcultivări. Timpul
20
de sterilizare şi concentraţia soluţiei sterilizante se aleg pentru fiecare material
experimental în parte. Sterilizarea materialului vegetal se face în hote cu flux
laminar. Tot aici, se repartizează şi mediul în spaţiile de cultură (dacă nu a fost
repartizat înainte de sterilizare).
Iniţierea unei culturi in vitro presupune: confecţionarea explantelor din
material vegetal sterilizat, folosind instrumente sterile; trecerea explantelor în
vasele de cultură prin inocularea la suprafaţa mediului şi transferarea în dulapurile
sau camerele climatizate. La intervale regulate de timp se fac subcultivări, adică se
transferă căluşurile, lăstarii, embrionii, etc. pe medii proaspete (Badea, E., 2001).
Tabelul 6
Tipuri de culturi in vitro____________
Tipul de cultură ScopulCultura de embrioni Scurtarea ciclului de ameliorare
Prevenirea avortării embrionilor
Depăşirea incompatibilităţii Cultura de
meristeme
Eliminarea patogenilor (virusuri,
bacterii, ciuperci) Clonarea plantelor
Conservarea germoplasmei Stocarea Cultura de apexuri
şi noduri
Lăstărirea axilară pentru donare
CrioprezervareaCultura explantelor
fără muguri
Clonarea prin formarea organelor
adventive Izolarea mutantelor Cultura de
calus/celule în
suspensie
Clonarea planielor prin formarea
mugurilor sau embrionilor
Cultura de antere şi
mi- crospori
Producerea haploizilor şi liniilor
homozigotice Producerea plantelor Cultura de ovule şi
flori excizate
Depăşirea incompatibilităţii pre şi
postzigotice Prevenirea absciziei Cultura de
protoplaşti
Hibridarea somatică şi crearea
cibrizilor Transferul de gene şi crearea 21
Cultura de
protoplaşti, celule,
ţesuturi şi organe
Studii de frtopatologie: pătrunderea şi
replicarea virusurilor; interacţiunea
gazdă-parazit, etc.
în funcţie de gradul de organizare, culturile in vitro pot fi:
- organizate (plante întregi, embrioni, organe), realizate mai ales în scopul
micropropagării;
- neorganizate (căluşuri, suspensii), realizate mai ales pentru selecţia
mutantelor, izolarea protoplaştilor, etc.;
- neorganizate/organizate, care permit parcurgerea etapelor:
explant -> calus/suspensie —► embrioni/muguri -> plante.
Cu alte cuvinte, acest tip de culturi fac posibile dediferenţierea şi
rediferenţierea.
Tipurile de culturi in vitro mai pot fi clasificate şi în funcţie de natura
materialului vegetal în:
- culturi de plante (obţinute prin germinarea seminţelor, embrionilor sau prin
înrădăcinarea lăstarilor);
- culturi de embrioni;
- culturi de organe (apexuri, rădăcini, antere, etc.);
- culturi de explante (porţiuni de organe, ţesuturi, etc.);
22
- culturi de calus (în care ţesuturile diferenţiate dediferenţiază şi produc o
masă de celule numită calus);
- culturi de celule în suspensie (căluşuri sau explante de diferite origini,
cultivate în mediu lichid, agitat, care generează o masă de celule izolate şi de
agregate celulare mici);
- culturi de protoplaşti (celule lipsite de peretele celular).
2.5. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro
Celulele plantelor posedă două caracteristici pe care se bazează
biotehnologiile, cu toate aplicaţiile lor:
- pot fi cultivate in vitro, pe medii sintetice;
- pot regenera organisme complete, capabile să se reproducă. Această a doua
caracteristică, numită totipotenţă, este proprie numai plantelor superioare, ceea ce
demonstrează că programul de diferenţiere este flexibil, orice celulă diferenţiată
putând deveni, în anumite condiţii, totipotentă.
Cultura in vitro este un ansamblu de tehnici care presupune folosirea unor
elemente de asepsie şi realizarea unui mediu perfect controlat. Pe un mediu
nutritiv sintetic, se pot cultiva plante întregi, organe, fragmente de organe, ţesuturi
şi bineînţeles, celule izolate şi protoplaşti. Materialul vegetal folosit pentru
iniţierea culturilor in vitro poartă numele de explant. Atunci când se realizează
culturi de fragmente de organe sau culturi de celule pe medii adecvate, în condiţii
controlate de lumină, temperatură şi umiditate, prin acţiunea componentei
hormonale a mediului se induce dediferenţierea celulelor diferenţiate, care încep
apoi să se dividă. Organul îşi pierde treptat structura, în decursul a 3-4 săptămâni.
23
Bibliografie
1. www.referat.ro
2. www.agbioview.org
3. www.bioresurse.ro
4. Bonciu Elena, Iancu Paula 2011 - Noţiuni de bioinginerie şi biotehnologii. Strategii
şi aplicaţii, Editura Sitech
5. Popa,L. 1988 – Ingineria Genetică Editura. ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti
24