INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURI VEGETALESfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiei n viaa omului, n toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au fcut progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plante i rase de animale cu nsuiri favorabile i cu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat. Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumtate de secol s-a fcut, n principal, pe organisme simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organisme unicelulare. Odat cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dac noiunile acumulate anterior erau valabile i dac existau i alte procese specifice modului complex de organizare. Cunoscndu-se comportamentul organismelor simple, cercettorii au nceput s se gndeasc la cultura pe medii artificiale a unor poriuni de plante sau chiar celule. Problema care a aprut a fost aceea a meninerii viabilitii acestor celule, de la prelevarea de pe planta mam pn la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe pn la regenerarea (refacerea) unei noi plante. Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aa de simpl cum s-a presupus fiind necesar mult timp i multe cercetri, la nceput fr succes, dar apoi totul s-a clarificat. n 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeaz substanele ce determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar, iar primele ncercri de culturi de esuturi au fost fcute n 1902, de ctre Haberland, din nefericire, fr rezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule i esuturi ncep s apar din anul 1922, cnd Knudson reuete germinarea seminelor de orhidee in vitro iar Robbins obine prima cultur de esut de rdcin n condiii artificiale. Pe baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conine informaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, n anul 1952 Morel i Martin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a explantelor meristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestora plante sntoase, libere de viroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze. n acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rat de multiplicare ntr-un ritm imposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiionale de nmulire vegetativ, evitnduse i degenerarea soiurilor din cauza infeciilor virale, transmisibile prin nmulire vegetativ. n anul 1962, dup muli ani de studii i ncercri, Murashige i Skoog, au reuit s elaboreze un mediu de cultur considerat ca fiind de baz , care cu mici modificri poate fi utilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de esuturi. Reuita experienelor lui Coking n 1960 privind izolarea enzimatic a protoplatilor din mezofil foliar, a fcut posibil obinerea unor populaii mari de protoplati iar apoi producerea de hibrizi somatici. Anul 1966 este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind cultura de explante vegetale in vitro. Aceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea de tehnici eficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu ajutorul protoplatilor, odat cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmitori de gene izolate) s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresani cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc. Att pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite n special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetic.

CAPITOLUL I 1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE I APLICABILITATE1.1.1 Definiie n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii de asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturi sau celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n momentul n care explantul crete. Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care se desprinde de pe planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur. Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit. Acesta poate evolua formnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltrii organelor aeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmulirii nedifereniate a celulelor. Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma o plant identic cu planta mam. Teoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i exprima acest caracter, datorit pe de o parte diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare de specializare al acelor celule. Astfel, s-a demonstrat practic c, ntr-o plant matur, celulele specializate care constituie esuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipsete citoplasma i nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul c ntreaga informaie genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i pierd capacitatea de totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. Rmn, ns, anumite zone n care activitatea celulelor este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noi celule. Aceste celule sunt mici n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuol mic i nucleu mare dispus central i prezint o membran celulozic, formnd esutul cu denumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosime a plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini. 1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari de plant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiii normale de cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni i sintetizndu-i singure substanele nutritive necesare. Din acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectate urmtoarele condiii: -prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil explantelor;

-asigurarea i controlarea factorilor de mediu (temperatur, lumin, umiditate) n limitele optime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopul urmrit; -stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizarea corespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere; -asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecia materialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturor operaiilor n hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare. 1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro Datorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au rspuns afirmativ, sunt utilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar, etc. n agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii secundari. Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim: -asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantiti mici de material vegetal. Teoretic, se asigur o multiplicare exponenial, prin care n circa 6 luni se pot obine 1 milion de plante; -se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros, precoce i productiv; -necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pe vertical pe 3-5 nivele suprapuse; -obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de esuturi generative (cu n cromozomi); -d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care n condiii normale sunt imposibil de obinut; -selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori; -se evit efectul sezonier de pepinier; -se pot obine semine artificiale; -se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire; -asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale de cultur; -asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi ferme de multiplicare. Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care, deocamdat rmn s fie nmulite tradiional. Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n mas a plantelor, cum ar fi: -necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate indispensabile activitilor de micropropagare, care sunt costisitoare; -necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro; -utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de producie; -nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la metodele cunoscute de multiplicare; -exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii soiurilor;

-riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri care se comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru unele specii.

1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE EXPLANTELOR CULTIVATE IN VITRO

LA

NIVELUL

Explantele inoculate pe medii aseptice i vor relua activitatea metabolic, se vor integra noilor condiii de via, i vor reamorsa procesele fiziologice vitale i vor ncepe un nou ciclu de via. n dependen de mediul de cultur, de natura inoculilor, de seria de operaiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculri, de condiiile de cultur i de scopul urmrit, dup dediferenierea celulelor i regenerarea de noi celule, evoluia acestora poate fi dirijat. Inoculii pot fi meninui ntr-o stare primar de organizare cum ar fi: culturi de celule n suspensie (fr a intervenii formarea de agregate celulare) sau de calus, ori pot fi induse procese de citodifereniere, de morfogenez sau organogenez. 1.2.1 Diferenierea Celulele meristematice, divizndu-se continuu, dau natere la noi i noi celule care, treptat, cresc i sufer o specializare morfofiziologic ce poart numele de difereniere. n procesul de difereniere se pierd caracterele citologice i fiziologice de tip embrionar specifice celulelor meristematice, evolundu-se spre caliti proprii specializrii funcionale a diferitelor tipuri de esuturi sau organe n alctuirea crora celulele mature vor intra. n primele faze de difereniere se remarc o modificare ultrastructural i funcional a celulelor, fenomen denumit citodifereniere. Pe msura diferenierii, volumul celulei crete, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma devine pelicular i parietal, se extinde vacuomul care mpinge citoplasma i nucleul la periferia celulei. Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, n funcie de rolul ndeplinit de celule. Odat cu avansarea proceselor de difereniere peretele celular poate suferi modificri secundare de genul depunerilor de celuloz, lignin, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care conduc treptat la o ngreunare a comunicrii intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim). Celulele odat difereniate nu se mai divid. Celulele care compun un esut sau organ nu posed acelai ritm de cretere i se afl sub un permanent endocontrol fitohormonal. Substanele elaborate de celule pot difuza nspre celulele nvecinate exercitnd un anumit rol n dezvoltarea acestora fenomen denumit inducie, i care st la baza interrelaiilor dintre esuturi, ce servesc la organizarea acestora n formaiuni funcionale, respectiv la organogenez. Dup difereniere i generarea de noi celule se ajunge la situaia n care celulele neoformate tind s se reorganizeze structural i funcional suferind o citodifereiere, histodifereniere, cu organizarea de esuturi (histogenez), de organe (organogenez) i n final regenerarea unei noi plante. Diferenierea celular in vitro nu este foarte variat, unele funcii sunt reduse sau simplificate n timp ce altele sunt amplificate. 1.2.2 Dediferenierea celular Dediferenierea const n transformarea progresiv a celulelor din starea de celul specializat n celul meristematic, rectignd aptitudinea de a se divide.

Dediferenierea natural a celulelor poate fi observat n organele care se ramific sau n cazul traumatizrii organelor i al generrii, la locul rnirii, de calus. Procesul de dedifereniere este complex i se instaleaz n momentul n care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce declaneaz transformri la nivel molecular. n cadrul unui esut nu toate celulele dedifereniaz, puine celule devin centrii generatori de noi i noi celule suficiente pentru a asigura ndeplinirea fenomenelor de restituie. n caz de traumatism organele din esuturile lezate beneficiaz de acumularea unor substane cu rol esenial n inducerea i stimularea proceselor de dedifereniere. Deci, fitohormonii, condiiile de cultur, natura esuturilor implicate, starea lor fiziologic i vrsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin n procesele de regenerare. Aptitudinea celulelor de a se dediferenia este foarte inegal rspndit n corpul plantelor i chiar i n cadrul subunitilor structurale, morfofuncionale, care alctuiesc un organism, existnd diferene mari n ceea ce privete capacitatea de a se dediferenia, la celule aparinnd aceluiai organ sau chiar esut. Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea s-i reorganizeze un mod de via, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural i funcional n celule meristematice, apte de multiplicare. Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenia este foarte inegal rspndit la specii, organe i esuturi variate. Fazele de dedifereniere celular pot fi caracterizate astfel: 1.prima faza de dedifereniere: -amorsarea proceselor de dedifereniere; -producerea dediferenierii celulelor pn la dobndirea caracteristicilor citologice specifice unui esut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemntoare ca aspect i structur cu cambiul. 2.a doua faz de dedifereniere: - dediferenierea n continuare a celulelor pn la stadiul de celule cu caracter de meristem primar; -generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre organogene), ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante; -generarea, prin proliferarea celulelor dedifereniate, a unui calus neorganizat, structurat omogen. La nivelul acestui esut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni. 1.2.3 Regenerarea Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-i reface oricare parte le-a fost distrus. Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, esuturilor sau celulelor vegetale se exploateaz la maxim capacitatea regenerativ a celulelor explantelor, respectiv se pune n valoare manifestarea integral a totipotenialitii celulare. Teoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt totipotente. Din celule somatice sau obinut plante diploide, iar din celule generative, prin androgenez i ginogenez, sau regenerat plante haploide. Ca i n cazul dediferenierii celulare, se poate spune c i n regenerare exist o mare variabilitate n ceea ce privete reactivitatea celular, capacitatea regenerativ este manifestat sau nu de ctre o celul vegetal sau de un grup de celule n funcie de numeroi factori endogeni i exogeni. Factorii endogeni ce joac un rol esenial n regenerare sunt: vrsta celulelor, gradul de difereniere, capacitatea de a se dediferenia, coninutul n hormoni, natura balanei hormonale i echipamentul enzimatic. Factorii exogeni implicai n regenerare

sunt:traumele i natura acestora (stresul datorat introducerii unui explant n cultura in vitro), precum i condiiile de mediu. Totipotena este deinut de ctre fiecare celul a plantelor dar exprimarea sa aparine numai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente morfogenetic n a rspunde la variai stimuli i care, n condiii specifice, pot da natere la tulpini, rdcini sau embrioni. Numrul celulelor dintr-o populaie cultivat in vitro care-i exprim potenialul organogen sau embriogen se afl sub controlul mai multor factori. Specia. Exist specii la care regenerarea are loc n special prin organogenez i specii care regenereaz prin embriogenez, dar i specii care pot regenera att lstari ct i embrioni in vitro. Genotipul. S-a constatat c nu toate soiurile aparinnd unei specii cultivate au potenial regenerativ. Astfel, s-au evideniat genotipuri culturabile, ce au permis o regenerare uoar din orice tip de esut, dar i genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a fcut cu mare dificultate i cu rezultate slabe. Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante genereaz calus regenerativ. La altele ns obinerea plantelor in vitro este condiionat de utilizarea anumitor explante, de exemplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenele foarte tinere i microsporii genereaz calusuri regenerative. Vrsta explantelor. Calusurile iniiate din esuturi tinere regenereaz mult mai bine dect cele provenite din explante mature. n embriogeneza somatic direct, exprimarea totipotenei depinde de stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurg embriogeneza direct celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei i sinergidele. Ali factori care influeneaz regenerarea sunt: starea fiziologic a plantei donor, compoziia mediului de cultur, vrsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea i calitatea luminii, stresul (biotic sau abiotic). 1.2.4 Morfogeneza in vitro ntruct la culturile in vitro morfogeneza prezint aspecte particulare, specifice acestui tip de cultur, vom adopta termenul de morfogenez n sens larg iar n acest context, vom descrie procesele de morfogenez sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza i embriogeneza. Bibliografia existent pn n prezent subliniaz dependena capacitii morfogenetice de natura explantelor; pe de alt parte sunt numeroase referiri bibliografice care evideniaz relaia care exist ntre genotip i competena morfogenetic a explantelor cultivate in vitro. Vasil (1984) a considerat ca factor decisiv n meninerea capacitii morfogenetice, starea fiziologic i de dezvoltare a explantului. Deci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiioneaz regenerarea i reacia explantului , altfel spus un rspuns morfogenetic corespunztor a fost obinut numai atunci cnd explantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai avansate n dezvoltare, fa de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen. Morfogeneza la culturile in vitro este influenat, n mare msur de anumii factori: -coninutul endogen n fitohormoni i aportul exogen de regulatori de cretere; -srurile minerale prezente n mediul de cultur (mai ales natura sursei de azot); -natura i concentraia glucidului din mediul de cultur; -prezena n substrat a unor compui organici, n special al unor aminoacizi; -prezena, natura i concentraia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate n mediu sau existente n atmosfera din recipientele de cultur;

-prezena n substrat a unor extracte complexe, de origine biologic, sau a crbunelui activ; -factorii fizici (lumina, temperatura). Deci lumina, temperatura, potenialul osmotic al mediului, starea fizic a acestuia, tipul vaselor de cultur sunt factori care pot influena n sens negativ morfogeneza. Nu se cunoate nc dac morfogeneza este influenat i n ce msur, de substanele introduse iniial n mediul de cultur sau de ctre complexul ionic, format n substrat, ca o consecin a autoclavrii, sau n ce msur schimbrile intervenite n compoziia mediului, sub aciunea inoculilor, afecteaz morfogeneza. 1.2.4.1 Organogeneza in vitro Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie ntreag de fenomene biologice, aflate n antecedena momentului explantrii esuturilor. Pn n momentul explantrii esuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, mpreun cu sistemul crora le aparineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte n care diferitele cerine fiziologice au fost satisfcute, mai mult sau mai puin. Dintre aceste cerine amintim raportul endogen n fitohormoni i coninutul endocelular n nutrieni, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de aprovizionarea cu sruri minerale. De modul n care au fost asigurate aceste cerine, prealabile explantrii, vor depinde, n mare msur, reacia explantelor, capacitatea regenerativ i mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivai din acestea. Aspectele menionate au fost foarte clar relevate, mai ales n cazul studiilor de embriogenez somatic i de nrdcinare a tulpinilor recalcitrante n a genera rdcini adventive. De exemplu, pentru inducerea nrdcinrii tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurt durat, a lor cu soluie nutritiv, coninnd 100 mg/l AIB. Cu toate acestea, nici o tulpin nu a nrdcinat dac tulpinile au fost pstrate, pe o durat lung de timp, n acest mediu; rdcinie s-au difereniat i au crescut numai dup ce explantele caulinare au fost scoase i reinoculate pe un alt mediu, lipsit de auxin (Teixeira, 1981). Din cele prezentate, s-a putut reine faptul c factorul endogen este dominant n obinerea unei anumite reacii i c pe lng operarea unei modificri n condiiile de incubare ale inoculilor, alegerea explantului constituie factorul determinant n evoluia acestora in vitro, n procesele de morfogenez. A.Rizogeneza in vitro Un anumit fragment explantat se comport, n linii mari, ca un minibuta. El difer de un buta normal, ntruct cel clasic deine bogate rezerve endogene, are muguri i eventual frunze. Mugurii i frunzele pot i dup desprinderea fragmentului de planta mam s sintetizeze anumii compui hormonali. Explantul ns, din cauza dimensiunilor sale reduse i a detarii sale, nu mai beneficiaz de susineri pe care s le primeasc de la muguri sau de la frunze i rmne n totalitate dependent de mediul de cultur. n acest caz factorul genetic, mrimea explantului vrsta plantei mam, starea fiziologic a celulelor pe care le deine, sunt tot atia factori care concur la evoluia ulterioar a inoculului. Uneori, ns, in vitro, se produce o pierdere a capacitii rizogene, mai ales ca urmare a practicrii unor repicri (subculturi) succesive. Se pune problema pstrrii sau a redobndirii capacitii rizogene. Factorii care condiioneaz meninerea acesteia i mai ales, cei care cauzeaz pierderea aptitudinii rizogene sunt n mic msur cunoscui.

Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slab sau n urma unei perioade scurte de aciune (600 luci mai puin de o or/zi). Temperatura optim pentru rizogenez este aceea de 26 oC. Uneori, ns, se recomand practicarea unei alternane ntre o temperatur sczut (5-15 oC) i ridicat, n prezena luminii, a auxinei i a unui mediu bogat n glucide. n cele mai multe cazuri, formarea rdcinilor este localizat polar. Rdcinile se formeaz la polul radicular al explantului, n timp ce generarea mugurilor este localizat la polul foliar. Aportul de auxin, n concentraie ridicat, poate perturba polaritatea. n concentraii optime auxina stimuleaz rizogeneza. B.Caulogeneza in vitro Formarea de mugurai in vitro, denumit i caulogenez, respectiv formarea de centri vegetativi, este esenial atunci cnd se urmrete, de exemplu, multiplicarea sau reconstituirea unei noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatic. Inducerea caulogenezei, a formrii de mugurai i tulpinie, la nivelul inoculilor cultivai in vitro, este stimulat de prezena n mediul de cultur a citochininelor, adeseori, n condiiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie menionat i faptul ca formarea de mugurai la nivelul calusului se afl sub controlul interaciunii celor dou categorii de fitohormoni. Reuita formrii mugurailor presupune nu doar prezena celor dou tipuri de fitohormoni, ci i a realizrii unui anumit raport al crui eficien este variabil n funcie de specie, de proveniena i natura inoculului. Se poate spune deci, c nu este important doar raportul fitohormonal, ci i natura i concentraia compuilor utilizai ca regulatori de cretere. Uneori, se poate declana caulogeneza reducnd concentraia de auxin. Alteori, cel mai mare numr de mugurai este atins atunci cnd se folosesc concentraii relativ ridicate de citochinin. Dar nu exist reguli general valabile. Adeseori fiecare experien reprezint un caz aparte, iar reacia explantelor, la balana hormonal din substrat, variaz mult, n dependen de tipul materialului vegetal. La calus, n inducerea caulogenezei, se obin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea succesiv a acestuia, ntr-o prim etap, pe un mediu fie cu o concentraie foarte ridicat de 2,4D, fie n prezena unei auxine mai slabe ca eficien, dar administrat n concentraie mare, asociat eventual cu o citochinin, n concentraie moderat. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport sczut n auxin i cu un coninut ridicat n citochinin, ar putea conduce cu succes la declanarea procesului de nmugurire. Factorii externi (lumina, temperatura, calitile fizice ale mediului) sunt controversai n ceea ce privete efectele lor asupra caulogenezei. Aciunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor i de etapele parcurse anterior. Cu toate c numeroase specii necesit o anumit fotoperioad pentru inducie floral, n general se apreciaz c formarea de mugurai este independent de fotoperioad. Temperatura recomandabil pentru desfurarea optim a proceselor de caulogenez este aceea de 25 oC. Folosirea alternativ a mediilor lichide i a celor solide poate exercita un efect benefic asupra producerii proceselor de morfogenez. Astfel, la orhidee, se cunoate c meninerea protocormilor n stare submers favorizeaz multiplicarea acestora, dar este inhibat organogeneza. Trecerea protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declaneaz organogeneza. Dac dup o perioad de meninere a protocormilor pe mediu agarizat (cteva sptmni) se submerseaz protocormii, prin acoperirea lor cu soluie nutritiv diluat, sau cu ap distilat steril, se reuete o stimulare a proceselor de organogenez (Cachi, 1983). La monocotiledonate capacitatea caulogen este mai moderat. Aptitudinea cerealelor de a forma muguri in vitro este foarte variabil. Adeseori aceast capacitate, la nivelul

calusului, se pierde n timp, pe msura practicrii unor subcultivri succesive (mai ales la gru). 1.2.4.2 Embriogeneza somatic Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celular i de histogenez finalizate cu formarea unui embrion se numete embriogenez. Indiferent de tipul embriogenezei, punctul de plecare n formarea viitoarei plante este o unic celul. Embriogeneza somatic este fenomenul prin care din celule somatice iau natere embrioni. Aadar dintr-o celul a sporofitului, pe cale sexuat se pot genera embrioni care se aseamn foarte mult cu embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicrii repetate a unei celule somatice i nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative. Embriogeneza somatic in vitro a fost semnalat la morcov de ctre Steward i colab. (1958) i de ctre Reinert (1958, 1959). n inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut adugarea n mediul de cultur a laptelui din nuc de cocos datorit citochininelor naturale, aflate din abunden n acest produs natural. Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogenez somatic s-a reuit o cotitur n cercetrile de embriologie experimental. Astfel, s-a putut stabili: -capacitatea embriogen este coninut n fiecare celul, aparent banal i c aceast aptitudine nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare; -embrionul n formare are un anumit grad de autonomie i nu este strict dependent de prezena unui anumit mediu constituit din albumen, aa cum este cazul la embrionul zigotic; -att embrionul zigotic, ct i cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute n embriogeneza clasic i anume: celula generatoare d natere la un masiv celular care, treptat sufer o succesiune de transformri denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpil sau torpedo. n embriogeneza somatic prin izolarea i detaarea explantelor se realizeaz eliberarea celulelor din intercorelaiile fiziologice n care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul plantei, moment n care se rup nu numai legturile trofice i fitohormonale avute, ci se sisteaz i eventuala prezen a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimic controlau i blocau dezvoltarea haotic a celulelor unui organism. 1.2.5 Habituaia sau anergismul Habituaia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se refer la totalitatea schimbrilor ereditare survenite spontan, la un moment dat, n raport cu cerinele de aprovizionare a celulelor cultivate pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacie, de rspuns, a materialului biologic, la anumii fitoefectori, regulatori de cretere sau vitamine, prezeni n mediul de cultur. Habituaia nu se refer numai la reacia inoculilor n raport cu fitohormonii exogeni, ci privete o gam mai larg de probleme, unele dintre ele nencadrate nc n aceast categorie de manifestri fiziologice. Astfel, explantul detaat, lipsit de punctul vegetativ (dominana apical), trece prin transformri particulare, specifice noii stri fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot prezenta un comportament deosebit (Gautheret, 1980). Mecanismul habituaiei este nc necunoscut. Se tie doar c, exist anumii factori de mediu care favorizeaz instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) i temperaturile ridicate.

1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor i tulpinilor i a fost semnalat la culturile de salat n ser (Gautheret, 1980). Se apreciaz c, n cazul acestui fenomen, n anumite condiii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor devin translucide ca o consecin a infiltrrii apei n spaiile intercelulare, nlocuindu-se aerul din ele. n condiii aseptice, plante vitroase pot s apar brusc. Ele sufer transformri morfofiziologice, frunzele lor recurbndu-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate i casante, prezentnd o cretere malformat, hipertrofiat. Aspectul general este degenerat. Studiile amnunite asupra structurii frunzei au artat c frunza nu are celulele difereniate n cele dou esuturi, palisadic i lacunar. Meristemele lstarilor vitrificai sunt mai mici dect la cei normali. Celulele sunt mult hidratate i conin clorofil mai puin. S-a constatat c prin adugarea crbunelui vegetal n mediul de cultur se elimin sau se reduce foarte mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraiei de agar la 11,1% reduce vitrificarea (Orlikowska, 1985). Concentraii mai mari de 0,8% de agar duc ns la scderea ratei de multiplicare i de aceea este foarte dificil de mbinat cele dou aspecte.

CAPITOLUL II 2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITROTehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la aceeai premiz: posibilitatea de a controla ntr-un mod optim factorii de mediu (temperatur, lumin, compoziia mediului de cultur, pH, umiditate) necesari fragmentului de plant inoculat n condiii artificiale de mediu, n ncercarea de a analiza funciile sale fiziologice sau de a-l conduce ntr-o anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari (micropropagarea). Tehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui numr de probleme: -meninerea unui explant viabil i activ din punct de vedere vegetativ; -permiterea creterii normale a unui explant reprezentat de o structur organizat (meristem, vrf de cretere sau mugure); -inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus pentru formarea de organe sau embrioni somatici; -inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor explante formate din celule difereniate (fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.) rezultnd o nou organizare tisular; -inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor amintite mai sus. Aceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea regulatorilor de cretere endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de cretere. Aceste substane par a determina orientarea dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru care li se acord prima atenie atunci cnd se ncearc explicarea unor fenomene fiziologice.

2.1.1 Regulatorii de cretere Existena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul secolului trecut. Numeroase lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au evideniat prezena lor, dar nu leau putut identifica dect mult mai trziu. Primii fitohormoni descoperii au fcut parte din clasa auxinelor, n jurul anului 1934, giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu, n anii 50. Aceste trei tipuri de regulatori de cretere exercit o aciune stimulativ asupra metabolismului celular. Exist i substane cu efecte inhibitoare asupra creterii i dezvoltrii celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat n anul 1965 i substanele fenolice identificate civa ani mai trziu. De asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscut ca regulator de cretere atunci cnd metodele de msurare a acesteia au permis detectarea sa n organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor. Aceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de plante. Exist i fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice asemntoare celor naturali, prezentnd o aciune fiziologic similar. Toate aceste substane, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de cretere i au anumite caracteristice comune: -acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt toxice, de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide; -acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind determinat de balana hormonal stabilit ntre ei; -intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe moduri de aciune astfel nct noiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonat. O diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei naturali const n faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminai suficient de repede, pe cnd cei artificiali persist mult mai mult fiind deseori preferai aplicaiilor practice. 2.1.1.1 Auxinele Auxinele au fost descoperite n urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae. Numele de auxine provine din grecescul auxein a crete, determinnd elongarea celulelor (auxesis cretere ce se refer n special la mrimea celulei dect la numrul de celule). Este un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz C10H9O2N cunoscut sub numele de acid - indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul - indolil acetic A. Proprietile fiziologice ale auxinelor

Auxinele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de concentraiilor i de interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva din efectele lor s-a putut concluziona c: -exercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz creterii plasticitii peretelui celular i penetrrii apei n celul. Apoi rezistena peretelui scade i celula crete n lungime; -modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descrcare de ioni de H+, determinnd o cretere a aciditii responsabil de diminuarea rezistenei peretelui celular i o absorbie de ioni de K+; -influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza ARN-ului ribozomal (ribozomii particip la sinteza proteinelor); -stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial (acest tip de aciune a determinat insuccesele din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui numr de celule asemntoare, numite calus; -acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena intervine n schimb n reglarea nivelului de auxin cel puin la nivelul vaselor conductoare; -acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe, n particular asupra fenomenelor de dominan apical; -determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor; -au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor ornamentale destinate comerului de flori tiate; Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a auxinei deoarece concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n parte i se schimb n funcie de concentraia celorlali fitoregulatori. Modul de aciune al auxinelor. Nu se poate da un rspuns precis, dar cercetrile n domeniu au evideniat existena unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei ipoteze au rezultat urmtoarele concluzii: -n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar diferene de reacie n concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest fitohormon; -n funcie de afinitatea receptorului pentru auxin unii sunt angrenai mai repede dect alii. Au fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere, de aici se poate extinde ideea existenei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni. B. Auxinele n plante Toate plantele sintetizeaz auxine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i n florile i fructele tinere. Auxinele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunat n organele tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce nseamn c auxinele sunt n concentraie mai mare n apropierea situsurilor de sintez. Astfel, auxinele sunt prezente ntr-o concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea i elongarea celulelor. C. Auxinele sintetice De cnd au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compui chimici similari acestora, care au generat n celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirm

existena receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenai mai puin de activitatea auxinenzimelor , vor putea avea un efect prelungit n plante. Printre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt: -acidul.indolil butiric (AIB); -acidul naftalen acetic (ANA Fig.2) i derivaii si: acidul naftooxiacetic (ANOA) i naftilacetilamida (NAD); -acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

Fig.2 Acidul naftalen -acetic n practic, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puin toxice dar i mai puin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibat de aciunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dac implic un risc mai mare de toxicitate. n aplicaiile agricole, compuii auxinici sunt folosii pentru cicatrizarea rnilor rezultate n urma tierilor anuale din pomicultur, n evidenierea fructelor partenocarpice sau pentru ntrzierea cderii frunzelor sau a fructelor pn la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic. i n domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleai substane urmrindu-se n principal efectele rizogenice i de multiplicare a celulelor pe care acestea le genereaz. 2.1.1.2 Giberelinele Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evideniat nainte ca acestea s fie identificate. Primele observaii (1926) au fost fcute pe plante de orez atacate de o ciuperc (Giberella fujikuroi) care prezentau internoduri mult elongate i frunze clorotice. Extractul apos din ciuperc a provocat simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenei unei substane responsabile de aceste efecte. Prima giberelin identificat a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat n 1939 i numit giberelina A). Aceast prim descoperire a fost urmat de descoperirea altor gibereline pn cnd n plante i n ciuperci au fost identificate n total aproximativ cincizeci de gibereline. Acetia sunt toi compui endogeni. n practic, giberelinele folosite sunt extracte purificate. Cea mai folosit giberelin este GA3 (Fig.3) i mai puin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau GA7. Este posibil ca n urmtorii ani s fie folosite gibereline sintetice, avnd n vedere c primele gibereline sintetice au fost obinute prin anii 80.

Fig.3 Acidul giberelic Toi aceti compui au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate i poziia substituenilor n nucleu. A. Proprietile fiziologice ale giberelinelor Proprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posed aceleai gibereline. Principalele proprieti ale acidului giberelic sunt: -acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate spectaculoase (ex: s-au obinut plante de varz cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre varietile pitice ale unor specii pot atinge talii normale n urma aplicrii de GA3, n general varietile pitice nu reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acioneaz i asupra pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie (cu 15 pn la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenelor prea dezvoltate (ex: la viele de vie cu ciorchini deni, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor laxe); -n cultura in vitro giberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor, care, n absena acestora, prezint un aspect globular; -stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor hidrolitice. S-a dovedit c la seminele de orz, acumularea -amilazei, o enzim cu rol n transformarea amidonului n zaharuri solubile, este datorat acidului giberelic, care acioneaz direct sau dup asocierea cu un receptor. Giberelinele acioneaz, de asemenea, n prezena auxinelor, i sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor; -acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce necesit temperaturi sczute pentru a nflori, astfel nct n prezena giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturi sczute (morcov). La alte specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire, prezena giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fr formarea florilor (sfecl). Aceste contradicii n aparen au o explicaie simpl: n plantele prezentate mai sus frigul acioneaz doar asupra creterii tulpinii, pe cnd n cellalt caz asupra procesului de nflorire. Astfel, giberelinele, i exercit doar rolul de stimulatori ai elongaiei neinfluennd, n acest caz, procesele fiziologice normale; -acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin, prun; -exercit o aciune complex asupra germinrii seminelor sau pornirii n vegetaie a mugurilor dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice (temperaturi sczute) nu permit acest lucru, inducnd i ramificarea sau creterea ramurilor la Hydrangea; -n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. Par a se opune fenomenului de dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop, acionnd ns

asupra meristemelor apicale sau axilare i asupra butonilor florali, prin stimularea creterii i dezvoltrii acestora. B. Giberelinele n plante Giberelinele au fost descoperite att n plante ct i n ciuperci cu o distribuie inegal. Unele gibereline se pot ntlni doar n plante, altele doar n ciuperci i unele n ambele grupe (acizii giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posed doar un fel de gibereline, n alte specii se afl i acioneaz mai multe tipuri de gibereline. Locurile de sintez a giberelinelor se afl la nivelul frunzelor foarte tinere, n mugurii foliari i florali, n lstarii activi, n vrful rdcinilor i n embrioni. Giberelinele circul liber prin plant fr existena unei polariti fiind asociate deseori zaharurilor, eliberndu-se n situsurile int. 2.1.1.3 Citochininele Citochininele au fost descoperite n timpul studiilor efectuate asupra esuturilor vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit i acum este bine cunoscut faptul c adiia de lapte de nuc de cocos n mediile artificiale de cultur are un efect favorabil asupra multiplicrii celulare i n lstrire. Cercetrile ce au ncercat s descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui complex chimic activ de natur purinic, care nu a putut fi iniial identificat. Aceste rezultate au dat posibilitatea continurii cercetrilor asupra purinelor i n 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o substan activ numit chinetina. Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi compui endogeni: -zeatina (Fig.4) -izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt: chinetina (Kin Fig.4) (6furfurilaminopurina) i benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a) b) Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n asociere cu zaharuri. A. Proprietile fiziologice ale citochininelor Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care: -au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. n acest proces citochininele sunt indispensabile, dar ineficiente fr aciunea auxinelor, cele dou complementndu-se reciproc. Auxinele favorizeaz duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor; -au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea lstarilor, fiind ns antagonice rizogenezei;

-exercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd sinteza proteinelor, prin rolul ce-l joac n compoziia ARN-ului de transfer i protejnd metaboliii de aciunea enzimelor hidrolitice. Acest efect determin ntrzierea senescenei pn la punctul n care frunzele mature tratate cu citochinine se comport asemntor celor tinere din punct de vedere metabolic; -exercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd lstrirea axilar; Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in vitro deoarece au permis obinerea unor progrese importante n micropropagarea plantelor. Proprietile citochininelor permit rezolvarea dificultilor enumerate mai sus, cum ar fi meninerea viabilitii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dedifereniere. B. Citochininele n plante Prima citochinin endogen a fost identificat n 1963 n embrioni imaturi de porumb, de unde i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina (IPA), descoperit puin mai trziu n plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conin citochinine sintetizate n special n rdcini i n embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determin atragerea substanelor nutritive spre aceste zone datorit efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Creterea n dimensiuni a tuberculilor i fructelor se datoreaz prezenei citochininelor endogene localizate n aceste organe. Citochininele se pot asocia cu zaharurile i circula prin plante fr polaritate. Se presupune ca ele circul ntr-o form inactiv i c rmn localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca n cazul aplicaiilor pe frunze. 2.1.1.4 Etilena Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp n urm n ncperile de depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcia sa de regulator de cretere nu a fost evideniat pn n momentul dezvoltrii tehnicilor de analiz n plante. Etilena se afl n plante n cantiti infime i poate fi produs de toate prile acesteia.

Fig.5 Etilena Principalele proprieti ale acestui regulator de cretere sunt: -determin iniierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosit la nceput pentru coacerea fructelor la lmi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la mr i cire; -accelereaz procesele de cdere a frunzelor i fructelor, fiind folosit atunci cnd se urmrete recoltarea mecanizat a fructelor la cirei i mslini; -induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosit n horticultur; -modific ritmul de cretere prin aciunea pe care o exercit asupra polaritii transportului auxinelor; -are aciune favorabil asupra tuberizrii. Aceste proprieti au unele puncte comune cu auxinele (nflorirea Bromeliaceaelor, corelaii de cretere) iar unele antagonice (cderea frunzelor i fructelor, tuberizarea).

Aciunea antagonic a etilenei pare a depinde de interaciunea dintre cele dou substane ce pot controla sinteza, concentraia i circulaia lor. Aplicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au fcut progrese doar dup descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetreaz esuturile, unde se elibereaz etilena. Toate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea cea mai mare se sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori i organe rnite. 2.1.1.5 Inhibitori ai creterii Multe substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre substanele endogene enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.

A. Inhibitorii fenolici Inhibitorii fenolici, ntr-un numr mare n plante, inhib metabolismul i intervine n multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de cretere, fie ca inhibitori ai reaciilor metabolice. Ei intervin n inducerea strii de laten a mugurilor i seminelor, la nceput prin ncetinirea creterii acestora urmat de stoparea total a acesteia. Nu se tie exact rolul i mecanismul lor n inducerea strii de laten. n culturile in vitro aceti compui sunt deseori sintetizai i eliberai n mediul de cultur, unde se oxideaz cauznd brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea n unele medii de cultur se utilizeaz substane anti-oxidante sau adsorbani pentru a detoxifia mediul. Exist cteva exemple referitoare la folosirea substanelor fenolice n cultura in vitro, cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea nrdcinrii la altoii de mr. B. Acidul abscisic Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat n 1965 i de atunci a fost descoperit n toate plantele. Acest inhibitor pare s fie sintetizat de fiecare dat cnd o plant este supus unor condiii stresante (lipsa apei, rnire, cldur excesiv). Existena acidului abscisic n celule este una din cauzele crora plantele supuse unor factori stresani i ncetinesc activitatea metabolic. ncetinirea activitii plantelor este reversibil atunci cnd condiiile de stres sunt trectoare i poate induce starea de laten sau chiar decesul plantei atunci cnd condiiile nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic Proprietile acidului abscisic sunt similare celor ale compuilor fenolici. Astfel, cele mai importante proprieti ale acidului abscisic sunt:

-aciune favorabil asupra cderii frunzelor i fructelor; -determin creterea permeabilitii celulelor fa de ionii de potasiu, ceea ce poate influena nchiderea stomatelor; -acioneaz asupra nfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurt cultivate n condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parial (Chenopodium rubrum), sau chiar stimula nflorirea (Plumbago). n cazul n care plantele de zi scurt sunt supuse unor condiii de zi lung poate induce nflorirea unora dintre specii i inhibarea altora. Aplicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poate inhiba nflorirea atunci cnd plantele sunt supuse unor condiii normale de fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaii pot conduce la supoziia c nopile lungi favorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este prea simpl pentru explicarea modului diferit de aciune a acidului abscisic. Acidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie de speciile folosite i de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte diferite i greu de interpretat. Concluzii Regulatorii de cretere endogeni sunt prezeni n plante pe tot parcursul vieii acestora, dar prezena acestora nu este constant. Concentraiile lor se schimb n cursul diferitelor stagii fiziologice i sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeai etap fiziologic. Variaia continu n plante a coninutului n regulatori de cretere determin problemele legate de alegerea momentului de recoltare a explantului. Tehnicile de cultur in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai importante sunt auxinele i citochininele. Raportul citochininauxin influeneaz procesele fiziologice din explante, determinnd evoluia acestora n diferite sensuri n funcie de concentraia celor doi fitohormoni. Astfel, dup Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi: -dac raportul auxine citochinine este mare, se induce rizogeneza; -dac raportul este subunitar se induce lstrirea, explantele tind spre o funcionare caulogenic; -dac raportul este apropiat de unitate, explantele au tendina s genereze formaiuni calusare. Aceast schem general este ntotdeauna valabil, chiar dac exist variaii n funcie de tipul de explant i mai ales n funcie de specia luat n cultur. Pe lng aceti fitoregulatori principali exist i ali regulatori de cretere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar n cele mai multe cazuri acetia au doar rol stimulator sau favorizant i rareori esenial.

2.2 ALEGEREA EXPLANTULUICelulele vegetale vii au capacitatea potenial de a intra n diviziune i de a reproduce un individ ntreg similar plantei donor. Aceast capacitate denumit totipotena celular, indic faptul c fiecare celul deine toate informaiile necesare regenerrii unei plante ntregi, proprietate ce este tot mai mult exploatat n culturile in vitro. Chiar dac toate celulele au totipoten nu este uor, cel puin pentru moment, s se foloseasc n practic aceast calitate, ns cu ct cercetrile avanseaz, cu att numrul acestora va crete. Este mai uor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil s reacioneze n condiii artificiale de cultur unde s evolueze spre multiplicare clonal mai mult sau mai puin semnificativ n funcie de rspunsul obinut. Micropropagarea face posibil obinerea

de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mam, ns uneori este i surs de variabilitate genetic atunci cnd explantul este supus anumitor condiii. nainte de a decide criteriile de selecie ale unui explant este necesar cunoaterea evoluiei fiziologice ce va ajuta la nelegerea diferenelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plant atunci cnd este detaat de planta mam. 2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante n contextul reproducerii sexuate se poate preciza, ntr-o manier simplist, c ciclul de via al unei plante se mparte n patru stadii principale. A. Embriogeneza Embriogeneza ncepe cu fecundarea unei oosfere de ctre un anterozoid. Oul astfel format este protejat de ovul unde ncepe s se divid. Celulele se organizeaz la nceput ntr-o mas sferic (faza globular a embrionului), apoi se dezvolt forme simetrice reprezentnd cotiledoanele rudimentare (faza cordiform a embrionului dicotiledonat) dup care se dezvolt structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula i radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu ncepe diferenierea celular. Specializarea celulelor este nc foarte puin datorat unei funcionri programate i mai mult datorit unui program genetic ce se va pstra i n celulele mature ce n anumite condiii se vor comporta similar unor celule gametice, dnd natere unor organe sau embrioni, de aceast dat somatici. n momentul de fa, nu se cunoate pe deplin mecanismul diferenierii celulare. Se presupune c poziionarea celulelor n relaie cu celelalte celule, dar i cu mediul de cultur, determin un schimb de semnale biochimice, ce moduleaz funcionarea fiecrei celule. n contextul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine ca urmare a dou cauze: pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei (fiecare celul are acelai echipament informaional genetic), n care acioneaz programul embriogenic, iar pe de alt parte, datorit poziionrii specifice a celulei care va fi recunoscut de structurile membranare. Aceste structuri filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuia sau altui semnal capabil s modifice programul informaional spre un anumit tip de celul. Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele sunt depozitate n albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce intrarea embrionului n starea de laten. Seminele pot fi apoi diseminate, putndu-se pstra i rezista condiiilor nefavorabile din mediul nconjurtor. B. Stadiul vegetativ Cnd condiiile externe sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt seminele germineaz i din embrion ia natere o nou plant. De creterea plantelor sunt responsabile dou tipuri de meristeme: meristemul caulinar ce determin creterea prii aeriene a plantei i meristemul radicular, ce determin creterea prii subterane a plantei. Meristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o parte extern, epiderma de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern sau corpus. ntr-o seciune transversal se poate observa o parte apical unde celulele au o activitate mitotic redus, nconjurat de un inel de celule aflate n diviziune activ, celule responsabile de creterea tulpinii. Diviziunea ncepe de la inelul iniial: zona epidermal difereniaz n frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior n parenchim cortical i vase conductoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul caulinar are o funcionare ritmic programat genetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuie

corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii) i, n al doilea rnd, n forma frunzelor. Se remarc aici c florile ce permit identificarea i clasificarea plantelor se bazeaz aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentat mai sus privitoare la diferenierea celulelor n interiorul embrionului poate fi luat n considerare similar celei privitoare la meristeme. La nceput, plantula este hrnit din rezervele nutritive aflate n endospermul seminei, primele frunzulie, deseori conturate n interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub denumirea de frunze juvenile. Planta crete i devine capabil s se hrneasc singur, rdcinile transport spre frunze srurile minerale i compuii organici odat cu regulatorii de cretere. n schimb, rdcinile primesc de la frunze substane nutritive bogate n glucozide, vitamine i de asemenea n regulatori de cretere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaii de cretere ntre sistemul aerian i cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical Corelaiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecrei plante (arbore, tufi, tulpini ntortochiate sau mprtiate, etc). Aceast arhitectur poate fi modificat prin curarea de uscturi sau ramuri nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de cretere. n contrast frunzele i menin forma.

Fig.8 Meristem radicular

Aceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n general, informaii despre ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab de fenomene de cretere relative dect de motenirea genetic. Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la cteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele perene. n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de cretere alternnd cu cele de repaus. Aceast succesiune, care reflect adaptarea plantei la climatul mediului nconjurtor, este determinat de stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiile condiiilor de mediu (temperatur, lumin, secet, umiditate, etc). Plantele ce intr n perioada de laten i sisteaz creterea, substanele glucizidice nefolosite sunt pstrate n rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau prile aeriene ale plantelor ierboase se usuc. Atunci cnd revin condiiile favorabile (latena mugurilor este indus de obicei de temperaturile sczute) rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene. C. Stadiul reproductiv Stadiul reproductiv este marcat de modificrile de ritm n funcionarea meristemului caulinar. Inelul iniial nceteaz progresiv s mai funcioneze i se observ c celulele centrului latent intr n diviziune activ iniiind formarea florii sau a inflorescenei. Diferenierile ncep la margini unde se formeaz staminele i prile fertile ale plantei: staminele i pistilul. Florile angiospermelor sunt considerate lstari modificai constituite dintr-un ax central i anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele i pistilul). Aceste nou program este la fel de precis ca i precedentul i se presupune c mecanismele de difereniere sunt similare. Instalarea strii generative este progresiv i la nceput poate fi reversibil, n unele condiii este posibil s se revin la starea vegetativ. Modificrile modului de aciune pot fi controlate fie de plant i n aceste condiii variaiile climatice nu au nici un efect, fie de variaiile climatice (temperatur, lumin, umiditate), caz n care planta percepe aceste variaii i drept rspuns emite stimuli ce vor direciona meristemul spre stadiul reproductiv. La unele specii, existena un timp ndelungat a condiiilor nefavorabile de mediu poate duce la mpiedicarea nfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu n viaa unui meristem, asigurnd prin fertilizare, continuitatea speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor. Aceast caracteristic permite plantei s supravieuiasc mai muli ani (Saintpaulia, cerenelGeum urbanum, cpun, etc). Dac aceste meristeme sunt induse artificial s nfloreasc, plantele nfloresc i mor comportndu-se asemeni unei plante anuale. Cercetrile asupra naturii stimulilor ce acioneaz asupra meristemelor florale nu sunt concludente, tiindu-se doar c intervin unii fitohormoni dar i alte substane. Se pot cita cteva modele de culturi in vitro, n care, variind componentele mediului de cultur i proporia fitoregulatorilor de cretere s-au putut obine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive. D. Stadiul de senescen Stadiul de senescen urmeaz stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt la sfritul vieii lor, fructificarea epuiznd rezervele, rdcinile nu mai hrnesc planta n mod normal, schimburile de substane nutritive se reduce i plantele se pregtesc de iernare. La speciile perene, aceast etap ncepe prin ncetinirea funciilor rdcinilor odat cu debilitarea ntregii plante, ce devine mult mai sensibil la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor s intervin cel puin la nceputul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic i etilena, alturi de alii).

Aceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieii unei plante ne permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz morfogeneza plantelor. Astfel, interaciunile pe distan scurt, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor i al meristemelor vegetative i regenerative. Alt tip de interaciuni sunt interaciunile dintre organe ce permit plantelor s recunoasc mediul nconjurtor i variaiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea s se adapteze noilor condiii datorit schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizai n anumite locusuri, circulnd n direcia unui punct int ce rspunde la acel stimul. n cursul deplasrii lor fitohormonii sunt controlai de sistemele enzimatice existente n plante. Aceste interaciuni sunt de aa natur nct de-a lungul unui ciclu de via al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de cretere evolueaz continuu i reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului nconjurtor al celulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. Datorit acestui fapt, la recoltarea unui explant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul fiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de pe care se prelev, precum i de mrimea i natura fragmentului excizat. 2.2.2 Selecia explantelor n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei mam n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei donor explantele pot reaciona diferit la condiiile culturii in vitro. n general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivit de explante, potenialul de adaptabilitate al explantelor la condiiile artificiale de via diminundu-se cu vrsta plantei mam. n cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizai din ovul i inoculai pe mediul de cultur dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ normal i complet. Aceast tehnic prezint un interes sczut atunci cnd se are n vedere micropropagarea (potenialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu excepia cazului strict de autogamie). Pe de alt parte, aceast tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. n unele cazuri, de ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot fi avortai sau mor imediat n ovul, aceast tehnic permite creterea i dezvoltarea normal a acestor embrioni. esuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din explante btrne. n unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut. Dup germinarea n stadiul juvenil, esutul prelevat prezint un rspuns favorabil in vitro i este sursa multor succese n domeniu. Odat cu naintarea n vrst a plantei donor, potenialul de cultur in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminueaz. Acest fenomen este specific mai ales plantelor perene, i n mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este msurabil, cu excepia arborilor aduli. n acest stadiu, totui, pentru multe specii, iniierea culturii doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul tnr acetia au o capacitate rizogenic ridicat. Exist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i arboricole: -una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i arboricole. n acest caz lstarii par a avea caracteristici juvenile i nrdcineaz mai repede (de exemplu la nuc i eucalipt). La aceste specii esuturile de origine ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil, probabil datorit faptului c se afl n apropierea rdcinilor; -a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i arboricole tropicale i a coniferelor. Aceast tehnic permite rejuvenilizarea i obinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din smn. Altoiul

crete i este apoi nlturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire. La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuli ce se formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a meristemului la vi de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in vitro, protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizarea observat este deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie. ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmatice sau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii de noi celule. Mecanismele exacte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure. Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cnd plantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul de funcionare al meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturii in vitro. Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen, dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete. 2.2.3 Selecia explantelor n funcie de vrsta explantului Problemele legate de vrsta explantului apar la speciile perene n care se poate distinge un stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au euat atunci cnd s-a ncercat iniierea unei culturi de esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri n vegetaie, dar au avut succes atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi. De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb. Primvara organele cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de tipul auxinelor, giberelinelor i citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conductoare se diminueaz, iar toamna se sintetizeaz inhibitorii creterii. De aceea, nu e surprinztor faptul c explantele, prelevate de la aceeai plant n perioade variate ale vegetaiei, vor da rspunsuri diferite chiar dac vor fi plasate pe acelai tip de mediu. De aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendina de a nrdcina uor atunci cnd sunt prelevate n anumite faze de vegetaie, n special dac sunt excizate n perioada de vegetaie, cnd concentraia de auxin este maxim. La speciile cunoscute deja ca recalcitrante la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizrii se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt, unui tratament cu temperaturi sczute, unui regim de lumin particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern n vederea stimulrii rizogenezei. 2.2.4 Selecia explantelor n funcie de amplasarea plantei donor Dup determinarea stadiului i perioadei optime explantele pot fi prelevate. Dup tipul de organizare a fragmentului ce urmeaz a fi cultivat in vitro se pot lua n considerare dou cazuri:

1.Explantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul mugurilor, apexurilor caulinare, meristemelor i apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniierea unei culturi de esuturi, deoarece acestea sunt receptive i ridic cele mai puine probleme, genernd cu uurin, n condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dac mediul de cultur nu este potrivit poate tulbura funciile explantului i conduce la dediferenierea celulelor, genernd calus. Utilizarea acestui tip de explante este similar unei microbutiri i este tehnica cel mai des folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii. Interesant de amintit este faptul c explantele posed un fel de memorie a tipului de cretere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind n special ntlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante la care corelaiile de cretere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pmnt i nu erecte. Unele cercetri au evideniat faptul c aceast memorie aparine celui mai apropiat internod de lng meristem. 2.Explantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi fragmente de tulpin, frunze, flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de cultur, li se induce o reversie complet cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide i de a-i ctiga din nou capacitatea organogenic. Pentru aceste explante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile plantei sunt capabile s urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou organizare structural. Dar, n acest caz, diferenele ntre specii sunt uriae. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile s regenereze din toate prile plantei (peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obinute doar din fragmente de tulpin. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuindu-se iniierea culturii de esuturi din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuit obinerea de propaguli doar din cotiledoane. n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb foliar i tulpini tinere. 2.2.5 Selecia explantelor n funcie de mrimea i natura acestora Mrimea explantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare importan. Cu ct explantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant i mediul de cultur va avea o influen limitat. n cazul explantelor de dimensiuni mici direcionarea acestuia n sensul dorit se face mai uor, deoarece explantul este receptiv la substanele din mediul de cultur, i anume la regulatorii de cretere existeni. Explantele organizate cuprind n general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt nlturai), fiind o unitate suficient de complet pentru care mediul va favoriza creterea, sau n cazul diferenierii axilare, va bloca creterea apical. Pentru meristemele ce trebuie s aib dimensiuni foarte mici, exist o mrime minim ce conine domul meristematic cu dou primordii foliare. Sub aceast mrime supravieuirea explantului este foarte dificil i pierderile sunt mari, peste aceast dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor. Dimensiunile explantelor variaz ntre 5 i 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulri uoare a materialului vegetal, sub aspectul excizrii sau prelevrii, fasonrii i inoculrii acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelai mediu de cultur, a mai multe fragmente de peiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 i 7 mm, s-a observat c doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat dou tipuri de rezultate: unele explante s-au vetejit, iar altele au format doar rdcini. Fr ndoial, n

ultimul caz, auxinele prezente n mediu au jucat cel mai important rol, pe cnd n cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n joc i fitohormonii endogeni. Se pot fasona explante din diferite tipuri de esuturi: epidermal, cortical, parenchim medular, dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de esut este cel epidermal. esuturile corticale i cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori n stadiul de calus. Parenchimul medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre regulatorii de cretere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit mduv de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine i citochinine. Din esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerrii spre stadiul caulogenic (lstari), rizogenic (rdcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse. Cel mai mic explant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilor izolai mecanic sau enzimatic. Protoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RSPUNSUL EXPLANTELOR N CULTURPrima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in vitro este meninerea viabilitii (pe lng problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, dup fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin n contact direct cu mediul de cultur, fenomen datorat oxidrii substanelor fenolice sintetizate n mediu, oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant i mediul de cultur. Nu toate speciile prezint fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parial rezolvat prin imersia explantelor ntr-o soluie antioxidant (soluie de acid ascorbic cu acid citric n proporie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat dup fasonarea acestuia sau prin adiia n mediul de cultur a unor substane adsorbante sau detoxificante, cum ar fi crbunele activ (1 pn la 4 g/l) sau polivinilpirolidon (5 pn la 10g/l). Odat rezolvat aceast problem este necesar orientarea explantului, n funcie de natura sa, n direcia dorit de operator. 2.3.1 Explante cu structur rudimentar Explantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode. Prima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul de cultur a fitohormonilor din clasa auxinelor i/sau a giberelinelor, foarte rar se pot aduga i citochinine, ntotdeauna ntr-o doz foarte mic. Dup iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni calusare la baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante s rmn de dimensiuni mici, deoarece dac acest calus crete n dimensiune, ceea ce deseori se ntmpl, indic existena unui dezechilibru ntre substanele minerale sau fitohormonii din mediul de cultur. Dup formarea calusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o ran) se formeaz prima frunzuli, apoi prima rozet de frunze i mai trziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelai tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe dou medii succesive, la speciile lemnoase. Primul mediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru propagarea fragmentelor cu un nod (microbutire). Al doilea mediu, mbogit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), servete ca mediu de nrdcinare (Actinidia, mr, numeroase specii lemnoase).

A doua metod const n blocarea creterii apexului caulinar favoriznd regenerarea i dezvoltarea lstarilor laterali (axilari), caz n care mediul de cultur este adiionat cu citochinin (de la 1 la 10mg/l). Lstarii regenerai pot fi izolai i crescui pe mediu pentru cretere, fr hormoni sau cu acid giberelic n concentraie mic. n unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultur pentru nrdcinarea lstarilor, mediu adiionat n general cu auxine. Utilizarea acestui tip de explante este important deoarece asigur posibilitatea efecturii unui numr foarte mare de subculturi i, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate. 2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de esut Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate n esuturi fr o organizare structural, putnd proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpin, frunze, rdcini) sau generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct). Celulele ce rspund la cultura in vitro trebuie s treac prin procesul de dedifereniere, adic sa se ntoarc la stadiul de celule nedifereniate. Acest tip de reversie este mai uor de obinut la celulele vegetale i mai greu la cele animale. Observaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri ce intervin n procesul dediferenierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se mrete, citoplasma devine mai dens. Dup realizarea acestor modificri celulele ncep s se divid, stadiu denumit histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur a auxinelor. n al doilea stadiu, numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens, cu vacuole mici i nucleu voluminos. Celulele pstreaz capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o mas meristematic ce se va dezvolta ntrun nou individ. Observnd un explant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei formaiuni calusare cu rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a mediului sunt primele ce ncep s se divid i s se dediferenieze. Dac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz calus i deci tot explantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitro au o poziie precis, de exemplu la Begonia rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza periorilor glandulari. n general celulele int, adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, n special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. Aceste celule se vor organiza ntr-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu tulpini i rdcini, cum este cazul la Begonia i Saintpaulia. La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observ n primul stadiu formarea de calus (calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, i doar n al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelai mediu de cultur sau pe alt mediu, se dezvolt meristemul ce va da natere noii plantule. Cnd se formeaz meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a se dezvolta ca i explantele organizate, doar c se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul. Al doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul cruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau embriogenez somatic. Acest fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost descoperit la mai multe specii, att anuale ct i perene. Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai mare msur de compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se prelev celulele generatoare. n multe cazuri embriogeneza somatic, este precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv (Fig 9).

n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii ajung n stadiul globular, apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion capabil s genereze o plantul (Fig 10). Pentru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente dou medii de cultur. Primul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor. Uneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni pentru a induce germinarea embrionilor somatici i creterea plantulelor, n timpul acestor subcultivri are loc diluia fitohormonilor la nivel celular permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regenerai din calus Utilizarea explantelor difereniate este foarte avantajoas deoarece sursa de explante este nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. n funcie de rspuns, aceste explante prezint unele dezavantaje la nivel genetic. n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i exist probabilitatea ca celule mutante s genereze embrioni din care s ia natere noi plante.

a

b

c

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) n stadiul globular, b) n stadiul cordiform, c) genernd o plantul n al doilea rnd, cea mai mare rat de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus, caz n care, datorit ritmului intens de diviziune celular numeroase celule pot prezenta modificri la nivel genetic (modificri cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificri citoplasmatice). Aceast variabilitate poate fi suficient de mare i n unele cazuri a fost chiar folosit pentru inducerea de mutani, prin stimularea formrii calusului pe medii adecvate fitohormonal i chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creterea

probabilitii mutaiilor. Dup fragmentarea calusurilor i inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat c printre plantulele neoformate unele prezentau modificri morfologice evidente mai ales citoplasmatice. n consecin, de fiecare dat cnd propagarea unei specii necesit trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calitii genetice a plantelor obinute. Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetrile asupra culturilor ce au pornit de la explante difereniate au permis nelegerea modului de aciune al fitoregulatorilor de cretere, a cror echilibru n mediul de cultur este determinant pentru orientarea celulelor s funcioneze ntr-un ritm ales de operator, innd cont de echilibrul endogenic. Nu se tie nici n prezent care este modalitatea de a determina exact concentraia i balana hormonal atunci cnd se apeleaz la fitoregulatori exogeni, dar pe de alt parte, acetia din urm permit cercettorilor manipularea materialului biologic n sensul dorit. Aceste cercetri, ce sunt nc incomplete, sunt baza de la care s-a pornit n realizarea multor aplicaii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a nceput s fie tot mai mult folosit.

CAPITOLUL III 3.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DE CELULE I ESUTURI VEGETALEncperile destinate cultivrii in vitro a explantelor vegetale trebuie s fie: luminoase, lipsite de igrasie, s prezinte instalaii de iluminare, canalizare, curent electric, toate n perfect stare de funcionare. Orice defeciune poate perturba desfurarea normal a lucrrilor efectuate n acest laborator. n toate compartimentele laboratorului trebuie asigurat o curenie perfect, praful i murdria constituind surse de infecii. Toate operaiunile, cum ar fi: repartizarea mediilor de cultur, prelevarea, dimensionarea i inocularea explantelor vegetale se realizeaz n condiii aseptice. O condiie esenial n reuita unei culturi in vitro const n realizarea unei asepsii perfecte, att a materialului biologic ct i a mediului de cultur. n cazul n care aceast asepsie nu este asigurat, n mediul de cultur pot aprea infecii microbiene i fungice n circa 2-5 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea proprietilor substratului de cultur, eliberarea de toxine, modificarea pH-ului i astfel dezvoltarea explantelor este inhibat. 3.1.1 Organizarea spaiilor ntr-un laborator de culturi in vitro Laboratorul de culturi in vitro trebuie s cuprind mai multe ncperi, grupate n funcie de lucrrile care se execut n ele, n dou zone: -zona nesteril cuprinde: spltorul, camera de distilare a apei, laboratorul de preparare a mediilor, laboratorul de testare a infeciilor, camera pentru sterilizarea sticlriei i a mediilor de cultur, camera de cretere, camera frigorific, camera de aclimatizare, ser i solarii; -zona steril este constituit dintr-o camer sau incint steril. Dimensionarea ncperilor i dotarea lor cu aparatur depinde de specificul muncii prestate (cercetare, producie sau miniproducie).

A. Zona nesteril 1.Spltorul Destinaie: este ncperea n care are loc splarea sticlriei i recipientelor destinate culturilor in vitro. Aceast ncpere trebuie s fie organizat astfel: -s fie prevzut cu ciment pe jos i cu canalizare n pardoseal; -splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, n funcie de volumul de munc existent n laborator; -s fie dotat cu o chiuvet cu ap cald i rece, suporturi pentru uscarea sticlriei, dulapuri pentru depozitarea sticlriei, couri pentru gunoi; -poate s fie dotat i cu un distilator pentru ap. Modul de splare: -se pregtete sticlria care urmeaz a fi splat; -se elimin resturile de mediu i resturile vegetale din vasele de cultur; -mediile de cultur cu agar se colecteaz i se arunc la gunoi; -n cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea s fie autoclavate nainte de a fi deschise pentru a se evita rspndirea infeciei n laborator; -se pune sticlria la nmuiat n ap cald cu detergent, n bazinele destinate splrii; -se efectueaz splarea propriu-zis folosind perii utilizate n splarea sticlriei; -se cltete sticlrie n ap de robinet i apoi n dou reprize de ap distilat; -se aeaz sticlria pe suporturile speciale destinate uscrii acesteia. Se consider sticlria curat atunci cnd la suprafaa acesteia nu mai ader nici o pictur de ap. 2.Camera pentru sterilizare Destinaie: este locul n care se efectueaz sterilizarea mediilor de cultur, a apei distilate i a vaselor de cultur. Organizare: -trebuie s fie prevzut cu pardosea din ciment i instalaie de canalizare, sa fie racordat la reeaua de gaze, conectat la curent electric i s posede o surs de ap; -este dotat cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate; trebuie s existe dou tipuri de autoclave: unul conectat la reeaua de curent electric (fig. 1) iar cellalt avnd ca surs de energie gazul metan; sterilizarea vaselor cu mediu de cultur se realizeaz n casolete metalice sau couri de srm; -n unitile cu activitate mai redus sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate se poate face i n kukte; -este dotat cu etuve pentru sterilizarea sticlriei. 3.Camera pentru prepararea mediilor de cultur Destinaie: este ncperea n care se realizeaz prepararea mediilor de cultur. Organizare: -trebuie s fie spaioas i iluminat corespunztor; -trebuie s fie dotat cu instalaii de canalizare, curent electric, gaz, ap curent; -pardoseala trebuie s fie acoperit cu un material uor lavabil, iar mesele s fie placate cu faian sau folie melaminat pentru a fi uor de ntreinut; -aceast ncpere va fi dotat cu etuve, pupinele pentru presterilizarea instrumentarului, agitatoare magnetice, bi marine, pH-metru (Fig.2), frigider, congelator,

distilator (Fig.3), balan tehnic i balan analitic (Fig.4), precum i un variat sortiment de sticlrie. 4.Camera de cretere Destinaie: este destinat pstrrii inoculilor n con