cultivos_cel
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Gloria L. CamargoLaboratorio de Virologa
Universidad de Boyaca
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Que son los cultivos celulares?...Quesonlos cultivos celulares?...Conjunto de tcnicas Mantenimiento o
crecimientoCell, tejidos u
rganos (animalo vegetal)
Cto, x.x, metabolismos Ambiente artificial
in vitro
Fisiolgicas,bioqumicas,
genticas
propiedades
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APLICACINAPLICACIN......
AislamientoAmplificacin
Descubrimiento
Vacunas Rta inmunitaria
Hospedero
Biologa molecularBioqumica
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HISTORIA...HISTORIA... Von Recklinghansen. Logro mantener vivos por mas de un mes hematies de anfibios
Roux. Demostr la factibilidad de mantener cell vivas en medios artificiales
Harrison.
Estudio sistemtico de los cultivos en cell in vitro
Steinhadt. Virus de la viruela sobreviva varias semanas en cultivos de tejidos de cornea de conejos y caballos
Topacio y Hyde Los virus al multiplicarse producen cambios en los cultivos cell ECP
Earle y col. Demostraron que para que una cell se divida necesita ser alimentada con los nutrientes correctos Enders y col. El virus de la poliomielitis puede propagarse en cultivos cell de origen diferente al tejido nerviosos
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ry y col. Establecen la primera lnea cell continua (HeLa). Medios con plasma de pollo, extracto SFB
Se investiga los requerimientos nutritivos de las cell en cultivo. Suero, a.a, azucares.
Hayflick y Moorhead Usaron por primera vez a/b para prevenir la contaminacin de los cultivos de fibroblastos. Pudieron realizar 12 pases de los cultivos.
Austi Tocco y Sato.
Se empiezan a establecer las primeras lneas celulares diferenciadas Sato y col demuestran que las diferentes lneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento.
Se realiza la vacuna para la Influenza A H1N1 en Cultivos Cell
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Consiste en transferir clulasde un cultivo crecido a unnuevo recipiente, para que segenere otro cultivo. (PASE)
Extraer el rgano otejido del organismode origen
Tienen diferentesclases de cultivo,que se caracteriza
Capacidad dereplicacion
Capacidad deser sub-cultivado
CLASES DECULTIVOSCELULARES...CLASES DECULTIVOSCELULARES...
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CULTIVOS EN MONOCAPA...CULTIVOS EN MONOCAPA...
Clulas adherentes ocultivos fijos
Requieren unirse SUPERFICIE
Dependientes de
anclajeMULTIPLICARSE2 TIPOS
AGITACINESTACIONARIO
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CULTIVOS EN SUSPENSIN ...CULTIVOS EN SUSPENSIN ...
Clulas se multiplican Suspendidas
Medio liquido
Subcultivo por dilucin No adhesin
Cultivo inicialadquiri mximo
de saturacin
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CULTIVOPRIMARIO...CULTIVOPRIMARIO...
MXIMO 10 SUBCULTIVOS.
Clulas provenientesdel tejido original
Trasplantados aCondiciones artificiales
Porcin celular variada
POBLACIN CELULAR PASES SUCESIVOSPROLIFERAR
LENTAMENTERPIDAMENTE
DESAPARECEPREDOMINA
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LINEASCELULARES...LINEASCELULARES...
Derivadas deun cultivo
primario, se puedencultivar in vitrorepetidamentey se dividen en :
DIPLOIDE HETEROPLOIDES
+ 75%
Mismo cariotipode las clulasSe originannormales ysiguennormales
- 75%
Mismo cariotipode las clulasSe originantejido normal oanormalCell sufrentransformaciones
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LINEA CELULARES TEJIDO DE ORIGEN VIRUS QUE PUEDEN SERAISLADOS EN CADA TIPO
CELULAR
HEp-2 Carcinoma epidermoide delaringe humana
Herpes simplex, Enterovirus,Poliovirus, Adenovirus.
MDBK Rin bovino Herpes y Adenovirus bovino,estomatitis vesicular.
MDCK Rin canino Influenza, Adenovirus
MRC-5 Pulmn embrionario humano Citomegalovirus
Vero Rin de mono Herpes y Poliovirus
BHK-21 Rin de hamster Estomatitis vesicular y feibreaftosa
HeLa Carcinoma de cervixhumano Poliovis, Adenovurus
RD Rhabdomiosarcoma humano Poliovirus, Herpes simplex
PK 15 rin porcino Estomatitis vesicular,Parvovirus porcino.
A. albopictus Larva de Aedes albopictus Arbovirus.
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MEDIOS DECULTIVO...MEDIOS DECULTIVO...
MEMMedio de
crecimientoMedio de
mantenimientoMedios
selectivosMedios de
congelacin
RequerimientoMnimo
MEM MEMTipo declulas
MEM
SSB, a.a.
vitaminas
10-15% 2% SFBPropsito del
cultivo
50% SFB
Base para losdems medios
SFBIntervalo desubcultivos
Crecimientoutilizacin
8% dimetilsulfoxido
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Factores basicos paralaFactores basicos paralasupervivenciacelular...supervivenciacelular...
Presin
osmtica
pH
CO2 Oxigeno
Agua
SSBVitaminas
A.A. Suero
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Ami ci s it mi s l s tr s c mpuest s* r te s
requeri sen l s
medi sdefinidos
li resdesuero
Ar inina istena lutamina istidina Isoleucina eucina isina etionina enilalanina Treonina Triptofano Tirosina alina
iotina olina olato icotinamid
a
antotenato iridoxal Tiamina i oflavina
aCl Cl aH
2PO
4 aHCO3 CaCl2 Cl2
lucosa
Penicilina
streptomicina
Anfotericina
ojofenol
uero fetal
ovino
Insulina Transferrina actoresde
crecimiento
especficos
Tabla1. equerimientosmolecularesdeunmediodecultivoparavirus.
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Obtencin de las clulas..Obtencin de las clulas..
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Unin acolorantes
acoplados acolorantes
fluorescentes
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MICRODISEPCIN POR CAPTURA DE
LASER
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Contenedores para cultivo celularContenedores para cultivo celular
A: Fraso T. B: Frasco triple.C: Botellas rodantes. D: Biorreactor.E: Frasco con pipetas.
F: Frascos con agitacin.
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Contaminacin delosContaminacin delos
cultivoscell...cultivoscell...La contaminacin puede tener varios origenes:Tejidos originales
Productos biolgicos (suero mycoplasma R apenicilina)El personal del laboratorio con su propia floraDel medio ambiente (laboratorio- material)
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Cuando esta presente encultivos celulares, no
siempre resulta en
alteracionesmicroscpicas de lasclulas o del medio;
muchas infecciones crecenlentamente y pueden tener
los siguientes efectos:
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Nivelesy normasdeseguridadNivelesy normasdeseguridad
Nivel1. Nopresentanpeligrosreconocidos.
Nivel2. SeempleanmaterialesdeorigenprimarioquenoseconoceelriesgodeinfeccinoquetienenlaposibilidaddequeenlasmuestrascontenganVIH, TBC,hepatitisB uotrospatgenos.
Nivel3. Sumanejopresentaunriesgopotencial.
Nivel4. Extremadamentepeligrosos.
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Contajecelular...Contajecelular...
Porcentaje de viabilidad (%) = Nmero de clulas vivas/Nmero declulas totales * 00 (>85-90% se siembra).
Nmero de clulas vivas/ml = Clulas contadas vivas x factor dedilucin x 04
Nmero de clulas necesarias = Nmero de placas x la mitad delvolumen de cada placa x clulas viables ( .350.000 para neuronas).
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Ventajas...Ventajas...
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CULTIVO DE CELULAS INFECTADA CON SARAMPION 7 DIASPOST INOCULACIN SE OBSERVAN CLULAS GIGANTES Y
MULTINUCLEADAS (40X)
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SE OBSERVAN INCITOS (AGRUPACIONESDE CLULAS) EN00X
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CLULASVERO SIN INFECTAR 48 HORAS POS INFECCION.
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CLULASVERO SIN INFECTAR, SE OBSERVA BIEN DEFINIDOEL CITOPLASMA, LOS NUCLEOS CON SUSU RESPECTIVOSNUCLEOLOS.
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CLULASVERO 24 HORAS POS INFECCION
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CELULAS DE HIGADO DE CONEJO TEIDAS CON GIMSA , 48HORAS POS INFECCION ( 00X) NORMALES.
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CLULASDE HIGADO DE CONEJO SIN INFECTAR, SEOBSERVAN LOS NUCLEOLOS Y CITOPLASMA SINAFECTAR.
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CLULAS GIGANTES POR EFECTO CITOPATICO (CULTIVO DE CELULAS DE CONEJO) CAUSADO PORVIRUS DE Herpes zoster.
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CLULASDE HIGADO DE CONEJO INFECTADAS con virusHerpes Zoster.
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INFECTADA Vs NO INFECTADA
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