1

RAPORT ȘTIINȚIFIC

privind implementarea proiectului Ingineria metabolică la Escherichia coli pentru obţinerea 1,4-butandiolului din glucoză şi glicerină şi conversia

catalitică a acestuia la compuşi cu valoare adăugată” (METABCHEM)

Cod proiect: PN-II-PT-PCCA-2013-4-1090, Nr. 44/2014

Perioada de implementare: 01. Ianuarie – 05. Decembrie 2015

I. REZUMATUL ETAPEI

Proiectul propune dezvoltarea unei tehnologii hibride pentru obținerea de 1,4-butandiol, urmărind obiectivele specifice: 1. Valorificarea biologică a deșeurilor industriale ca glucoza sau glicerina rezultat din producția biodieselului; 2. Crearea tulpinilor modificate genetic cu caracteristici îmbunătățite pentru randament ridicat;

3. Obținerea din resurse regenerabile produse cu valoare adăugată, ca 1,4-butandiol;

4. Optimizarea condițiilor de fermentare privind obținerea de 1,4- butandiol din glucoză sau glicerină;

5. Transformarea de 1,4-butandiol la THF și PBD;

6. Caracterizarea catalizatorilor nano. Lucrările derulate în perioada raportată fac parte din Etapa II: “Analiza şi optimizarea căilor metabolice în E. coli pentru producţia de BDO din resurse regenerabile ca glucoza sau glicerina” a proiectului de cercetare.

Rezultatele etapei cuprind următoarele:

Identificarea genelor/reacțiilor ce vor fi eliminate pentru îmbunătățirea producției BDO

Identificarea fenomenului diauxic în cazul BDO

Dezvoltarea metodelor analitice de determinare calitativa si cantitativa a 1,4-butandiolului si a acidului succinic din medii de cultura

Clasificarea genelor/reacțiilor din noua cale biosintetică

Identificarea de specii active pentru reacţiile de oxidare

Tehnologia catalitică heterogenă de transformare a 1, 4-butandiolului (BDO) la gamma-butirolactonă

Condițiile de policondensare a BDO-lui cu SAC

Diseminarea rezultatelor s-a efectuat prin participarea la workshop și conferințe internaționale (Anexa 11):

A. Tirsoaga, M. Verziu, B. Jurca, E. Kemnitz, V. I. Parvulescu, S. M. Coman, Designing Nb based nanocomposite catalysts for the one-pot synthesis of lactic acid from cellulose, 3rd International Symposium on Green Chemistry, La Rochelle, France, May 3-7, 2015 (POSTER).

I. Podolean, M. Tudorache, V. I. Parvulescu, S. M. Coman, Green synthesis of succinic acid in heterogeneous

catalysis, 11th International Conference on Renewable Resources and Biorefineries, York, UK, June 3 – 5, 2015 (ORAL PRESENTATION).

I. Podolean, B. Papuc, M. Tudorache, V. I. Parvulescu, S. M. Coman, New insights in the catalytic oxidation of

levulinic acid to succinic acid, 12th European Congress on Catalysis – EuropaCat-XI, Kazan, Russia, 30 August – 4 September, 2015 (POSTER).

A. Tirsoaga, B. Jurca, V. I. Parvulescu, S. M. Coman, Magnetic nanocomposites: design, synthesis and application

in biochemicals synthesis, 12th European Congress on Catalysis – EuropaCat-XI, Kazan, Russia, 30 August – 4 September, 2015 (POSTER).

2

Zsolt Bodor, Beáta Ábrahám, Réka Sinkler, Lányi Szabolcs, Orbán Csongor, Ildikó Miklóssy, FERMENTATION STRATEGIES FOR 1,4-BUTANEDIOL PRODUCTION FROM BIO-INDUSTRY BYPRODUCTS, 10th European Congress of Chemical Engineering, Nice, September 27-October 1, 2015, France (POSTER).

BODOR Zsolt, MIKLÓSSY Ildikó, SINKLER Réka, ORBÁN Kálmán Csongor, LÁNYI Szabolcs, ÁBRAHÁM Beáta, An in silico Re-design of the Metabolism in Escherichia coli for Increased 1,4-butanediol Production from Renewable Feedstocks, 21st International Conference on Chemistry, Șumuleu Ciuc, September 23-27, 2015, Romania (ORAL PRESENTATION).

MIKLÓSSY Ildikó, BODOR Zsolt, SINKLER Réka, ORBÁN Kálmán Csongor, ÁBRAHÁM Beáta, LÁNYI Szabolcs, Production Possibilities of Non-natural Metabolites by Genetic Engineering, 21st International Conference on Chemistry, Șumuleu Ciuc, September 23-27, 2015, Romania (ORAL PRESENTATION).

Réka SINKLER, Ildikó MIKLÓSSY, Zsolt BODOR, Kálmán Csongor ORBÁN, SZABOLCS Lányi, Beáta ÁBRAHÁM, Critical Analysis of Enzyme Selection, Expression, and Production Potential of New Biosynthetic Pathway Enzymes in Different Knock-out Mutants of Escherichia coli, XIXth Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering-RICCCE, Sibiu, September 2-5, 2015, Romania (ORAL PRESENTATION).

Activitățile II.1. Caracterizarea fluxurilor reacțiilor importante folosind metoda FBA; II.2. Clasificarea reacțiilor în funcție de impactul produs asupra căilor metabolice și determinarea redundanței; II.3. Analiza relațiilor dintre gene și reacții, determinarea genelor critice cu cele mai multe conexiuni; II.4. Clonarea genelor care codifică enzimele necesare pentru biosinteza BDO; II.5. Evaluarea calitativă a produșilor țintă sintetizat biologic folosind o nouă cale biosintetică; II.6. Biosinteza metabolitului cheie (acid 5-hidroxi-2-oxopentanoic) din glucoză şi glicerină; II.7. Conversia biochimică a 5H2OA la BDO; II.8. Determinarea activității genelor heterologe prin analiza expresiei ale genelor; II.9. Optimizarea cantităţii de specii active necesari pentru reacțiile de oxidare Partea 2; II.10. Workshop 1; II.11. Reproiectarea metabolismului celular prin inginerie metabolică, modificarea genetică a tulpinii gazdă pentru producerea de BDO la randament ridicat și la o rată de creștere constantă; II.12. Analiza complexă a transcriptomului în diferite condiții folosind microarray scanner; II.13. Conversia BDO obținut folosind microorganisme modificate genetic la gamma-butirolactona.

II. DESCRIEREA ȘTIINȚIFICĂ ȘI TEHNICĂ

La ora actuala este unanim acceptat ca transformarea biomasei in molecule platforma ar putea reprezenta o alternativa viabila la dependenta industriala de zacamintele fosile [1]. Deoarece, pentru sinteza multora dintre moleculele vizate, este necesara aplicarea chimiei de oxidare, sunt lesne de inteles eforturile multor grupuri de cercetare in dezvoltarea unor catalizatori solizi eficienti in procesele de oxidare a biomasei, si in prezenta unor agenti de oxidare prietenosi cu mediul, de tipul oxigenului molecular sau a apei oxigenate. Nu mai putin importante sunt studiile realizate pentru dezvoltarea unor catalizatori usor de recuperat si reciclat din mediul de reactie [2]. O astfel de abordare este impusa de faptul ca in timpul separarii si a recuperarii catalizatorilor (prin filtrare sau centrifugare) acestia pot suferi degradari care determina diminuarea avansata a eficientei catalitice.

In acest context, oxidarea selectiva a zaharurilor C6 (glucoza si fructoza) a fost recunoscuta in ultimii ani ca un domeniu extrem de important al chimiei de oxidare [3], prin sinteza unor chimicale, precum acidul gluconic, glucuronic, glucaric sau 2-ceto-D-gluconic, esentiale pentru multe ramuri industriale [4, 5]. Astfel de procese sunt realizate, de cele mai multe ori, la temperaturi de 20-80°C si la un pH slab bazic (pH = 7-9), cu aer sau oxigen in faza apoasa si in prezenta unor catalizatori pe baza de metale platinice. Deoarece catalizatorii bi- si multi-metalici sunt mai activi, mai selectivi si mai rezistenti la dezactivare decat catalizatorii mono-metalici, Pt poate fi inlocuita cu astfel de catalizatori [6]. O alternativa la catalizatorii bimetalici o reprezinta combinarea catalizatorilor mono-metalici cu modificatori organici, precum compusi cu N sau P, care se adauga direct in mediul de reactie [7].

Una din cele mai mari probleme ale lumii moderne o reprezintă acumularea deşeurilor obţinute din mase plastice ce nu se degradează sub acţiunea factorilor de mediu. În ultimii ani s-au făcut eforturi în vederea înlocuirii acestor materiale cu unele biodegradabile obţinute din resurse regenerabile [8, 9]. Procesul de biodegradare al unor astfel de polimeri are loc cu formarea CO2, CH4, H2O, şi alţi compuşi naturali [10] ce nu prezintă risc pentru mediul înconjurător.

3

Printre materialele ce satisfac aceste cerinţe se numără poliesterii aliftici. Polibutilen succinatul (PBS) este un poliester alifatic ce se obţine prin reacţia dintre acidul succinic (SAC) şi 1,4-butandiol (BDO). De remarcat este faptul că SAC ocupă locul doisprezece în topul compuşilor chimici bio obţinuţi din zahăr, iar BDO se obţine cu uşurinţă prin reducerea SAC, PBS fiind astfel un polimer obţinut din monomeri bio [8]. SAC poate fi considerat o „platformă chimică” datorită uşurinţei cu care se obţine prin procese biotehnologice şi versatilităţii sale de a conduce la diferiţi compuşi chimici (Anexa 1) [11].

In cele ce urmeaza vor fi prezentate rezultatele experimentale obtinute in studiul oxidarii glucozei si a 1, 4- butandiolului (BDO) in conditii de oxidare catalitica umeda, in prezenta catalizatorilor de tip Ru@NPM (preparati si caracterizati in Etapa I) precum si date experimentale de sinteza si caracterizare fizico-chimica a unor sisteme nanocatalitice, cu proprietati magnetice, de tipul: Nb2O5@SiO2@NPM (cu 30 si 60% Nb2O5) prin metode de impregnare si coprecipitare. Catalizatorii preparati s-au testat, de asemenea, in reactii de oxidare a 1, 4-butandiolului si degradare a glucozei. Sinteza PBS are loc printr-o reacţie de polimerizare în două etape, esterificare şi policondensare, schema generală de reacţie fiind prezentată în Figura 1. Esterificare

Policondensare

Figura 1. Schema generală de sinteză a PBS din SAC şi BDO

Proprietăţile polimerului pot să fie influenţate şi de condiţiile de reacţie (oxidarea, temperatura de lucru, puritatea materiilor prime, etc.) [9]. Pentru evitarea oxidării în timpul polimerizării ambele etape de sinteză au loc sub azot în vederea eliminării oxidării. O descriere detaliată privind sinteza PBS din SAC și BDO se găsește în Anexa 2. Formarea de THF ca produs secundar de reacţie are drept efect obţinerea de PBS cu mase moleculare mici. BDO are tendinţa de a forma THF, iar la temperaturi joase (120 °C) acest proces este catalizat de aciditatea AS [12]. Obţinerea unui polimer cu masa moleculară dorită se poate realiza prin alegerea unei temperature optime de polimerizare şi a unui catalizator efficient. Mai multe studii s-au ocupat de determinarea eficienţei catalizatorilor de policondensare utilizaţi în sinteza PBS [8, 12, 13]. În cazul oxizilor metalici de Sb şi Ge [8] s-a observat că aceştia au eficienţă bună atunci când sunt utilizaţi împreună cu acizi ce conţin grupări hidroxil (acid lactic sau gliolic), aceştia având rol de agenţi de chelatizare. S-a mai arătat că aceşti catalizatori au totuşi eficienţă mai mică decât cei de Ti. Recent studiul lui Ferreira et al. [13] a arătat că Ti este cel mai eficient catalizator pentru sinteza PBS. În acelaşi studiu s-a arătat că un efect mare asupra masei moleculare medii gravimetrice (Mw) şi asupra viscozităţii polimerului o are concentraţia catalizatorului. De asemenea temperatura de sinteză influenţează proprietăţile finale ale PBS, o temperatură prea ridicată putând să conducă la degradarea polimerului. O altă problemă ce apare în sinteza de PBS o reprezintă toxicitatea catalizatorilor de policondensare [12]. Toxicitatea cea mai scăzută o are Ti, acesta fiind utilizat inclusiv în medicină. De asemenea derivaţii de Zr şi Bi sunt consideraţi siguri din punct de vedere al toxicităţii. Deşi Ge şi Hf nu sunt consideraţi toxici, unii derivaţi ai acestora sunt consideraţi toxici, iar derivaţii de Ge au efecte negative asupra vieţii marine. Stibiul este toxic, ceea ce limitează şi utilizarea derivaţilor săi.

HO OH

HO OH

O

O

+ HO

O O

O H

O

O

p

+ p+1 H 2 O

Vid +Cat HO

O O

O H

O

O

p O

O H

O

O

+ HO OH

Cat + H2O n

4

Toxicitatea derivaţilor organometalici de Sn depinde de natura grupărilor organice. Astfel compuşii monoorganici şi diorganici sunt consideraţi siguri, iar cei triorganici sunt toxici. Compuşii tetraorganici au toxicitate redusă, dar se descompun în triorganici. Compusul staniului cu trioctil are toxicitate mică, în timp ce compuşii cu trifenil şi triclorhexil au toxicitate ridicată. Ordinea toxicităţii conpuşilor staniului

în funcţie de tipul grupării organice este: trietil metil propil butil. PBS este un polimer semicristalin (Figura 2), această proprietate a sa putând să influenţeze atât proprietăţile chimice şi mecanice ale polimerului cât şi biodegradabilitatea acestuia [10, 14, 15]. PBS poate prezenta două forme de cristalinitate: forma α se obţne atunci când PBS este cristalizat prin topire statică, în timp ce forma β se obţine sub stres mecanic. În vederea îmbunătăţirii biodegradabilităţii, dar şi a proprietăţilor fizice ale PBS s-au sintetizat atât copolimeri ai acestuia cât şi compozite ale PBS [10, 16-18]. PBS este un polimer ce se degradează printr-un mechanism de hidroliză [19]. Hidroliza are loc la legătura ester şi are ca rezultat diminuarea masei moleculare a polimerului, permiţând astfel degradarea acestuia sub acţiunea microorganismelor. Atât proprietăţile mecanice şi chimice bune, biodegradabilitatea cât şi faptul că acest polimer se obţine din monomeri ieftini proveniţi din biomasă a făcut ca PBS să se impună în ultimul timp pe piaţa mondială ca înlocuitor al unor materiale plastice ce nu se biodegradează. PBS se utilizează în realizarea de plase pentru supermarket, folie pentru ambalaje sau folie pentru mulci şi alte articole. Luându-se în considerarea creşterea cererii de materiale biodegradabile la nivel mondial, este de aşteptat ca cererea de PBS să crească rapid.

Figura 2. Structura cristalină a PBS (a. forma α, b. forma β) [15]

Metode Experimentale

I. Caracterizarea fluxurilor reacțiilor importante folosind metoda FBA

Fluxurile celor mai importante reactii din metabolismul celular au fost caracterizate în diferite condiții de mediu ținând cont de condițiile de fermentare. Inputurile simulărilor au fost limitate la mediul minimal (M9) care conține numai săruri minerale iar pentru sursa de carbon a fost selectat glucoza sau glicerina cu diferite rate de absorbție/utilizare. Rata de absorbție a glucozei și a glicerinei a fost fixat la 10 respectiv 20 mM gDCW-1h-1 pentru fiecare condiție în parte. Pentru condițiile microaerobe consumul de oxigen a fost fixat la 5 mM gDCW-1h-1 iar pentru condiții anaerobe consumul oxigenului a fost blocat- 0 mM gDCW-1h-1. Distribuția fluxului de carbon a fost vizualizat folosind OptFlux [20] și au fost analizate în detaliu luând în considerare valorile fluxurilor și astfel am reușit să identificăm cele mai importante enzime, căi în condiția respectivă. Enzimele, fluxurile au fost caracterizate în cazul tulpinilor cu 2, 3 și 4 mutații.

Optimizarea bi-level cu OptKnock [21] sau GDLS [22] durează foarte mult în cazul modelelor metabolice unde numărul reacțiilor este de ordinul miilor. Pentru a reduce timpul de calcul reacțiile cu impact nesemnificativ asupra BDO au fost excluse, astfel a fost creat o listă pentru reactii cu posibil efect asupra producției butandiolului și în același timp asupra ratei de creștere (Anexa 2). Este important sa mentionam ca rata de creștere poate fi influențată de condițiile de cultură și de modificările genetice. Metabolismul celular poate fi analizată prin utilizarea: ratei de producție, randamentului de produs și productivitatea specifică (ex. de substrat). Analizele in silico au fost realizate în MATLAB, (Mathworks Inc,, Natick, MA), utilizând SBML Toolbox (versiunea 4.1.0,

http://sbml.org/software/sbmltoolbox/) și COBRA Toolbox (versiunea 2.0.5,

5

http://opencobra.sourceforge.net/openCOBRA/Welcome.html). Optimizarea a fost realizată cu ajutorul pachetului

Gurobi (versiunea 5.6 www.gurobi.com) si TOMLAB CPLEX (Tomlab Optimization Inc., San Diego, CA, USA) [23,24).

II. Clasificarea reacțiilor în funcție de impactul produs asupra căilor metabolice și determinarea redundanței

Pentru clasificarea reacțiilor în funcție de rolul și impactul produs asupra funcției obiective a fost folosit pFBA (parsimonious Flux Balance Analaysis) [25]. Este de așteptat ca, atunci când celulele cresc exponențial va fi o selecție pentru cele cu rate de creștere ridicate și va exista un avantaj considerabil în cazul celulelor cu cele mai puține enzime active. pFBA similar cu FBA optimizează funcția obiectivă și minimizează fluxul prin modelul metabolic clasificând fiecare gene/reacție în parte în funcție de modul în care aceasta contribuie la soluția optima. Genele sunt clasificate în șase categorii: 1. Esențiale pentru creșterea optimă, 2. pFBA optima (gene neesențiale care contribuie la creșterea optimă și la minimizarea genelor cu flux), 3. ELE- mai puțini eficienți din punct de vedere enzimatic, 4. MLE- mai puțini eficienți din punct de vedere metabolic, 5. pFBA no-flux (fără flux) și 6. Blocate (gene asociate cu reacții blocate). Calculele au fost făcute pentru tulpina sălbatică, pentru tulpina sălbatică cu calea biosintetică și pentru mutante cu 3 (ΔPFL, ΔLDH, ΔADH) respectiv 4 mutații (ΔPFL, ΔLDH, ΔADH și ΔGLUDy) în condiții microaerobe și anaerobe având drept sursă de carbon glucoza sau glicerina.

Creșterea diauxică a fost identificata cu ajutorul metodei dFBA [26], care poate fi utilizat pentru a analiza procesele dinamice (cvasi- staționare) și dacă concentrația butandiolului se schimbă în timpul fermentației în cazul în care concentrația glucozei sau ale glicerinei scade la un punct critic.

III. Analiza relațiilor dintre gene și reacții, determinarea genelor critice cu cele mai multe conexiuni

Evaluarea in silico pe scară largă a deleţiei unor gene a fost efectuată, pentru a determina impactul genelor eliminate asupra ratei de creștere atat pentru tulpinile sălbatice cat și pentru cele mutante. Genele au fost clasificate ca: neletale (creștere maximă neschimbată), cu impact redus de letalitate (reducând creșterea maximă) și letale (fără creștere). Au fost analizate impactul deleției tuturor genelor (1363) asupra tulpinile de tip sălbatic și tulpinile mutante în diferite condiții de mediu și de substrat. Astfel a fost obținut distribuția creșterii ratei relative pentru fiecare gene din model.

IV. Clonarea genelor care codifică enzimele necesare pentru biosinteza BDO

Enzimele (elementele fundamentale ale căilor biosintetice heterologe) pot fi obținute din diferite surse, iar o serie de baze de date, secvențe și proprietăți funcționale ale enzimelor stau la baza unei selecții raționale ale enzimelor care catalizează pasurile individuale ale căilor biosintetice heterologe. Bazele de date de secvențe proteice facilitează o abordare filogenetică a problemei, prin selectarea genelor paraloge care codifică enzime cu funcții similare [27]. Diversitatea asigurată de evoluția enzimelor (enzime mai robuste, mai eficiente, cu specificitate de substrat diversificată) oferă posibilitatea selecției enzimelor pentru conversia unor substraturi non-naturale, iar printr-o abordare modulară, enzimele pasurilor individuale provenind din diferite fundaluri biosintetice, pot fi combinate pentru a realiza o serie de reacții într-un scop definit [28]. Tulpina E.coli reconstruită cu modificări metabo-genetice publicată în ref [29] şi Genomatica poate fi utilizată pentru producerea BDO. Cu toate acestea, căile metabolice introduse pentru biosinteza BDO sunt complicate, în cazul acidului succinic ca substrat intermediar fiind necesare şapte reacţii iar în cazul α-cetoglutaratului şase reacții favorabile termodinamic. S-a propus, astfel în această etapă a proiectului, construirea unei căi biosintetice mai puţin complicate (Figura 3) a BDO în E.coli, capabilă să utilizeze şi să transforme materiile prime regenerabile, precum glucoza şi glicerolul la compuşi chimici cu valoare adăugată. Calea biochimică proiectată pentru 1,4-butandiol pornește de la metabolitul intermediar al ciclului tricarboxilic, succinil-CoA, care poate fi convertit în 4-hidroxibutirat de enzima adhE2 din Clostridium acetobutylicum [30]. Gruparea carboxil al produsului intermediar poate fi activată de enzima nativă succinil-CoA-sintetază sau de enzima heterologă AtoI (acetat CoA transferaza) din Acetobacter aceti. În pasul final al căii metabolice, 4-hidroxibutiril-CoA va fi convertit la 1,4-butandiol în mod similar reacției catalizate de alcool/aldehid reductază sau malonil-CoA reductază. Reacțiile heterologe pentru formarea de 1,4-butanediol s-au selectat pe baza surselor din literatură și a bazelor de date specifice (KEGG, Brenda), urmat de analiza critică a proprietăților–cheie (specificitate de substrat, kcat, masă moleculară, molecular weight, subunități) și proprietățile genetice (conținut GC content, distanță filogenetică față de tulpina-gazdă.

6

V. Evaluarea calitativă a produșilor țintă sintetizat biologic folosind o nouă cale biosintetică

Scopul acestui studiu este dezvoltarea de metoda analitica de determinare calitativa si cantitativa a 1,4-butandiolului din medii de cultura.

Metoda analitica sensibila si selectiva utilizata cel mai adesea pentru determinarea compusilor organici este gaz cromatograful cuplat cu spectrometrul de masa (GC/MS). Capacitatea gaz cromatografului de a separa compusi chimici aflati in amestecuri complexe depinde de urmatorii factori: utilizarea coloanelor de separare cromatografica de dimensiuni si faze stationare optime pentru separarea compusilor de interes, prezenti in proba; stabilirea conditiilor de lucru optimizate (debit eluent, temperaturi de lucru, conditii specifice pentru modificarea temperaturii sistemului). Probele de medii de cultura sunt prea complexe pentru a putea fi analizate dupa o metoda standard si de aceea se impun o serie de operatii preliminare de prelucrare a probei, in scopul eliminarii interferentelor si concentrarii compusilor de interes. Tehnica de extractie utilizata in cadrul acestui studiu a fost extractia lichid-lichid, pentru care a fost testata trei variante: a) extractia cu acetat de etil; b) extractia cu toluen : tert-butil metil eter (1:1); c) extractia cu toluen: dietil eter (1:1). Metodele de extractie lichid-lichid au fost combinate cu metoda de derivatizare, utilizand N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA). Derivatizarea s-a efectuat, dupa extractia lichid-lichid, adaugand 50 µL de BSTFA si incuband probele la 60℃ timp de 1 h. Compuşii sililaţi in acest studiu sunt: 1,4-buntandiol-2TMS (M=234), 1,5-pentandiol-2TMS (M=248), acid succinic-2TMS (M=262), respectiv acid glutaric-2TMS (M=276). Coloanele capilare cromatografice utilizate in acest studiu au fost de doua tipuri: una apolara, respectiv o coloana cu polaritate redusa; fiind vorba de coloana capilara avand faza stationara de 100% dimetil polisiloxan (1MS - apolara), respectiv coloana capilara cu faza stationara mixta de 5% fenil 95% dimetil pilosiloxan (5MS – polaritate redusa).

a) Optimizarea conditiilor gaz cromatografice si de spectrometrie de masa pentru coloana HP-1MS Probele au fost analizate utilizand un program de temperaturi care incepe analiza la temperatura de 60°C

(mentinuta 2 minute), urmata de o incalzire cu un gradient de 20°C/minut pana la 180°C, dupa care se aplica un gradient de 30°C/minut pana la atingerea temperaturii de 300°C, unde este mentinut timp de 5 minute. S-a utilizat un spectrometru de masa, de tip cuadrupol, prevazut cu o sursa de ionizare cu impact electronic (EI).

In acest studiu a fost urmarit separarea cromatografica a 1,4-buntandiol-2TMS –lui, 1,5-pentandiol-2TMS -lui, acidului succinic-2TMS, acidului glutaric-2TMS, respectiv acidului α-ketoglutaric-3TMS (M=362). Determinarea 1,5-pentandiol-2TMS –lui a fost introdusa cu scopul de a utiliza acest compus ca standard intern, pentru determinarea cantitativa a 1,4-buntandiol-2TMS –lui din probe reale, iar acidul glutaric-2TMS ca standard intern pentru determinarea cantitativa a acidului succinic-2TMS si a acidului α-ketoglutaric-3TMS.

Spectrele de masa characteristice inregistrate in regim online prin baleerea continua (full scan) a domeniului de masa 50-650 Dalton, obtinute pentru compusii de interes corespund cu o probabilitate ridicata celor prezenti in baza de date NIST.

Metoda SIM dezvoltata pentru detectia compusilor de interes extrasi din medii de cultura este urmatoarea: grupul nr. 1 ionii scanati sunt m/z 116, 177, 219, 234 intre 5.00 ÷ 6.50 minute; grupul nr.2 ionii scanati sunt m/z 69, 233, 248, 247, 262 intre 6.50 ÷ 7.50 minute; grupul nr. 3 ionii scanati sunt m/z 204, 261, 276 intre 7.50 ÷ 8.50 minute; grupul nr. 4 ionii scanati sunt m/z 291, 318, 347 intre 8.50 ÷ 17.00 minute;

Liniaritatea raspunsului spectrometrului de masa fata de cantitatea de substanta demonstreaza faptul ca exista o stricta proportionalitate intre cantitatea de substanta si intensitatea semnalului obtinut.

b) Optimizarea conditiilor gaz cromatografice si de spectrometrie de masa pentru coloana HP-5MS Gaz cromatograful a fost echipat cu o coloana capilara HP-5MS de lungime de 30 m; diametru interior de 0.25 mm;

grosimea stratului de faza stationara de 0.25 μm. Programul de temperatura pentru care se obtine o separare cromatografica satisfacatoare este urmatorul: 80°C (mentinuta timp de 2 minute) se creste cu gradient de 3°C/min la 116°C, urmat de un gradient de 20°C/min pana la atingerea temperaturii de 200°C, dupa care se creste in continuare pana la 300°C cu viteza de 50°C/min, unde se mentine timp de 5 minute.

VI. Conversia biochimică a 5H2OA la BDO

Sistemul de expresie pETDuet selectat în etapa anterioară a proiectului a asigurat realizarea unor vectori plasmidiali de coexpresie, capabili de a menține în formă funcțională genele aferente căii heterologe în diferite tulpini de E. coli. Vectorii conțin, ca marker de selecție, gena codificatoare a beta-lactamazei, care conferă rezistență la ampicilină celulelor purtătoare a vectorilor recombinați și reprezintă baza selecției și menținerii acestor celule în culturile de producție și de

7

exprimare. Harta de restricție a vectorului pGS1.1 (conținând genele identificate pentru realizarea căii biosintetice heterologe adhE2 și sucCD), cu evidențierea principalelor proprietăți.

VII. Obținerea tulpinilor de producție a 1,4-BDO

Culturile obținute din tulpinile optimizate metabolic (tulpina M14D3, din care s-au eliminat genele pflB, ldhA și adhE) transformate (tulpini conținând vectorul ADN pGS1.1) s-au realizat în volume de 100 mL, în mediu M9, suplimentat cu ampicilină pentru menținerea plasmidelor în cursul cultivării. În vase anaerobe (condițiile de anaerobioză fiind asigurate prin purjarea mediului de cultură cu CO2 înaintea incolulării). Inducerea exprimării genelor căii biosintetice s-a realizat cu 1 mM IPTG (izopropil-tiogalactopiranozidă), adăugată în momentul inoculării. Pe durata cultivării, s-a monitorizat creșterea numărului de celule prin măsurarea valorilor OD600, și s-au determinat concentrațiile metaboliților de interes în intervalele specificate din supernatantul culturilor de producție conform metodologiei bioanalitice elaborate.

VIII. Determinarea activității genelor heterologe prin analiza expresiei ale genelor

În vederea studierii expresiei genice ai vectorilor obținuți, la nivel de proteine, respectiv purificarea enzimelor individuale și determinarea preliminară a proprietăților enzimatice, s-a realizat exprimarea acestora în tulpini de expresie specializate. Sistemul vectorial ales oferă posibilitatea de a obține proteinele individuale în cantități ridicate (datorită promotorului puternic folosit), în forma proteinelor de fuziune, conținând în secvența de aminoacizi regiuni specifice (tag-uri) prin care se poate realiza separarea și purificarea proteinelor de interes prin cromatografie de afinitate, respectiv marcarea specifică prin anticorpi. Expresia controlată a enzimelor în celulele transformate E. coli BL21(DE3)Star, cu vectorii pGS1, pGS1.1 s-a realizat în culturi de 100/500 mL, în mediu LB suplimentat cu 50 µg/ml ampicilină. Culturile de producție s-au inițiat de la valori OD de 0.1 și s-au incubat la 37C cu agitare 250 rpm până la atingerea valorii de DO600 de 0.5-0.7 (faza logaritmică de creștere). Inducerea expresiei genice s-a realizat prin adăugarea la culturile de producție a agentului de inducere IPTG. Întrucât concentrația de inductor folosit poate influența semnificativ cantitatea de proteine exprimate, în special în cazul vectorilor de co-expresie, s-a stabilit concentrația optimă de IPTG folosit în teste preliminarii, cărora în restul experimentelor s-a folosit o concentrație de inductor de 0.5 mM. Producția de proteine s-a realizat timp de 4 ore, iar probe pentru separarea prin electroforeză și analiza proteinelor celular s-au luat în fiecare fază a experimentelor.

IX. Reproiectarea metabolismului celular prin inginerie metabolică, modificarea genetică a tulpinii gazdă pentru producerea de BDO la randament ridicat și la o rată de creștere constantă

Optimizarea tulpinilor de producție s-a realizat pornind de la rezultatele optimizării in silico prin algoritmul OptKnock și analiza fluxului de carbon, prin eliminarea căilor competitive căii biosintetice heterologe pentru 1,4-butandiol. Eliminarea căilor concurente s-a obținut prin deleția genelor-cheie, folosind sistemul de recombinare λ-Red [31]. Sistemul recombinazei λ-Red cuprinde trei gene: γ, β și exo. În cadrul procesului de recombinare între ssADN (ADN monocatenar) și oligonucleotidă proteina β se leagă de ssADN pentru a proteja ADN-ul monocatenar de atacul nucleazelor. Inactivarea unei anumite gene este preferabil să fie realizată prin recombinare omologă [31], în care o regiune a cromozomului se înlocuiește cu ADN-ul heterolog introdus. Aceasta se realizează în cazul în care procesul de transformare, deci introducerea secvenței de ADN străin în celula recipient, se realizează cu ajutorul unei casete de înlocuire [32]. Caseta cuprinde trei părți principale: 1) informațiile genetice dorite să fie introduse (în cele mai multe cazuri aceasta este gena pentru rezistență la antibiotice/genă-marker de selecție), 2) o regiune promotor, compatibilă cu celula recipientă și astfel exprimarea genei introduse poate fi realizată, 3) regiuni de flancare de mărimea 40-50 bp al căror secvență de nucleotide corespunde regiunilor terminale din gena care urmează să fie eliminată din celula gazdă.

X. Prepararea catalizatorilor pe baza de pentoxid de niobiu X.1. Impregnare

Nanoparticulele magnetice (MNP) s-au preparat prin urmatoarea metodologie: intr-o solutie de 6.5 g

Fe(NO3)3*9H2O in 160 ml H2O se adauga 1.6 g FeCl2 *4H2O. Amestecul obtinut se mentine la 90C sub argon, timp de 30

min. La aceasta se adauga brusc 12 ml NH3 (25wt%) cu formarea unui precipitat negru, care se lasa in atm inerta la 90C

8

aprox. 2-3 h. Magnetita formata se separa cu un magnet extern si se spala cu H2O de mai multe ori, pana la pH ~ 7 si se

usuca la 80C, 12-15 h. MNP s-au redispersat in baia cu ultrasunete, dupa care s-a adaugat etanol, 10 ml de NH4OH (25%), 1.50 ml TEOS

si s-au lasat pentru 8 h, sub agitare, la 40°C. Particulele acoperite cu SiO2 s-au spalat apoi cu apa si etanol, s-au uscat pentru 24 h la 80°C si s-au calcinat la 180°C, pentru o ora. Materialul obtinut s-a notat cu MNP@SiO2.

MNP@SiO2 s-au dispersat in solutie de NH4[NbO(C2O4)2(H2O)m (ANBO), in cantitati corespunzatoare obtinerii in catalizatorul final a 30 wt% sau 60 wt% Nb2O5. La solutia obtinuta, s-a adaugat o solutie de amoniac (28 wt%) in picatura, pana la precipitare completa. Precipitatul format s-a maturat la temperatura camerei, pentru 24 h, apoi s-a spalat pana la pH neutru. Catalizatorul s-a uscat sub vacuum la 40°C pentru 2 h, si s-a calcinat la 500°C pentru 8 h.

Catalizatorii preparati s-au abreviat: I.MNP@SiO2@Nb2O5(30%) - calcinat I.MNP@SiO2@Nb2O5(30%) - necalcinat I.MNP@SiO2@Nb2O5(60%) - calcinat

I.MNP@SiO2@Nb2O5(60%) – necalcinat

X.2. Co-precipitare

Pentru prepararea a unui gram de proba, solutia apoasa de ANBO (de la 0.11 la 1.4 g) s-a picurat in TEOS (de la 3.3 la 1.4 g) hidrolizat in prealabil cu HCl (0.05 M), la temperatura camerei, pentru circa 60 min. Raportul molar HCl/TEOS s-a mentinut la o valoare constanta de 4. Dupa aceasta etapa, in solutie s-au adaugat nanoparticulele magnetice (magnetita) si o solutie de amoniac (28 wt%) pana la precipitare completa. Precipitatul obtinut s-a maturat la temperatura camerei pentru 24 h, s-a spalat pana la pH neutru, s-a uscat sub vacuum la 40°C pentru 2 h, si s-a calcinat la 500°C pentru 8 h.

Catalizatorii astfel obtinuti s-au abreviat: II.MNP@SiO2@Nb2O5(30%) II.MNP@SiO2@Nb2O5(60%)

XI. Caracterizarea catalizatorilor

- Măsurătorile de difracție de raze X (XRD) au fost efectuate cu difractometrul Siemens D5000 cu radiația Cu Kα filtrată

de nichel (X = 1.5418Å) cu viteza de scanare 0.1 min-1 în intervalul 2Ө cuprins între 10 și 80. - Spectrele DRIFT (spectroscopie de reflectanţă difuză în infraroşu cu transformată Fourier) au fost înregistrate cu un spectrometru Thermo 4700 (400 scanări cu rezoluția 4 cm-1) în intervalul 600–4000 cm-1. - Spectrele Raman s-au colectat cu un spectrometru Horiba Jobin Yvon – Labram HR UV–Vizibil–NIR (200–1600 nm), cu un laser la o lungime de unda de 633 nm.

XI. Teste catalitice. Oxidarea glucozei si a 1,4- butandiolului

Testele de oxidare catalitica a glucozei si 1,4-butandiolului s-au realizat într-o autoclavă confectionata din sticlă, dupa cum urmeaza: la un amestec de 0.5 mmol glucoza (sau BDO) in 10 ml apa s-au adaugat 50 mg catalizator. Dupa inchiderea

autoclavei, aceasta s-a presurizat cu oxigen (10 atm) si amestecul s-a mentinut la temperaturi cuprinse între 150-180 C, sub o agitare de 800 rpm, pentru 1-4 ore. Daca in cazul 1,4-butandiolului parte din experimenta s-au realizat la 35°C, cu oxidant – apa oxigenata, in cazul oxidarii glucozei, parte din experimente s-au realizat in prezenta n-butilaminei (0.25 mmol).

XII. Analiza produsilor de reactie

Indiferent de materia prima transformata (glucoza sau BDO), dupa separare, produsii de reactie obtinuti s-au silanizat după următoarea procedură: la 50 mg probă de reacţie s-au adaugat 1 mL piridină şi 1 ml agent de silanizare (bis-trimetilsilil-trifloroacetamidă). Amestecul rezultat s-a menţinut la o temperatură de 60°C, timp de 30 min, sub agitare. După răcire la temperatura camerei, solventul s-a îndepărtat sub vacuum, la o temperatură de 35°C. Probele astfel obţinute s-au diluat cu 1 ml n-hexan şi s-au analizat cromatografic (GC-FID, Shimatzu). Identificarea produsilor de reactie s-a realizat cu ajutorul unui GC-MS (Carlo Erba Instruments QMD 1000, echipat cu o coloana Factor Four VF-5HT).

9

XII. Teste de policondensare

Avand in vedere conditiile de policondensare descrise in literatura, s-au efectuat o serie de teste abordand policondensarea in 3 etape: etapa 1 - esterificarea; etapa 2 - policondensarea primara, pana la viscozitate moderata; etapa 3 - avansarea gradului de policondensare. Etapa 1 s-a realizat in balon cu agitare mecanica intensa prevazut cu cot ASTM si utilizand ciclohexanul pentru distilarea extractiva a apei. Metoda are avantajul ca se desfasoara la temperatura de cca 79°C, de fierbere a azeotropului ciclohexan-apa. Terminarea eliminarii de apa nu conduce la cresterea temperaturii, ciclohexanul firbând la 80,5°C. La aceasta temperatura ciclizarea BDO la THF este nesemnificativa si astfel nu se modifica echimolecularitatea diol-diacid. Continuarea distilarii extractive in aceste conditii nu conduce la cresterea vizibila a viscozitatii, aparatul de distilare extractiva fiind astfel protejat de blocare. Pentru stabilirea conditiilor tehnice de transpunere a procesului s-au facut o serie de teste cu amestec de reactie echimolar format din 0,1 mol BDO si 0,1 mol SAC si cu continut de impuritati monofunctionale (alcool n-propilic - PrOH si acid propionic - AcPr, acid formic - AcF) precum si nivele diferite de umiditate. Durata distilarii extractive a fost de 3 ore, amestecul fiind racit in cca 15 min. dupa oprirea extractiei

XIII. Dezvoltarea metodelor de profilare a expresiei genice

Extracția de ARN total din culturile de producție s-a realizat prin GeneJetRNA Extraction kit (Thermo), conform recomandărilor producătorului, ARN total s-a obținut într-un volum de 30 uL, și s-a folosit pentru experimentele ulterioare, după determinarea concentrației de ARN și al purității (Cary 60, Agilent).

XIII.1 analiza prin microarray Analiza transcriptomilor se realizează printr-o platformă Affymetrix, folosind lame microarray GeneChip® E. coli Genome 2.0, potrivit recomandărilor producătorului. Probe de ARN total cu coeficientul RIN (RNA integrity number)>7 (determinat prin separarea probelor pe chip ARN Bioanalyzer, Agilent) se folosesc pentru hibridizarea pe microarray, potrivit instrucțunilor, urmată de reverz-transciere pronind de la 10ug de ARN și fragmentare cADN cu tartare cu DNază I și marcarea prin terminal-deoxinucleotidil-transferază. cADN complementar se hibridizează timp de 16 h la 50°C pe lamele de microarray, după care se procedează la spălarea și colorarea lamelor prin ficoeritrină, folosind platforma Fluidic Station FS450 (Affymetrix). Imaginile fluorescente se obțin print-un scanner GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), iar datele se analizează prin MAS5.0 (Microarray Suite/Software, Affymetrix).

XIII.2 analiza prin RT-Q-PCR Analiza cvantitativă a expresiei genelor relevante, normalizată la gena-housekeeping 16SrARN se realizează pornind de la 1 ug de ARN, folosind One-Step Superscript® Kit (Thermo) și amorse genă-specifice. Condițiile reacției real-time PCR: 10 min denaturare inițială la 94°C, 30 sec la 94°C, 30 sec la 55°C, 30 sec la 72°C (35xcicluri) iar detecția produșilor PCR se realizează la 83°C (Mx3005P, Agilent, cu software de analiza MxPro). Rezultate și Discuții

Caracterizarea fluxurilor reacțiilor importante folosind metoda FBA

Cele mai bune rezultate au fost obținute din succinil-CoA folosind calea biosintetică proiectată pentru obținerea de 1,4-butandiol (Figura 3).

10

Figura 3. Căile principale și calea biosintetică a BDO-lui

Producția maximă teoretică a butandiolului cu această cale biosintetică a fost obținut prin fixarea ratei de creștere la o valoare minimă de 0.1 h-1, după care a urmat maximizarea fluxului BDO. Astfel a fost evaluat stabilitatea căi și condițiile unde homofermentația este posibilă. Rezultatele obținute sunt prezentate în Figura 4.

Figura 4. Rata de producție teoretică maximă și randamentul (Yp/s(%)) Glc și Glyc reprezintă glucoza respectiv glicerina, aIndică unde este posibilă homofermentația

Așa cum ne-am așteptat randamentul teoretic maxim a fost obținut pentru glucoză în condiții microaerobe. Acest lucru se datorează cantității de carbon consumat, în cazul glucozei fiind mai mare. Însă randamentul (g/g) este mai mare în cazul glicerinei datorită stări sale reduse. Homofermentația poate să aibă loc numai în condiții microaerobe unde rata de absorbție a substratului este de numai 10 mM gDCW-1h-1. Randamente obținute (g/g): glucoza 10 mM#20mM WT/microaerobe 0.56#0.58, WT/anaerobe 0.41#0.49; glicerina 10 mM#20mM WT/microaerobe 0.58#0.63, WT/anaerobe NA#0.32.

-30

-20

-10

0

10

20

30

Glc Glc Glyc Glyc

Co

nsu

mp

tio

n/p

rod

uct

ion

rat

e

(mM

/gD

CW

/h)

Conditions

Theoretical maximum

Microaerobic Anaerobic

114%a82%

117% 98%

59%a64%

33%

11

Caracterizarea fluxurilor s-a realizat cu ajutorul FBA inclusiv OptKnock și GDLS. Rezultatele obținute sunt prezentate în Anexa 3.

Analizând rezultatele obținute se poate concluziona că rata de creștere poate fi cuplat cu rata de producție (creștere dependentă de butandiol) a butandiolului cu 3 KO în diferite condiții de mediu. Enzimele cele mai importante, cu cele mai multe apariții în procesul de optimizare au fost: ACALD (acetaldehid dehidrogenaza) de 38, ALCD2x (alcohol dehidrogenaza) de 24, PFL (piruvat format liaza) de 20, LDH_D (lactat dehidrogenaza) de 18 și TKT2 (transketolaza) de 15 ori. Aceste reacții sunt critice în redirecționarea fluxului de carbon spre BDO și sunt conectate direct la metabolismul central. Randamente obținute: în condiții anaerobe 0,37 g/g (randament-C mol 0,48); în condiții microaerobe aproximativ 0,19 g/g (randament C-mol 0.26) (rata de absorbție a substratului 10 mM) și 0.27 g/g (randament C-mol 0.37) (rata de absorbție a substratului 20 mM). Rezultate similare au fost prezentate în literatura de specialitate dar cu patru mutații (4 KO) [29].

Rezultatele obținute în cazul glicerinei sunt prezentate în Anexa 4. Combinația optimă găsită în cazul glucozei a fost testat și pentru glicerină. În condițiile date fluxul de carbon nu poate fi direcționat spre BDO și o cantitate mare de carbon se pierde sub formă de alanină sau valină. Cauza principală poate să fie fluxul insuficient de mare a enzimelor PPC (fosfoenolpiruvat carboxilaza) și PDH (piruvat dehidrogenaza), iar piruvatul în exces va fi transformat în alanina sau valină. Cele mai bune rezultate au fost obținute cu 4 mutați (PFL, ALCD2x, LDH_D, GLUDy (glutamat dehidrogenaza)) (unde producția poate fi cuplat cu rata de creștere), iar eliminare acidului acetic va avea un impact negativ asupra formarea biomasei. Enzimele cele mai importante, cu cele mai multe apariții în procesul de optimizare au fost: ACALD de 36, ALCD2x de 25 și GLYK (glicerol kinaza) de 22 de ori. Randamentul a fost calculat pentru condiția microaerobă luând în considerare rata specifică de utilizare a substratului (10 și 20 mM): 0,26 g/g (randment C-mol 0.36) și 0,42 g/g (randament C-mol 0,58). Rezultate similare au fost publicate în literatura de specialitate [33]. Analizând fluxurile diferențe semnificative au fost observate în cazul PPC, unde fluxul a fost de 6, 10 respectiv 7 ori mai mare comparat la tulpina sălbatică în condiții microaerobe, anaerobe (glucoza) și microaerobe (glicerină).

Clasificarea reacțiilor în funcție de impactul produs asupra căilor metabolice și determinarea redundanței

Clasificarea reacțiilor, mai ales ale căii biosintetice a butandiolului s-a realizat cu ajutorul pFBA în condiții diferite de mediu. Introducerea și modificarea căilor metabolice pentru a obține butandiol a schimbat importanța câtorva gene/reacții. Enzimele au fost clasificate în șase categorii (Figura 5), enzimele heterologe înainte de eliminarea căilor competitive au fost în categoria MLE (metabolically less efficient) și după optimizare au fost clasificate ca fiind în grupa pFBA-optima (non-essential genes contributing to the optimal growth rate and minimum gene associated flux). Diferențele între tulpina sălbatică și cele mutante sunt prezentate în Figura 5.

12

Figura 5. Categoriile obținute cu pFBA pentru tulpina sălbatică și cele mutante. Simulările au fost efectuate pentru fiecare condiție în parte pentru o clasificare exactă. Rezultatele sunt prezentate pentru condiții microaerobe și anaerobe cu rata de absorbtie 10 și 20 mM, A) glucoză 10 mM, B) glucoză 20 mM, C) condiții microaerobe 10 mM glicerină, D) glicerină 20 mM. WT- tulpina sălbatică microaerobe, Mut- mutante microaerobe, WT(a)- tulpina sălbatică anaerobe, Mut(a)- mutante anaerobe

Identificarea fenomenului diauxic în diferite condiții de mediu

Simulările au fost efectuate folosind metoda dFBA pentru a identifica dacă concentrația butandiolului se modifică în timpul creșterii diauxice. Rezultatele au confirmat că concentrația butandiolului rămâne neschimbat dacă substratul primar glucoza respectiv glicerina este consumat, de exemplu acidul acetic nu poate fi considerat ca sursă de carbon pentru obținerea butandiolului în condițiile date (Anexa 5).

Analiza relațiilor dintre gene și reacții, determinarea genelor critice cu cele mai multe conexiuni

Figura 6 prezintă impactul deleţiei a tuturor celor 1363 de gene asupra tulpinilor de tip sălbatic și tulpinilor mutante în diferite condiții de mediu și substrat. Este prezentată distribuţia creşterii ratei relative pentru fiecare deleţie de gene din model [23].

0 20 40 60 80 100

WT

Mut

WT(a)

Mut(a)

10

0

14

0

10

25

10

24

4

2

4

0

6

57

6

9

55

0

0

0

0

6

0

6

Number of reactions

Stra

ins

A

0 10 20 30 40

WT

Mut

WT(a)

Mut(a)

7

2

2

2

13

20

12

12

6

2

4

0

3

4

6

9

0

0

0

0

0

6

0

6

Number of reactions

Stra

ins

B

0 10 20 30 40 50

WT

Mut

0

7

15

15

14

4

7

8

0

0

0

7

Number of reactions

Stra

ins

C

0 20 40 60 80

WT

Mut

WT(a)

Mut(a)

0

20

16

8

33

16

7

34

6

16

6

12

18

3

28

5

0

0

0

0

0

7

0

3

Number of reactions

Stra

ins

Essential pFBAOpt ELEMLE Zero flux Blocked

D

13

Figura 6. Rezultatul deleţiei genelor din cele 1363 (tip sălbatic) și 1360/1359 (mutante) de gene, distribuţia ratei de creştere relative, tulpina de tip sălbatic pe glucoză (I.) şi glicerină (II.) în condiţii aerobe (A), microaerobe (B) şi anaerobe

(C), tulpinile mutante (ΔpflB, ΔldhA, ΔadhE respective ΔpflB, ΔldhA, ΔadhE, ΔGLUDy) în condiţii aerobe (D), microaerobe (E).

Utilizând glucoza ca sursa unică de carbon, 200 din cele 1363 de gene a modelului (Fig. 6 . IA) au fost considerate a fi letale (gene critice) iar 48 de deleţii genetice au fost considerate de a avea efect negativ asupra ratelor maxime de creștere în condiții aerobe în mediu minimal. După modificările genetice s-a constatat că numărul genelor critice nu s-a schimbat și modificări minime au fost găsite în lista de gene cu rate reduse de creştere maximă (Fig. 6. ID). Aceleași simulări au fost efectuate pentru condiții microaerobe și anaerobe. Predicţiile microaerobe au fost în strânsă corelație cu cele obținute în condiţii aerobe, 200 de gene critice pentru tulpini de tip sălbatic și tulpini mutante, 45 (Fig. 6. IB), respectiv 54 de gene (Fig. 6. IE) cu rate de creștere reduse. Eliminarea oxigenului din sistem crește numărul genelor esențiale (Fig. 6. IC) la 204 și rata de creștere a fost redusă semnificativ (~40%) în cazul a zece gene. Lista de gene esențiale ale tulpinilor mutante (Fig. 6. IF) a rămas aceeași ca și în cazul tulpinilor de tip sălbatic (condiții anaerobe), sugerând că

14

modificarea metabolismului redox nu schimbă numărul genelor esențiale. Cu toate acestea s-a observat o diferență semnificativă în cazul genelor cu rate de creștere reduse (în tulpinile de tip sălbatic 25, iar în tulpinile mutante 47). O tendință similară a fost observată după schimbarea sursei de carbon la glicerină. Din cele 1363 gene din model, 199 de gene au fost considerate letale sub condiţii aerobe (Fig. 6. IIA) și microaerobe (Fig. 6. IIB) și 204 (Fig. 6. IIC) în condiții anaerobe. Gene cu creştere maximă redusă au fost după cum urmează: 43 în condiţii aerobe, 42 în condiţii microaerobe și 21 în condiții anaerobe. Eliminarea genelor importante din metabolismul piruvatului nu a schimbat lista genelor esențiale sub condiţii aerobe (Fig. 6. IID) și microaerobe (Fig. 6. IIE) (199), comparativ cu tulpinele de tip sălbatic. În cea ce privește nodurile cu cele mai multe conexiuni din rețeaua metabolică se poate confirma că avem câteva gene, metaboliți, reacții cu multe legături (sunt cele mai importante) (Anexa 6). Ținând cont de condițiile de mediu (aerobe, microaerobe, anaerobe și sursele de carbon), precum şi de mutaţiile, se poate trage concluzia că profilul genelor cu rate de creştere maxime reduse a fost afectat mai mult de substraturi și de prezenţa oxigenului decât de modificările genetice.

Clonarea genelor care codifică enzimele necesare pentru biosinteza BDO Ca un prim pas în realizarea experimentelor in vitro s-a efectuat obținerea secvențelor codificatoare pentru enzimele individuale ale căii metabolice heterologe proiectate. În cazul enzimei care catalizează prima reacție a căii heterologe, adhE2 din Clostridium acetobutylicum, considerând această primă reacție ca fiind pasul determinant al vitezei seriei de reacții, o atenție sporită s-a dedicat proiectării secvenței codificatoare și optimizării acesteia privind utilizarea de codoni. Ținând cont de preferința de codoni prezentată de E. coli, secvența optimizată, preconizată a asigura exprimarea proteinei cu randament ridicat și în formă nativă, activă, s-a obținut prin sinteză chimică de către o companie specializată (GeneScript, Koreea de Nord), fiind verificată prin secvențiere. În cazul genei corespunzătoare enzimei sucCD endogene tulpinii de producție, s-au utilizat metodele de clonare moleculară direcționată prin PCR, utilizând amorse gene-specifice, completate cu secvențele de recunoaștere ale restrictazelor selectate, iar ca templat, ADN-ul genomic izolat din tulpina E. coli MG1655. Imaginea gelului de electroforeză prezentată în Figura. 7 reprezintă produșii din reacția PCR genă-specifică, bandele ADN rezultate fiind corespunzătoare masei moleculare relative ale genei--țintă (2037 bp pentru sucCD).

Figura 7. Produșii reacțiilor PCR realizate pentru izolarea secvenței codificatoare sucCD.

Drept rezultate ale acestei activități, s-a realizat obținerea secvențelor codificatoare pentru enzimele (adhE2 și sucCD) unei căi heterologe aplicabile pentru producția de 1,4-buatndiol.

Evaluarea calitativă a produșilor țintă sintetizat biologic folosind o nouă cale biosintetică

In acest studiu a fost urmarit separarea cromatografica TIC a 1,4-buntandiol-2TMS –lui, 1,5-pentandiol-2TMS -lui, acidului succinic-2TMS, a acidului glutaric-2TMS respectiv acidului α-ketoglutaric-3TMS (M=362). Separarea cromatografica optinuta in cazul utilizarii coloanei capilare HP-1MS este prezentata in Figura 8.

15

Figura 8. Separarea cromatografica TIC obtinuta in cazul utilizarii coloanei HP-1MS pentru 1,4-buntandiol-2TMS, 1,5-

pentandiol-2TMS, acidul succinic-2TMS, acidul glutaric-2TMS, respectiv acidul α-ketoglutaric-3TMS La indentificarea compusilor un rol important il reprezinta existenta bazelor de date (NIST) (Anexa 7). Metoda SIM dezvoltata pentru detectia compusilor de interes pentru coloana HP-5MS este urmatoarea: grupul nr.

1 ionii scanati sunt m/z 116, 177, 234 intre 7.90 ÷ 10.50 minute; grupul nr.2 ionii scanati sunt m/z 103, 143, 248 intre 10.50 ÷ 12.70 minute; grupul nr. 3 ionul scanat este m/z 248, intre 12.70 ÷ 13.40 minute; grupul nr. 4 ionii scanati sunt m/z 129, 262, 247 intre13.40 ÷ 15.00 minute; grupul nr. 5 ionii scanati sunt m/z 158, 261, 276 intre 15.00 ÷ 25.20 minute (Anexa 8);

Optimizarea conditiilor gaz cromatografice pentru coloana cu faza stationara mixta 5% fenil 95% dimetil polisiloxan (5MS – polaritate redusa) si optimizarea conditiilor de spectrometrie de masa

16

In acest studiu a fost urmarit separarea cromatografica TIC a 1,4-buntandiol-2TMS –lui, 1,5-pentandiol-2TMS -lui, acidului succinic-2TMS si a acidului glutaric-2TMS. Separarea cromatografica optinuta in cazul utilizarii coloanei HP-5MS este prezentata in Figura 9.

Identificarea compusilor de interes a fost realizata pe baza spectrelor de masa inregistrata in full scan cu ajutorul bazei de date NIST: 1,4-buntandiol-2TMS, 1,5-pentandiol-2TMS, acid succinic-2TMS, acid glutaric-2TMS cu o probabilitate ridicata (Anexa 9).

Concluzii Utilizand extractia lichid-lichid si metoda de derivatizare prezentata a fost posibil detectia compusilor 1,4-

buntandiol, 1,5-pentandiol, acid succinic si acid glutaric sub forma sililata prin sistemul cuplat gaz cromatograf – spectrometru de masa. Metoda GC/MS dezvoltata pentru coloana capilara HP-1MS si pentru coloana capilara HP-5MS este potrivita pentru determinarea compusilor: 1,4-buntandiol-2TMS , 1,5-pentandiol-2TMS, acid succinic-2TMS si acid glutaric-2TMS, iar rezultatele obtinute confirma proportionalitatea intre cantitatea de substanta si intensitatea semnalului obtinut. Acest studiu a confirmat posibilitatea utilizarii 1,5-pentandiolului ca standard intern pentru determinarea cantitativa a 1,4-butandiolului, respectiv utilizarea acidului glutaric pentru determinarea cantitativa a acidului succinic.

Cele doua metode analitice GC/MS SIM dezvoltate pentru coloana capilara apolara, respectiv pentru coloana cu polaritate redusa sunt adecvate pentru determinarea simultana a 1,4-buntandiolului, 1,5-pentandiolului, acidului succinic si acidului glutaric sub forma derivatizata din mediul de cultura.

Conversia biochimică a 5H2OA la BDO

Subclonarea secvențelor codificatoare în vectorul original pETDuet1 s-a realizat prin clivarea vectorului, respectiv al produsului de PCR/genei sintetice obținut în pasul anterior cu un set de două enzime de restricție selectate pentru fiecare genă introdusă, urmată de izolarea și purificare benzilor aferente fragmentelor vectorului, respectiv insertului.

Figura 9. Separarea cromatografica TIC obtinuta in cazul utilizarii coloanei HP-5MS pentru 1,4-buntandiol-2TMS, 1,5-pentandiol-2TMS, acidul succinic-2TMS si acidul glutaric-2TMS

17

Figura 10. Ilustrarea asamblării vectorilor recombinați. A. Harta de restricție și proprietățile plasmidei pGS1.1,

conținând genele heterologe adhE2 și sucCD (graphic realizat cu SnapGene). B. Verificarea asamblării corecte ale constructelor rADN conținând genele adhE2 și sucCD, prin digestie cu enzime de restricție, urmată de separare prin

electroforeză în gel de agaroză 1% și vizualizate cu fluorogenul RedSafe. (M: marker de masă moleculară GeneRuler 1kb (Thermo). 1. vectorul pGS1 neclivat. 2. fragmente de ADN obținute prin digestia pGS1 cu restrictazele EcoRI și HindIII,

fragmentul de 2584 bp corespunde genei adhE2. 3. vectorul pGS1.1 neclivat. 4. vectorul pGS1.1, digestie EcoRI-HindIII, fragmentul de 2584 bp corespunde adhE2. 5. vectorul pGS1.1, digestie EcoRI-HindIII-KpnI-PstI. 6. vectorul pGS1.1,

digestie AatII-XhoI, fragmentul de 2036 bp corespunde genei sucCD. 7. vectorul pGS1.1, digestie AatII-XhoI-SalI)

Fragmentele astfel obținute s-au utilizat în reacții de ligare, prin care s-a realizat integrarea direcționată a genelor de interes în vectorii pETDuet. Produșii reacțiilor de ligare s-au introdus în în tulpini speciale E. coli (Top10F) prin transformare prin metoda CaCl2/MgCl2 și s-au propagat în culturi bacteriene pentru menținerea în conformație corectă și replicarea vectorilor recombinați. Preparatele plasmidiale obținute în acest mod au fost verificate prin digestie cu enzime de restricție, rezultând în

fragmente ADN de dimensiuni specifice. Fragmente rezultate din reacțiile de clivare cu ER în cazul vectorilor pGS1, pGS1.1

sunt ilustrate în Figura 10B. Imaginile gelurilor de electroforeză, ilustrând verificarea vectorilor recombinați

demonstrează asamblarea corectă a plasmidelor proiectate, întrucât s-au obținut fragmente ADN cu dimensiunile

așteptate. Adițional, secvențele vectorilor s-au verificat și prin secvențiere, secvențele vectorilor dovedindu-se corecte,

în cadrul de citire corespunzător, cu regiunile N- și C-terminale adecvate.

Conform rezultatelor prezentate, s-a reușit obținerea, în conformația corectă și în cantitate adecvată, a doi vectori rADN

(pGS1, pGS1.1) conținând gene heterologe/endogene pentru calea biosintetică de obținere a BDO. În fazele următoare,

vectorii de coexpresie s-au utilizat pentru integrarea căii biosintetice în tulpinile optimizate metabolic, în vederea

obținerii tulpinilor de producție a BDO, respectiv în tulpini specializate de expresie, cu scopul de a determina expresia

genică la nivel de proteine, respectiv de a obține enzimele individuale în formă pură.

Obținerea tulpinilor de producție a 1,4-BDO

Rezultatele prezentate în Figura 11 reprezintă evoluția concentrațiilor substratului (sursa de carbon), a produsului-țintă, respectiv anumitor metaboliți de interes în timpul fermentațiilor. Cantitățile de acid acetic și acid succinic determinate în supernatantul culturilor MG14D3 și MG14D3-pGS1.1 sugerează formarea acestor metaboliți în ambele culturi, concentrațiile acestor doi acizi organici variind cu modificările înregistrate în concentrațiile substratului (Figura 11A). Întrucât tulpinile obținute necesită adaptare și optimizare în continuare (de ex. optimizarea promotorului, echilibrului redox, consumului de ATP), am anticipat ca formarea produsului-țintă să se situeze în ordinea de mg/L de mediu de cultură. Astfel s-au înregistrat valori de concentrație detectabile (determinări HPLC-RID) cu o valoare maximă de 0.73 mg/L după 50 ore de cultivare (Figura 11B).

18

Figura 11. Evoluția concentrațiilor substratului, produsului-țintă și al unor metaboliți de interes în cursul

fermentațiilor.A. Evoluția metaboliților de interes în culturi anaerobe ale tulpinilor M14D3 și M14D3-pGS1.1. B. Evoluția concentrațiilor substratului și al BDO în culturi anaerobe ale tulpinilor M14D3 și M14D3-pGS1.1.

Pe baza acestor rezultate se poate afirma, că s-a realizat un obiectiv de importanță majoră a temei, crearea unei noi căi biosintetice funcționale pentru BDO. Cu toate că randamentul producției s-a dovedit a se situa mult sub valorile predicțiilor in silico, sau a datelor din sursele bibliografice relevante, în perspectivă, producția de 1,4-butandiol ar putea fi îmbunătățită prin optimizări metabo-genetice (reglaj fin al promotorului, optimizarea siturilor de legare ribozomale din vectorii de expresie), și prin optimizarea condițiilor de fermentație (pH, asigurarea condițiilor de anaerobioză utilizând gaze inerte), respectiv prin experimente de adaptare de lungă durată.

Determinarea activității genelor heterologe prin analiza expresiei genelor

Astfel, în Figura 12 sunt reprezentate proteinele celulare obținute în cursul exprimării heterologe (proteine celulare din culturile bacteriene înainte și după inducere). Similar, probe din fracțiile proteice din extractul celular brut, fracția solubilă de proteine, respectiv proteinele prezente în diferite fracții în timpul purificării prin cromatografie de afinitate s-au păstrat, și s-au pregătit conform celor descrise mai sus, fiind apoi separate prin SDS-PAGE.

19

Conform rezultatelor prezentate, culturile E. coli Star sunt adecvate producției de proteine din vectorii recombinați pGS1, pGS1.1. În probele corespunzătoare a 1,2 și 4 ore de cultivare după inducere, pot fi remarcate benzile proteice aferente enzimelor adhE2 (94.6 kDa) și sucCD (subunități de 38 și 40 kDa), respectiv, cu mase moleculare aparente similare maselor moleculare teoretice. Benzile proteice ale enzimelor heterologe sugerează în mod vizibil o cantitate ridicată de enzime heterologe produse comparativ cu benzile aferente celorlalte proteine celulare. Fracțiile de eluție obținute după purificare prin cromatografie de afinitate sugerează însă o purificare incompletă în cazul proteinelor cu 6xHis-tag (adhE2), concentrații de proteine în aceste fracții variind între 0.497 – 0.540 mg/mL în fracțiile purificate în cazul adhE2, respectiv 3.06 mg/mL proteine în fracția de eluție în cazul sucCD, purificat prin metodă batch pe baza S-tag C-terminal. În adiție la analiza proteinelor obținute din culturile de expresie heterologă prin SDS-PAGE, s-a realizat determinarea proteinelor purtând terminația hexahistidinică specifică (adhE2) prin Western Blotting, realizându-se marcarea specifică a acestor proteine cu anticorpi anti-His tag, iar rezultatele confirmă prezența proteinelor în formă 6xHis-fuzionată.

Figura 12. Proteine celulare obținute din culturi de E. coli BL21(DE3)Star transformate cu vectorul de coexpresie

pGS1.1; proteina AdhE2 purificată prin legare specifică pe Ni2+-Sepharose. Probe separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu SDS și vizualizate cu ComassieBlueR250.

M: marker de masă moleculară SeeBlue Plus2 (Invitrogen). 1. proteine celulare din cultura de producție BL21(DE3)Star-pGS1.1 înainte de inducere. 2 proteine celulare din cultura de producție la 1 h după inducere cu 1 mM IPTG. 3. proteine

celulare la 2 h după inducere. 4. proteine celulare după 4 ore de inducere. 5. proteine solubile obținute din extractul celular brut. 6. fracția proteică nelegată de rășina Ni2+-Sepharose. 7-8-9. fracții proteice pure după eluție cu 250 mM

imidazol.

Reproiectarea metabolismului celular prin inginerie metabolică, modificarea genetică a tulpinii gazdă pentru producerea de BDO la randament ridicat și la o rată de creștere constantă

Tulpina originală Escherichia coli K12 MG1655 s-a utilizat ca tulpină de bază pentru realizarea mutațiilor deleționale. Casete gene-specifice s-au realizat prin amorse gene-specifice folosind reacția PCR. Imaginea gelului de agaroză din Figura 13 reprezintă produșii de reacție (caseta genă-specifică ) obținuți în cazul genei pflB: mărimea benzii obținute fiind corespunzătoare masei moleculare relative a casetei pflB-specifice, purtând ca marker de selecție o genă care conferă rezistență la kanamicină.

20

Figura 13. Verificarea casetelor de gene specifice în gel de agaroză 1% .

Coloana 1: GeneRuler1 kb DNA ladder (Thermo). 2,3: Produși PCR corespunzători casetei specifice pentru gena pflB cu rezistență la cloramfenicol.

După obținerea casetelor gene-specifice, s-a procedat la transformarea tulpinii MG1655 cu plasmida pKD46, purtătoare a genei beta-lactamază, care conferă rezistență la ampicilină și a genelor corespunzătoare recombinazelor Red. Coloniile bacteriene transformate, cultivate la 30⁰C s-au folosit pentru obținerea celulelor electrocompetente, induse în prealabil cu arabinoză în vederea exprimării recombinazelor. Casetele gene-specifice lineare s-au introdus în celulele electrocompetente exprimând recombinazele Red, prin electroporare. În celulele transformate, selectate pe baza rezistenței la antibiotice purtate de caseta genă-specifică, s-a realizat astfel integrarea casetei genă-specifică în regiunile complementare ale genelor de eliminat. Genotipul tulpinilor astfel realizate s-a verificat prin reacții PCR, iar după confirmarea înlocuirii genelor originale cu casetele corespunzătoare, s-a procedat la eliminarea genelor marker de selecție. Îndepărtarea rezistenței la antibiotic purtat de casetele-gene specifice introduse s-a realizat printr-un nou ciclu de transformare a celulelor electrocompetente cu plasmida pCP20, termo-sensibilă, purtătoare a genelor codificatoare pentru flipază, care exprimându-se în timpul cultivării la 43⁰C a transformanților, îndepărtează genele marker de selecție. Astfel, repetând procedura descrisă pornind de la primul mutant delețional obținut, M14D1, s-a îndepărtat a doua genă, ldhA, obținându-se tulpina mutantă M14D2, iar în treilea ciclu, mutanta M14D3, din care s-a eliminat și gena codificatoare a alcool-dehidrogenazei adhE. Tulpinile astfel obținute s-au verificat și selectat extensiv pentru filtrarea eventualelor proprietăți de rezistență la antibiotice reziduale, care ar putea influența experimentele ulterioare. Genotipul tulpinilor mutante s-a verificat prin reacții PCR gene-specifice, produșii acestor reacții fiind ilustrate în Figura 14: Astfel, în cazul piruvat-format liazei, banda ADN corespunzătoare genei codificatoare de 2295 bp este prezentă doar în tulpina originală MG1655, iar în tulpinile mutante, regiunea rămasă în genom corespunde unei benzi de doar 200 perechi de baze azotate.

21

Figura 14. Verificarea genotipului tulpinilor mutante prin reacția PCR genă-specifică. Separarea prin electroforeză în gel de agaroză a produșilor PCR pflB și ldhA. M: marker GeneRuler 1kb (Thermo); 1: regiunea pflB a MG1655; 2-4: regiunea pflB în tulpinile M14D1, M14D2 și M12D3, 5: regiunea ldhA a MG1655; 6-8: regiunea ldhA în tulpinile M14D1, M14D2

și M12D3

În continuare, în vederea obținerii unor tulpini recombinate, optimizate metabolic, capabile să mențină vectorii

recombinați funcționali, tulpinile MG1655, M14D1, M14D2 și M14D3 s-au transformat cu vectorii obținuți în etapele

anterioare, folosind metoda chimică de transfer al vectorilor ADN. Tulpinile nu au prezentat diferențe semnificative

privind eficiența de transformare în comparație cu tulpina wild-type MG1655. În vederea evaluării stabilității tulpinilor

posibil producătoare de BDO în diferite condiții, în termenii menținerii plasmidelor și al exprimării genelor heterologe, s-

au realizat culturi aerobe și anaerobe din tulpina M14D3-pGS1.1 în mediu M9, cu ampicilină 50 ug/mL și 5g/L glucoză ca

unică sursă de carbon, culturile fiind menținute la 37⁰C cu agitare la 250 rpm, iar inducerea exprimării genice s-a realizat

în momentul inoculării, suplimentând mediul de cultură cu 0.5 mM IPTG. În cursul fermentațiilor, s-a urmărit cantitatea

de plasmide menținute în culturi, respectiv evoluția exprimării genice, la nivel de proteine, utilizând metodele descrise

anterior. Cum era de așteptat, privind menținerea vectorilor recombinați în culturile tulpinei optimizate metabolic

M14D3, nu s-au înregistrat diferențe semnificative privind cantitățile de ADN plasmidial în diferite momente ale

fermentațiilor aerobe, respectiv anaerobe, în cazul culturii anaerobe fiind observată o ușoară reducere în cantitatea de

ADN plasmidial prezent în cultură, consistent cu valorile OD600 mai reduse. Privind exprimarea genică la nivel de proteine,

urmărirea evoluției proteinelor celulare în intervale de timp definite în cursul fermentației anaerobe/aerobe a rezultat

în identificarea proteinelor codificate în vectorul de co-exprimare pGS1.1, intensitatea relativă a benzilor proteice

corespunzătoare modificându-se în timp, conform creșterii numărului de celule în culturi. Din imaginea gelului de

electroforeză SDS-PAGE din Figura 15. se remarcă faptul că în cazul condițiilor aerobe, proteinele heterologe sunt

prezente în culturile bacteriene la un nivel comparabil cu cele înregistrate în cazul tulpinii specializate de expresie.

22

Figura 15. Proteine celulare prezente în culturi anaerobe (A) și aerobe (B) a tulpinii optimizate M14D3-pGS1.1.

M: marker de masă moleculară SeeBlue Plus2 (Invitrogen). +. proteine celulare în culturile E. coli (DE3)Star-pGS1.1, după 4 ore de inducere, probă folosită drept control pozitiv pentru prezența proteinelor adhE2 și sucCD.

Pe baza rezultatelor prezentate, se poate concluziona, faptul că în această etapă a cercetării, s-a realizat cu succes obținerea unor tulpini optimizate metabolic, prin eliminarea unor gene-cheie a căilor metabolice competitive cu formarea de 1,4-butandiol. S-a determinat potențialul de menținere, în aceste tulpini modificate metabo-genetic, al vectorilor recombinați purtători ai enzimelor noii căi heterologi. Rezultatele sugerează o stabilitate adecvată a tulpinilor obținute, potențial bun de menținere a plasmidelor în cursul cultivării în condiții anaerobe sau aerobe, dar și funcționarea, la nivel de sinteză de proteine, a noii căi heterologe.

Analiza complexă a transcriptomului în diferite condiții

Analiza completă a expresiei genice a tulpinilor de producție de BDO s-a propus a fi realizată prin analiza

microarray a transcriptomului diferitelor variante ale tulpinilor optimizate, conținând enzimele căii biosintetice. Datele

experimentale rezultate se validează prin experimente de RT-Q-PCR genă-specifice.

Culturile de producție (MG1655, M14D2-pGS1.1, M14D3-pGS1.1), cultivate în condiții anaerobe, în volume de 100 mL mediu M9, suplimentat cu IPTG, ampicilină și glucoză 10 g/L ca sursă de carbon s-au cultivat până atingerea fazei exponențiale de creștere (OD600=0.5-0.7), după care s-a procedat la extracția de ARN total, determinarea calității și cantității de ARN, care ulterior se folosește pentru analiza microarray (reacții RT-PCR cu marcare specifică fluorescentă), respectiv reacții RT-Q-PCR genă-specifice (sinteza cADN, reacții Q-PCR cu marcare fluorescentă). Reacțiile de RT-PCR s-au realizat pentru un set de 5 gene de interes din punctul de vedere al funcționalității căii biosintetice introduse (pflB, ldhA, adhE, sucCD, fumA) folosind ca genă-control, regiunea 16SrADN). Rezultatele preliminare prezentate în Anexa 11, cu evidențierea produșilor PCR genă-specifice, folosind ca templat regiunile cADN amplificate prin reacțiile de reverz-transcriere sugerează că s-a realizat obținerea probelor de ARN total în cantitate și calitate adecvată experimentelor ulterioare, dar și faptul că analiza expresiei genice pentru genele relevante poate fi realizată. Date preliminare de extracție a ARN și realizarea reacțiilor RT-PCR genă-specifice arată că s-a realizat design-ul unui plan experimental adecvat pentru analiza completă a transcriptomului diferitelor culturi de producție, rezultatele preconizate oferind informații importante asupra diferențelor la nivel de expresie genică a tulpinilor de producție, respectiv posibilitatea identificării unor seturi de gene/clusteri activate sau represate în prezența căii heterologe. Astfel, vor putea fi determinate strategii de optimizare rațională a metabolismului tulpinilor de producție, în adișia la modificările deja realizate și obținerea unor tulpini cu productivitate superioară.

Prepararea catalizatorilor pe baza de pentoxid de niobiu In absenta catalizatorilor, degradarea termica a glucozei (T = 180°C) in conditii oxidative (10 atm O2) a decurs cu

viteze de reactie moderate (conversii de 10-12%), cu obtinerea unui spectru larg de produsi de reactie. Dintre acestia, cel mai important cantitativ a fost acidul glicolic (selectivitate de 28.4%). In prezenta catalizatorului 4%Ru(III)@MNP,

23

oxidarea catalitica umeda a glucozei are loc cu o selectivitate neasteptat de ridicata in acid succinic (62.7%) pentru o conversie totala (100%) a glucozei. Din pacate insa, in timpul reciclarii catalitice, chiar daca catalizatorul si-a pastrat activitatea la un nivel ridicat, la fiecare ciclu catalitic selectivitatea la acid succinic a inregistrat o scadere de cca. 20% per ciclu. Astfel, dupa al treilea ciclu catalitic, selectivitatea in acid succinic a fost de doar 20.8%.

Rezultatele obtinute sugereaza ca dezactivarea catalitica este determinata de scaderea pH-ului de reactie, caz in care acizii carboxilici formati sunt puternic adsorbiti pe suprafata catalizatorului. In consecinta, centrii catalitic activi sunt blocati, iar procesele secundare de oxidare avansata – favorizate [34]. Intradevar, analiza produsilor de reactie a pus in evidenta o crestere semnificativa a cantitatii de acizi carboxilici cu masa moleculara mica (lactic, glicolic, si gliceric), acompaniata de o acumulare a acestora pe suprafata catalizatorului utilizat, evidentiata de analizele elementale ale catalizatorului proaspat si utilizat in reactie (Tabel 1). Tabel 1. Analiza elementala a catalizatorului 4%Ru(III)@MNP proaspat si utilizat

Catalizator N % C % H %

Proaspat 0.303 1.387 0.578 Utilizat 0.393 3.538 1.757

In acord cu datele de literatura [35], adaugarea unei baze in reactiile de oxidare inbunatateste dehidrogenarea

gruparii alcoolice prin extractia protonului, facilitand desorbtia acizilor carboxilici generate si protejand catalizatorul impotriva dezactivarii. Cu toate acestea, experimentele realizate in prezenta NaOH au esuat, singurii identificati in reactie fiind compusi cu masa moleculara ridicata, denumiti generic “caramel”. Astfel de produsi sunt formati, de regula, prin incalzirea controlata a carbohidratilor cu diferiti reactivi precum hidroxidul de sodiu, sulfitul de sodiu sau clorura de amoniu [36].

Inlocuirea NaOH cu baze organice (amine) conduce, in conditii similare, la un spetru larg de acizi carboxilici precum acid lactic, glicolic si gliceric. Este foarte probabil ca acesti produsi sa se formeze prin mecanisme propuse in literatura de specialitate, specifice degradarii alcaline a glucozei [37].

In conditii de oxidare umeda (temperatura si presiuni de aer sau oxigen ridicate) apa sufera procese de disociere sau oxidare cu formare de radicali hidroxilici. Este posibila, de asemenea, formarea si a unor specii de tip radicali hidroperoxi si a apei oxigenate, prin recombinarea acestora [38]. Astfel de radicali, impreuna cu oxigenul molecular, pot rupe nucleele glicozidice cu formare de acizi carboxilici. Mai mult, in prezenta bazelor de tip amina, astfel de specii, extrem de reactive pot favoriza ruperea legaturilor C-C, determinand o crestere a vitezei de oxidare umeda si a concentratiei de produsi de degradare alcalina a glucozei (acizi carbozilici cu masa moleculara mica), in acord cu datele de literatura [49]. Deoarece in analiza produsilor de reactie nu s-au identificat produsi de oxidare ai aminei, se poate presupune ca aceasta este protonata in timpul procesului si astfel, protejata pentru oxidare.

Testele catalitice in prezenta n-butilaminei si in absenta catalizatorului pe baza de ruteniu cationic au decurs cu formarea unor cantitati reduse de acid succinic (< 12%) si a unor cantitati ridicate de lactone (36%). Extrem de interesant este insa faptul ca adaugarea in mediul de reactie atat al catalizatorului Ru(III) cat si a n-butilaminei exercita un efect sinergetic puternic in procesul de oxidare catalitica umeda, cu obtinerea unor selectivitati in acid succinic (87.5%) net superioare celor obtinute doar in prezenta catalizatorului pe baza de Ru(III) (Raport de activitate, Etapa I). Adaugarea n-butilaminei la catalizatorul recuperat din al treilea ciclu catalitic determina, de asemenea, o crestere a selectivitatii in acid succinic de la 20.8% la 44.0%.

Rezultatele obtinute sunt extrem de incurajatoare desi mecanismul de producere a acidului succinic nu este pe deplin elucidat. O cale de reactie plauzibila se bazeaza pe un mecanism radicalic omogen-heterogen, initiat de radicalii hidroxilici si apa oxigenata formate. Catalizatorul pe baza de Ru(III) poate fi implicat in extractia atomilor de hidrogen cu formarea corespunzatoare a speciilor hidroperoxidice care, mai apoi, se transforma in radicali alkoxilici. Astfel de radicali pot suferi reactii de rearanjare cu ruperea nucleelor glucozidice intre C1 si C2 si formarea gruparilor aldehidice si carboxilice la atomii C3 si C2. In final, legatura eterica din nucleele piranoice se poate scinda iar gruparile aldehidice si hidroxilice formate (de la atomii C1 si C6) sunt oxidate, cu formarea acidului 2, 3- dihidroxibutandioic (acid tartric) si a acidului oxalic (instabil in conditiile dure de oxidare, ca atare, transformat in dioxid de carbon si apa, prin oxidare totala). Un astfel de mecanism se bazeaza si pe faptul ca in produsii de reactie nu au fost identificati fructoza si produsi derivati ai acesteia. Ca atare, este foarte probabil ca mecanismul de oxidare catalitica umeda sa nu implice reactia de izomerizare a glucozei la fructoza ca o prima etapa de reactie (caracteristica reactiilor de degradare in mediu slab bazic), ci un mecanism care implica ruperea nucleelor piranozice din glucoza, descris anterior si in acord cu datele de literatura [40].

24

Acidul succinic este un acid refractar, cu o reactivitate scazuta in conditiile de oxidare umeda impuse. In acest sens, Imamura [41] arata ca acidul succinic se degradeaza in proportie de doar 8%, dupa mentinerea acestuia timp de doua ore la 220°C si 30 bari O2 (conditii mult mai dure decat cele utilizate in acest studiu). Ca atare, odata format in procesul studiat, acesta nu mai sufera reactii aditionale de degradare. Nu este insa foarte clar mecanismul de formare a acestuia din acidul 2,3-dihidroxibutanoic (acid tartric) si implicarea speciilor catalitice Ru(III) sau/si a butilaminei. Pentru elucidarea acestei etape din mecanismul de reactie, se deruleaza activitati experimentale aditionale.

In ceea ce priveste sinteza catalizatorilor pe baza de pentoxid de niobiu (Nb2O5), ca o continuare a activitatilor realizate in Etapa I (2014), s-a avut in vedere generarea unor materiale avansate cu proprietati catalitice bi-acide (Lewis/Brønsted) si proprietati magnetice – necesare separarii facile din mediul de reactie.

Difractogramele XRD pentru probele preparate prin impregnare si co-precipitare sunt redate in Figurile 16-17. Linia de difractie larga de la 2θ = 15-25°, caracteristica silicei amorfe apare in toate difractogramele probelor

preparate prin impregnare (Figura 16) , indiferent de cantitatea de Nb2O5 (30 sau 60%), alaturi de liniile caracteristice magnetitei (2θ = 30.1°, 37.5°, 44.1°, 55.4°, 58.5°, si 64.1°, corespunzatoare datelor XRD pentru structura cristalina a fazei Fe3O4 cubice cu spinel invers (JCPDS 19-0629) []). Faptul ca in difractograme nu se observa linii caracteristice Nb2O5, poate fi datorat fie unei dispersii foarte ridicate a acestuia in stratul de silice, corespunzatoare unei dimensiuni de cristalite mai mici de 2–3 nm (limita de detectie pentru radiatia Cu-Kα), fie existentei Nb2O5 in stare amorfa.

Difractogramele XRD ale probelor preparate prin impregnare, cu un continut de 30% Nb2O5 prezinta aceeasi alura inainte si dupa etapa de calcinare, aratand ca temperatura ridicata de calcinare, aplicata probelor catalitice nu induce modificari structurale semnificative si sesizabile in probe. Nu acelasi lucru se intampla insa in cazul cresterii cantitatii de pentoxid de niobiu impregnat, de la 30 la 60%: in acest caz, dupa etapa de calcinare pentoxidul pare sa aglomereze pe suprafata silicei, cu formarea, cel mai probabil, a unor particule largi, in stare amorfa, puse in evidenta

prin aparitia unei linii de difractie largi si cu intensitate mica, la 2θ = 50.0 (atribuita, in literature de specialitate, fazei T-Nb2O5).

Figura 16. Difractograme XRD pentru probe preparate prin impregnare

Figura 17. Difractograme XRD pentru probe preparate prin co-precipitare (probe necalcinate)

O diferenta marcanta intre probele preparate prin cele doua metode (impregnare si co-precipitare) este data de disparitia liniei de difractie largi, caracteristica silicei amorfe, in cazul probelor preparate prin co-precipitare (Figura 17). Singurele linii de difractie observate sunt cele caracteristice magnetitei. Din pacate, este posibil ca prepararea acestor probe sa fi fost un esec, motiv pentru care, testele catalitice s-au realizat, in aceasta faza, doar pentru probele preparate prin impregnare.

Dimensiunea nanoparticulelor magnetice, determinata din XRD, prin aplicarea formulei Scherrer, a fost determinata ca fiind 8.8 nm.

Oxizii de niobium poseda, in general, structuri NbO6 coordinate octaedric cu distorsiuni diferite, in functie de modul de legare a poliedrelor - prin muchii sau colturi. Pe langa aceastea, pot exista si structuri NbO7 si NbO8 [42] (Anexa 9).

Literatura de specialitate arata ca interactia oxidului de niobium cu suprafete bazice solide conduce la formarea unor faze octaedrice NbO6 cu un grad ridicat de distorsiune, in timp ce interactia cu suprafete acide determina formarea

25

unor structuri NbO6, NbO7 si NbO8, slab distorsionate [44]. Procesele de deshidratare (prin calcinare) distorsioneaza suplimentar octaedrele NbO6. Octaedrele NbO6, cu un grad de distorsionare ridicat, poseda legaturi Nb=O – asociate centrilor de aciditate Lewis [45]. In contrast, octaedrele NbO6 slab distorsionate, precum si gruparile NbO7 si NbO8 poseda doar legaturi Nb-O, si sunt asociate centrilor de aciditate Brønsted. Centrii acizi Lewis sunt prezenti in toate sistemele de oxid de niobium suportat in timp ce existenta centrilor acizi Brønsted este limitata doar la sistemele de tip Nb2O5/Al2O3 si Nb2O5/SiO2 [43] (Tabel 2).

Spectrele Raman pentru probele MNP@SiO2@Nb2O5(60%) si MNP@SiO2 sunt prezentate in Figura 18. In acord cu datele de literatura, benzile localizate la ~290 cm-1, ~405 cm-1 si ~609 cm-1 pot fi atribuite hematitei (α-Fe2O3) [46]. Din pacate este dificila atribuirea benzilor Raman, care ar putea apartine doar hematitei (magnetita poate fi transformata in hematita prin expunere indelugata la radiatie laser) sau ar putea exista o suprapunere cu eventualele benzi caracteristice oxidului de niobiu.

Figure 18. Spectre Raman pentru probele a. MNP@SiO2 si b. MNP@SiO2@Nb2O5(60%) (proba preparata prin impregnare si calcinata la 500°C).

Rezultatele obtinute in degradarea glucozei, in prezenta catalizatorilor pe baza de Nb2O5 sunt redate in Tabelul 2.

Tabel 2. Rezultate catalitice obtinute in degradarea glucozei, in prezenta catalizatorilor MNP@SiO2@Nb2O5, preparati prin

impregnare (180C, 24h)

Catalizator Temp.

(C)

Timp (h) Conversie (%) Principalii produsi de reactie (%)

MNP@SiO2@Nb2O5(30%) necalcinat

180 24 64.83 22% Acid glicolic 8.26% Acid lactic

MNP@SiO2@Nb2O5(30%) calcinat 180 24 100 45.52% Acid glicolic 38.39% Acid lactic

MNP@SiO2@Nb2O5(60%) necalcinat

180 24 100 17.7% Acid glicolic 4.5% Acid lactic

MNP@SiO2@Nb2O5(60%) calcinat 180 24 100 16.24% Acid glicolic 56.42% Acid lactic

Asa cum se observa, principalul produs de reactie format este acidul lactic. In acord cu datele de literatura, sinteza acidului lactic din hexoze este puternic influentata de aciditatea catalizatorilor solizi [47]. Mai mult, mecanismul de formare al acidului lactic necesita prezenta centrilor de aciditate Lewis – capabili sa catalizeze izomerizarea/esterificarea triozelor [48]. In acord cu aceste date, selectivitatea in acid lactic creste de la 38.4 la 56.4%, pentru o conversie totala a glucozei, cu cresterea cantitatii de Nb2O5 de la 30 la 60%. Un astfel de comportament catalitic poate fi explicat doar daca se admite prezenta speciilor niobil (Nb=O) – asociate centrilor acizi Lewis, prezente pe suprafata stratului de silice.

O alta activitate derulata in cadrul acestei etape a fost cea de dehidrogenare oxidativa in faza lichida a 1, 4-

butandiolului la -butirolactona – intermediar important in sinteza unei game variate de polimeri, rasini si fibre sau in industria petrochimica [49].

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

b

aRa

ma

n s

ign

al (a

.u.)

Raman shift (cm-1)

26

Oxidarea 1, 4- butandiolului decurge, in prima etapa, cu formarea 4-hidroxibutanalului care, mai apoi poate fi

transformat, pe doua cai alternative: 1) in -butirolactona, prin tetrahidrofuran-2-ol (THF-2-OL) sau 2) in acid succinic,

prin acid 4-hidroxibutanoic (4HB)[50] (Anexe 10).

Pentru aceasta reactie s-au aplicat doua metodologii de oxidare, folosind doi agenti de oxidare benigni: oxigen molecular (solvent apa, 180°C, 10 atm O2) si apa oxigenata (0.5 ml H2O2, 35°C). Principalele rezultate obtinute, in prezenta catalizatorilor pe baza de Ru(III) si Nb2O5, sunt prezentate in Tabelul 3.

Asa cum se observa din Tabelul 3, in functie de natura catalizatorilor si a conditiilor de reactie, oxidarea 1, 4- butandiolului decurge cu formarea de produsi diferiti. Astfel, in prezenta catalizatorilor pe baza de Ru(III) si in conditii de oxidare umeda, reactia decurge cu conversii extrem de ridicate (liniile 1 si 2, Tabel 3) ale 1,4-butandiolului si selectivitati foarte mari in acid succinic (80-81%). Ru(III) activeaza insa nu doar reactia de oxidare ci si de rupere de legaturi C-C sau C-OH, cu formare de compusi de oxidare avansata sau de izomerizare a acidului 4-hidroxibutanoic (4-HB) la acid 2-hidroxibutanoic (2-HB). Tabel 3. Rezultate catalitice in oxidarea 1, 4-butandiolului

Catalizator Oxidant C (%) S (%)

4-HB 2-HB AS THF-2-OL BTL

1-Ru@SiO2@MNP

O2 97.9 6.2 11.5 80.5 - 0

3-Ru@SiO2@MNP

O2 99.6 1.3 16.4 80.7 - 0

4-Ru@SiO2@MNP

O2 96.2 7.0 36.4 54.3 - 0

MNP@SiO2@Nb2O5(60%)

O2 3.4 44.4 - 7.6 41.5 0

1-Ru@SiO2@MNP

H2O2 1.3 67.5 - - 32.5 -

3-Ru@SiO2@MNP

H2O2 1.6 75.3 - - 24.7 -

4-Ru@SiO2@MNP

H2O2 0.9 18.3 - - 81.7 -

Aceste reactii secundare sunt favorizate si de cantitatile ridicate de specii de tip Ru(III). Astfel, in prezenta

catalizatorului 4-Ru@SiO2@MNP (linia 3, Tabel 3) cantitatea de 2-hidroxibutanoic (2-HB) creste de la 16.4 la 36.4% cu scaderea concomitenta a selectivitatii in acid succinic (de la 80.7 la 54.3%).

In prezenta acelorasi catalizatori dar in conditii mai blande de reactie si oxidant – apa oxigenata – conversiile 1, 4-butandiolului scad la valori < 2%. In acest caz insa principalul produs de reactie este tetrahidrofuran-2-ol (THF-2-OL),

intermediar de sinteza a -butirolactona. Chiar in conditii de oxidare umeda (180°C, 10 atm O2) tetrahidrofuran-2-olul (THF-2-OL) se formeaza cu selectivitati ridicate (41.5%) daca reactia este realizata in prezenta catalizatorului MNP@SiO2@Nb2O5(60%). Concluzii

In aceasta etapa de proiect s-au realizat activitati care au vizat identificarea si optimizarea speciilor catalitic active pentru reacţii de oxidare a glucozei si 1, 4-butandiolului (BDO). Rezultatele obtinute sunt extrem de importante, furnizand informatii experimentale pentru identificarea speciilor catalitic active in reactiile de oxidare studiate, atat in cazul catalizatorilor pe baza de Ru(III) cat si a celor pe baza de Nb2O5.

Rezultatele obtinute reprezinta o baza importanta pentru elucidarea mecanismului de formare a acidului succinic prin oxidarea celor doua tipuri de materii prime regenerabile. Pe langa aceasta, sistemele catalitice create prezinta o importanta deosebita din punct de vedere aplicativ: este pentru prima data cand s-a reusit sinteza directa a acidului succinic din glucoza, in conditii de oxidare catalitica umeda in prezenta unor catalizatori de sinteza. O astfel de sinteza poate constitui o alternativa viabila la metodele fermentative aplicate la ora actuala.

In prezent se continua optimizarea sistemelor catalitice pentru oxidarea 1, 4-butandiolului la -butirolactona, prin optimizarea conditiilor de oxidare cu oxigen molecular. Rezultatele obtinute in acest caz, sunt extrem de

27

satisfacatoare privind sinteza de acid succinic dar, este foarte clar ca, conditiile de reactie alese sunt mult prea dure

pentru a genera -butirolactona. Teste de policondensare

Tabel 4. Rezultatul testelor pentru reactiile echimolare

Nr crt

H2O ppm

AcPr %

AcF %

PrOH %

THF rezult.

ref. BDO

H2O extrasa,

mL

Obs.

1 50 0 0 0 urme 1,6 amestec incolor, viscos, curge liber

2 500 0 0 0 2% 1,5 THF distila cu apa, amestecul ramane fluid

3 <50 0,1 0 0 0,1% 1,6 amestec incolor, usor vascos

4 <50 0 0 0,1 urme 1,6 amestec incolor, usor vascos

5 <50 0 0 0,1 7% 1,6 amestec incolor, fluid

6 <50 0 0 1 70 cca 2,1 Amestecul se coloreaza galben brun, se formeaza numerosi produsi si

geluri, apa contine numerosi produsi

Testele arata importanta puritatii materiilor prime. Apa si compusii monohidroxilici nu au efecte notabile in etapa 1. Prezenta impuritatilor acide conduce la efecte dependente de taria acidului, toate fiind negative. Cu probele 1, 2, 3 si 4 s-a continuat cu etapa 2/3, in laborator lucrându-se in evaporator rotativ, la un vid de 0,1 torr. Nedispunand de aparate cu forfecare inalta la scara d elaborator, etapa 3 nu poate fi definitivata la aceasta scara. Neputându-se masura cantitatea de apa eliminată, s-au cântarit baloanele inainte si dupa evaporare timp de 4h pe baie de ulei siliconic la 150°C. Evaporarea s-a facut atât fara catalizator, cat si cu 1% masic Ti (OBu)4. Produsii de policondensare au fost dizolvati la o concentratie de 1% in DMF (dimetil formamida) si s-a masurat viscozitatea relativa. Produsii fara catalizator se coloreaza in diverse nuante de galben, cei cu catalizator Tabel 5. Rezultatul experimentelor privind obtinerea produselor cu mase moleculare ridicate

Proba Fara catalizator 1% Ti (OBu)4

Obs apa, g rel apa, g rel

1 cca 0,1 1,2 0,2 1,8 produsul fara catalizator este ceros, galbui, cel cu catalizator este solid, dur, aproape incolor

2 cca 0,1 1,2 0,2 1,6 similar cu proba 1

3 0,2 1,1 0,2 1.1 produsi inalt viscosi, colorati ca opasta

4 0,1 1,05 0,2 1,1 produsi inalt viscosi, colorati, ca opasta

Experimentele demonstreaza ca pentru obtinerea de mase moleculare ridicate este necesar ca materiile prime sa fie libere de impuritati monohidroxilice, cu precadere acizi. Prezenta apei conduce la scaderea masei moleculare a poliesterului iar in concentratie peste 500 ppm, are ca efect si scaderea randamentului cu pierdere de BDO ca THF. Rezumatul S-au stabilit conditiile in care BDO poate fi policondensat cu SAC pentru obtinerea de poliesteri utilizabili. S-a determinta ca fiind rationala divizarea procesului de policondensare in trei etape, primele doua putand fi conduse in aparate conventionale, suficiente pentru se4lectia corecta a conditiilor de reactie. Cu reteta finala se va sintetiza o cantitate suficienta de precondensat care sa poata fi definitivata intr-un minimalaxor metalic. S-a stabilit ca impuritatile monohidroxilice trebuie sa fie eliminate la un nivel sub 50 ppm. Concentratia admisibila a apei in materiile prime trebuie sa fie sub 500 ppm, de preferinta sub 200 ppm. Singurii catalizatori utilizabili fara a avea efecte nocive asupra mediului sau operatorilor sunt cei bazati pe alcoxizi de Ti. Concluzii

28

PBS este un poliester alifatic biodegradabil, cu proprietăţi chimice şi mecanice bune, ce poate înlocui polimerii ce reprezintă un pericol pentru mediul înconjurător. Condiţiile de sinteză şi tipul de catalizator joacă un rol important asupra proprietăţilor finale ale PBS (Mn, biodegradabilitate, stabilitate termică, etc.). Eficienţa catalizatorilor

organometalici creşte în ordinea Ti Zr Sn Hf Sb Bi. Catalizatorii de policondensare sunt sensibili la apă, fiind indicat ca aceştia să fie introduşi în sistem după etapa de esterificare. Toxicitatea catalizatorilor influenţează toxicitatea polimerului şi, înconsecinţă, influenţează utilizările compusului final. Catalizatorii cu Ti au cea mai mică toxicitate şi cea mai mare eficienţă, fiind cei mai utilizaţi în sinteza PBS. Cristalinitatea ridicată influenţează viteza de biodegradare a acestui polimer.

Avand in vedere cele prezentate mai sus si obiectivele acestei etape, se poate constata ca s-au indeplinit toate obligatiile contractuale pe perioada raportata a proiectului de cercetare.

Bibliografie

1. B. Kamm, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5056. 2. R. A. Sheldon, Green Chem., 2000, 2, G1. 3. H. Roper, In: Carbohydrates as Organic Raw Materials; Lichtenthaler, F. W., Ed.; VCH: Weinheim, 1991;

p 267. 4. M. Besson, P. Gallezot, Catal. Today 2000, 57, 127. 5. A. Corma, S. Iborra, A. Velty, Chem. Rev. 2007, 107, 2411. 6. M. Besson, P. Gallezot, In: Fine Chemicals through Heterogeneous Catalysis; Sheldon, R. A., van

Bekkum, H., Eds.; Wiley- VCH: Weinheim, 2001, p 491. 7. T. Mallat, C. Brönnimann, A. Baiker, Appl. Catal. A-Gen. 1997, 149, 103. 8. Jacquel N, Freyermouth F, Fenouillot F, Rousseau A, Pascault JP, Fuertes P, et al. Journal of Polymer

Science Part A: Polymer Chemistry. 2011;49(24):5301-12. 9. Rizzarelli P, Carroccio S. Polymer Degradation and Stability. 2009;94(10):1825-38. 10. Chen C-H, Peng J-S, Chen M, Lu H-Y, Tsai C-J, Yang C-S. Colloid and Polymer Science. 2010;288(7):731-8. 11. Bechthold I, Bretz K, Kabasci S, Kopitzky R, Springer A. Chemical Engineering & Technology.

2008;31(5):647-54. 12. Lahcini M, Qayouh H, Yashiro T, Simon P, Kricheldorf HR. Journal of Macromolecular Science, Part A. 2010;47(6):503-9. 13. Ferreira LP, Moreira AN, Pinto JC, Jr. FGdS. Polymer Engineering & Science. 2015;55:1889-96. 14. Lu SF, Chen M, Shih YC, Chen CH: Polymer Physics. 2010;48:1299-308. 15. Xu J, Guo B-H, Microbiology Monographs: Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2010. 16. Huang C-L, Jiao L, Zeng J-B, Zhang M, Xiao L-P, Yang K-K, et al. Polymer. 2012;53(17):3780-90. 17. Huang X, Li C, Zheng L, Zhang D, Guan G, Xiao Y. Polymer International. 2009;58(8):893-9. 18. Kim H-S, Chen G-X, Jin H-J, Yoon J-S Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering

Aspects. 2008;313-314:56-9. 19. Shah AA, Hasan F, Hameed A, Ahmed S. Biotechnology Advances. 2008;26:246-65. 20. Isabel Rocha, Paulo Maia, Pedro Evangelista, Paulo Vilaça, Simão Soares, José P Pinto, Jens Nielsen,

Kiran R Patil, Eugénio C Ferreira and Miguel Rocha, BMC Systems Biology 2010, 4:45. 21. A.P. BURGARD, P. PHARKYA, C.D. MARANAS, Biotechnol. Bioeng., 84(6), 647-657 (2003). 22. D.S. LUN, G. ROCKWELL, N.J. GUIDO, M. BAYM, J.A. KELNER, B. BERGER, J.E. GALAGAN, G.M. CHURCH, Mol. Syst. Biol., 5, 296 (2009). 23. S.A. BECKER, A.M. FEIST, M.L. MO, G. HANNUM, B.Ø. PALSSON, M.J. HERRGARD, Nat. Protoc., 2, 727-

738 (2007). 24. J. SCHELLENBERGER, R. QUE, R.M. FLEMING, I. THIELE, J.D. ORTH, A.M. FEIST, D.C. ZIELINSKI, A.

BORDBAR, N.E. LEWIS, S. RAHMANIAN, J. KANG, D.R. HYDUKE, B.Ø. PALSSON, Nat. Protoc., 4, 1290-1307 (2011).

25. Lewis NE, Hixson KK, Conrad TM, Lerman JA, Charusanti P, Polpitiya AD, Adkins JN, Schramm G, Purvine SO, Lopez-Ferrer D, Weitz KK, Eils R, König R, Smith RD, Palsson BØ, Mol Syst Biol. 2010 Jul;6:390.

26. Mahadevan R, Edwards JS, Doyle FJ 3rd, Biophys J. 2002 Sep;83(3):1331-40.

29

27. S. Bergmann, J. Schumann, K. Scherlach, C. Lange, A. A. Brakhage and C. Hertweck, Nat Chem Biol , vol. 3, pp. 213-217, 2007.

28. J. Wua, P. Liub, Y. Fana, H. Baoa, G. Dua, J. Zhoua and J. Chena, Journal of Biotechnology, vol. 167, no. 4, p. 404–411, 2013.

29. H. e. Yim, Nature Chemical Biology, vol. 7, pp. 445-453, 2011.

30. L. e. a. Fontaine, Journal of Bacteriology, vol. 184, no. 3, pp. 821-830, 2002.

31. K. A. Datsenko and B. L. Wanner, Proc Natl Acad Sci U S A. , vol. 97(12), pp. 6640-5, 2000.

32. B. Gust, G. Chandra, D. Jakimowicz, T. Yuqing, C. J. Brution, C. K. F and λ. R.-m. g. m. o. a.-p. Streptomyces, "Advances in Applied Microbiology," vol. 54, 2004.

33. Campodonico MA, Andrews BA, Asenjo JA, Palsson BO, Feist AM, Metab Eng. 2014 Sep;25:140-58. 34. S. Roy, M. Vashishtha, A. K. Saroha, J. Eng. Sci. Techol. Rev. 2010, 3, 95. 35. T. Mallat, A. Baiker, Chem. Rev., 2004, 104, 3037. 36. J. M. De Bruijn, Starch, 1987, 39, 23. 37. C. J. Knill, J. F. Kennedy, Carbohydrate Polymers, 2003, 51, 281. 38. S. Roy, M. Vashishtha, A. K. Saroha, J. Eng. Sci. Techol. Rev., 2010, 3, 95. 39. P. Beltrame, M. Comotti, C. Della Pina, M. Rossi, Appl. Cat. A, 2006, 297, 1. 40. M. Antal, Jr., T. Leesomboon, W. S. Mok, G. N. Richards, Carbohydr. Res., 1991, 217, 71. 41. S. Imamura, Ind Eng Chem Res 1999, 38, 1743. 42. Y. Chen, H. Gu, Mater. Lett., 2012, 67, 49. 43. J. M. Jehng, I. E. J. Wachs, Phys. Chem. 1991, 95, 7373. 44. J. M. Jehng, I. E. Wachs, Catal. Today 1993, 16, 417. 45. S. M. Maurer, E. I. Ko, J. Catal. 1992, 135, 125. 46. A. P. Kozlova, S. Sugiyama, A. I. Kozlov, K. Asakura, Y. Iwasawa, J. Catal., 1998, 176, 426. 47. F. Clippel, M. Dusselier, R.V. Rompaey, P. Vanelderen, J. Dijkmans, E. Makshina, L. Giebeler, S. Oswald,

G. V. Baron, J. F. M. Denayer, P. P. Pescarmona, P. A.Jacobs, B. F. J. Sels, Am. Chem. Soc., 2012, 134, 10089.

48. L. Li, C. Stroobants, K. Lin, P. A.Jacobs, B. F. Sels, P. P. Pescarmona, Green Chem. 2011, 13, 1175. 49. J.Huang, W.-L. Dai, K. Fan, J. Catal. 2009, 266, 228. 50. J. Huang, W.-L. Dai, H. Li, K. Fan, J. Catal. 2007, 252, 69.

30

Anexe

Anexa 1

Figura 1. Căi posibile pentru obţinerea acidului succinic şi derivaţilor săi [11]

Sinteza SAC din biomasă poate să conducă la produşi secundari de reacţie care pot influenţa procesul de polimerizare. Puritatea materiilor prime este o condiţie primordială în sinteza PBS fiind necesară eliminarea compuşilor monohidroxilici, a aminelor (primare şi secundare) şi a aminoacizilor, aceşti compuşi putând limita lungimea lanţului. De asemenea trebuie avut în vedere că prezenţa compuşilor polihidroxilici (n≥3) conduce la reticulare, iar metalele grele otrăvesc catalizatorii utilizaţi în procesul de sinteză. Toate aceste aspecte susţin utilizarea de materii prime şi catalizatori cu puritate înaltă în sinteza PBS. În etapa de esterificare, în urma reacţiei dintre SAC şi BDO, se obţine un oligomer de PBS şi apă. Apa formată în timpul acestei etape se elimină din sistem pentru a evita o durată mare de reacţie în etapa de policondensare, ceea ce ar conduce la PBS cu masă moleculară mică şi formarea de produşi secundari de reacţie (tetrahidrofuran (THF)). Temperatura la care urmează să aibă loc etapa de esterificare trebuie aleasă astfel încât să se asigure o viteză optimă de reacţie şi să se elimine riscul formării de produşi secundari de reacţie. În etapa de policondensare, sub acţiunea catalizatorilor, se obţine PBS şi BDO din oligomeul PBS. Catalizatorii utilizaţi în acest proces sunt oxizi sau compuşi organometalici de titan (Ti), germaniu (Ge), staniul (Sn), zirconiu (Zr), bismut (Bi) etc. Eliminarea BDO şi a urmelor de apă din sistem se face sub vid înaintat iar Catalizatorii aleşi trebuie să aibă reactivitate ridicată şi să fie rezistenţi la hidroliză. În acest mod se asigură o masă moleculară optimă şi un timp de reacţie mai scurt. Datorită sensibilităţii catalizatorilor la apă, aceştia se adaugă în sistem după esterificare, aşa cum se arată în Figura 2 [15].

31

Figura 2. Evoluţia forţei de torsiune în timpul policondensării cu: titan (IV) n-butoxid, adăugat înainte (●) şi după

esterificare (■) [9]

Jacquel et al. [8] a studiat eficienţa catalizatorilor, atât organometalici (Figura 3) cât şi oxizi de Ge şi stibiu (Sb), utilizaţi

în sinteza PBS. Autorii au observat că ordinea eficienţei catalizatorilor organometalici este: Ti Zr Sn Hf Sb Bi.

Figura 3. Catalizatori organometalici utilizaţi în sinteza PBS [15]

32

Anexa 2

Figura 4. Etapele identificarii reactiilor importante pentru OptKnock și GDLS. Prin reducerea numărului de reacții scade

atât timpul de calcul cât și numărul predicțiilor fictive.

iJO1366

model

Remove blocked

reactions

Remove essential

reactions

Remove zero flux

reactions

Remove exchange and

transport reactions

Remove diffusion

reactions

Remove biologically

complicated reactions

Remove orphan

and excluded

subsystems

reactions

~ 152 target

reactions

33

Anexa 3

Tabelul 1. Rezultatele obținute cu OptKnock și GDLS și caracterizarea fluxurilor (glucoza)

Valorile reprezentate cu bold și italic reprezintă condițiile unde rata de producție a butandiolului poate să fie 0. Abrevieri: ACALD, TKT2,ALCD2x, LDH_D, PFL, FUM- fumaraza

Method Wild-type

growth

rate

Mutant

growth

rate

BDO

production

rate

KO By-

products

Production

rate

MAX

theore-

tical

Acetate 11.53

Formate 13.50

Acetate 12.60

Formate 13.39

Acetate 23.67

Formate 26.58

Acetate 24.74

Formate 26.48

FBA (10)

FBA (10)

FBA (20)

FBA (20)

21.06

0.21 14.91

ALCD2x,

LDH_D,

PFL, FUM

Acetate 21.93

0.52

0.42 8.70ACALD,

TKT2

19.56Anae-

robic0.30 14.46

ALCD2x,

LDH_D,

PFL

Acetate

Acetate 20.21

0.52 11.30

ALCD2x,

LDH_D,

PFL, FUM

Acetate 20.85

0.77

0.70 5.32ACALD,

TKT2

23.29Micro-

aerobic0.58 10.97

ACALD,

LDH_D,

PFL

10.72

0.13 7.39

ALCD2x,

LDH_D,

PFL, TKT2

Formate

10.60

0.24

0.19 4.41ALCD2x,

TKT2

8.20Anae-

robic0.13 7.32

ALCD2x,

LDH_D,

PFL

Acetate

9.87

0.41 4.04

ALCD2x,

LDH_D,

PFL, TKT2

Acetate

9.49

0.49

0.48 1.01ACALD,

TKT2

11.42Micro-

aerobic0.42 3.84

ALCD2x,

LDH_D,

PFL

Acetate

34

Anexa 4

Tabelul 2. OptKnock design și caracterizarea fluxurilor pentru glicerină

Valorile reprezentate cu bold și italic reprezintă condițiile unde rata de producție a butandiolului poate să fie 0. Abrevieri: GLYK, FADRx – flavon oxidoreductaza, CBMKr – carbamat kinaza, CBPS – carbamil fosfat sintaza

Method Wild-type

growth

rate

Mutant

growth

rate

BDO

production

rate

KO By-

products

Production

rate

MAX

theore-

tical

Acetate 4.33

Formate 5.50

4.00

5.00

N/A N/A N/A N/A N/A

N/A N/A N/A N/A N/A

N/A N/A N/A N/A N/A

Acetate 9.00

Formate 10.00

8.66

9.90

Acetate 12.97

Formate 31.47

13.00

31.75

12.97

31.45

0.33 0.3 0.16 PFL,

ALCD2x,

LDH_D

L-valine 2.69 5.94 Micro-

aerobic

0.08 N/A N/A PFL,

ALCD2x,

LDH_D

N/A N/A N/A Anae-

robic

0.45 0.33 2.68 PFL,

ALCD2x,

LDH_D

L-alanine 12.37 12.85 Micro-

aerobic

0.19 0.03 5.01 PFL,

ALCD2x,

LDH_D

L-alanine 14.59 N/A Anae-

robic

FBA (20)

FBA (10)

Anae-

robic

0.12 5.00

ACALD,

CBMKr,

CBPS

Acetate

Formate

0.12 5.12

ALCD2x,

CBMKr,

CBPS,

FADRx

Acetate

Formate

FBA (20) 0.19

0.14 5.00ALCD2x,

FADRx

6.53

ALCD2x,

GLYK,

TKT2

Acetate

Formate

0.25 8.68

ALCD2x,

GLUDy,

LDH_D,

PFL

Acetate 8.00

FBA (20) 0.45

0.31 6.32ACALD,

GLYK

12.85Micro-

aerobic

0.31 6.56

Anae-

robicFBA (10) 0.08 N/A

0.25 2.71

ALCD2x,

GLUDy,

LDH_D,

PFL

Acetate 3.54

0.33

0.28 1.43ACALD,

GLYK

5.94Micro-

aerobic

0.28 1.64

ALCD2x,

GLYK,

TKT2

Acetate

FormateFBA (10)

35

Anexa 5

Figura 5. Rezultatele simulărilor dFBA pentru glucoză, A) microaerobe, B) anaerobe

Rezultate similare au fost obținute și în cazul glicerinei dar cu un batch time mai lung datorită ratei de creștere care este mai mică față de glucoză.

Figura 6. Rezultatele simulărilor dFBA pentru glicerină în condiții microaerobe

A B

36

Anexa 6

Figura 7. Distributia metabolitilor cu cele mai multe conexiuni (loglog plot)

Anexa 7

Utilizand aceasta metoda a fost posibil identificarea compusilor de interes: 1,4-buntandiol-2TMS (Figura 8), 1,5-pentandiol-2TMS (Figura 9), acid succinic-2TMS (Figura 10), acid glutaric-2TMS (Figura 11), respectiv α-ketoglutaric-3TMS (Figura 12) cu o probabilitate ridicata.

Figura 8. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-1MS pentru 1,4-butandiol(2TMS), dupa derivatizarea compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

37

Figura 9. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-1MS pentru 1,5-pentandiol(2TMS), dupa derivatizarea compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

Figura 10. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-1MS pentru acidul succinic(2TMS), dupa derivatizarea

compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

Figura 11. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-1MS pentru acidul glutaric (2TMS), dupa derivatizarea

compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

38

Figura 12. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-1MS pentru acidul α-ketoglutaric(2TMS), dupa derivatizarea

compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent Anexa 8

fragmentograma de ioni selectati (SIM), este semnalul obtinut prin inregistrarea ionilor caracteristici care ofera informatie selectiva (in mod normal este ionul molecular si/sau ionul de intensitate maxima pentru compusul urmarit, sau alti ioni caracteristici compusului de interes);

Se poate lucra in modul SIM cand se adopta ca un timp de retentie dat, un set de ioni sunt caracteristci unui anumit compus dat. Aceasta analiza este foarte eficienta si rapida, mai ales daca urmarim un compus cunoscut, sau avem nevoie de informatii primare despe proba, sau dorim excluderea semnalelor care nu au interes din punctul de vedere al studiului (in acest caz semnalul glicerinei la timpul de retentie de 6.997 min).

Separarea cromatografica SIM obtinuta in cazul utilizarii coloanei HP-1MS pentru 1,4-buntandiol-2TMS, 1,5-pentandiol-2TMS, acidul succinic-2TMS, acidul glutaric-2TMS, respectiv acidul α-ketoglutaric-3TMS obtinuta dupa derivatizarea, respectiv extractia lichid-lichid efectuata cu toluene: tert-butil metil eter (1:1) din mediul nutritiv in care s-a adaugat 6000 ng din fiecare compus de interes, este prezentata in Figura 13.

Figura 13. Separarea cromatografica SIM obtinuta in cazul utilizarii coloanei HP-1MS dupa derivatizarea, respectiv

extractia lichid-lichid din mediul nutritiv a compus de interes

39

Liniaritatea raspunsului spectrometrului de masa fata de cantitatea de substanta introdusa a fost testata realizand curbele de calibrare pentru fiecare compus de interes. S-au preparat standarde la 6 concentratii diferite in domeniul 0÷2000 ng/proba, pentru care s-a efectuat analiza full scan. Rezulatele experimentale obtinute sunt prezentate in Figurile 14-17. Pentru compusii tinta valorile coeficientul de corelare (R2) se incadreaza in intervalul 0.97-0.99, ceea ce indica faptul ca in fiecare situatie exista o stricta proportionalitate intre cantitatea de substanta si intensitatea semnalului obtinut.

Figura 14. Curba de calibrare obtinuta pentru 1,4-butandiol(2TMS)

y = 5269.9x - 544274R² = 0.9829

-1000000

1000000

3000000

5000000

7000000

9000000

11000000

13000000

0 500 1000 1500 2000 2500

Are

a (a

.u.)

fo

r m

/z=1

16

Compound quantity (ng)

Calibration curve for 1,4-Butanediol(2TMS)

Figura 15. Curba de calibrare obtinuta pentru 1,5-pentandiol(2TMS)

y = 5780.9x - 275404R² = 0.9976

-1000000

1000000

3000000

5000000

7000000

9000000

11000000

13000000

0 500 1000 1500 2000 2500

Are

a (a

.u.)

fo

r m

/z=6

9

Compound quantity (ng)

Calibration curve for 1,5-Pentanediol(2TMS)

40

Figura 17. Curba de calibrare obtinuta pentru acidul succinic(2TMS)

y = 2351.1x - 295552R² = 0.9727

-1000000

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 500 1000 1500 2000 2500

Are

a (a

.u.)

fo

r m

/z=2

47

Compound quantity (ng)

Calibration curve for Succinic acid(2TMS)

Figura 16. Curba de calibrare obtinuta pentru acidul glutaric(2TMS)

y = 641.61x - 64328R² = 0.9893

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 500 1000 1500 2000 2500

Are

a (a

.u.)

fo

r m

/z=2

04

Compound quantity (ng)

Calibration curve for Glutaric acid(2TMS)

41

Anexa 9

Probele au fost analizate cu un sistem gas cromatograf 7890B cuplat cu un spectrometru de masa cu cuadrupol 5977MS, de tip Agilent, dotat cu injector automat pentru probele lichide.

Gaz cromatograful a fost echipat cu o coloana capilara HP-5MS, avand faza stationara non-polara mixta (5% fenil 95% dimetil polisiloxan) si gaz purtator He (1.5 ml/min) cu urmatoarele caracteristici: lungime de 30 m; diametru interior de 0.25 mm; grosimea stratului de faza stationara de 0.25 μm. Dupa multiple modificari, programul de temperatura pentru care se obtine o separare cromatografica satisfacatoare este urmatorul: 80°C (mentinuta timp de 2 minute) se creste cu gradient de 3°C/min la 116°C, urmat de un gradient de 20°C/min pana la atingerea temperaturii de 200°C, dupa care se creste in continuare pana la 300°C cu viteza de 50°C/min, unde se mentine timp de 5 minute. Acest program de temperatura are o durata totala de 25.2 minute.

Vaporizarea probei injectate de 2 µL are loc la temperatura de 230°C a injectorului. Linia de transfer catre spectrometrul de masa este incalzita la temperatura de 300°C.

Gaz cromatograful cuplat cu spectrometrul de masa are o sursa de ionizare cu impact electronic si analizor cuadrupolar. Condiţiile experimentale utilizate sunt urmatoarele: temperatura sursei de ioni este de 230°C unde energia electronilor este de 70 eV, iar cuadrupolul este mentinut la temperatura de 150°C. Achizitia spectrelor de masa incepe la 7.90 min, pentru domeniu de masa 50-550 Dalton. Datele experimentale se achiziţioneaza in mod continuu online si pot fi extrase cu programului software MSD ChemStation Data Analysis.

Figura 19. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-5MS pentru 1,4-butandiol(2TMS), dupa derivatizarea compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

Figura 18. Curba de calibrare obtinuta pentru acidul α-ketoglutaric (3TMS)

y = 677.94x - 19615R² = 0.9876

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 500 1000 1500 2000 2500

Are

a (a

.u.)

fo

r m

/z=3

47

Compound quantity (ng)

Calibration curve for α-Ketoglutaric acid(3TMS)

42

Figura 20. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-5MS pentru 1,5-pentandiol(2TMS), dupa derivatizarea compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

Figura 21. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-5MS pentru acidul succinic(2TMS), dupa derivatizarea compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

Figura 22. Spectrul de masa obtinut utilizand coloana HP-5MS pentru acidul glutaric(2TMS), dupa derivatizarea compusului standard in cantitate de 1000ng/proba dizolvat in solvent

Metoda SIM dezvoltata pentru detectia compusilor de interes extrasi din medii de cultura, in cazul utilizarii coloanei capilare HP-5MS este urmatoarea:

- grupul nr. 1 utilizat pentru detectia 1,4-butandiolului ionii scanati sunt m/z 116, 177, 234, iar intervalul de timp pentru care se face scanarea este 7.90 ÷ 10.50 minute;

- grupul nr.2 utilizat pentru detectia 1,5-pentandiolului ionii scanati sunt m/z 103, 143, 248, iar intervalul de timp pentru care se face scanarea este 10.50 ÷ 12.70 minute;

43

- grupul nr. 3 utilizat pentru evitarea scanarii ionilor specifici glicerinei ionul scanat este m/z 248, iar intervalul de timp pentru care se face scanarea este 12.70 ÷ 13.40 minute;

- grupul nr. 4 utilizat pentru detectia acidului succinic ionii scanati sunt m/z 129, 262, 247, iar intervalul de timp pentru care se face scanarea este 13.40 ÷ 15.00 minute;

- grupul nr. 5 utilizat pentru detectia acidului glutaric ionii scanati sunt m/z 158, 261, 276, iar intervalul de timp pentru care se face scanarea este 15.00 ÷ 25.20 minute;

Separarea cromatografica SIM obtinuta in cazul utilizarii coloanei HP-5MS pentru 1,4-buntandiol-2TMS, 1,5-pentandiol-2TMS, acidul succinic-2TMS si acidul glutaric-2TMS obtinuta dupa derivatizarea, respectiv extractia lichid-lichid efectuata cu toluene: dietil eter (1:1) din mediul nutrient in care s-a adaugat 10000 ng din fiecare compus de interes, este prezentata in Figura 23.

Liniaritatea raspunsului spectrometrului de masa fata de cantitatea de substanta introdusa a fost testata realizand curbele de calibrare pentru fiecare compus de interes. S-au preparat standard duplicate la 6 concentratii diferite in domeniul 0÷1000 ng/proba, pentru care s-a efectuat analiza SIM dupa derivatizare. Rezulatele experimentale obtinute sunt prezentate in Figurile 24-27. Pentru compusii de interes valorile coeficientul de corelare (R2) se incadreaza in intervalul 0.94-0.99, ceea ce indica faptul ca in fiecare situatie exista o stricta proportionalitate intre cantitatea de substanta si intensitatea semnalului obtinut

Figura 23. Separarea cromatografica SIM obtinuta in cazul utilizarii coloanei HP-8MS dupa derivatizarea compusilor de interes eluati in solvent in cantitate de 1000 ng fiecare

44

Figura 26. Curba de calibrare obtinuta pentru acidul succinic(2TMS)

y = 35.638x + 14314R² = 0.9497

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 200 400 600 800 1000 1200

Ari

e m

ed

ie [

u.a

.]

Cantitatea de substanta [ng]

Curba de calibrare pentru acid succinic

Figura 24. Curba de calibrare obtinuta pentru 1,4-butandiol(2TMS)

y = 935.25x + 49819R² = 0.9932

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 200 400 600 800 1000 1200

Ari

e m

ed

ie [

u.a

.]

Cantitatea de substanta [ng]

Curba de calibrare pentru 1,4-butandiol

Figura 25. Curba de calibrare obtinuta pentru 1,5-pentandiol(2TMS)

y = 851.3x - 31586R² = 0.9876

-200000

0

200000

400000

600000

800000

1000000

0 200 400 600 800 1000 1200

Ari

e m

ed

ie [

u.a

.]

Cantitatea de substanta [ng]

Curba de calibrare pentru 1,5-pentandiol

45

Figura 27. Curba de calibrare obtinuta pentru acidul glutaric(2TMS)

Anexa 9 Tabel 1. Relatie structura oxid de niobium – frecventa Raman [44]

Anexa 10

Schema 1. Oxidarea 1, 4-butandiolului la -butirolactona (BTL) si/sau acid succinic (AS)

y = 66.715x + 18150R² = 0.9498

0

20000

40000

60000

80000

100000

0 200 400 600 800 1000 1200

Ari

e m

ed

ie [

u.a

.]

Cantitatea de substanta [ng]

Curba de calibrare pentru acid glutaric

46

Anexa 11

Figura 28. Produșii din reacția RT-PCR gene-specifice.

47

Anexa 12