CITOMETRIA IN FLUX

Citometria in flux

reprezinta o abordare

tehnica noua, de mare

complexitate, ce permite

determinarea simultana a

mai multor parametri fizici

si chimici caracteristici

unei singure celule aflate

in miscare intr-un curent

lichid.

Flow ~ celule in miscareCyto ~ celulaMetry ~ masura

Masurarea proprietatilor celulelor intr-un sistem fluid.

Citometria in flux este o tehnica moderna, complexa si

performanta de analiza celulara, care permite masuratori

rapide, cu rezolutii superioare metodelor clasice, separate

pentru fiecare celula sau constituent celular, incluzand acizii

nucleici, complexele imune, cromozomii sau organitele

celulare, aflate in cadrul unor suspensii. Astfel, pot fi facute

analize multiparametrice simultane, ale unui numar mare

de particule (de la 400 la 3000 particule/secunda), ale caror

caracteristici au coeficienti mici de variatie.

Citologia vs. Citometria in flux

Citologia

Localizarea antigenelor celulare este posibila

Subtipurile celulare sunt greu de cuantificat

Numarul de masuratori multiparametrice este limitat

Citometria in flux

Localizarea antigenelor celulare nu este posibila.

Numarul de celule analizat intr-un timp foarte scurt este foarte mare

Analizele multiparametrice sunt posibile.

Ce se intampla in cazul citometriei in flux?

Celulele in suspensie sunt aliniate, una dupa alta, in Celulele in suspensie sunt aliniate, una dupa alta, in vederea prezentarii individuale sistemului de excitarevederea prezentarii individuale sistemului de excitare

O sursa LASER ilumineaza fiecare celula individual, iar O sursa LASER ilumineaza fiecare celula individual, iar lumina reflectata si fluorescenta emisa sunt colectate lumina reflectata si fluorescenta emisa sunt colectate de detectoride detectori

Datele colectate sunt convertite intr-un semnal electric, direct proportional cu fluorescenta emisa

Datele electronice sunt convertite in date digitale si Datele electronice sunt convertite in date digitale si analizate cu ajutorul unor programe specificeanalizate cu ajutorul unor programe specifice

Sistemul optic

Sistemul fluidic

Sistemul electronic

Interpretarea datelor

Principiul de functionare al unui citometru Principiul de operare - celulele (particulele existente în proba) sunt injectate într-

un curent de fluid - curent de transport / curent purtător. Suspensia celulară trece

printr-o zona de detecţie considerată zona de interacţiune a fiecărei particule în

parte, cu o sursă de excitaţie luminoasă.

Semnalele luminoase sunt detectate simultan de către 4 fotodetectori şi

transformate în semnale electrice echivalente, care sunt, apoi, amplificate şi

convertite în semnale digitale.

Se vor obţine simultan, pentru fiecare particulă în parte, 4 parametri diferiţi: FSC si

SSC - criterii morfologice), iar FL1 şi FL2 (emisia de fluorescenta).

FSC (Forward Scatter) “împrăştiere înainte” – dimensiunea si forma particulelor.

SSC (Side Scatter) “împrăştiere laterală” – granularitatea particulelor.

FL1/2 - Intensitatea fluorescentei este proportionala cu cantitatea colorantului fixat,

respectiv cu cantitatea componentei celulare de interes (acizi nucleici, antigene de

suprafata).

Forward Scatter

FSCFSCDetectorDetector

Laser BeamLaser Beam

Original from Purdue University Cytometry LaboratoriesOriginal from Purdue University Cytometry Laboratories

Side Scatter

FSCFSCDetectorDetector

CollectionCollectionLensLens

SSCSSCDetectorDetector

Laser BeamLaser Beam

Original from Purdue University Cytometry LaboratoriesOriginal from Purdue University Cytometry Laboratories

Fluorescence Detectors

FSCFSCDetectorDetector

CollectionCollectionLensLens

Laser BeamLaser Beam

FluorescenceFluorescenceDetector A, B, C, etc…Detector A, B, C, etc…

Original from Purdue University Cytometry Laboratories, Modified by James MarvinOriginal from Purdue University Cytometry Laboratories, Modified by James Marvin

Importanta FSC si a SSC

Corelarea datelor despre dimensiunea si structura interna a celulelor permite diferentierea tipurilor celulare intr-o populatie heterogena de celule

FSC

SS

C

Lymphocytes

Monocytes

Granulocytes

RBCs, Debris,RBCs, Debris,Dead CellsDead Cells

Aplicatiile citometriei in flux:

•Dimensiune, structura interna a celulei;

•Continutul de ADN (ciclu celular, ploidie, proliferare);

•Continutul de ARN;

•Analiza si sortarea cromozomilor;

•Expresia si localizarea proteinelor;

•Antigene de supratafa, intracelulare si nucleare;

•Apoptoza;

•Viabilitatea celulara;

Determinarea, prin citometrie in flux, a

continutului de ADN in celulele

meristemului radicular, la radicelele de

ceapa (Allium cepa L.), dupa 72 ore de la

punerea bulbului de ceapa in contact cu

apa.

A. Histograma ADN in cazul proliferarii

asincrone;

B. Histograma ADN dupa un tratament

prealabil al radicelelor, timp de 15 ore, cu

hidroxiuree si eliberarea, pentru 2 ore, de

sub influenta agentului blocant. Dupa 2 ore

de la incetarea tratamentului: 67% dintre

celulele se afla in faza S timpurie; 17%

dintre celulele sunt celule dipoide care au

iesit din ciclul celular, aflandu-se in faza

G0;16% dintre celulele sunt in faza G2-M.