VALIDAREA METODELOR ANALITICE

Validarea unei metode analitice se defineste ca fiind:

1) procesul prin care laboratorul isi stabileste caracteristicile de performanta, limitele metodei si,

prin care, se identifica factorii care influenteaza aceste caracteristici precum si gradul de

influenta al acestor factori;

2) procesul prin care laboratorul verifica daca metoda este adecvata scopului in care va fi

utilizata.

De ce este necesara, cand si cine realizeaza validarea metodei analitice?

De ce?

Validarea metodei analitice este o cerinta esentiala in practica analizei chimice.

Cand?

- atunci cand laboratorul introduce in lucru o metoda pe care nu a mai utilizat-o in trecut;

- atunci cand trebuie implementate imbunatatiri ale metodei ca urmare a introducerii unui tip de

reactiv imbunatatit de catre producator, schimbarii echipamentului, schimbarii producatorului

reactivilor;

- atunci cand metoda este extinsa pentru a fi utilizata si pentru alt scop decat cel pana in prezent;

- atunci cand rezultatele controlului de calitate indica o modificare a performantelor metodei;

- pentru a demonstra echivalenta a doua metode utilizate in laborator (ex. o metoda noua

introdusa fata de metoda utilizata pana in prezent, sau fata de o metoda standardizata);

- pentru a demonstra echivalenta metodei cand sunt utilizate instrumente diferite;

- cand se introduce o metoda validate.

Cine?

Laboratorul care utilizeaza metoda analitica este responsabil pentru a se asigura ca metoda este

corect validata.

Daca o metoda analitica este dezvoltata cu un domeniu larg de utilizare (ex. procedura standard

publicata), atunci se realizeaza studii in care sunt implicate mai multe laboratoare. Nu este cazul

pentru laboratoare industriale. Validarea intr-un singur laborator impune sa aleaga, in functie de

cerintele clientului, caracteristicile potrivite: selectivitate, exactitate, precizie, domeniu de lucru,

limita de cuantificare, robustete etc.

Conditiile tehnice in care se realizeaza metoda

Validarea metodei trebuie sa se realizeze in urmatoarele conditii:

- responsabilul de validare trebuie sa fie o persoana competenta;

- conditiile de mediu cerute de specifiicatile metodei (ex. specificatiile date de producatorul

echipamentului, reactivilor) trebuie sa fie satisfacute;

- echipamentul de masurare trebuie sa fie in buna stare de functionare, trebuie sa fie etalonate

inainte de validare (daca este cazul) si calibrat corespunzator;

- reactivii sunt adecvati lucrului cu echipamentul care urmeaza a fi validat si sunt in termen de

valabilitate;

- materialele de referinta si reactivii etalon trebuie sa fie adecvati metodei care urmeaza a fi

validate si trebuie sa fie in termen de valabilitate.

Parametri de performanta

1. Selectivitate si specificitate

Atat selectivitatea cat si specificitatea sunt parametri de performanta ai unei metode analitice care ofera

o idée la soliditatea metodei analitice.

selectivitatea = abilitatea metodei analitice de a masura si diferentia analitii in prezenta componentilor

care sunt asteptati a fi prezenti (ex. diferite substante interferente);

specifitatea = abilitatea metodei analitice de evalua analitul in prezenta componentilor care sunt

asteptati a fi prezenti (ex. diferite substante interferente).

Selectivitatea este cercetata prin studierea capacitatii metodei de a masura analitul de interes din probe

in care interferentele specifice au fost introduse in mod intentionat (!!! interferentii introdusi sunt acei

care pot exista in probele reale). Interferentele pot aduce modificari asupra concentratiei analitului

(cresteri sau scaderi a concentratiei) sau pot modifica panta curbei de etalonare.

Exemplu:

O metoda analitica este selectiva atunci cand se pot determina, in proba de analizat, in prezenta

diferitelor substante interferente introduse in mod intentionat, compusi fenolici (fluor-fenol, nitro-fenol

etc).

O metoda analitica este specifica atunci cand se poate determina, in proba de analizat, in prezenta

diferitelor substante interferente introduse in mod intentionat, un singur compus din clasa fenolilor

(fluor-fenol).

Specificitatea este superioara selectivitatii.

Rezultatele obtinute se pot trece intr-un tabel de forma:

Nr. crt.

Proba + compus interferent Absorbanta

Concentratie

analit in proba [mg/L]

Concentratie analit in proba dupa adaugarea compusului

interferent[mg/L]

1 proba standard 0,129 0,200 0,2002 proba standard + compus interferent 0,504 0,200 0,7883 proba standard + compus interferent 0,017 0,200 0,1044 proba standard + compus interferent 0,003 0,200 0,084

2. Domeniul concentratiilor de lucru. Liniaritate

domeniul concentratiilor de lucru = intervalul dintre concentratia inferioara si cea superioara a

analitului din proba de analizat pentru care s-a demonstrat ca procedura are un nivel potrivit de

precizie, exactitate si liniaritate.

liniaritate = abilitatea unei metode analitice de a obtine rezultate proportionale cu concentratia

analitului din proba.

In domeniul de concentratii de lucru raspunsul analitic poate fi liniar si, pentru a demonstra acest lucru

este necesara o etalonare in mai multe puncte (minim 6 concentratii diferite; de preferabil 10-11).

Functia liniara de etalonare este data de ecuatia:

y = a + bx

unde:

a – intersectia cu ordonata in origine,

b – panta dreptei de etalonare.

In figura urmatoare se evidentiaza liniaritatea curbei de etalonare si domeniul concentratiilor de lucru:

0.100, 0.069

0.200, 0.125

0.400, 0.258

0.600, 0.373

0.800, 0.511

1.000, 0.637y = 0,6356x+0,0016R2 = 0,9995

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

concentratie analit [mg/L]

abso

rban

ta [

nm

]

3. Precizie

precizia = potrivirea intre o serie de masurari obtinute de la mai multe probe. Probele provin de la

aceeasi proba (proba-mama).

Precizia are urmatoarele nivele:

Repetabilitate

Este obtinuta cand determinarile sunt facute de acelasi operator, in acelasi laborator, folosind acelasi

instrument, aceeasi metoda intr-un interval scurt de timp.

Este o masura a gradului de imprastiere intr-un interval de incredere a rezultatelor obtinute in urma

masurarii executate de acealasi analist, in aceleasi conditii de lucru.

Rezultatele obtinute se pot trece in tabel:

Nr. crt.Concentratie analit in proba

[mg/L]Absorbanta

1 0,206 0,1302 0,200 0,1273 0,196 0,1234 0,208 0,1325 0,196 0,123

Parametri statistici Valoare calculataDeviatie standard, s (mg/L)Deviatia standard medie, sx (mg/L)Deviatia standard relativa procentuala, RSD (%):Intervalul de incredere pentru valoarea medie, (mg/L)

0,00560,00252.78±x 0.0053

Precizie intermediara

Sunt analizate probe identice prin aceeasi metoda, in acelasi laborator, cu 2 sau mai multe instrumente, de

catre operatori diferiti, intr-un interval mai lung de timp.

Prin precizie intermediara se verifica daca, in cadrul aceluasi laborator utilizand aceeasi metoda,

rezultatele sunt precise.

Rezultatele obtinute se pot trece in tabel:

Nr. crt.Concentratie analit in proba

[mg/L]Absorbanta

1 0,420 0,2692 0,384 0,2483 0,408 0,2624 0,372 0,2405 0,384 0,2466 0,396 0,2537 0,400 0,2598 0,408 0,2639 0,396 0,257

Statistical parameter Calculated valueStandard deviation, s (mg/L)Standard deviation of mean value, sx (mg/L)

0,0150,0049

Relative standard deviation, RSD (%):Confidence interval for mean value (mg/L)

3.72±x 0.010

Reproductibilitatea

Sunt analizate probe identice prin aceeasi metoda dar in laboratoare diferite si, deci, in conditii diferite.

Se verifica daca rezultatele aceleasi metode realizate in laboratoare diferite sunt precise

Se determina, prin calcule, urmatorii parametri:

- abaterea standard

( )1

1

2

−

−=

∑=

n

xxs

n

ii

unde:

- xi – concentratia de analit;

- x – valoarea medie a concentratiei;

- n – numar de masurari.

- abaterea standard medie

n

ss x =

unde:

- s – abaterea standard;

- n – numar de masurari.

- abaterea standard relativa procentuala

100⋅=x

sRSD

unde:

- s – abaterea standard;

- x – valoarea medie a concentratiei.

- interval de incredere (intervalul in care se

gasesc valorile obtinute in urma masurarii)

xstx ⋅±

unde:

- sx – abaterea standard;

- t – factor Student (pentru n-1 grade de

libertate si nivel de incredere 95%).

4. Exactitatea (acuratetea)

exactitatea = apropierea dintre valoarea reala si valoarea gasita in proba de analizat.

Exactitatea unei metode analitice se poate determina prin metoda imbogatirii probelor. Relatia de

calcul este:

100% ⋅−=CA

CUCFR ,

unde:

CF – concentratia/ cantitatea analitului masurata in proba imbogatita;

CU – concentratia/ cantitatea analitului masurata in proba neimbogatita;

CA – concentratia/ cantitatea analitului adaugata.

Rezultatele obtinute in urma recuperarii trebuie sa fie cuprinse in domeniul 85% ≤ R ≤ 105%.

Rezultatele obtinute se pot trece intr-un tabel de forma:

Concentratie analit in proba neimbogatita

CU

Concentratia analitului adaugataCA

Concentratie analit in proba imbogatita

CF

Recuperare(%)

0.050.01 0.060 1000.01 0.060 1000.01 0.059 90

0.050.03 0.083 1100.03 0.081 103.30.03 0.079 96.67

0.050.05 0.100 1000.05 0.102 1040.05 0.099 98

Valoarea medie a recuperarii 100.22

5. Limita de detectie (LOD) si Limita de cuantificare (LOQ)

limita de detectie = cea mai mica cantitate sau concentratie care poate fi detectata fata de blanc si care

poate fi distinsa de zero.

limita de cuantificare = cea mai mica cantitate sau concentratie care poate fi determinate cu un nivel

acceptabil al repetabilitatii si exactitatii.

Limita de detectie se determina astfel: se masoara 10 probe blanc, fiecare o singura data, fata de blanc.

Din seria de 10 masurari se determina media blancx si abaterea standard experimentala s:

blancblancLOD sxx ⋅+= 3

Limita de cuantificare se determina astfel: se masoara 10 probe blanc, fiecare o singura data, fata de

blanc. Din seria de 10 masurari se determina media blancx si abaterea standard experimentala s:

blancblancLOQ sxx ⋅+= 10

3, respectiv, 10 reprezinta parametri de incredere (k, 2-3 pentru LOD, respectiv, m, 5-10 pentru LOQ).

Cu cat k este mai mare, cu atat intervalul de incredere este mai larg.

Valoarea limitei de cuantificare trebuie sa fie mai mica decat cea mai mica valoare din domeniul

concentratiilor de lucru.

6. Robustetea

robustetea = o masura a capacitatii unei metode analitice de a ramane neafectata de variatii mici,

introduse in mod intentionat, a parametrilor metodei.

Pentru evaluarea robustetii pot fi variati:

- parametri interni: temperature, pH, concentratia reactivilor etc.;

- parametric externi: analisti, echipamente, laboratoare etc.

Daca metoda se dovedeste a fi robusta fata de variatia unui paramtru se poate determina ecuatia

dreptei de regresie, abatarea standard si coeficientul de determinare R2. Se verifica astfel liniaritatea

metodei.

Rezultatele obtinute se pot trece in tabel:

Nr. Volum reactiv [mL] Absorbanta Concentratie analit

crt. [mg/L]

1 0 -0.034 02 2 0.262 0.1023 4 0.252 0.0974 6 0.200 0.0785 8 0.139 0.0556 10 0.081 0.034

Nr. crt..

Volum reactiv [mL] pHConcentratie

analit [mg/L]

Absorbanta

1 0 10 0,200 0,1252 2 10 0,220 0,1403 4 10,5 0,216 0,1374 6 11 0,176 0,1125 10 11 0,180 0,1146 20 11 0,200 0,126

Structurarea raportului de validare

Raportul de validare trebuie sa cuprinda:

1. prezentarea conditiilor in care a fost facuta validarea (metoda, responsabil, conditii de mediu,

echipamente, reactivi etc.);

2. prezentarea parametrilor de performanta a metodei (1-6);

3. anexe care sa cuprinda documente doveditoare (curba de calibrare etc);

4. concluzii cu privire la satisfacerea cerintelor;

5. declaratie de validitate a metodei.