metode analitice aplicate farmaceutica (uv, ir, ms, rmn)

62
Metode optice de analiză Aceste metode utilizează proprietăţile optice ale substanţelor. Metodele spectrale de analiză se bazează pe utilizarea fenomenelor de emisie sau de interacţiune a radiaţiei electromagnetice cu atomii sau moleculele substanţei de analizat (absorbţie). Emisia sau absorbţia radiaţiilor electromagnetice de către sistemul cercetat duce la apariţia unui semnal analitic ce dă informaţii despre compoziţia calitativă şi cantitativă a substanţei analizate. Intensitatea semnalului analitic este proporţională cu numărul de particule care au cauzat acest semnal, deci cu concentraţia componentului ce se determină. În cazul metodelor spectrale de absorbţie, semnalul analitic este absorbanţa. Spectrofotometria prin absorbţia luminii (metode absorbţiometrice) Spectrofotometria se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagnetice şi este folosită pentru identificarea şi determinarea cantitativă a acestora. Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicol de radiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbită este în funcţie de structura şi de numărul moleculelor sau al atomilor substanţei cu care interacţionează fascicolul de radiaţii. 1

Upload: babbaranchordas

Post on 09-Aug-2015

109 views

Category:

Documents


9 download

DESCRIPTION

Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

TRANSCRIPT

Page 1: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Metode optice de analiză

Aceste metode utilizează proprietăţile optice ale substanţelor.Metodele spectrale de analiză se bazează pe utilizarea fenomenelor de emisie

sau de interacţiune a radiaţiei electromagnetice cu atomii sau moleculele substanţei de analizat (absorbţie).

Emisia sau absorbţia radiaţiilor electromagnetice de către sistemul cercetat duce la apariţia unui semnal analitic ce dă informaţii despre compoziţia calitativă şi cantitativă a substanţei analizate.

Intensitatea semnalului analitic este proporţională cu numărul de particule care au cauzat acest semnal, deci cu concentraţia componentului ce se determină.

În cazul metodelor spectrale de absorbţie, semnalul analitic este absorbanţa.

Spectrofotometria prin absorbţia luminii (metode absorbţiometrice)

Spectrofotometria se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagnetice şi este folosită pentru identificarea şi determinarea cantitativă a acestora.

Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicol de radiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbită este în funcţie de structura şi de numărul moleculelor sau al atomilor substanţei cu care interacţionează fascicolul de radiaţii.

Radiaţia electromagnetică ce constituie lumina este caracterizată (ca de altfel toate radiaţiile electromagnetice) prin lungime de undă (l), frecvenţă (n), respectiv energie (Є) corelate prin expresia: Є = hn, în care:

l = distanţa în linie dreaptă cuprinsă între două maxime consecutive ale unei unde);

n = frecvenţa radiaţiei (numărul de oscilaţii pe secundă); n = 1/T;T = perioada, ce reprezintă intervalul de timp dintre două maxime consecutive.

c = viteza luminii = 3.1010 cm/s.Numărul de unde cuprinse într-un cm se numeşte număr de undă: n = 1/l (cm).Fiecare radiaţie luminoasă poartă o energie - cuantă de energie - ce este

proporţională cu frecvenţa acesteia:

Є = h.n = h.c/l

h = constanta lui Planck = 6,62.10-27 erg.s

1

Page 2: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

l se măsoară în:- microni (m) 1m=10-6 m = 10-3 mm- milimicroni (mm) 1mm = 10-9 m = 10-6 mm- nanometri (nm) 1nm = 10-9 m = 10-3 m.1 nm = 10-9 m = 10-7 cm = 10Å; 1Å = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m; 1mm = 10-6 m = 10-4 cm = 103 nm.Funcţie de lungimea de undă a radiaţiilor electromagnetice, domeniile spectrale

sunt cele indicate în tabelul 1.

Tabelul 1. Domeniile spectrale funcţie de lungimea de undă

După cum se poate observa şi din relaţia Є – l, aceste mărimi sunt invers proporţionale, deci la lungimi de undă mari, energiile sunt mici şi invers.

O cuantă luminoasă (un foton) poate fi absorbită de un atom sau moleculă, dacă prin aceasta atomul sau molecula trec la unul din nivelele de energie superioare ce diferă de starea de plecare prin energia fotonului.

Energia moleculei (Є) este dată de suma energiilor electronice, de vibraţie şi de rotaţie:

Є = Є electronice + Є vibraţie + Є rotaţieExistă două tipuri de salturi de energie moleculară obţinute în mod diferit:- prin excitaţii electronice, ce corespund energiilor radiaţiilor cu l cuprins între

200 şi 800 nm, implicând saltul electronilor pe nivele energetice superioare - un orbital de antilegătură - acestea determină spectrele de absorbţie în UV şi VIS (spectre electronice);

2

Page 3: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

- prin excitaţiile moleculare determinate de radiaţiile IR (l = 2,0 - 25 mm, domeniul cel mai utilizat) rezultă spectrele moleculare (de rotaţie vibraţie sau spectrele IR)

- de rotaţie 100 - 15000 mm; - de vibraţie 1,5 - 100 mm.

Absorbţia radiaţiei electromagnetice de o anumită lungime de undă este dependentă de caracteristicile structurale ale moleculei şi dă o indicaţie asupra prezenţei acesteia, figura 1.

Figura 1. Absorbţia radiaţiei electromagnetice

Trecând printr-o probă un fascicol luminos cu diverse lungimi de undă se constată că, la anumite valori ale lui l, radiaţia electromagnetică este absorbită .

O înregistrare a cantităţii de lumină absorbită de o probă funcţie de lungimea de undă se numeşte spectru de absorbţie, figura 2.

Figura 2. Spectrul de absorbţie

Aceste spectre de absorbţie sunt produse de diferite tipuri de tranziţii pe care le pot suferi electronii din atomi sau molecule: tranziţie electronică (spectre UV-VIS); tranziţie de vibraţie (spectre IR) în care nucleele dintr-o moleculă se mişcă faţă de altul de-a lungul unei axe care le uneşte; tranziţie de rotaţie (spectre de microunde) în care moleculele prezintă o mişcare de rotaţie în jurul unei axe ce trece prin centrul de greutate al moleculei, fiind perpendiculară pe dreapta ce uneşte cele două nuclee (dacă este o moleculă diatomică)

Pentru a se obţine spectre electronice este nevoie de o energie mai mare decât în cazul spectrelor de absorbţie în IR , tabelul 2.

Tabelul 2. Energia şi lungimea de undă corespunzătoare energiei interneTipul de energie internă Domeniul, eV l corespunzătoare energiei

3

Page 4: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Rotaţie 1,24.10-2 - 1,24. 10-4 100 - 10 mm

Vibraţie 0,828 - 0,0124 1,5 - 100 mmElectronică 8,28 - 0,828 150 – 1500 nm

Absorbţia energiei luminoase în domeniul UV-VIS poate produce următoarele fenomene:

- trecerea electronilor dintr-un orbital de legătură s sau p, ocupat de electroni în stare fundamentală, în orbitali de antilegătură s* sau p*, neocupaţi în stare fundamentală, dar posibil de a fi ocupaţi în stare excitată;

- trecerea din orbitali de non legătură n (electroni neparticipanţi) în orbitali s* sau p*, figura 3.

Figura 3. Tranziţii electronice posibile

Tranziţiile s–s* sunt date de substanţele ce conţin numai legături simple - s -; acestea necesită o energie foarte mare, iar informaţiile obţinute sunt prea puţin importante pentru a da indicaţii asupra structurii substanţelor.

Tranziţiile electronice produc benzile de absorbţie prezente în spectrul unei substanţe, benzi caracteristice anumitor grupări de atomi. Aceste benzi pot fi deplasate sub influenţa unor factori structurali sau a unor factori de mediu (de exemplu solventul etc.). Deplasarea poate fi:

- batocromă: maximum se deplasează spre lungimi de undă mai mari (spre roşu). Deplasarea batocromică produsă la trecerea unei substanţe covalente în combinaţia ionică este numită halocromie (are loc o extindere a sistemului cromofor).

- hipocromă: maximum de absorbţie se deplasează spre lungimi de undă mai mici (violet) şi intensitatea maximă de absorbţie este influenţată de factori structurali şi de mediu.

Creşterea intensităţii absorbţiei se numeşte efect hipercromic, scăderea intensităţii absorbţiei se numeşte efect hipocromic.

4

Page 5: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

În figura 4 sunt prezentate şi alte fenomene ce apar în cazul absorbţiei luminii de către moleculele substanţelor.

A - Absorbţie ; F - Fluorescenţă; P - Fosforescenţă; VR - Vibraţie de relaxare; IC - Conversie internă; ISC - Încrucişare intersisteme.

Figura 4. Fenomene posibile ce apar la absorbţia radiaţiei luminoase de către atomi sau molecule

Măsurătorile spectrofotometrice cantitative se bazează pe legea de absorbţie Bouguet–Lambert–Beer: descreşterea intensităţii fascisolului după ce a străbătut un strat absorbant este proporţională cu grosimea stratului şi concentraţia acestuia.

I / Io = 10-ecl ; I = Io.10-ecl

unde: I = intensitatea luminii transmise (ce părăseşte proba);Io = intensitatea luminii incidente (ce pătrunde în probă);

e = coeficient molar de extincţie sau absorbtivitate molară;c = concentraţia soluţiei ce absoarbe (în mol/L);l = grosimea stratului absorbant (cm).I / Io = T = transmitanţă sau transmisie - este deci raportul dintre intensitatea

luminii transmise I şi intensitatea luminii incidente Io.

Aplicând logaritmul pentru Io / I rezultă:

5

Page 6: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

log (Io / I) = log (1 / T) = ecl = A = E = D = absorbanţă (A), extincţie (E) sau

densitate optică (D).

Deci, legea care stă la baza spectrofotometriei se exprimă simplu:

A = e.c.lLegea de bază a spectrofotometriei spune că absorbanţa (extincţia) este

proporţională cu concentraţia şi cu grosimea stratului absorbant.O altă mărime utilizată în spectrofotometrie rezultă tot din relaţia de mai sus.

Raportul A / c.l = a = absorbtivitate sau coeficient de extincţie (k), în care c este concentraţia (în g / L) (altă unitate de concentraţie decât molaritatea) şi l este grosimea stratului absorbant (în cm).

Dacă în relaţia de mai sus, l = 1 cm, c = 1 mol/L, relaţia devine:A = ee se numeşte în acest caz absorbtivitate molară (absorbanţă molară sau

coeficient molar de extincţie). Această mărime este o caracteristică a moleculei şi variază numai cu lungimea de undă. Deci, prin absorbtivitate molară se înţelege absorbanţa unei soluţii cu concentraţia de 1 mol / L şi grosimea stratului absorbant de 1 cm, la o anumită lungime de undă.

O altă mărime utilizată este absorbanţa specifică (coeficient de extincţie specifică sau simplu extincţie specifică).

Se notează (FR X) sau şi reprezintă absorbanţa unui strat de soluţie

cu concentraţia 1% (m/v) şi grosimea de 1 cm, la o anumită lungime de undă. Este de asemenea o constantă ce caracterizează fiecare substanţă.

Sensibilitatea unei metode se poate vedea după valoarea lui e şi A. Prin urmare, sub numele de absorbţiometrie sau spectrofotometrie prin

absorbţie a luminii se înţeleg toate metodele ce au la bază următorul principiu: un fascicol luminos, de o anumită lungime de undă, străbate proba de analizat şi după proporţia în care este absorbită radiaţia luminoasă, se determină cantitatea de substanţă absorbantă.

Metoda se numeşte absorbţiometrie fotometrică sau spectrofotometrie prin absorbţie sau încă spectrocolorimetrie; denumirea de colorimetrie este improprie, acesta definind în realitate metodele de analiză pentru specificarea şi descrierea culorilor.

Metodele absorbţiometrice au cunoscut o evoluţie considerabilă şi datorită tehnicilor moderne de lucru şi aparaturii folosite.

Domenii de aplicare şi avantaje

Datorită perfecţionării aparaturii şi metodelor de lucru, spectrofotometria UV-VIS a devenit o metodă performantă, cu o eroare mică = 0,25 - 0,5%, comparabilă cu a

6

Page 7: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

metodelor titrimetrice. (la început mai ales în cazul analizei urmelor precizia lăsa de dorit.

Principalele avantaje:- se pot aplica pentru dozarea majorităţii substanţelor. În cazul în care compusul

nu absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacţie chimică adecvată într-un compus colorat ce absoarbe lumina.

- folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de determinare a urmelor de substanţă.

- sunt metode rapide, prin măsurarea directă, fără a fi necesară adăugarea de soluţie titrată. În multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin folosirea unor reactivi specifici şi prin controlul strict al reacţiei se poate elimina interferenţa ionilor străini (controlul pH-ului, lungime de undă convenabil aleasă, utilizarea solvenţilor organici pentru extragerea complecşilor coloraţi, utilizarea unor reacţii redox etc.).

- prin metodele spectrofotometrice se poate pune în evidenţă punctul de echivalenţă într-o metodă titrimetrică (titrare spectrofotometrică).

Schema bloc a unui spectrofotometru de absorbţie în UV şi vizibil este următoarea:

Sursa de radiaţii este în mod obişnuit o lampă de incandescenţă (cu filament de wolfram) pentru domeniul vizibil, iar pentru domeniul ultraviolet o lampă cu hidrogen sau deuteriu etc.

Cuvele şi monocromatorul pentru domeniul vizibil sunt confecţionate din sticlă iar pentru ultraviolet din cuarţ.

În prezent pentru selectarea radiaţiei monocromatice se folosesc mai puţin prismele şi mai mult reţelele de difracţie.

Solventul folosit pentru realizarea soluţiilor, mai ales pentru determinări în UV, trebuie să nu absoarbă în domeniul cu maximul de absorbţie pentru probă, tabelul 3.

Tabelul 3. Domeniul de absorbţie în UV pentru unii solvenţi

SolventulDomeniul în care

absoarbe (nm)Solventul

Domeniul în care absoarbe (nm)

Apa până la 190 Diclormetan 200 – 230n-Hexan până la 195 1,2-Dicloretan 200 – 233Metanol 200 – 210 Cloroform 200 – 250Etanol 200 – 210 Acetat de etil 200 – 260Ciclohexan 200 – 210 Tetraclorură de carbon 200 – 265

7

Page 8: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Eter etilic 200 – 210 Dimetilformamidă 200 – 270Acetonitril 200 – 212 Benzen 200 – 2801,4-Dioxan 200 – 220 Toluen 200 – 285Izooctan 200 – 220 Piridină 200 – 305Glicerină 200 – 230 Acetonă 200 - 330

Metode de dozare

Metode directe

In cazul substanţelor la care se cunoaşte valoarea absorbanţei specifice sau molare determinarea se face astfel:

Se măsoară absorbanţa (densitatea optică - D, A, E) a soluţiei de analizat si

folosind relaţia A = e.c.l se determină concentraţia cunoscând valoarea lui e şi l, (l reprezintă grosimea cuvei şi de regulă este de 1 cm = 10 mm).

Dacă pentru o substanţă se cunoaşte valoarea absorbanţei specifice, se poate calcula concentraţia în substanţa de analizat pe baza relaţiei:

=> c în g% (m/v)

Calculul se face în modul următor:

..................................1 g/100 ml

A ................................. c g/100 ml

Se poate folosi şi metoda curbei de etalonare (calibrare) ţinând cont de faptul că A = f(c), vezi figura 5.

În acest scop se prepară o serie de soluţii etalon cărora li se determină absorbanţa la lungimea de undă caracteristică analitului (λ max). Se reprezintă grafic variaţia absorbanţei în funcţie de concentraţia, obţinându-se curba de etalonare. Folosind absorbanţa probei prelucrată în acelaşi mod cu soluţiile etalon, prin interpolare, se află din curba de calibrare cioncentraţia analitului.

8

Page 9: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Figura 5. Curba de calibrare în spectrofotometria de absorbţie

Pentru a avea o bună precizie, concentraţiile soluţiilor se aleg astfel încât valorile absorbanţelor să fie cuprinse în domeniul 0,20 - 0,80.

Metode indirecte

La soluţia de analizat se adaugă un reactiv ce determină scăderea absorbanţei (de exemplu prin formarea unui complex). Curba de etalonare va avea forma următoare, figura 6:

Figura 6. Curba de calibrare în cazul în care reactivul determină scăderea absorbanţeiPrin determinarea absorbanţei se află concentraţia.

Metoda diferenţială

Este o tehnică spectrofotometrică în care soluţia de referinţă (martorul) conţine componentul major din probă iar spectrul înregistrat reprezentă diferenţa dintre absorbanţa probei şi a soluţiei de referinţă.

9

Page 10: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Deosebirea faţă de metodele clasice constă în înlocuirea martorului clasic cu această soluţie de referinţă.

De exemplu, la determinarea liganzilor pentru anumite enzime, soluţia de referinţă este constituită din enzima şi solvent iar proba conţine enzimă şi ligandul în acelaşi solvent.

Titrimetrie spectrofotometrică

Se determină punctul de echivalenţă într-o titrare prin măsurarea variaţiei absorbanţei funcţie de volumul de soluţie adăugată. Se reprezintă grafic această variaţie. Punctul de inflexiune reprezintă volumul de echivalenţă. Curbele de titrare pot avea formele (1) in cazul in care solutia titrata este colorata si la titrare culoarea dispare, sau (2) cazul in care produsul de reactie este colorat, figura 7.

Figura 7. Stabilirea punctului de echivalenţă spectrofotometric

Spectre derivate

Spectrul de absorbţie este reprezentarea grafică a absorbanţei funcţie de lungimea de undă, - spectru de ordin 0. În scopul analitic acest spectru poate fi derivat, obţinându-se spectrele derivate:

- de ordinul întâi:

- de ordinul doi:

- de ordinul n:

10

Page 11: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

În figura 8 sunt prezentate efectele derivării unui spectru cu un singur maxim de absorbţie.

Derivata I-a se obţine prin reprezentarea vitezei de variaţie a absorbanţei în funcţie de lungimea de undă, spectrul începe şi se termină la valoarea zero, trecând prin zero la aceeaşi valoare a lungimii de undă corespunzătoare maximului de absorbţie.

Figura 8. Spectre derivate

Principala caracteristica a derivatei de ordin doi este un minim la aceeaşi lungime de undă ca şi maximul din spectrul de ordin zero.

Derivata a patra prezintă o bandă pozitivă cu un maxim la aceeaşi lungime de undă ca şi maximul din spectrul de ordin zero.

Prin transformarea spectrului UV–VIS în derivate de ordin I sau II se obţine de regulă un profil mult mai complex decât în cazul spectrului de ordin zero.

Spectrul derivat accentuează diferenţele dintre benzile spectrului, poate rezolva suprapunerea benzilor şi, cel mai important, poate a reduce efectul interferenţelor.

11

Page 12: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Spectrele derivate pot fi utilizate la confirmarea identităţii unui compus prin compararea cu spectrele unor compuşi de referinţă. Dacă spectrele sunt similare compuşii sunt identici.

Un efect nedorit al procesului de derivare este scăderea raportului semnal / zgomot odată cu creşterea gradului de derivare.

Aplicaţii

Efectuarea unei determinări cantitative (dozări) spectrofotometrice sau elaborarea unei noi metode de dozare cuprinde următoarele etape de lucru:

a) Studiul reacţiei chimice ce stă la baza determinării (reacţie de culoare) implicând:

- alegerea reactivului de culoare, - a solventului, stoechiometria reacţiei, - viteza de apariţie a culorii, - stabilitatea în timp a speciei colorate, - influenţa diferiţilor factori asupra reacţiei de culoare (pH, temperatură, ordinea

adăugării reactivilor, prezenţa speciilor străine, interferenţi), - sensibilitatea reacţiei de culoare, - domeniul optim de concentraţie.b) Studiul aspectului fizic al determinării: alegerea lungimii de undă la care

compusul colorat prezintă absorbanţă maximă şi a metodei de măsurare.c) Verificarea valabilităţii legii Lambert-Beer.d) Construirea curbei de etalonare.e) Măsurarea absorbanţei probei de analizat (prelucrată în aceleaşi condiţii cu

etalonul) şi deducerea valorii concentraţiei de pe curba de etalonare.

Sensibilitatea metodei spectrofotometrice depinde de doi factori: sensibilitatea reacţiei de culoare şi sensibilitatea înregistrării (observării) diferenţelor mici de absorbanţă.

Sensibilitatea reacţiei de culoare este proporţională cu coeficientul molar de extincţie al substanţei ce absoarbe.

Pe baza unor considerente teoretice se poate prevedea că valoarea maximă a lui e este de ordinul 105 (100000).

Sandell afirma că: sensibilitatea (S) unei reacţii de culoare este dată de cantitatea de substanţă (mg) dintr-un strat de soluţie cu secţiunea de 1 cm2 ce produce o absorbanţă egală cu 0,001 (de exemplu, sensibilitatea reacţiei Fe2+ cu o-fenantrolină

este 0,05mg/cm2; iar pentru Mn2+ după oxidare la MnO4- este 0,1mg/cm2).

Prin analogie cu legea Bouguet–Lambert–Beer:

12

Page 13: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Acest coeficient S, este definit de Kortűm ca fiind cantitatea de substanţă exprimată în mg conţinută într-un litru de solvent ce determină o absorbanţă egală cu 0,001 pentru o grosime a stratului absorbant de 1 cm.

S-au elaborat un număr foarte mare de metode de dozare atât pe compuşi anorganici cât şi organici. Practic, orice substanţă poate fi dozată şi printr-o metodă spectrofotometrică, dacă se utilizează o reacţie de culoare adecvată pentru VIS sau UV. Contribuţii în domeniu: Sandell, Charlot, Babko etc.

Vom prezenta în continuare câteva exemple de dozări, cu referire la substanţe de interes farmaceutic.

Dozarea alcaloizilor

Determinarea spectrofotometrică a alcaloizilor se bazează pe proprietatea acestora de a forma compuşi coloraţi cu o serie întreagă de reactivi atât din categoria reactivilor generali ai alcaloizilor cât şi reactivi specifici unei anumite structuri chimice.

Alcaloizi ca stricnina, chinina, cinconina etc. reacţionează cu acidul picric formând precipitate colorate care după separare şi dizolvare în amoniac se determină spectrofotometric (sarea de amoniu a acidului picric este colorată în galben).

Se mai poate aplica extracţia picratului respectiv într-un solvent organic convenabil ales şi măsurarea absorbanţei soluţiei obţinute.

Sarea Reinecke (tetratiocianodiaminocrom III) NH4[Cr(SCN)4(NH3)2] formează cu alcaloizii precipitate colorate ce se separă, se spală, se dizolvă în acetonă şi se măsoară absorbanţa.

Heteropoliacizii precipită alcaloizii din mediu acid, precipitatele obţinute fiind reduse după separare şi purificare, cu TiCl2, SnCl2, SO3

2- etc. la albastru de molibden sau de wolfram funcţie de heteropoliacidul utilizat la precipitare (metoda albastrului de wolfram şi de molibden).

Alcaloizi cum ar fi codeina, vincamina, alcaloizi din Solanacee etc. precipită cu reactivul Wasiky (p-dimetilaminobenzaldehida).

Derivaţii barbiturici

Derivaţii barbiturici pot fi determinaţi atât în UV cât şi în VIS. Determinările în UV se fac la lmax = 220 nm în mediu acid şi 240-245 nm în mediu bazic.

De exemplu barbitalul (veronalul) la pH = 10 absoarbe la 240 nm prezentând = 538, ciclobarbitalul = 423 iar fenobarbitalul = 431.

13

Page 14: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Pentru determinarea în vizibil se utilizează reactivi de culoare: de exemplu pentru fenobarbital acetatul de cobalt şi izopropilamină. (lmax = 560 nm).

Acidul ascorbic

Spectrul de absorbţie în UV trasat în soluţie de HCl 0,01N prezintă lmax = 245

nm şi =695, iar în tampon fosfat de pH = 6,4 lmax = 265 nm, = 945. Pentru

domeniul vizibil se utilizează o serie întreagă de reacţii de culoare cum ar fi reacţia produsului de oxidare (acidul dehidroascorbic) cu hidrazine => hidrazone colorate.

În reacţia cu diclorfenilindofenol se obţine o curbă descendentă (decolorare).

Sulfamide

Metodele de dozare ale sulfamidelor sunt prezentate în tabelul 4.

Tabelul 4. Absorbanţa specifică pentru câteva sulfamide

Sulfamida lmax (UV)

Sulfapiridina 240 620 (apă)Sulfapiridina 261 680Sulfapiridina 270 857Sulfadiazina 270 844 (etanol)Tolbutamidă 228 500 (etanol)

Pentru compuşi ce nu absorb în UV se aplică reacţii chimice ce conduc la produşi cu absorbţie în UV.

De exemplu, alcaloizii formează cu clorura de p-nitrozobenzoil un ester (esterul p-nitrozobenzoic) cu lmax = 253 nm.

Aminele primare şi secundare

Aminele primare şi secundare reacţionează cu anhidrida cinamică în acetonitril formând amida cinamică ce prezintă absorbanţă maximă la 305 nm (acidul cinamic

C6H5_CH=CH_COOH).

Aminoacizii (ca şi aminele de fapt) formează cu clorura de anisil dimetilaminoftaleina, respectiv sulfonamide cu lmax = 284-290 nm şi 320-350 nm.

Cationi metalici

Câţiva dintre reactivii folosiţi pentru determinarea spectrofotometrică a cationilor sunt consemnaţi în tabelul 5.

Tabelul 5. Reactivi folosiţi pentru determinarea spectrofotometrică a unor cationi.

14

Page 15: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

ReactivulIonul ce se determină

lmax emax

Alizarina Zr 525 5,3.103

Acidul cromotropic Ti 460 1,7.104

Difeniltiocarbazona Pb 520 6,6.104

8-hidroxichinoleina Al 386 6,6.103

Nitrozo-R (sare de Na) Co 500 1,5.104

1,10-fenetrolina Fe (II) 508 1,1.104

Piridilazonaftol Zn 515 2,3.104

Ditiocarbamat de Na Cu 436 1,3.105

Bis - baze Schiff Mn 460 9,8.104

Hormonii corticosteroizi

Hormonii corticosteroizi (hidrocortizon, flumetazona, fluocinolona, prednisolona etc.) prezintă maxim de absorbţie la lmax = 240 nm, = 400.

Pentru dozări în vizibil, reacţia cu albastru de tetrazoliu lmax = 525 nm.

Acidul salicilic şi derivaţii săi

Acidul salicilic şi derivaţii săi se determină prin reacţia cu Fe3+ în mediu neutru, obţinându-se compuşi cu lmax = 525 nm.

Determinarea concentraţiei a două substanţe în amestec, având maximum de absorbţie la lungimi de undă apropiate

Se poate rezolva determinarea spectrofotometrică a unor amestecuri ce conţin două componente chiar dacă spectrele lor se suprapun parţial, prin măsurarea absorbanţei probei la două lungimi de undă corespunzătoare maximelor de absorbţie ale celor două componente. Această determinare se poate realiza datorită faptului că absorbanţele sunt aditive.

S-a constatat că spectrul de absorbţie a unui amestec de doi componenţi (x şi y) este echivalent cu rezultatul însumării spectrelor caracteristice celor 2 componenţi x şi y, figura 9.

15

Page 16: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Figura 9. Spectrul de absorbţie a doi compuşi x şi y (separat) şi în amestec.

Prin urmare, dacă se determină absorbanţa probelor la lungimile de undă l1 ,l2 caracteristice componenţilor x şi y (este vorba de lmax) se pot scrie următoarele ecuaţii:

;

În aceste ecuaţii s-a ţinut seama de faptul că absorbanţa totală la cele două lungimi de undă este determinată de suma componentelor x şi y (conform spectrului de absorbţie)

Prin rezolvarea sistemului de ecuaţii, rezultă:

;

unde:cx = concentraţia componentului x în probă (% m/v);cy = concentraţia componentului y în probă;Al1 = absorbanţa probei la lungimea de undă l1;

Al2 = absorbanţa probei la lungimea de undă l2;

= absorbanţa specifică a componentei x la lungimea de undă l1;

= absorbanţa specifică a componentei x la lungimea de undă l2;

= absorbanţa specifică a componentei y la lungimea de undă l1;

= absorbanţa specifică a componentei y la lungimea de undă l2;

b = grosimea stratului absorbant (cm), (în general b = 1 cm).

16

Page 17: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Pentru a calcula absorbanţa specifică a celor două componente la cele două lungimi de undă (dacă nu se cunoaşte) se folosesc soluţii etalon de concentraţie 1% (m/v).

Se poate determina concentraţia şi folosind coeficientul molar de extincţie

(A = e.c.b), sistemul de ecuaţii fiind asemănător. Se va deduce în acest caz concentraţia soluţiei de analizat în moli/L.

Coeficientul molar de extincţie, dacă nu este cunoscut, se determină experimental prin măsurarea absorbanţei soluţiei etalon la cele două lungimi de undă.

De exemplu: A = 0,750; c = 4,63.10-4 M; b = 1 cm.

e = A/(c.b) = 0,750 / 4,63.10-4 = 1577 cm-1. M-1

17

Page 18: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Spectrometria I.R.

Radiaţiile IR constituie partea spectrului electromagnetic cu lungimea de undă superioară radiaţiilor vizibile şi inferioare undelor radio.

Spectrul electromagnetic

Radiaţiile IR sunt constituite din:- IR apropiat 750 - 2500 nm (0,75 - 2,5 mm);- IR mijlociu 2500 - 50000 nm (2,5 - 50 mm);- IR îndepărtat 50000 - 1000000 nm (50 - 1000 mm).(1 nm = 10-9 m = 10-7 cm)De obicei, pentru radiaţiile IR, l se exprimă în mm sau număr de unde

(1mm = 10-4 cm = 10-6 m = 103 nm = 104Å)= număr de unde = 1/l; (se exprimă în cm-1).

Legătura între l şi am văzut-o deja: = 1/l (cm) = 104/ l(mm) deoarece 1 mm = 10-4 cm.

Exemplu: l = 2,5 mm = 2500 nm = 2,5.10-4 cm

= (1/2,5). 104 = 4000 cm-1

Domeniul ce prezintă cel mai mare interes pentru analiza organică este foarte limitat şi cuprinde vibraţiile cu l între 2,5 - 25 mm, respectiv 4000 - 400 cm-1.

Energia acestor radiaţii este prea mică pentru a produce modificări în structura electronică a moleculelor sau atomilor absorbanţi, dar este suficientă pentru a produce modificări în energia lor de vibraţie sau rotaţie.

Prin analogie cu spectrele UV-VIS, spectrul IR este reprezentarea grafică a procentului de energie absorbită (absorbanţa sau transmisia) funcţie de lungimea de undă exprimată în mm sau frecvenţă exprimată în cm-1 (număr de unde).

Radiaţiile IR a căror lungime de undă depăşeşte 100 mm sunt absorbite de moleculele substanţelor, modificându-le energia de rotaţie. Această absorbţie este

18

Page 19: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

cantitativă, motiv pentru care un spectru de rotaţie moleculară prezintă un ansamblu de linii fine.

În schimb, radiaţiile cu lungime de undă mai mică (1 - 100 mm), deci cu energii mai mari, sunt capabile, atunci când sunt absorbite, să producă modificări - tranziţii - în energiile de vibraţie moleculară. Aceste tranziţii sunt cuantificate şi ele, dar spectrele de vibraţie nu vor mai prezenta linii ci benzi mai mult sau mai puţin late, datorită faptului că fiecărei tranziţii de energie de vibraţie i se pot asocia tranziţii de energie de rotaţie.

Intensităţile bezilor de absorbţie sunt indicate fie prin transmisie T, fie prin absorbanţă A (D,E).

Transmisia = energia fascicolului IR după trecerea prin probă / energia fascicolului IR la intrarea în probă;

T = I/I0.A = log (1/T) = log(I0/I)

T% = (I/I0).100T% = transmitan]a substanţei de analizat (în procente);I = intensitatea luminii transmise;I0 = intensitatea luminii incidente.Există două tipuri de vibraţii moleculare:- vibraţii de alungire (stretching) şi- vibraţii de deformare (bending)O vibraţie de alungire este cea în cursul căreia doi atomi se apropie şi se

depărtează periodic de-a lungul axei lor comune (se modifică continuu distanţa interatomică).

Într-o vibraţie de deformare, sunt modificate şi unghiurile dintre legături, iar în spectrul IR vor fi observate numai cele care antrenează variaţii periodice ale mementului de dipol al moleculelor. Sunt perturbări ce survin în repartiţia sarcinilor electrice în interiorul moleculei din cauza diverselor vibraţii care sunt responsabile de interacţiunea ce se produce între moleculă şi câmpul electromagnetic oscilant al radiaţiei IR. Vibraţiile de deformare sunt de patru tipuri: forfecare, legănare, răsucire, basculare.

Considerând un grup de atomi aşezaţi neliniar de forma AX2, acesta va cuprinde 3 vibraţii: alungire, deformare în plan şi deformare în afara planului. În general, pentru o moleculă ce cuprinde n atomi, se vor înregistra 3n-6 (33-6 = 3 pentru AX2) tipuri de vibraţii fundamentale (figura 1).

19

Page 20: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Figura 1. Tipuri de vibraţii fundamentale pentru o moleculă tip AX2

Acest număr teoretic al tipurilor de vibraţii (şi de frecvenţe de absorbţie) nu corespunde numărului de benzi de absorbţie din spectru. Se pot observa benzi suplimentare ce corespund frecvenţelor armonice ale frecvenţei fundamentale sau benzilor de combinaţie a căror frecvenţă este egală cu suma frecvenţelor celor două vibraţii fundamentale.

Deasemenea, anumite benzi, previzibile teoretic, pot să nu apară din diferite motive:

- frecvenţa fundamentală este în afara domeniului 2,5-15 mm;- banda fundamentală are o intensitate prea mică pentru a fi vizibilă în spectru;- două frecvenţe fundamentale sunt foarte apropiate şi se confundă etc.Calculul frecvenţei ce corespunde vibraţiei de alungire a unei legături, poate să

se facă apelând la legea lui Hooke.Aceasta se bazează pe un model mecanic al vibraţiei de alungire pentru o

moleculă diatomică, considerată a fi formată din două mase reunite printr-un resort (oscilator armonic)

yx

MyMx

Se obţine relaţia:

în care: = frecvenţa în cm-1 (număr de unde);

c = viteza luminii (cm.s-1);

f = constanta de forţă a legăturii (în dyne.cm-1);Mx şi My = masele atomilor x şi y (în grame).

În general, constanta de forţă a legăturii este de ordinul a 5.105 dyn/cm pentru legături simple, respectiv de 2 sau de 3 ori mai mare pentru legături duble respectiv triple.

20

Page 21: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Prin aplicarea formulei în cazul legăturii C-H, considerând masele celor doi

atomi 19,8.10-24 g respectiv 1,64.10-24 g (M1 = 12 g.mol-1/6.1023 atomi.mol-1 = 19,8.1024;

M2 = 1 g.mol-1/6.1023 atomi.mol-1 = 1,66.10-24), frecvenţa de vibraţie a acestei legături va fi 3040 cm-1 (3,3 mm).

În realitate, frecvenţa pentru legăturile C-H din grupările metil şi metilen apare la 2960 şi 2850 cm-1.

Imprecizia calculului se explică prin aceea că nu s-a ţinut cont şi de influenţa atomilor vecini legăturii C-H. Înlocuind H cu deuteriu frecvenţa de vibraţie a legăturii C-D apare la valori mai mari ale lui n ca la C-H, fapt ce serveşte la atribuirea frecvenţelor de vibraţie C-H diverselor grupări prezente în moleculă.

Calcule asemănătoare celui de mai sus permit să se prevadă următoarele domenii de frecvenţă pentru:

CC C O C H 1300-800 cm-1

(7,7-12,5mm)

C C OC NC NO1900-1500 cm-1

(5,3-6,7mm)

CC NC 2300-2000 cm-1

(4,4-5,0mm)

Pentru a aduce mai multă precizie în calculul frecvenţelor de vibraţie prin relaţia lui Hooke, este necesar să se ţină seama simultan de masa atomilor şi de energiile de legătură. Creşterea constantei de forţă joacă un rol mai important decât creşterea masei atomilor.

Astfel, legătura F-H va absorbi la o frecvenţă mai ridicată decât legătura C-H (4138 cm-1 faţă de 2862 cm-1).

Energia utilizată pentru o vibraţie de deformare este în general mai slabă decât energia unei vibraţii de alungire şi benzile caracteristice din spectrul IR apar spre frecvenţe mai mici decât cele corespunzătoare vibraţiilor de alungire.

Domeniile atribuite diverselor frecvenţe de alungire şi de deformare sunt indicate în tabelele ce cuprind frecvenţele sau lungimile de undă caracteristice câtorva grupe de atomi.

Influenţa legăturii de hidrogen asupra frecvenţei de vibraţie trebuie luată în seamă deoarece micşorează frecvenţele de alungire şi măreşte frecvenţele de deformare.

Aparatura

Un spectrofotometru cu dublu fascicol, comportă cinci părţi principale:

21

Page 22: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

1 2 3 4 5

1. Sursa de radiaţii IRRadiaţiile IR se obţin la temperatura de 1000-1800°C. Sursa este constituită fie

dintr-un filament Nernst (oxizi de zirconiu, thoriu şi ceriu fixaţi pe un liant), fie baghetă Globar (carbură de siliciu). Ambele sunt aduse la temperatura de lucru prin trecerea unui curent electric.

Energia emisă de o sursă Globar este maximă în regiunea 5500-5000 cm-1 şi descreşte spre numere de undă mai mici (la 600 cm-1 descreşte de 600 ori). Filamentul Nernst emite maximum de energie spre 7100 cm-1 şi scade de 1000 ori spre frecvenţe mai coborâte.

Radiaţia ce pleacă de la sursă este împărţită în două fascicole: unul traversează proba, celălalt substanţa de referinţă.

2. Compartimentul pentru probeCompartimentul pentru probe cuprinde loca[ul cuvelor pentru proba de analizat

şi de referinţă. Celulele (cuvele) sunt foarte diferite funcţie de substanţa de analizat.

3. Fotometrul

Fotometrul este dispozitivul care realizează măsurarea intensităţii fascicolului ce străbate proba comparativ cu a celui de referinţă.

Fascicolul de referinţă reflectat de un sistem de oglinzi, cade pe o oglindă turnantă ce realizează un fascicol intermitent cu o frecvenţă între 8 şi 13 cicluri pe secundă, după care trece printr-o fantă şi cade pe fotocelulă.

Concomitent, fascicolul ce străbate proba cade printr-un sistem de oglinzi pe aceeaşi oglină turnantă şi apoi prin aceeaşi fantă, pe detector.

Se poate spune că cele două radiaţii au fost combinate într-un singur fascicol modelat cu o frecvenţă ce depinde de viteza de rotaţie a oglinzii turnante. Cele două fascicole pot fi echilibrate cu ajutorul unui dispozitiv de atenuare, piptene, ce absoarbe mai mult sau mai puţin fascicolul de referinţă. Cu ajutorul unui servomecanism atenuatorul echilibrează cele două fascicole; mişcarea acestuia este apoi înregistrată funcţie de lungimea de undă, realizându-se spectrul IR de absorbţie.

4. Monocromatorul

Monocromatorul realizează separarea unei radiaţii monocromatice folosind prisme speciale, transparente la IR.

22

Page 23: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Astfel, o prismă din NaCl este utilizabilă satisfăcător în domeniul 4000-650 cm-1, cele din CaF2 numai în domeniul 4200-1300 cm-1, iar cele din KBr şi CsBr sunt mai indicate pentru domeniul 1100-385 cm-1.

În prezent, utilizarea reţelelor de difracţie este din ce în ce mai acceptatî, datorită numeroaselor avantaje.

Se spune că un aparat are o putere de rezoluţie cu atât mai mare cu cât separă un domeniu de lungimi de undă mai îngust. Cu cât fanta prin care trece fascicolul este mai mică, rezoluţia este mai mare. Nu se poate lucra însă cu fante foarte mici (înguste) deoarece intensitatea radiaţiei emise de sursă scade, mai ales la lungimi de undă mari.

La aparatele moderne, lărgimea fantei este reglată astfel încât intensitatea fascicolului să rămână prectic constantă.

5. Detectorul – înregistratorul

Detectorul - înregistratorul (receptorul) este un dispozitiv ce furnizează dateleprivind intensitatea fascicolului ce străbate proba. În general, se utilizează trei

tipuri de detectori: detectori termici, piroelectrici şi fotoconductori. Se mai foloseşte celula pneumatică sau celula Golay - bazată pe energia totală care acţionează asupra detectorului, flexibilă şi foarte sensibilă, utilă în domeniul 0,8-1000 mm.

Detectorii termici folosesc efectul caloric al fascicolului de lumină. Se utilizează termocuplul şi bolometrul.

În cazul termocuplului, energia fascicolului încălzeşte lucul de sudură a două lame bimetalice, forţa electromotoare ce ia naştere fiind funcţie de energia incidentă.

În cazul bolometrului, încălzirea are ca efect modificarea valorii unei rezistenţe, modificare ce este dependentă de energia incidentă.

Deci, orice modificare a intensităţii fascicolului probei, comparativ cu cel de referinţă, se traduce printr-un semnal electric care se înregistrează.

Atât termocuplul cât şi bolometrul sunt utilizate pentru domeniul 0,8-400 mm, dar nu au sensibilitate prea mare.

Detectorii piroelectrici sunt confecţionaţi din materiale dielectrice cu proprietăţi termice şi electrice speciale. Cel mai utilizat material este triglicin-sulfatul deuterat.

Celula fotoconductivă - semiconductor din PbS sau PbSe utilizată pentru domeniul 0,7-3,3 mm.

Starea fizicǎ a probei

Spectrele IR se pot înregistra pentru toate substanţele, idiferent de starea de agregare.

1. Gazele şi lichidele cu punct de fierbere scăzut sunt examinate în celule speciale, în prealabil vidate. În acestea şi lichidele cu punctul de fierbere scăzut se volatilizează şi se realizează de fapt spectrul vaporilor. Pentru cele cu punctul de

23

Page 24: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

fierbere mai ridicat, pentru a avea loc volatilizarea, celulele pot fi încălzite. În cazul gazelor drumul optic poate atinge şi 40 m.

2. Lichidele pot fi examinate în stare pură sau în soluţie, folosind cuve speciale cu grosimea între 0,005 mm şi 0,1 mm, cantitatea de produs variind între 1 şi 10 mg. Dacă se folosesc soluţii, acestea se introduc în cuve cu grosimea de 0,1-1,00 mm; concentraţiile soluţiilor pot fi de 0,05-10% (1-15 mg substanţă). Celula cu proba martor conţine solventul; are grosimea fixă sau variabilă şi se plasează pe traiectoria fascicolului de referinţă, fiind confecţionată din acelaşi material şi având aceeaşi grosime cu cuva pentru probă. Materialul din care sunt confecţionate cuvele trebuie să fie transparent pentru lumina infraroşie (clorură de sodiu, bromură de potasiu, fluorură de litiu).

Soluţiile şi lichidele mai pot fi examinate şi sub forma uni film între două ferestre.

Spectrul înregistrat în cazul soluţiilor cuprinde atât benzile de absorbţie ale substanţei dizolvate cât şi benzile caracteristice solventului. Din acest motiv, solvenţii utilizaţi pentru analiza IR trebuie să fie anhidri, transparenţi în domeniul de lungimi de undă explorat şi să nu formeze legături de hidrogen cu substanţa de cercetat

În tabelul 5 sunt prezentaţi câţiva dintre solvenţii mai utilizaţi cu indicarea regiunilor transparente.

Tabelul 1. Solvenţii utilizaţi pentru analiza IRSolventul Regiuni transparente

CS2 860-880, 1450-1650, 2200-2400

CCl4 700-860, 960-1010, 1350-1400, 1490-1600

Perclorbutadienă 800-980 ; 1050 - 1080 ; 1500 - 1550Nujol 1390-1500, 2700-3000Fluorolube tot domeniul

3. Solidele se pot examina în IR prin trei procedee: suspensie într-un lichid vâscos, dispersie solidă sub formă de pastilă obţinută prin comprimare, film (peliculă) depus pe o lamă transparentă la IR.

Suspensiile se obţin prin amestecarea a 2-5 mg probă solidă cu o picătură de nujol (ulei de parafină cu punct de fierbere ridicat), fluorolube (amestec de hidrocarburi fluorurate) sau hexaclorbutadienă. Suspensia astfel obţinută este examinată sub forma unui film subţire plasat între două plăci din sare transparentă la IR, folosind pentru compensare solventul fixat între plăci din acelaşi material şi aceeaşi grosime.

24

Page 25: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Pastilele sunt obţinute prin comprimarea puternică a unui amestec omogen obţinut din 1 mg substanţă de analizat şi 100 - 400 mg KBr anhidră, de puritate spectrală; amestecul se introduce într-o matriţă specială şi se comprimă la o presiune de câteva sute kg/cm2. Se înregistrează spectrul IR faţă de un comprimat preparat în aceleaşi condiţii însă fără substanţa de analizat.

Filmele depuse pe o placă se utilizează mai rar şi numai pentru substanţele care pot fi topite şi solidificate sau pentru cele care se dizolvă într-un solvent nepolar, uşor volatil.

Indiferent de maniera în care se pregăteşte proba de analizat, aceasta trebuie să fie anhidră.

Interpretarea spectrelor. Aplicaţii

Pentru a se putea realiza o interpretare corectă a spectrelor IR care să conducă la rezultate concludente, trebuie îndeplinite următoarele condiţii:

- spectrofotometrul IR să aibă o bună rezoluţie;- substanţa studiată să fie bine purificată;- aparatul folosit să fie corect etalonat.Etalonarea aparatului se face înregistrând spectrul unui film din polistiren

pentru care se cunosc în mod riguros poziţiile benzilor de absorbţie caracteristice.Deasemenea, trebuie avut în vedere faptul că nu se pot stabili complet diversele

moduri de vibraţie a unei molecule şi din acest motiv, interpretarea unui spectru IR se face prin compararea empirică a mai multor spectre.

Cea mai mare parte a frecvenţelor de vibraţie a unui grup de atomi variază destul de mult de la o moleculă la alta, datorită vibraţiilor foarte complexe ce pot exista în aceasta. Totuşi, anumite frecvenţe, cum ar fi cele care rezultă din alungirea legăturilor C-H şi C=O, variază foarte puţin de la o moleculă la alta ceea ce ajută la stabilirea structurii studiate, tabelul 2.

Tabelul 2. Frecvenţele de vibraţie pentru unele grupări.Tipul de legătură Domeniul (cm-1)

C-H 2840-3000CH – aromatic 3000-3100CH – alchine 3300C=C olefine 1640-1680

C=C – alchine 2150-2260

C=C aromatic 1450-1600C-O alcool, eter, acizi, esteri 1080-1300C=O aldehide, cetone, acizi, esteri 1690-1760O-H alcool, fenol 3590-3640CN vinil 2210-2260C-Cl 600-800

25

Page 26: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Orice concluzie la care s-a ajuns, prin reperarea unei benzi a spectrului trebuie confirmată prin examinarea acestei regiuni din spectru. De exemplu, dacă constatăm existenţa unei benzi caracteristice - vibraţie de alungire - pentru gruparea C=O din funcţia aldehidă ( =1690 cm-1), trebuie să ne asigurăm că există în spectru şi banda caracteristică de alungire a legăturii C-H din grupul CHO la 2750 cm -1 (3,63m). La fel atribuirea unei benzi carbonil dintr-un ester ( CO =1750 cm-1) trebuie să fie

confirmată prin observarea unei benzi intense situată între 1310 şi 1100 cm-1 (7,6 - 9,1 mm) corespunzătoare alungirii legăturii C-O a grupării ester.

În foarte multe cazuri benzile sunt deplasate datorită formării legăturii de hidrogen.

Regiunile mai importante pentru un examen preliminar sunt cele situate peste 1350 cm-1 (până la 2000 cm-1) şi cele cuprinse între 900 şi 650 cm-1. Benzile corespunzătoare regiunilor intermediare sunt complexe.

Pentru a confirma structura unei substanţe, pe lângă spectrele IR, se folosesc şi spectrele de masă, UV, RMN etc.

Moleculele cu un număr mare de atomi admit şi un foarte mare număr de vibraţii normale, ceea ce face ca interpretarea spectrelor să fie dificilă.

Pornind de la un număr foarte mare de spectre ale substanţelor cunoscute, s-au tras concluzii general valabile, spectrometria IR empirică fiind foarte utilă.

Nu există doi compuşi organici cu spectrul IR identic şi din acest motiv spectrul IR a devenit un criteriu de identificare a fiecărei substanţe organice, asemănător cu amprentele digitale la oameni. Domeniul de frecvenţă sub 1500 cm-1, fiind caracteristic fiecărei substanţe, a primit denumirea de regiune a amprentei digitale. Coincidenţa acestei regiuni în spectrele a două substanţe este o dovadă a identităţii lor.

Spectrele IR pot constitui şi o dovadă a purităţii unei substanţe. Apariţia unor benzi suplimentare faţă de spectrul substanţei pure dovedeşte prezenţa unor impurităţi. Desigur, va fi ma uşor decelată o singură impuritate decât mai multe însumând aceeaşi concentraţie.

Unele reacţii chimice în care reactantul şi produsul de reacţie prezintă benzi caracteristice individuale se pot urmări comod şi sigur cu ajutorul spectrelor IR (dispare banda reactantului şi apare cea a produsului de reacţie).

În cazul cromatografiei pe coloană a unui amestec de produşi, identificarea diferitelor fracţiuni se poate face şi prin spectroscopie IR, mai ales dacă produşii sunt incolori.

Toate tipurile de molecule, organice şi anorganice, cu foarte mici excepţii, absorb în domeniul IR. Din acest motiv, spectrofotometria IR oferă posibilităţi de determinare pentru un număr mare de substanţe. Mai mult, datorită unicităţii spectrului IR, specificitatea acestei metode va fi atinsă sau depăşită de un numărm relativ mic de alte metode analitice.

Specificitatea şi-a găsit aplicaţii mai ales în analiza amestecurilor de compuşi organici foarte înrudiţi.

Analiza unui amestec de hidrocarburi

26

Page 27: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

O aplicaţie tipică a spectroscopiei cantitative IR este analiza unui amestec de izomeri C8H10 ce conţin o-xilen, m-xilen, p-xilen şi etilbenzen.

Spectrele pentru aceşti compuşi în domeniul 12 - 15 mm, în ciclohexan prezintă benzi maxime (peak-uri) caracteristice individuale la 13,47 mm, 13,01 mm, 12,58 mm şi 14,36 mm. Totuşi, datorită suprapunerii benzilor de absorbţie, absorbanţa unui amestec la oricare din aceste lungimi de undă, nu este în întregime determinată de concentraţia unui singur component. De aceea se determină absorbanţele molare pentru fiecare din aceşti patru compuşi la cele patru lungimi de undă. Cu acestea pot fi scrise patru ecuaţii care permit calcularea concentraţiei fiecărei specii, prin măsurarea absorbanţei amestecului la cele patru lungimi de undă (vezi UV-VIS).

Determinarea poluanţilor din aerDeterminarea poluanţilor din aer necesită metode sensibile, rapide şi foarte

specifice pentru o mare varietate de compuşi chimici. Spectrofotometria IR îndeplineşte aceste cerinţe mai mult chiar decât alte metode analitice.

Proba de aer ce conţine cinci specii chimice în concentraţii cunoscute, a fost analizată cu un instrument computerizat, utilizând o celulă gazoasă de 20 m. Datele au fost imprimate în 1 - 2 minute de la injectarea probei.

Spectrometre IR cu transformare Fourier

Spectrometrele în infraroşu cu transformare Fourier oferă avantajele unei neobişnuit de mari sensibilităţi, rezoluţie şi viteză de achiziţie a datelor (tot spectrul este achiziţionat în mai puţin de o secundă). Din păcate, aceste instrumente sunt mult mai scumpe şi mai complexe.

Spectrometrele cu transformare Fourier nu conţin elemente dispersive, toate lungimile de undă fiind detectate şi măsurate simultan. Pentru a separa lungimile de undă este necesară modularea semnalului sursei în aşa fel încât să poată fi decodat prin transformare Fourier, o operaţie matematică ce necesită utilizarea unui calculator de mare viteză.

Spectrometrele IR tradiţionale sunt cunoscute ca instrumente dispersive. Odată cu apariţia instrumentelor pe bază de calculator şi microprocesor, aceste instrumente clasice au fost înlocuite în mare parte de spectrometre în infraroşu cu transformare Fourier (FTIR), care prezintă mai multe avantaje. În loc de un monocromator tip reţea de difracţie, un instrument FTIR foloseşte un interferometru pentru a obţine spectrul.

Schema de bază a unui instrument cu interferometru este următoarea, figura 2.Radiaţia de la o sursă IR convenţională este împărţită în două raze, una care pleacă spre o oglindă cu poziţie fixă şi alta care pleacă spre o oglindă în mişcare. Atunci când razele sunt reflectate, una este deplasată puţin (defazată) faţă de cealaltă. Înainte de a

27

Page 28: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

trece prin probă, se produce interferenţa tuturor radiaţiilor monocromatice din rază. Astfel, prin probă trec simultan toate lungimile de undă, iar interferenţa se modifică în timp prin deplasarea oglinzii cu o viteză liniară. Rezultatul absorbţiei radiaţiei de către probă este un spectru obţinut în timp, numit interferogramă, ce reprezintă intensitatea absorbţiei ca funcţie de diferenţa de drum optic dintre cele două raze. Folosind un microprocesor, aceasta este convertită în domeniu de frecvenţe, cu ajutorul unei operaţii matematice numite transformare Fourier (de unde şi numele de spectrometru IR cu transformare Fourier); în urma acestui proces se obţine un spectru infraroşu convenţional.

Avantajul principal al unui instrument cu interferometru este faptul că se procesează mai multe date simultan. Prin probă trec toate radiaţiile odată, faţă de instrumentele clasice în care proba era expusă succesiv câte unui domeniu îngust.

Figura 2. Schema de bază a unui instrument cu interferometru

Acest proces conduce la creşterea raportului semnal-zgomot şi la obţinerea în câteva secunde a unui spectru cu o rezoluţie comparabilă sau chiar mai bună decât la folosirea unei reţele de difracţie.

Principiile interferometrului şi a transformării Fourier sunt cunoscute de peste un secol, dar aplicaţiile practice au trebuit să aştepte apariţia tehnicilor digitale de calcul cu ajutorul calculatorului.

28

Page 29: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Spectrometria de masă

Spectrometria de masă este o metodă instrumentală de analiză a compuşilor organici având la bază fragmentarea moleculelor în ioni de masă diferită cu sarcină pozitivă şi separarea lor în fascicule de ioni cu aceeaşi masă folosind concomitent interacţiunea acestora cu un câmp electric şi magnetic.

În principiu, are loc bombardarea substanţei de cercetat cu un fascicul de electroni, urmată de accelerarea ionilor formaţi şi separarea lor funcţie de masă prin acţiunea concomitentă a unui câmp electric şi magnetic.

Un spetrometru de masă cuprinde:- un compartiment de producere a ionilor sub acţiunea unui fascicul de

electroni (1);- un compartiment de accelerare a ionilor în câmp electric longitudinal (2);- un compartiment de separare în câmp magnetic transversal funcţie de

raportul m/e (3);- un compartiment de detectare a ionilor (4)

Când detectorul (4) este o placă fotografică, care este impresionată mai mult sau mai puţin funcţie de numărul ionilor, aparatul se numeşte spectrograf.

Aparatele moderne înregistrează curentul ionic (proporţional cu numărul de ioni) sub formă de spectru, funcţie de masa ionilor şi de abundenţa lor; asemenea aparate se numesc spectrometre de masă.

Majoritatea spectrometrelor de masă realizează separarea ionilor pozitivi, deoarece la bombardarea moleculelor de cercetat (cel mai adesea organice) cu un fascicul de electroni se expulzează un electron din moleculă formându-se un ion pozitiv.

Diferenţa esenţială a spectrometriei de masă de celelalte metode spectrale constă în aceea că după înregistrarea spectrului substanţei cercetate, aceasta nu mai poate fi recuperată, fiind transformată în ioni, pe când în celelalte metode au loc numai modificări în starea fizică a substanţei.

Schema unui spectrometru de masă cu focalizare magnetică este redată în figura 1:

29

Page 30: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Figura 1. Schema unui spectrometru de masă

- Proba este introdusă în spectrometru şi vaporizată;- Ionii de sarcină z (un multiplu al sarcinii electronului) sunt produşi prin

bombardarea probei cu un flux de electroni în camera de ionizare; energia electronilor trebuie să fie mai mare de 70 eV (1eV = 96,5 KJ.mol-1; 70 eV = 6750 KJ.mol-1)

- Ionii rezultaţi sunt acceleraţi într-un câmp electric căpătând o energie cinetică similară câmpului;

- Ionii de masă m sunt deviaţi în câmp magnetic funcţie de raportul m/z pe diferite traiectorii circulare;

- Variind tăria câmpului magnetic se pot focaliza pe detector ionii de o anumită masă m (m/z) ;

- Ionii focalizaţi sunt detectaţi şi se înregistrează spectrul de masă.Spaţiul interior al spectrometrului de masă este puternic vidat.Fiecărui raport m/z îi corespunde o traiectorie de o anumită rază:

În câmp electric energia de accelerare este egală cu energia cinetică:

(1) unde:

m - masa (Kg); e - sarcina ionului; v - viteza ionului (m/s); UA - tensiunea de

accelerare (V).În câmp magnetic forţa magnetodinamică este egală cu forţa centrifugă:

(2) sau (3)

unde:H - intensitatea câmpului magnetic (T - tesla); r - raza traiectoriei ionului (m).Rezultă că viteza are expresia:

30

Page 31: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

(4)

Înlocuind în relaţia (1) valoarea lui v din expresia (4) obţinem:

(5) sau (6)

de unde rezultă că:

(7) şi (8) sau (9)

Spectrul de masă: ionii rezultaţi prin bombardarea compusului organic sunt instabili şi se fragmentează aproape instantaneu. Spectrul de masă al unui compus organic constituie reprezentarea abundenţei relative a fragmentelor de scindare, purtătoare de sarcini pozitive, în funcţie de raportul m/e al acestor particule.

Drept etalon al abundenţei se consideră, de regulă, cel mai intens maxim din spectru - picul de bază - base peak. Atribuind acestuia valoarea 100% se pot determina cu uşurinţă abundenţele relative ale tuturor ionilor. Întrucât abundenţele sunt foarte diferite ca valoare, uneori picurile cele mai importante prezintă în spectru intensităţi extrem de mici (abundenţe foarte reduse). De regulă, spectrul de masă se dă sub formă grafică (figura 2).

Figura 2. Spectrul de masă al cafeinei

În cazul analizelor cantitative, se înregistrează cantitatea totală de ioni (curentul ionic total); înălţimea unui pic redă ponderea procentuală a acelui maxim din cantitatea totală a ionilor. În acest caz se impune o însumare riguroasă a intensităţilor tuturor ionilor din spectru până la M (masa moleculară).

31

Page 32: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Aplicaţii

Spectrometria de masă se poate folosi atât în analiza calitativă cât şi în cea cantitativă.

Spectrometrele de masă se folosesc mult cuplate cu un gaz cromatograf pentru detectarea şi înregistrarea componentelor separate prin gaz cromatografie.

Tehnica mixtă gaz – cromatografie pe coloane capilare - spectrometrie de masă (GC-MSD) cât si cromatografia de lichide de inalta performanta cu detector spectrometru de masa a putut fi realizată practic datorită faptului că metodele necesită cantităţi mici de probă şi de acelaşi ordin de mărime (de la miligrame la nanograme).

Spectrometria de masă foloseşte şi la determinări de mase moleculare şi structuri ale substanţelor organice necunoscute prin:

- furnizarea masei moleculare exacte;- posibilitatea stabilirii unei formule brute;- prin aducerea unei dovezi asupra existenţei posibile a unor elemente

structural caracteristice (alături de alte metode: RMN, IR etc.).

Aplicaţii în chimia organică

Procesul de ionizare a unei molecule poate avea loc în două moduri:- cu formare de ioni negativi prin înglobarea electronului (mai rar):

M + e _> M-

fenomen cunoscut sub numele de "absorbţie de rezonanţă".- cu formarea unui ion pozitiv (cel mai frecvent) prin expulzarea unui electron

din moleculă:

M + e– _> 2e– + M+

Dacă energia electronilor este mică (5 - 10 eV), se formează aşa numitul "ion molecular" având aceeaşi masă ca a moleculei. Ionul molecular format este destul de instabil şi se descompune rapid desfăcându-se într-un număr mare de fragmente, de regulă cu formarea unui radical şi a unui ion:

M+ _> R + I+

Radicalul fiind neutru din punct de vedere electric nu va fi observat cu spectrometrul de masă. Procesul poate avea loc în mai multe etape.

Fragmentările moleculelor în spectrometrul de masă răspund la următoarele trei tendinţe:

- formarea de ioni cât mai stabili;- formarea de radicali cât mai stabili;- eliminarea de particule neutre stabile (N2, CO2, H2O etc.).

Dintre picurile unui spectru prezintă interes deosebit:- picul molecular;

32

Page 33: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

- picul de bază care reprezintă etalonul de măsurare a intensităţii;- picurile datorate contribuţiilor izotopice.De exemplu, în cazul hidrocarburilor saturate:- ionii moleculari sunt instabili şi prin pierderea unui ion de hidrogen se

formează ioni de carboniu primari cu formula generală: [CnH2n+1]+ .

O reacţie importantă de scindare a acestora este pierderea unei molecule de etilenă, dar se pot scinda radicali liberi alchil sau atomi de hidrogen.

Ionii cu sarcină electrică se stabilizează prin mezomerie iar ionii carboniu trec în ioni mai stabili.

Ionizarea moleculelor de analizat se poate face folosind ca reactiv un gaz (metan, metilpropan sau amoniac) care introduşi în camera de ionizare, în urma bombardării cu electroni, produc ioni moleculari, care, reacţionează apoi cu moleculele probei cu apariţia ionilor de tip MH+ ; au loc reacţiile:

Reactia primară:

CH4 + e- CH4+· + e- + e-

electron ion electronul din electronul (ionizare) rapid molecular reactivul gaz încetinit Reacţiile secundare: CH4

+· CH3 + H·

CH4+· + CH4 CH5

+ + CH3· (Autoprotonare)

ionul reactant

CH3+ + CH4 C2H5

+ + H2

Coliziune cu molecula din proba M : M + CH5

+ MH+ + CH4 (ionul M+1)molecula moleculadin probă protonatăM + C2H5

+ MC2H5+ (ionul lui M+29)

Daca M este de tipul RH:RH + CH5

+ R+ + CH4 + H2 (ionul M-1)

Astfel de ionizare se numeşte ionizare chimică (IC).În spectrul de masă obţinut prin ionizare chimică picul ionului molecular

predomină. Avantajul acestui tip de ionizare este creşterea sensibilităţii detecţiei la valori de ordinul femtogramelor (10-15g).

33

Page 34: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară(RMN)

Spectroscopia RMN este o metodă instrumentală de analiză având la bază măsurarea absorbţiei de către proba, aşezată într-un câmp magnetic exterior, a radiaţiei electromagnetice (de rezonanţă) în regiunea frecvenţelor radio.

În comparaţie cu spectrometria UV, VIS şi IR unde erau implicaţi în absorbţia radiaţiei electromagnetice electronii, în RMN sunt implicate nucleele atomilor.

Bazele teoretice ale spectroscopiei RMN au fost puse de W. Pauli în 1924 care a prevăzut în mod cert prezenţa spinului magnetic. Verificarea experimentală s-a făcut în 1946 independent de către F. Bloch, Stanford şi E. Purcell. În 1952 Bloch şi Purcell au primit premiul Nobel pentru aceste realizări.

În 1953 apare primul spectrometru RMN de înaltă rezoluţie ce a fost folosit şi pentru studii privind structura chimică a substanţelor. În prezent spectroscopia RMN a căpătat o extindere deosebită în chimia organică, anorganică, biochimie, medicină etc.

Teoria rezonanţei magnetice nucleare

Unele nuclee, asemănător electronilor, prezintă un moment magnetic de spin ce se poate orienta într-un câmp magnetic exterior efectuând o mişcare de precesie cu o anumită frecvenţă şi care poate intra în rezonanţă cu o radiaţie electromagnetică externă (din domeniul radio).

Deoarece energia nucleelor este mult mai mare ca a electronilor, va necesita pentru orientarea spinului un câmp magnetic mai intens.

Nucleele unor atomi (H1, C13, N15, F19, P31 etc.) având numărul cuantic de spin I =1/2, execută ca şi electronii o mişcare de rotaţie în jurul propriei axe - mişcare de spin. Momentul mecanic de spin al nucleului este cuantificat conform relaţiei:

unde: I - număr cuantic de spin.Ca şi în cazul electronului, nucleul în rotaţie, fiind încărcat, va reprezenta un

curent electric, care va crea un câmp magnetic (magnet elementar) a cărui axă coincide cu cea a spinului.

Comparând protonul cu electronul vom constata că viteza de rotaţie a protonului este mult mai mică decât a electronului deoarece protonul are momentul de inerţie mult mai mare. Aceasta echivalează cu un curent elementar mult mai slab şi deci un moment magnetic mult mai mic. Unitatea de moment magnetic este "magnetonul nuclear" - mn - dată de relaţia:

34

Page 35: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

în care: eo = sarcina; mp = masa protonului; h = constanta lui Planck.

Valoarea magnetonului nuclear este de aproximativ 2000 ori mai mică decât magnetonul electronului care are masa de aproximativ de 2000 ori mai mică.

Ca şi electronul nucleul când este supus acţiunii unui câmp magnetic exterior se va comporta ca un giroscop, axa sa de rotaţie efectuând o mişcare circulară (de precesie) "precesia Larmour" în jurul axei câmpului magnetic exterior (figura 1).

Figura 1. Precesia Larmour

Pentru orice nucleu în câmp magnetic exterior sunt posibile numai orientările pentru care proiecţiile momentului magnetic pe axa acestui câmp sunt date de

produsul: gn.nI

.mn unde:

gn - factor giromagnetic nuclear (pentru proton g = 5,585);

nI - numărul cuantic magnetic nuclear (poate lua 2I + 1 valori, de la -I la +I);

mn - magnetonul nuclear.

Pentru proton care are I = 1/2 există doar două orientări ( ) a căror

înclinare faţă de axa câmpului este de aproximativ 54°.Orientarea în sensul câmpului magnetic este mai stabilă (energie mai mică),

decât cea în contra câmpului (energie mai mare).Diferenţa de energie între cele două orientări este dependentă de câmpul

magnetic exterior (H).

DE = mn.gn

.H, unde:

gn - factor giromagnetic nuclear; mn - magnetonul nuclear;

H - câmpul magnetic exterior (Tesla, 1T = 10000 gauss).Pentru ca protonul să interacţioneze cu o cuantă de radiaţie electromagnetică

este necesar ca aceasta să aibă exact energia DE. Numai în acest caz cuanta de energie

35

Page 36: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

electromagnetică va putea fi absorbită de proton şi prin urmare îşi va inversa spinul şi va trece din starea de energie joasă în starea de energie înaltă (figura 2).

Figura 2. Interacţiunea protonului cu o cuantă de radiaţie electromagnetică

Condiţia de rezonanţă va fi dată de relaţia: DE = h.n = mn.gn

.H, şi deci,

mărimea frecvenţei de rezonanţă - n - este:

n = DE/h = (mn.gn

.H) / h

sau

v = 2p.n = 2p.(mn.gn

.H) / h = H , n = H / 2pDE = hH / 2p

unde:v - frecvenţa Larmor - raportul giromagneticFrecvenţa de rezonanţă poate fi calculată şi cu relaţia: n = µn H / h I, unde:I = numărul cuantic de spinŢinând cont că precesia Larmor se face cu o frecvenţă egală cu a cuantelor de

radiaţie electromagnetică absorbită, v va reprezenta în acelaşi timp viteza unghiulară a precesiei.

Diferenţa de energie între cele două orientări este foarte mică în cazul protonului (comparativ cu electronul). De exemplu, în câmp magnetic de 14000 Gauss, frecvenţa de rezonanţă corespunde la 60 MHz, unde cu frecvenţe în domeniul radio.

În general, la introducerea unei probe în câmpul magnetic exterior, tendinţa tuturor nucleelor este de a se aranja în acelaşi sens cu câmpul. În momentul rezonanţei, protonii cu orientare paralelă trec, ca urmare a absorbţiei de energie, în orientare antiparalelă.

36

Page 37: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Cedarea energiei absorbite pentru restabilirea echilibrului iniţial are loc prin

fenomene de relaxare: relaxare spin-reţea _ energia este cedată reţelei (probei) sub

formă de căldură _ şi relaxare spin-spin _ energia este cedată pentru modificarea spinului.

Spectrul RMN, reprezintă curba absorbţiei de energie electromagnetică de către compusul studiat în funcţie de câmpul magnetic aplicat (sau frecvenţă).

Spectrul RMN se realizează folosind un spectrometru RMN cu schema prezentată în figura 3:

Figura 3. Schema de principiu a unui spectrometru RMN

Câmpul magnetic, H, pe care îl manifestă cu adevărat un nucleu nu este câmpul exterior, H0, aplicat ci câmpul magnetic exterior modificat de vecinătăţile locale ale

nucleului, electrice şi magnetice. Câmplu exterior, H0, este modificat de ecranarea

magnetică manifestată de electronii legăturilor înconjurătoare. Deci, valoarea observată a lui H este dependentă de vecinătăţile moleculare ale protonului ce dau semnalul (absoarbe sau emite unde de radiofrecvenţă).

În spectrometrul RMN proba este plasată într-un tub în centrul câmpului magnetic, H0, şi este iradiată cu unde de radiofrecvenţă n. Unul din cei doi factori H0

sau n se pot modifica . Deoarece câmpul H este proporţional cu frecvenţa, proba de analizat este supusă fie unui câmp magnetic constant H0 şi variind frecvenţa, fie

invers.Deoarece fiecare proton primeşte un anumit câmp aplicat şi o frecvenţă

corespunzătoare cu cea de rezonanţă funcţie de vecinătăţile sale, va fi emis un semnal de o anumită frecvenţă ce poate fi captat de o bobină receptoare (aşezată perpendicular pe bobina oscilatorului de radiofrecvenţă ), pentru a nu capta frecvenţa generatorului.

Spectroscopia RMN prezintă importanţă majoră pentru chimia organică, ajutând

la elucidarea structurii moleculelor, deoarece factorul giromagnetic _ gn_ şi deci

37

Page 38: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

frecvenţa de rezonanţă, depind în mare măsură de vecinătatea atomică a nucleului respectiv.

Rezonanţa magnetică a protonului cu spinul 1/2 (I = 1/2) prezintă importanţă deosebită pentru studiul compuşilor organici, deoarece majoritatea acestora prezintă în moleculă şi atomi de hidrogen. Faptul că izotopul C12, O16 şi O18 nu au moment magnetic de spin şi deci nu dau fenomene de rezonanţă magnetică nucleară, prezintă un avantaj, uşurând interpretarea spectrelor RMN - protonice.

În prezent se execută spectroscopie RMN pentru F19, C13, P13 şi N15 (toate cu I = 1/2).

Deplasarea chimică

Protonul, în orice combinaţie, se găseşte înconjurat de un nor electronic ce manifestă o ecranare faţă de câmpul magnetic exterior H0 datorită câmpului magnetic

He asociat curentului electric produs de electronul în mişcare.

Drept urmare asupra protonului nu acţionează întregul câmp magnetic aplicat, cu alte cuvinte la o frecvenţă dată a oscilatorului (undelor radio) semnalele de rezonanţă a diferitelor categorii de protoni apar la câmpuri exterioare mai intense decât cel corespunzător unui proton liber. La fel se întâmplă într-un câmp magnetic constant, rezonanţa are loc la frecvenţe mai mici ale oscilatorului (unde radio).

Gradul de ecranare a protonului diferă după modul în care este legat protonul în moleculă. Spre exemplu, în molecula de etanol, protonul cel mai puţin ecranat este cel din gruparea OH, cel legat de oxigen; mai ecranaţi sunt cei din gruparea CH2 şi mai

ecranaţi cei din gruparea CH3.

La frecvenţă constantă a oscilatorului, variind intensitatea câmpului magnetic apare un semnal de rezonanţă mai întâi pentru protonul din OH, apoi la o valoare mai mare a câmpului pentru CH2 şi în sfârşit la o valoare şi mai mare pentru CH3 ,

figura 4.

Figura 4. Semnalul de rezonanţă pentru proton funcţie de gradul de ecranare

Diferenţa dintre intensitatea câmpului magnetic de rezonanţă (sau frecvenţa de rezonanţă - Hz) şi cea pentru protonul liber se numeşte deplasare chimică şi se consideră faţă de o linie arbitrară.

38

Page 39: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Diferenţele de ecranare ale diferitelor categorii de protoni, funcţie de modul de legare în moleculă sunt foarte mici.

Se exprimă în ppm şi se notează cu d.

d = (Hstandard - Hproton) / Hstandard; dppm = (Hs - Hp).106/Hs

d = (nstandard - nproton) / nstandard; dppm = (ns - np).106/ns

Pentru tipurile uzuale de protoni, deplasările chimice au valori ale lui d cuprinse între 1 şi 10.

După cum am văzut punctul de zero nu poate fi corect fixat şi din acest motiv distanţa între diferitele semnale RMN se măsoară faţă de poziţia unui compus standard (standard extern când este introdus în prealabil în aparat sau standard intern când este dizolvat în probă).

Standardul dă un singur semnal intens şi îngust la una din extremităţile scalei. Cel mai utilizat este tetrametilsilanul - TMS - (CH3)4Si lichid cu pf = 27°C, formând

un semnal corespunzător celor 12 protoni echivalenţi şi puternic ecranaţi.Valoarea deplasării chimice d este aceeaşi indiferent dacă se lucrează cu un

aparat de 40, 60 sau 100 MHz (frecvenţa radio a oscilatorului), precum şi dacă se exprimă d funcţie de câmp sau frecvenţă.

Este preferabil să se lucreze la frecvenţe mai mari, 60 sau 100 MHz (chiar mai mult - 220 MHz) pentru care corespunde un câmp mai intens şi se realizează o extincţie mai mare, cu alte cuvinte un raport semnal/zgomot mai mare, spre deosebire de alte ramuri ale spectrometriei, unde coeficienţii de extincţie depind foarte mult de structură.

De exemplu, gruparea carbonil în IR nu are aceeaşi valoare în aldehide, cetone sau esteri, pe când în RMN, intensitatea semnalului unui proton este aceeaşi indiferent de gradul de protonare.

Intensitatea benzilor de absorbţie RMN este proporţională cu numărul protonilor responsabili de absorbţie.

Majoritatea spectrometrelor RMN trasează pe spectru şi curbele integrale. Se compară valorile relative ale integralelor diferitelor semnale ele fiind în acelaşi raport ca şi numărul diferitelor categorii de protoni.

Dăm un exemplu de spectru RMN în figura 5.

39

Page 40: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Figura 5. Spectru RMN (lA / lB = nr. protoni A / nr. protoni B).

Deplasările chimice ale câtorva tipuri reprezentative de protoni sunt redate în tabelul 1.

Tabelul 1. Deplasările chimice pentru grupările metil, metilen şi metin din diverse combinaţii.

Structurad, ppm

M = CH3 M = CH2 M = CH

Alifatici a substituiţi M-Cl 3,0 3,5 4,0 M-Br 2,7 3,4 4,1 M-NO2 4,3 4,4 4,6

M-OH (sau OR) 3,2 3,4 3,6 M-O-Æ 3,8 4,0 4,6 M-OC(=O)R 3,6 4,1 5,0 M-C=C 1,6 1,9 -

CCM 1,7 2,2 2,8 M-C(=O)H 2,2 2,4 - M-C(=O)R 2,1 2,4 2,6 M-C(=O)Æ 2,4 2,7 3,4 M-C(=O)OR 2,2 2,2 2,5 M-Æ 2,2 2,6 2,8

Alifatici b substituiţi M-C-Cl 1,5 1,8 2,0 M-C-Br 1,8 1,8 1,9 M-C-NO2 1,6 2,1 2,5

M-C-OH (sau OR) 1,2 1,5 1,8 M-C-OC(=O)R 1,3 1,6 1,8 M-C-C(=O)H 1,1 1,7 - M-C-C(=O)R 1,1 1,6 2,0 M-C-C(=O)OR 1,1 1,7 1,9

M-C-Æ 1,1 1,6 1,8

Aplicaţiile RMN

40

Page 41: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

Una din aplicaţiile RMN a fost şi este identificarea grupelor funcţionale cum ar fi OH în alcooli şi fenoli, acizi carboxilici, protonii (hidrogenul) din olefine, hidrogenul acetilenic, din amine, amide.

Deci, prin spectroscopia RMN a protonilor se poate realiza identificarea şi elucidarea structurii unor molecule organice, metal-organice şi biochimice.

Un spectru RMN, ca şi un spectru IR adesea este suficient pentru identificarea unui compus organic.

Pentru o identificarea sigură şi pentru a stabili o structură este necesar a se corobora spectrele RMN cu alte determinări: spectre IR, UV, analiza elementală C, H, N, spectre de masă etc.

În prezent pe lângă spectroscopia RMN a protonilor se foloseşte şi cea pentru F19 (identificarea acestui element în compuşi cu fluor), C13 şi N13.

În analiza cantitativă spectrosopia RMN poate fi folosită pentru faptul că există o proporţionalitate între aria picurilor şi numărul de nuclee responsabile pentru pic.

Dacă, spre exemplu, se cunoaşte aria semnalului pe proton, aria unui pic poate fi folosită pentru a stabili concentraţia speciei respective.

Practic se foloseşte un standard intern, comparându-se aria picului standard sau a compuşilor de analizat, cu condiţia ca aria picului standard să nu depăşească nici unul dintre picurile probei.

Pentru calibrare se folosesc cel mai mult derivaţi organici de silan, având picurile protonilor cu localizare înaltă.

Dezavantajul principal al analizei cantitative RMN este costul ridicat al aparaturii şi dificultatea analizei probelor complexe care se rezolvă mai uşor prin alte tehnici.

Rezonanţa magnetică nucleară este în mod obişnuit folosită pentru determinarea structurii substanțelor, dar există şi multe alte aplicaţii importante ale sale.

Spectroscopia RMN de relaxare poate fi folosită pentru a evalua proporţia dintre faza solidă şi cea lichidă din produse alimentare ce conţin multe lipide, cum ar fi margarinele. Metoda se bazează pe faptul că timpul de relaxare spin-spin al protonilor din faza lichidă este mai mare decât al celor din faza solidă. Dacă se înregistrează variaţia intensităţii semnalului protonilor în timp, se obţin două curbe, corespunzătoare celor două faze. Prin extrapolarea acestor curbe se obţin intensităţi ale semnalului care sunt proporţionale cu cantitatea relativă de protoni din faza lichidă şi solidă.

Aplicaţiile RMN în medicină devin tot mai comune, de la simple studii dinamice la diagnosticarea anormalităţii ţesuturilor.

Studiul prin RMN-13P al sângelui şi al fluidelor celulare permite monitorizarea în timp real a pH-ului sanguin, tehnică necesară în cazul diabeticilor. Absenţa insulinei poate conduce la nivele toxice ale acidităţii intracelulare, caz în care o perfuzie cu hidrogenocarbonat de sodiu poate ajuta la restabilirea pH-ului intracelular normal. Monitorizarea are loc prin măsurarea deplasării chimice între semnalele fosforului organic şi a celui anorganic. Acest lucru este posibil deoarece semnalul RMN al fosforului anorganic depinde mult de pH şi se poate deplasa cu până la 1 ppm pentru o

41

Page 42: Metode Analitice Aplicate Farmaceutica (UV, IR, MS, RMN)

unitate de pH. Aria fiecărui pic se poate utiliza pentru a calcula concentraţia relativă a fiecărui compus organic (de exemplu ATP), şi în consecinţă se poate evalua starea metabolică a ţesuturilor.

Folosirea RMN-1H pentru scanarea corpului uman a devenit un fapt obişnuit. Intensitatea semnalelor RMN-1H depinde atât de densitatea protonică cât şi de timpul de relaxare al acestora. În consecinţă, protonii din apă, proteine, lipide, carbohidraţi şi alte substanţe ar trebui să prezinte semnale diferite. Totuşi, principalele specii care au densităţi de protoni suficient de mari pentru a da un semnal apreciabil sunt apa şi lipidele. Vecinătăţile nucleelor care intră în rezonanţă dau acestora timpi de relaxare diferiţi, şi deci semnale diferite. În consecinţă se pot diferenţia diferitele organe ale corpului.

Imaginile obţinute se numesc imagini de rezonanţă magnetică (s-a renunţat la termenul „nuclear” pentru a evita asocierea cu radiaţiile nucleare) şi arată asemănător cu imaginile obținute cu ajutorul razelor X. Imaginile de rezonanţă magnetică se pot achiziţiona pentru un singur organ sau pentru tot corpul. Imaginile ţesuturilor moi se pot realiza în orice plan, obţinându-se date complementare cu cele obţinute prin raze X pentru ţesuturile tari. Scanarea durează aproximativ 20 min, şi de aceea subiectul trebuie să păstreze nemişcată zona ce va fi scanată în interiorul unui magnet cu diametru mare.

Nu se cunosc efecte secundare asociate cu această tehnică, ceea ce înseamnă că o persoană (incluzând indivizii tineri şi cei sensibili) poate fi scanată în mod regulat pentru a monitoriza evoluţia anumitor stări patologice cum ar fi cancerul sau scleroza multiplă.

42