1330261384_imunofluorescentaindirectametodascreeningpentrudetectareaanticorpilorantinuclear

Imunofluorescena indirect-

metod screening pentru

detectarea anticorpilor

antinucleari

Biol. Monica Cristina Gheorghiu

Dr. Mihaela Blaj

Departamentul de Imunologie

BIOCLINICA S.A. Timisoara

Imunofluorescena indirect-metod screening

pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Definiie:

Bolile autoimune constituie un grup heterogen de afeciuni caracterizate de prezena anticorpilor circulani orientai mpotriva constituenilor celulari

Importana clinic:

Fiecare boal autoimun sistemic are un spectru de anticorpi antinucleari specifici

2



OBIECTIVE

Evaluarea sensibilitii i specificitii tehnicilor ELISA/EIA versus IFI

Imunofluorescena indirect este considerat metoda gold standard pentru determinarea

anticorpilor antinucleari(ACR)

3



07.04.2009 - 10.06.2010

IFI

2851

EIA

184

IB

184

4

MATERIAL I METOD



Tehnici folosite pentru detectarea anticorpilor antinucleari (AAN)

5

AA

N s

cree

nin

g

IFI indirect

EIA n faz solid

AA

N c

on

firm

are

EIA, IB n faz solid

ID, CIE, RIA n faz fluid

Hemaglutinare pasiv



IFI

NOVA LITE Hep-2 ANA

NOVA LITE

Crithidia luciliae

(dsDNA)

EIA

ORGENTEC antigene singulare

ORGENTEC

mixturi de antigene

IB EUROIMMUN

Profile autoimmune

disease

6



IFI pe substrat Hep-2

descrie pattern-uri noi, asociate cu boli autoimune (35 de pattern-uri nucleare i citoplasmatice corespunznd la peste 100 de antigene diferite)

7



Diferitele tipuri de pattern-uri de pe substratul Hep-2 se asociaz cu boli autoimune i structuri

biochimice

8

Pattern Structuri

biochimice Boal

autoimun



9

Ag Ac

Ag Ac

Ag Ac conjugat

conjugat

Principiul IFI



10



5 regiuni principale ale celulelor Hep-2

11

Membran nuclear Nucleoplasm Nucleoli

Fusul mitotic Citoplasm



diluia productor

1/40

diluia literatur

1/80

1/160 diluia utilizat

1/160

12



13

Pro

cen

t p

ozi

tivi

40

35

30

25

20

15

10

5

0 1/40 1/80 1/160 Titru

Corelaia dintre diluie i procentul de anticorpi antinucleari pozitivi

date proprii date literatura (ACR)



14

Principiul EIA i IB



EIA

alternativ viabil, uor de efectuat i standardizat

pot fi determinate cantitativ 8-14 antigene (din cele peste 100 de autoantigene identificabile pe Hep-2)

antigenele determinate sunt: ADN nativ, histone, nucleozom, Sm, U1-snRNP, SS-A/Ro (Ro-52 i Ro-60), SS-B/La, Scl-70, Jo-1, centromer, gp-210, sp 100

15



IB

este o metod calitativ

se identific simultan mai multe tipuri de anticorpi

nRNP-Sm, Sm, SS-A, Ro-52, SS-B, SCL-70, Pm-SCL, Jo-1, centromer, PCNA, ds-DNA, histone, nucleozom

16



474

2377

Rezultate IFI

pozitive

negative

17

REZULTATE



50 50 50

18

IFI EIA IB

NEGATIVE

Probe IFI negative lucrate EIA i IB



2377

290

184

Probe pozitive IFI lucrate EIA i IB

IFI

IFI

IFIEIA

IFIIB

19

158

121



5% 12%

23%

19%

26%

11% 4%

Repartizarea pacienilor pe grupe de vrst (ani)

0-20

21-30

31-40

41-50

51-60

61-70

>70

20



86%

14%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Distribuia pacienilor n funcie de sex

femei

brbai

21



LES, AR sero-negativ

S. Sjgren, S. antifosfolipic Ciroz biliar primitiv

Lamine A, B, C

Membran nuclear linear Membran nuclear punctat

Gp210, p62 din porul nuclear



LES, AR

23 Constitueni ai cromatinei: ADN dublu catenar, histone, nucleozomi

Omogen



Conectivit mixt de esut conjunctiv

24 Constituieni ai granulelor intercromatinice: hnRNP

Matrice nuclear



Conectivit mixt de esut conjunctiv, LES

Constituieni ai spliceozomei: antigen Smith (Sm), U1-RNP

Dens ptat (Sm)



S. Sjgren, LES, dermatomiozite

26

SS-A SS-B

Fin ptai Fin ptai



Scleroderma, S. Raynaud

27

Granulaii foarte fine (Scl 70)

Topoizomeraz I



Ciroz biliar primitiv,

LES

28

Puncte nucleare Multiple puncte nucleare

P80-coilin Sp-100, PML

Ciroz biliar primitiv,

Hepatite cronice active



S. Sjgren, F. Raynaud, Scleroderma/

Polimiozita overlap, LES, AR Scleroderma

29

PM-Scl, Th/ To, Nucleolin Constituieni nucleolari: U3RNP

Nucleolar omogen (PM-Scl) Nucleolar clumpy



Scleroderma F. Raynaud, Scleroderma

Constituieni nucleolari: RNA pol.I NOR-90, RNA pol I, ASE-1

Nucleolar ptat (ARN polimeraza I) Nucleolar ptat cu puncte mitotice



Scleroz sistemic, LES, Conectivite de esut nedifereniate

31

RNA-helicaza II

Nucleolar dens ptat



LES

32

DNA polimeraza ciclina

PCNA



Scleroderma, F. Raynaud, S. Sjgren, Ciroz biliar primitiv

33

Centromer

Proteine ale centromerului A, B, C



Infecie cu Mycoplasma pneumoniae LES

34

Numa 235 HsEg5

Spindle pole pattern (NUMA) Spindle fibre pattern



Polimiozit, LES Ciroz biliar primitiv

35

Constituieni ai ribozomilor: aminoacil tRNA sintetaza, Ribo-P0, P1, P2

Proteine M1-9, piruvat dehidrogenaz (M2)

Granulaii dense perinucleare

(ribozomi)

Reea granulo-filamentoas

(mitocondrie)



Miozite, Polimiozite LES, AR, S. Sjgren, atrofia cerebral

36

Complex de nucleoproteine Constituieni ai aparatului Golgi: golgina, giantina

SRP Granulaii perinucleare la un pol al nucleului (aparatul Golgi)



Polimiozite, dermatomiozite

37 Histidil t-RNA sintetaza

Granulaii fine perinucleare (Jo-1)



56% 26%

9% 9%

Aspectul pattern-ului

Aspect ptat

Aspect omogen

Aspect nucleolar

Alte aspecte

38



14

8

44 42

19

6

0 4

21 18

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Antigene nucleare determinate EIA

39



11

6

39 37

15

4 3 0

3 3

19 18

8

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Antigene nucleare determinate IB

40



0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

14

8

44 42

19

6

0

4

11

6

39 37

15

4 3 0

3

EIA

IB

41

Concordana antigenelor nucleare solubile din EIA i IB cu aspectul ptat din IFI



16

17

18

19

20

21

ds-DNA

nucleozom

21

18

19

18 EIA

IB

42

Concordana antigenelor nucleare din EIA i IB cu aspectul omogen din IFI



Real

pozitivi

Real

negativi

Fals

pozitivi

Fals

negativi

EIA 184 50 0 26

IB 184 50 0 63

43

Date EIA i IB



Sensibilitate Specificitate

EIA

88% 100%

IB 66% 100%

44

Sensibilitatea i specificitatea obinute cu metodele

EIA i IB

CONCLUZII

1. IFI poate fi folosit cu succes ca metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari punnd la dispoziie ntregul spectru antigenic

2. Evideniaz anticorpii orientai mpotriva unor antigene nc nedescoperite, neizolate

3. Un rezultat pozitiv, nsoit de titru i aspectul pattern-ului orienteaz spre boala autoimun sau spre autoanticorp

4. ELISA i IB pot fi folosite pentru confirmare i monitorizarea bolilor autoimune

5. Intruct aspectele de tip nucleolar i puncte nucleare nu au nc corespondent n ELISA, pledeaz pentru folosirea IFI ca metod screening

45

46

Anticorpi antinucleari (depistajIFI)

Se repeta Anticorpi antinucleari (depistajIFI), daca suspiciunea

persista (2-3 luni)

Auto-anticorpi anti Jo1

Aspect mitocondrial

Aspect aparat Golgi

Aspect ribozomal

Aspect de tip Jo1

Auto-anticorpi anti mitocondrii

Aspect omogen

Aspect inelar

Aspect puncte

nucleare

Aspect PCNA

Aspect de tip

centromer

Aspect nucleolar

Aspect dens patat

Aspect fin patat

Antigene nucleare solubile

Auto anticorpi anti-Sm

Auto anticorpi anti-RNP

Auto anticorpi anti-SSA

Auto anticorpi anti SSB

Auto anticorpi

anti Scl 70

Auto antic. anti RNA Pol (III)

Fara specificitate

ADN nativ si sau

cromatina

Profil antigene nucleare solubile

Profil antigene specifice hepatice

Anticorpi antinucleari titrare (aspect, titru)

Posibile granulatii citoplasmatice

Nici o afectiune, remisiune, tratament

Polimiozite % de LES

Ciroza biliara primitiva

Proteina P ribozomala

slab

Scleroza sistemica

progresiva, Scleroderma

overlap, S. Raynaud

S. Crest, Scleroza

sistemica, Fenomene Raynaud

Marker pentru LES

Ciroza biliara primitiva

Posibil LES activ, Artrita

reumatoida (AR), Lupus indus

medicamentos

Marker LES

Conectivita mixta de

tesut (MCTD)

S. Sjogren, LES

LES neonatal, S. Sjogren

Marker scleroderma

Scleroderma mai ales difuza

cutanata

LES, MCTD, AR, EBV, Hepatita cronica

1330261384_imunofluorescentaindirectametodascreeningpentrudetectareaanticorpilorantinuclear

Documents