transfer de embrioni la bovine
DESCRIPTION
proiectTRANSCRIPT
Transferul de zigoți la bovine
Apăvăloaei Sergiu
Grupa C
Ameliorarea producției animale a beneficiat de progrese realizate în mai multe domenii:
selecția geneticii, controlul reproducției, vaccinarea și echilibrul rațiilor alimentare. Atât pe plan
mondial, cât și în România, pentru perfecționarea continuă a procesului de reproducție se aplică cu
succes biotehnologia transferului de zigoți.
Transferul de zigoți este o metodă modernă de intensibizare a reproducției ce constă în
recoltarea, după poliovulație și fecundație, a zigoților din aparatul genital al femelei donatoare și
transferul acestora în aparatul genital al femelelor receptoare, unde urmează ca acesta să se
dezvolte.
Biotehnologia transferului de zigoți presupune cunoașterea proceselor fiziologice legate de
ovulație, particularități ale ciclului sexual al femelelor și evoluția zigotului în primele zile de la
fecundație.
Din punct de vedere zooeconomic, transferul de zigoți oferă posibilitatea folosirii cu
eficientță crescută a rezervelor de ovocite de la animalele cu o înaltă valoare zootehnică
(donatoare), prin provocarea maturării și eliberării mai multor gameți femeli, cu obținerea unui
număr mai mare de produși de la aceeași femelă. Tranferul de zigoți se practică și pentru scurtarea
intervalului dintre generații. Prin instalarea gestației, femela intră în repaus productiv pe întreaga
durată a gestației. Prin practicarea transferului de zigoți, produșii de concepție sunt transferați în alte
organisme, lucru care oferă posibilitatea obținerii unor noi produși de la aceeași femelă în intervalul
de timp în care, în mod normal, ar fi trebuit să fie gestantă. Datorită scurtării intervalului dintre
generații, se accelerează ameliorarea efectivelor de animale.
Din punct de vedere științific, transferul de zigoți reprezintă o biotehnologie prin intermediul
căreia se pot efectua studii științifice ale proceselor intime legate de fecundație și de influiențele
maternă și paternă asupra produsului de concepție. Produșii obținuți astfel permit studierea
influiențelor factorilor genetici și ai mediului extern asupra dezvoltării zigoților, ereditatea grupelor
sangvine, obținerea de animale ”mozaic de gene”, a concentrării mai multor caractere pe același
individ, a instituirii unei profilaxii și terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism.
Etapele tranferului de zigoți la vacă
1. Selecția și pregătirea vacilor donatoare
Criteriile selecției donatoarelor sunt:
- performanța reproductivă- stare ginecoligică perfectă, intervalul dintre parturiție și primul estru să
fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiție-însămânțare mai mic de 80 de zile, indicele de
gestație să fie mai mic de 1,5;
- superioritate genetică- ritm superior de creștere, înainte și după înțărcare, randament ridicat la
sacrificare, producția de lapte;
- valoarea produsului obținut prin transfer embrionar.
Vacile donatoare trebuie să fie sănătoase, să suporte mai multe intervenții de poliovulație și
recolare de zigoți. Alimentația lor are un rol foarte important, acestea fiind grupate după mărime și
necesități nutriționale, pentru care sunt întocmite rații cât mai complete care să asigure necesarul de
hrană zilnic pentru fiecare grupă.
Vacile donatoare, după poliovulație, vor fi însămânțate artificial cu material seminal provenit
de la cei mai valoroși tauri.
2. Selecția și pregătirea vacilor primitoare
Este important ca receptoarele să aibă aparatul genital integru, de aceea se recomandă
folosirea vițelelor. Ele trebuie să fie sănătoase, fără afecțiuni ginecologice (să aibă fișe ginecologice
în care vor fi menționate ciclurile sexuale, data și caracterul estrului, durata ciclului sexual), să aibă
aceeași talie cu donatoarea (în momentul transferului să aibă 80% din greutatea adultului), să fie
apte să nască descendeți cu aceeași greutate la naștere ca donatoarele.
Un alt aspect important este ca alimentația să fie echilibrată.
3. Sincronizarea estrului și ovulației la vacile donatoare și primitoare
Se face prin mijloace medicamentoase, urmărind succesiv două-trei cicluri de călduri la
vacile donatoare, stabilindu-se durata cicluilui. Astfel se calculează data apariției ciclului și, în
funcție de data previzibilă, se acționează prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele
primitoare, având ca scop inducerea căldurilor, sincronizate cu căldurile naturale ale donatoarei.
Această sincronizare medicamentoasă cuprinde mai multe metode:
- metoda cu spirale;
- implantul subcutanat cu progeteron;
- metoda cu PGF2α
- metoda cu progesteron și PGF2α
4. Inducerea poliovulației și însămânțarea arficială a vacilor donatoare
Poliovulația reprezintă provocare eliberării concomitente la aceeași perioadă de călduri a
unui număr sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei. În prezent sunt aplicate două principale
metode clasice de tratament poliovulator:
- gonadotropina serică (PMSG) în doză de 2500-3000 U.I. intramuscular; la două-trei zile de la
administrare se injectează intramuscular o doză de PGF2α, căldurile apărând la 48-60h după.
Dezavantajul acestei metode este producerea de chiști ovarieni.
- FSH în doze de 28-40 mg intramuscular sau subcutanat, fracționat dimineața și seara, timp de 4
zile. Administrarea PGF2α în doză de 500-700 μg se face la 72h de la începerea tratamentului,
estru apărând la 50-60h de la injectarea prostaglandinei. Avantajul acestei metode este că nu
produce chiști ovarieni.
În ceea ce privește repetarea tratamentelor de poliovulație la aceeași donatoare, s-a constatat
că tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau ani, fiind necesar un interval de
cel puțin 60 de zile după fătare în vederea începerii unui nou tratament.
5. Fecundarea ovocitelor
Ovocitele sunt fecundate în urma însămânțării artificiale, de regulă efectuându-se două
însămânțări artificiale la 12 și 24h de la începutul căldurilor observate clinic sau sistematic, după 56
și 72h de la administrarea PGF2α.
6. Recoltarea zigoților
Zigoții sunt recoltați din cornul uterin, după ieșirea din oviduct, recoltarea realizându-se de
regulă între zilele 6-8 după fecundație. Se foloseau două metode de recoltare a zigoților, chirurgical
și nechirurgical, metoda chirurgicală fiind abandonată în prezent.
Metoda nechirurgicală presupune: contenția femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta
vulvei și a regiunii perivulvare, identificarea prezenței corpilor galbeni pe ovar, introducerea
lichidului de spălare în lumenul cornelor uterine, spălarea acestora, recuperarea lichidului împreună
cu zigoții, identificarea și recuperarea zigoților din lichidul recuperat și supus decantării și
aprecierea morfologică a lor.
Prin examen transrectal apreciem răspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpându-se
cu atenție ambele ovare și numărându-se corpii galbeni. Se introduce cateterul de tip Folley prin
cervix până în cornul uterin, la circa 5-8cm de la bifurcația coarnelor uterine. Cu o seringă se
introduce prin cateter aproximativ 8-15ml de aer cu scopul de a fixa cateterul și a împiedica
refularea lichidului de spălare. Irigarea coarnelor uterine se face continuu, calea de evacuare a
lichidului fiind conectată la vasul de colectare a mediului recuperat printr-un tub de plastic. În cazul
cateterului cu două căi recuperarea lichidului de spălare se face prin calea de admisie căruia îi este
adaptată o piesă în forma literei y. Evacuarea lichidului se face printr-un tub din plastic conectat la
un filtru de colectare cu orificii foarte mici care au rol de reținere a zigoților, lichidul traversând
filtrul și fiind colectat într-un recipient. Același mediu de spălare este folosit și la spălarea celuilalt
corn uterin.
Între momentul recuperării zigoților și cel al inovulării lor în uterul receptoarelor, zigoții
trebuie să fie menținuți în viață în condiții speciale și manipulați în cele mai bune condiții tehnice și
igienice.
În ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluții tampon fosfat- PBS pentru spălarea
coarnelor uterine și pentru păstrarea zigoților recuperați. Acest lichid are un pH de 7,2 și conține
multe săruri minerale, glucoză și proteină.
Rezultatele recuperării zigoților depind în mare măsură de abilitatea și antrenamentul
operatorului, mediile, soluțiile, serurile, emzimele și substanțele crioprotectoare care vin în contact
cu zigoții trebuind să fie sterile.
7. Căutarea și aprecierea calității zigoților
După prelevare zigoților, vasul cu lichidul recoltat este lăsat să se decanteze timp de 20-30
minute. Stratul superior se îndepărtează, iar cel inferior în care se găsesc zigoții se transferă într-o
placă Petri cu diametrul de 10cm.
Pentru identificarea zigoților se examinează cu mare atenție la stereolupă fiecare pătrat de la
niveului plăcii Petri. Zona pelucidă garantează protecția zigotului, motiv pentru care ea trebuie să
fie perfect integră, fără fisuri și perfect sferică. După identificare, aceștia sunt transferați în plăci
Petri mai mici cu lichid de conservare, cu ajutorul unei seringi de aspirare. După ultima baie, zigoții
sunt condiționați pentru congelare în paiete, pe care se menționează identificarea donatoarei, rasa,
data colectării, numărul de zigoți și centrul de producție.
8. Conservarea și deconservarea zigoților
Congelarea rămâne cea mai avantajoasă metodă de menținere pentru un interval de timp
practic nelimitat a viabilității zigoților. Zigoții sunt menținuți în stare solidă în azot lichid la o
temperatură de circa -196°C.
În timpul congelării intervin doi factori letali pentru zigoți: formarea gheții intracelulare și
concentrația salină ridicată. Pentru a preîntimpina efectul negativ al acestor factori metoda de răcire
constă în deschidratarea parțială a celulelor și evitarea șocului produs de concentrații ridicate în
săruri prin ultilizarea unui crioprotector, în general glicerol, în mediul de congelare.
Protocolul de congelare a zigoților bovini prevede:
alegerea zigoților
timp de recoltare până la începerea congelării 2-3h
introducerea lor în mediu de congelare la temeratura laboratorului
introducerea în paiete identificate
răcirea până la -6°C sau -7°C cu o viteză de 4°C/minut
inducerea cristalizării
răcirea până la -30°C cu o viteză de 0,4°C/minut
introducerea paietelor direct în azot lichid și stocarea lor la -196°C.
La decongelare paietele se scot repede din containerul cu azot și se introduc direct într-o
baie de apă la 37°C, unde se mențin circa 30 de secunde.Îndepărtarea crioprotectorului se face
progresiv astfel încât ieșirea acestuia și pătrunderea apei în celulă să fie compatibile cu
permeabilitatea membranei celulare.
Nivelul supraviețuirii zigoților după congelare este condiționat de mai mulți factori: stadiul
de dezvoltare, calitatea înainte de congelare, femela donatoare.
9. Transferul zigoților
Pregătirea receptoarelor constă într-o sincronizare cât mai perfectă a cilului sexual cu cel al
femelei donatoare. O atenție specială se va acorda depistării ciclurilor (dimineața, prânz, seara),
apoi se determină momentul exact al începutului estrului. Prin examen transrectal se identifică
corpul galben de pe ovar, inovularea făcându-se în vârful cornului uterin adiacent ovarului cu corp
galben. Înainte și după transfer se va evita orice stres: tratamente antiparazitare, vaccinări, lotizări,
recoltări de sânge, schimbări de alimentație, etc. Variațiile climatice determină creșterea mortalității
zigoților.
Pentru transfer se folosește un pistolet Cassou în care se introduce paieta cu zigotul
decongelat. Traversarea cervixului trebuie să se realizeze cu mare precauție pentru a nu leza
mucoasa cervicală. Anestezia epidurală cu 4-6ml procaină 2% determină relaxarea cervixului și
evitarea contracțiilor organelor genitale.