TEMA (nr. 16): MICROBIOLOGIA SI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR PROVOCATE DE BACILI ACIDO-REZISTENTI

1. Clasificarea micobacteriilo. Agentii cauzali ai tuberculozei si micobacteriozelor si caracterele lor morfologice. Factorii de patogenitate.

Familia MycobacteriaceaeGenul MycobacteriumSpecii:Responsabile de tuberculoza uman: M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum (complex tuberculosis)Agentul leprei: M.leprae (strict uman)Micobacterii atipice, condiionat patogene: M.avium, M.ulcerans, M.fortuitum, M.kansasii, M.marinum, etc. Cauzeaz micobacterioze la persoane imunocompromiseMicobacterii nepatogene: M.smegmatis, M.gastri, M.phley

Caracteristica general a micobacteriilor: Bastonae G+ drepte sau uor ncurbate, necapsulate, asporogene, imobile, peretele celular este bogat n acizi micolici, acido-alcoolorezisten la colorarea Ziehl-Neelsen.M.tuberculosis este o bacterie patogen strict uman, responsabil de tuberculoz. Este sensibil la cldur, lumin solar direct, raze UV sau X. Rezistent la frig sau desicare. Este puin sensibil la acizi, baze (se utilizeaz n decontaminarea prelevatelor) sau detergeni i foarte sensibil la soluia de alcool de 70.

Mycobacterium tuberculosis a fost cauza "Pestei Albe" n sec. 17 i 18 n Europa. n aceast perioad 100 % din populaia Europei a fost infectat cu M.tbc i 25 % din aduli au decedat. Tuberculoza (TB) n prezent este prima cauz de deces din lume dintre toate infeciile bacteriene. Maladia afecteaz 1.7 mlrd persoane/anRM incidena TBC: 1990 49 cazuri la 100.000 (2149 anual); 2006 132 cazuri la 100.000 (5461 anual/3623), 2007 3578 cazuri, 2008 3399 cazuri

Caractere morfotinctorialeM.tbc este un bastona fin sau uor ncurbat, n frotiu se observ izolat, n grmezi sau corzi. Se coloreaz n rou prin tehnica Ziehl-Neelsen

Caractere de culturM.tbc este o bacterie strict aerob, foarte exigent la cultivare. Toate mediile de izolare au la baz ou coagulat. Mediul de referin Lowenstein-Jensen (ou, glicerin, asparagin, verde de briliant). Alte medii solide Popescu (acid glutamic n locul asparaginei), Finn (glutamat de Na).

Micobacteriile patogene cresc lent (perioada de generaie 20 ore), la 37C, pH 6,8-7,0.Coloniile de M.tbc apar peste 2-4 sptmni, sunt rugoase, friabile, conopidiforme, opace, de culoare crem-bej (colonii R).M.bovis i M.africanum formeaz colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8 sptmni.

Mediul lichid Sauton. Conine sruri minerale, asparagin, glicerin. M.tbc crete n 8-10 zile sub form de voal. Este utilizat i pentru repicarea tulpinilor de BCG.Activitatea biochimic a micobacteriilor patogeneToate micobacteriile patogene produc o catalaz termolabil, distrus la 68C timp de 20 min. Celelalte micobacterii posed catalaz termostabil.M.tbs i M.bovis hidrolizeaz ureeaM.tbc produce acid nicotinic (niacin), reduce nitraii n nitrii. M.bovis nu manifest astfel de activitate.

Compoziia chimic i factorii de patogenitate ai micobacteriilorLipidele constituie 20-60% din masa celulei. Se cunosc 3 componente lipidice majore:Acizii micolici. Previn distrugerea micobacteriilor n macrofage,protejeaz micobacteriile extracelulare de complementul din ser. Condiioneaz transformarea macrofagelor n celule epitelioide i celule gigante Langhans. Cord-factorul (sulfo-lipid) perturb respiraia n mitocondrii i inhib migraia PMN. Induce cultivarea n corzi (cosie) a M.tbc. Cerurile.

Lipidele din peretele celular al Mycobacterium tuberculosis sunt asociate cu urmtoarele proprieti ale bacteriei: Impermeabilitate la colorare Rezisten la multe antibiotice Rezisten la substane acide i alcaline Rezisten la activitatea litic a complementului Rezisten la oxidare i supravieuire n interiorul macrofagelorPolizaharidele joac un rol important n formarea Ac serici, conferind specificitatea imunologic. Proteinele reprezint suportul imunitii celulare i a hipersensibilitii tardive.

2. Sursa de infectie, mecanismele de transmitere. Patogeneza infectiei. Formele clinice primare si secundare de tuberculoza.

Patogeneza i formele clinice de tuberculozSursa de infecie omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise n bronii (M.tbc, M.africanum) sau bovinele bolnave (M.bovis).Transmiterea se efectueaz pe cale aerian (picturi, praf). Rareori este posibil contaminarea prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau mini contaminate.Receptivitatea este influenat de vrst i factorii de mediu: carene nutritive, alcoolism, stare imunosupresiv, etc

Primoinfecia tuberculoas Reprezint un ansamblu de manifestri clinice, umorale i anatomice care se desfoara n organism n urma primului contact cu agentul TBC.Dup contaminare (mai frecvent in copilrie), bacteriile ptrund n alveolele pulmonare (90 %), unde sunt captate de macrofage n care se multiplic (bacterii facultativ intracelulare, mpiedic formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare exsudativ nespecific.

Peste cteva sptmni (4-12) se dezvolt o imunitate celular i leziunea exsudativ evolueaz n leziune granulomatoas. Sub aciunea unor citokine secretate de limfocitele T (n special IFN gamma) are loc activarea macrofagelor, care devin deja capabile sa distrug micobacteriile. n acelai timp macrofagele activate se difereniaz n celule epitelioide i celule multinucleate gigante. Ele sunt nconjurate de limfocite i fibroblaste. Acesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infeciei. Infecia se extinde pe cale limfatic, cu afectarea ganglionilor regionali.

- Primoinfecia inaparent. La cca 85% leziunile se vindec i se pot autosteriliza. Nici o expresie clinic sau radiologic.Infecia primar subclinic. Dac multiplicarea bacteriilor este masiv, n leziunile tuberculoase se realizeaz o necroz cazeoas (tuberculom). Frecvent are loc calcifierea tuberculomului (complexul Ghon, leziunea este vizibil radiologic), cu autosterilizarea spontan sau cu persistena unor bacterii n leziune.Consecinele primoinfeciei inaparente sau subclinice: dezvoltarea imunitii antituberculoase i a sensibilizrii tuberculinice.

Tuberculoza primar manifest necomplicat. Pacienii au febr, astenie, pierdere n greutate, etc. Etapa ganglionar poate fi depit cu diseminri hematogene i afectarea pleurei, meningelui, mduvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre fie spre cicatrizare, fie spre agravare.Tuberculoza primar cu complicaii. Rareori (10% cazuri), evoluia este defavorabil: masele necrotice sunt evacuate n bronii, vase sanguine, pleur sau pericard cu formarea unei caverne, unde bacteriile se multiplic intens. Fistulizarea ntr-un vas sangvin disemineaz infecia sistemic (tuberculoza miliar). Starea general este alterat, apare febr, tuse, uneori hemoptizie. Bolnavul este contagios, eliminnd bacterii cu sputa.

Tuberculoza secundar. Se manifest n condiii de scdere a reactivitii imune, prin reinfecii masive sau reactivarea unor focare latente. Focarele noi apar n ritm lent i evolueaz cronic fr tendin de vindecare spontan.Alte forme clinice de tuberculoz: ganglionar, meningean, osteo-articular, uro-genital.Imunitatea antituberculoas este celular, nesteril. Hipersensibilitatea tardiv nsoete imunitatea celular. Ac circulani nu au rol protector.

3. Diagnosticul de laborator al tuberzulozei: produsul patologic, recoltarea, prelucrarea prealabila, metodele de diagnostic.

Diagnosticul de laborator al tuberculozeiPrelevate: n funcie de forma clinic: sputa matinal (5-10 ml), tubaje gastrice, urin, lichid pleural, articular, peritoneal, LCR, bioptate, etc n caz de necesitate se efectueaz omogenizarea /decontaminarea cu NaOH i concentrarea (prin centrifugare) a prelevatelor.Metode de diagnostic1. Examenul microscopic frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonae purpurii izolate) sau cu auramin (bastonae galbene pe fondul negru). Sensibilitatea 104 bacili/ml

2. Examenul bacteriologic izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea sensibilitii la chimioterapice (prin metoda diluiilor n mediu solid)3. Metoda biologic (inocularea la cobai). Servete uneori pentru confirmarea virulenei micobacteriei4. PCR pentru detectarea rapid a micobacteriilor direct n prelevate5. Intradermoreacia la tuberculin (reacia Mantoux). Se cerceteaz starea de hipersensibilitate cutanat la tuberculin. Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o cultur bulionic autoclavat de M.tuberculosis.

Pe faa anterioar a antebraului se injecteaz i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin n volum de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reacia pozitiv se manifest printr-o induraie i congestie cu diametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectueaz n funcie de contextul clinicReacia + indic c subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfecie), a fost vaccinat cu BCG sau este bolnav de tuberculoz (n acest caz diametrul depete 10 mm).Reacia negativ exclude diagnosticul de tuberculoz i indic receptivitatea individului la tuberculoz.

4. Particularitatile imunitatii antituberculoase. Profilaxia si tratamentul specific al tuberculozei.

Imunitatea omul poseda o imunitate naturala fata de tuberculoza administrare de BCG rol important - factorul genetic

Tratamentul tuberculozeiDOTS (Directly Observed Treatment Short Course Chemotherapie). DOTS este o strategie a OMS implementat n 1993. Principiile DOTS- tratament standardizat- tratament bifazic constituit dintr-o faz intensiv i faza de continuare- asocieri de medicamente antituberculoase- supraveghere direct a regularitii administrrii tratamentului antituberculosDin 2005 Program Naional de Control i Profilaxie a Tuberculozei (2006-10)

Antibiotice cu spectru larg: rifampicin, streptomicin, kanamicin, D-cicloserinFluorochinoloneChimioterapice care inhib sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul, Etionamida)Exigenele terapiei antituberculoase: a mpiedica selecia mutanilor rezisteni i a steriliza definitiv focarul.n acest scop se utilizeaz asocierea a 3-4 droguri pe o perioad de 6-12 luni.

Profilaxia specificVaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezint o tulpin vie avirulent de M.bovis. A fost obinut de Calmette i Guerin n 1921 dup multiple repicri (230 pasaje) pe mediu cu cartof, bil i glicerin.Vaccinul se administreaz i/dermic la vrsta de 4-5 zile de la natere. Revaccinarea la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reacia Mantoux negativ). MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TUSEI CONVULSIVE

5. Micobacteriile leprei si caracterele lor morfobiologice. Sursa de infectie, mecanismul, caile de transmitere, patogeneza si diagnosticul de laborator al leprei. Profilaxia si tratamentul specific.

Morfologie bacili drepti sau usor incurbati (unerori se intilnesc forme granulare sau clavetate) dispuse frecvent in grupuri (ca tigarile in pachet), sau in gremezi (sfere) Gram+, imobile, nu formeaza spori si capsule sunt polimorfe (diferite forme) dupa compozitia chimica seamana cu m.tuberculoaseCaractere de cultura nu creste pe mediile de cultura folosite pentru m. tuberculoase se pot cultiva in organismul Armadiilor (), din cauza ca au temperatura relativ joasa (30-35C) m.leprae se dezvolta bine, si apar granuloame tipice numai ca in catitati mai mari.Caractere enzimatice difenoloxidaza, participa la multipilacarea bacteriilor peroxidaza, citocromoxidaza, dehidrogenaza - enzime respiratorii.Toxinogenitatea nu produc exotoxine produc endotoxine si alergene (presupus), din pacate nu se poate de studiat mai aprofundat din cauza ca nu s-a putut gasi animal de laborator sensibil la m. lepreiRezistenta forte inalta in afara organismului uman isi pierde repede vitalitatea Patogenitatea pentru animale se cunosc afectiuni leproide la sobolani, bivoli, unele specii de pasari - dar ele difere de lepra umana. studiul acestor afectiuni au facut posibil presupunearea ca m.leprae se apropie in sens genetic de ag. patogeni ai tuberculozei si paratuberculozei deoarece la animale se trateaza cu preparate antituberculoase.Patogenia afectiunii la om sursa de infectie: omul bolnav. transmiterea: aerogen, prin rinofaringe, piele lezata, diferite obiecte. Contact indelungat cu persoana bolnava. dupa patrunderea agentului leprei in organism, el de inoculeaza in celulele diferitor tesuturi si organi apoi ajung in vasele limfatice si sangvine. Daca rezistenta organismului este inalta ele mor, daca persoana traieste si lucreaza in conditii defavorabile forma lenta trece in activa. Perioada de incubatie: 3-5 - 20-35 ani are evolutie cronica Sunt 3 tipuri (clinic): lepromatos, tuberculoid, nediferentiat1)Tipul lepromatos - rezistenta minima a organismului2)Tipul tuberculoid - rezistenta mare a organismului. Intradermoreactia alergica Mitsuda de regula pozitiva.3)Tipul nediferentiat - rezistenta variata (mai mult minim). Examenul bacterioscopic releva inconstant mycobacteriile de lepra.Imunitate seamana cu imunitatea de tuberculoza (dupa mecanism) - celulara la persoanele cu rezistana ridicata - se fagocitteaza de histiocite -> distruse la persoanele cu rezistenta scazuta - m.leprei se multiplica chiar si in fagocite (fagocitoza incompleta) imunitatea depinde de starea generala a organismuluiDiagnosticul de laborator prelevate: raclat de pe mucoasa nazala, continut de lepra cutanate, sputa, eliminari din ulcere metoda principala de diagnosticare - examenul microscopic colorat Ziehl - Neelsen pentru diferentierea leprei de tuberculoza - se infecteaza cobaii (cobaiul nu este receptiv la lepra) RFC, RHAI proba alergica pentru stabilirea tipului de lepra - injectare de lepromina (0.1ml) - 48-72 ore -> eritrem + o papula nu prea mare.Tratament preparate sulfonice (diafenilsulfon, solusulfon, dimocifon, diucifon) + refampicina, etionamida, protionamida, lampren se recomanda preparate desensibilizante si corticosteroizi (cortizon, prednizolon), imunoterapie, vitaminoterapieProfilaxia izolarea bolnavilor imunizarea copiilor in regiunile endemice pare sa aiba perspectiva.

6. Agentii cauzali al actinomicozei. Clasificarea. Caracterele lor morfobiologice. Factorii de patogenitate.

Clasificare Familiile: Actinomycetaceae, Streptomycetaceae Patogeni: A.bovis, A.israeliiMorfologie se multiplica prin germinarea sporilor fixati pe sporozoare, prin diviziune simpla strangulare si imugurire multi reprezentanti pot elebora antibioticeCaracterele de cultura anaerobi facultativi temperatura optima - 35-37C, dar se dezvolata si la 25-30C medii uzuale, pH- 4,4-9,0. acidorezistente, in culturi prospete formeaza granulozitate colonii S, altele colonii R, diferite culoriToxicogeneza se presupune ca contin edotoxineRezistenta foarte rezistente suport temp. pina la 60C timp de 1 ora sporii sunt deosebit de rezistentiPatogenitate pentru animale ataca bovinele, mai rar porcii si caii cronic, cu focare inflamatorii si fistulePatogenia afectiunii la om Sursa de contaminare: animale cit si obiecte ale mediului ambiant. boala este favorizata de praumatisme ale pielii si mucoasei si mai ales a dintilor cariati. apar focare purulente, fistule in puroi se constata granule (druze) compuse din filamente de actinomicete.7. Diagnosticul de laborator al actinomicozei: produsul patologic, recoltarea, prelucrarea prealabila, metodele de diagnostic.

Diagnosticul de laborator (4 etape) examenul preparatelor de puroi colorate/necolorate pentru decelarea druzelor insemintarea pe BGlucozat (pH6,8), geloza glucozata, mediul Sabouraud, conditii aerobe/anaerobe, 35-37C, izolarea culturii pure si identificarea ei RFC cu serurile bolnavilor intradermoreactia alergica cu extract din actinomiceteTratament actinolizate, vaccin actinomicetic polivalent, antibiotice si sulfanilamide in unele cazuri radiografia si interventie chirurgicalaProfilaxia respectarea igienei personale lichidarea factorilor ce favorizeaza dezvoltare bolii: traumatisme, asanarea cavitatii bucale si faringelui, ingrijirea dintilor, spalarea pe miini.

SpeciaForma coloniilorHidroliza amidonuluiFermentareaSensibilitatea la

arabinozeiribozeixilozeiamidonuluirafinozeistreptomicinacloramfenicol

A. bovisS+--+-+-+-

A. israeliiR-+-++++++