Tehnici actuale în biologia celulară

şi moleculară

-II-

TEHNICI ACTUALE

•Metode de studiu al proteinelor

•Metode de studiu al materialului genetic

3

METODE DE STUDIU AL PROTEINELOR

• ELECTROFOREZA• TRANSFERUL ELECTROFO-

RETIC

4

ELECTROFOREZA

• PRINCIPIU: particulele încăr-cate electric migrează într-un mediu vâscos, sub acţiunea unui câmp electric.

• Aplicaţii practice: studiul prote-inelor şi al acizilor nucleici.

5

ELECTROFOREZA PROTEINELOR

a. unidimensională, cand migrarea se realizează în gel într-o singură direcţie

b. bidimensională, când migrarea se realizează succesiv în două direcţii

ELECTROFOREZA PROTEINELOR

• Tipuri de electroforeză unidi-mensională

SDS – PAGEFOCALIZAREA IZOELECTRICĂ

7

ELECTROFOREZA SDS-PAGE

• realizează separarea protei-nelor dintr-un amestec pe baza greutăţii/gabaritului molecular, direct proporţio-nal cu masa moleculară.

ELECTROFOREZA SDS-PAGE

• Principiu: adsorbţia uniformă a dodecilsulfatului de sodiu pe unitatea de masă de proteină, realizând o încărcare constan-tă de sarcini negative (migra-rea va depinde numai de masa moleculară)

9

Focalizarea izoelectrică

Definiţia: separarea electro-foretică a proteinelor dintr-un amestec pe baza punctului lor izoelectric.

Focalizarea izoelectrică• Principiu: migrarea proteinelor în

funcţie de punctul izoelectric, până în zona din gel cu pH-ul identic cu cel al punctului lor izoelectric, unde devin neutre oprindu-şi mişcarea

• Gradientul de pH din gel este realizat de compuşi amfoteri numiţi amfoliţi

11

Focalizarea izoelectrică

Benzi p ro te ic e la p unc tul izoe le c tric

Std pI ProbăRezultate

12

Electroforeza bidimensională

• migrarea proteinelor în două direcţii:

1. prima direcţie – FOCALIZARE IZOELECTRICĂ

2. a doua direcţie – SDS-PAGE

Electroforeza bidimensională

• Rezultatele se prezintă sub forma unei hărţi cu proteinele separate în planul gelului.

14

Electroforeză bidimensională

Electroforeză 2D pe fracţiuni celulare din hepatocite (Fengsrud et al. Biochem. J. 352, 773–781, 2000)

Electroforeza acizilor nucleici

• Foloseşte, de regulă, geluri de agaroză, sau geluri de polia-crilamidă la concentraţii mici (până în 5%), care asigură spaţii largi de migrare

16

TRANSFERUL ELECTROFORETIC

• Metodă de extragere, în câmp electric, a macromoleculelor (proteine, acizi nucleici) separate electroforetic într-un gel, cu ataşarea lor pe hârtii cu proprietăţi adsorbante speciale

17

TRANSFERUL ELECTROFORETIC

Avantajele tehnicii:• Sporeşte accesibilitatea partenerilor

de identificare (anticorpi la epitopi, care se pot şi regenera datorită eliminării SDS; secvenţe oligonucle-otidice marcate fluorescent la ADN, sau ARN)

• Se pretează şi la identificări de receptori prin liganzi marcaţi

Transferul electroforetic al proteinelor (western blot)

1. Electroforeză SDS-PAGE

2. Transfer electroforetic membrană

3. Incubarea cu anticorpul primar specific

4. Incubarea cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidază, sau fosfatază alcalină

5. Dezvoltarea reacţiei de identificare (de regulă reacţie de chemiluminiscenţă amplificată)

Etape

19

Western BlotUtilizări:- determinare semicantitativă de

proteine (prin densitometrie)

- oferă informaţii legate de modificarea de expimare a proteinelor, sau de starea lor de activare în decursul diferitelor procese celulare

Transferul electroforetic al proteinelor (western blot)

Exemplu de rezultat:

Exprimarea diferitelor tipuri de integrine pe diverse tipuri celulare evidenţiată prin electroforeză, transfer şi imunodetecţie. Poziţiile 1-4 reprezintă nivelul de exprimare a integrinelor în keratinocite pasajul 1 (poziţiile 1, 3), respectiv pasajul 2 (poziţiile 2, 4); poziţiile 5-8 reprezintă nivelul de exprimare a integrinelor în celule musculare netede de trompă uterină la pasajele 2 (poziţia 5), 4 (poziţia 6), 6 (poziţia 7) şi 8 (poziţia 8).

(prin amabilitatea Dr. Laura Cristina Suciu şi Dr. Mircea Leabu)

21

Transferul electroforetic al ADN (Southern Blot)

Definiţie: metodă utilizată pentru identificarea unei anumite secvenţe ADN în materialul genetic recoltat de la pacient, animal de laborator sau cultură celulară

Southern BlotPrincipiu: folosirea unei probe comple-mentare celei investigate, marcată fluores-cent sau radiografic

23

Transferul electroforetic al ARN (Northen Blot)

- Detectarea anumitor secvenţe de ARN

- Similară ca procedeu cu Southern Blot

- Poate furniza informaţii legate de modularea exprimării anumitor gene în celule

Hibridizarea in situ

• Metodă de evidenţiere a unei secvenţe ADN, sau ARN în celule dintr-un ţesut sau din cultură, fără a trebui distrusă integritatea celulară şi extras materialul genetic

Hibridizarea in situ• Principiu: utilizarea unei

secvenţe complementare de ADN/ARN, marcate fluorescent, care să evidenţieze prezenţa in situ a secvenţei căutate

• Deoarece foloseşte un preparat fluorescent, metoda e cunoscută sub denumirea de FISH (fluorescent in situ hybridization)

26

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

• Metodă folosită pentru obţinerea unui număr mare de copii a unei anumite secvenţe de ADN

PCREtape

• denaturarea ADN şi separarea catenelor complementare

• adaugarea primerilor (secvenţe ADN complementare secvenţei-ţintă)

• sinteza de noi secvenţe de ADN dc sub acţiunea Taq-polimerazei

28

Secvenţierea genică

Metodă care permite descifrarea secvenţei de nucleotide care intră în structura unei gene

Secvenţierea genică• Metoda Sanger – Principiu• Blocarea sintezei catenei complementare

de ADN prin legarea unei dideoxinucleo-tide, în locul nucleotidei normale şi generarea de fragmente intermediare

• Migrarea ulterioară în gel de agaroză va etala secvenţe de ADN din ce în ce mai mari, diferind prin ultima bază azotată legată

Metoda Sanger

32

RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE PCR)

- Metodă foarte sensibilă de detectare şi cuantificare a ARNm

- Iniţial din ARN-ul ţintă se sintetizează secvenţa cADN, apoi urmează etapele PCR

- Utilizată în diagnosticul unor boli genetice, cuantificarea expresiei diverselor gene prin determinarea cantităţii de ARNm

33

Animale transgenice- Animale de laborator cărora li

se inseră gene mutante pentru a studia efectul lor asupra organismului gazdă.

- Mediu de studiu pentru evoluţia unor boli cu determinism genic şi a opţiunilor terapeutice

34

Animale de laborator transgenice

35

Animale knockout

- Înlocuirea genei de interes cu o genă inactivă sau o alelă mutată

- Animalul purtător nu va exprima această genă, putându-se studia efectul absenţei ei in organism.

36

Leptin knockout mouse

VIDEOMICROSCOPIA

• Urmărirea comportamentului celular în timp real în mini-incubatoare cu sistem microscopic încorporat

Ce înlesneşte?• Urmărirea celulelor timp îndelungat (ore, zile)

în modelări experimentale (adeziune, etalare, stimulări, inhibări, stres hipoxic, stres oxidativ)

• Stabilirea momentelor critice în comportarea celulelor în modelul experimental

• Măsurători morfologice• Măsurători de mobilitate celulară• Traiectorii ale dinamicii celulare• Migrări individuale, migrări de grup• Dezvoltări de experimente asupra

mecanismelor (prin metode alternative)

VIDEOMICROSCOPIA

DOK fibronectină

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20

Timpul (h)

Su

pra

faţa

den

ud

ată

(x10

3m m

2)

control

UV30

Analiza morfometrică şi fenomenologică a rezultatelor

UVA 30

-250

-175

-100

-25

50

125

200

-300 -200 -100 0 100 200 300

Control

-250

-175

-100

-25

50

125

200

-300 -200 -100 0 100 200 300

Capacitatea de reacoperire a suprafeţei denudate

Analiza direcţionalităţii de migrare prin trasarea traiectoriilor

Drept încheiere

• Nu vă lamentaţi de complexitatea informaţiilor!

• Gândiţi-vă că cei ce vor veni în anii următori vor avea şi mai multe de învăţat!

Dr. Mircea Leabu