METODE DE COLORARE UTILIZATE N EVIDENIEREA CROMOZOMILOR Metoda Feulgen (colorare rapid cu fucsin bazic) i metoda de colorare cu carmin acetic Metoda Feulgen a fost elaborat n 1924 de R. Feulgen i H. Rossenbeck. Metoda carmin acetic a fost elaborat n 1928 de J.A. Belling. Colorantul carmin (denumire veche: crmz), folosit curent n tehnicile de laborator de citologie, este o substan colorant, de un rou-intens, obinut prin extracie din gogoile femelelor homeopterului Coccus cacti (rom.= coenil) insect originar din Mexic, care triete pe cactui. Cele dou metode de colorare se bazeaz pe capacitatea cromatinei de a fixa colorani precum fucsina bazic i acidul carminic, colorndu-se selectiv i oferind posibilitatea de a studia etapele diviziunii celulare, numrul i morfologia cromozomilor, modificrile numerice i morfologice determinate de aciunea factorilor mutageni i de recombinrile intra- i interspecifice etc. Materiale necesare Procesul mitozei este, n principiu, acelai n toate organismele, att la plante, ct i la animale. Observaiile fcute pe celulele din plante aflate n mitoz pot fi extinse att la celulele animale, ct i la cele umane. ntruct cromozomii devin vizibili doar n cursul diviziunii celulare, materialul biologic vegetal folosit trebuie sa provin din esuturi aflate n diviziune (esuturi meristematice). Se pot folosi vrfuri de rdcini tinere de la semine de secar (Secale cereale, 2n = 14), bob (Vicia faba, 2n = 12) germinate n vase Petri sau de la bulbi de ceap (Allium cepa, 2n = 16). Alte materiale necesare: colchicin 0.01 %, alcool etilic, acid acetic glacial, HCl 1N, fucsin bazic, carmin-acetic, orcein-acetic, lame, lamele, lam de ras, penset, ace, sticl de ceas, pipete, spirtier, hrtie de filtru, foarfece, termostat, frigider, microscoape. Etapele de lucru n metoda Feulgen 1. Obinerea radicelelor. Seminele se pun la germinat pe hrtie de filtru mbibat cu ap. Radicelele se recolteaz cu ajutorul unui ac spatulat sau a unei foarfece, dup 2-3 zile, cnd ating lungimea de 5-10 mm. Pentru a obine un numr ct mai mare de metafaze, se recomand ca seminele germinate s fie supuse unui tratament termic (vasele cu semine germinate se introduc n frigider, timp de 30-60 minute dup care se transfer ntr-un termostat reglat la 30 C sau sub o lamp de birou pentru 1-2 ore). Bulbii de ceap se plaseaz deasupra unor vase cu ap de robinet astfel nct discul bulbului s se gseasc n ap, la temperatura camerei. Se recomand ca apa s fie schimbat zilnic. Rdcinile se recolteaz cnd au 2.5-5 cm lungime. Se utilizeaz celulele din vrful rdcinii, care au o diviziune activ. 2. Prefixarea are rolul de a inhiba formarea fusului de diviziune celular, stopnd procesul mitotic n stadiul de metafaz. Radicelele recoltate sunt puse n fiole de sticl sau flacoane de medicamente cu o capacitate de 10 ml, n soluie de colchicin 0.01%, timp de 4-5 ore. (Colchicina este un alcaloid extras din Colchicum autumnale brndua de toamn. n

1

practica medical, colchicina este utilizat, nc din antichitate, ca antiinflamator n tratamentul gutei, datorit capacitii de a se ataa de tubulinele celulare.) 3. Fixarea are scopul de a imobiliza componentele celulare, ceea ce se realizeaz practic prin omorrea celulei. Se pot folosi ca fixatori: un amestec de alcool etilic absolut-acid acetic glacial (3:1), fixator Carnoy (amestec de alcool etilic absolut-acid acetic glacial-cloroform, 6:3:1) sau o soluie 45% acid acetic. Se nlocuiete prefixatorul din fiolele cu radicele cu fixator i se las la temperatura de 4 C timp de 12-15 ore. 4. Hidroliza determin macerarea peretelui celular al celulelor din vrful vegetativ al radicelelor, uurnd, astfel, etalarea pe lama de sticl. Hidroliza se realizeaz cu acid HCl 1N, la 60C. Timpul de hidroliz depinde de compoziia peretelui celular i este caracteristic fiecrei specii (12 minute pentru secar, 10-20 minute pentru ceap). Se nlocuiete fixatorul cu soluia de HCl 1N i se introduce flaconul cu radicele la termostat. 5. Colorarea se realizeaz cu o soluie de fucsin bazic incolor (reactivul Schiff) care coloreaz cromozomii n rou-violaceu. O coloraie mai accentuat se observ la nivelul vrfului vegetativ al radicelei deoarece celulele de aici sunt active mitotic. Soluia de fucsin bazic (23ml) se adaug dup ndeprtarea HCl i splarea cu ap distilat a radicelelor i se menine 1015 minute. Pentru obinerea unei coloraii mai intense, se recomand prelungirea timpului de colorare pn la 30-60 minute. De asemenea, pentru obinerea unui contrast mai accentuat ntre cromatin i citoplasm, ulterior radicelele se in 30 minute n ap. 6. Realizarea preparatelor microscopice prin metoda squash, ce presupune etalarea celulelor n strat subire, ntre lam i lamel. - n mijlocul unei lame de sticl se plaseaz o pictur de acid acetic 45%. Pentru intensificarea coloraiei se recomand montarea radicelelor pe lam ntr-o pictur de carmin-acetic sau orcein acetic. - Se decupeaz vrful colorat al radicelei i se introduce n pictura de acid acetic de pe lam. - Se aeaz deasupra lamela, fr a produce bule de aer. - Se lovete sistematic cu un b de chibrit lamela pentru a obine o etalare ct mai bun a materialului de studiat. - Se acoper lamela cu o bucat de hrtie de filtru i se apas cu degetul mare, uniform i ferm celulele se vor etala i excesul de acid va fi ndeprtat i absorbit de hrtia de filtru. 7. Vizualizarea preparatelor la microscop pentru mrirea contrastului, se poate folosi filtrul verde. ntr-un preparat microscopic bun, celulele se prezint n monostrat, nucleii i cromozomii apar colorai n rou-violaceu intens i citoplasma este incolor. La unele dintre celule membrana poate fi distrus, cromozomii fiind, n consecin, dispersai i mai uor de examinat individual.

2

Etapele de lucru n metoda coloraiei cu carmin acetic 1. Obinerea radicelelor se face dup cum s-a prezentat anterior. 2. Fixarea materialului de studiu nu este obligatorie n acest caz deoarece soluia colorant conine acid acetic, fixarea i colorarea realizndu-se concomitent. Totui, o fixare prealabil face ca hidroliza materialului s se fac mai rapid i crete sensibilitatea acestuia fa de colorant. Fixatorii ce se pot utiliza sunt cei menionai anterior. 3. Hidroliza i colorarea se pot realiza simultan ntr-o soluie carmin-acetic. - ntr-o sticl de ceas se pun cteva picturi de carmin acetic i se introduc vrfurile de radicele. - Se plaseaz sticla de ceas deasupra flcrii unei spirtiere i se nclzete fr a ajunge la punctul de fierbere pn ce radicelele se nmoaie i se coloreaz intens. Se testez din timp n timp cu acul dac materialul biologic s-a inmuiat. n cazul unei hidrolize dificile, n soluia de carmin acetic se pot aduga cteva picaturi de HCl 1N. 4. Realizarea preparatelor microscopice prin metoda squash prezentat anterior. 5. Examinarea preparatului obinut la microscop.

Vizualizarea cromozomilor la Allium cepa

Pentru obinerea preparatelor permanente se folosete una din metodele de mai jos: - se monteaz preparatul n balsam de Canada sau euparal; - se parafineaz lamela; - se aplic soluie de lipit n jurul lamelei (pentru a mpiedica evaporarea).

3

PREPARATE VIZUALIZATE

4