7/21/2019 SecventializaRea SINGER Vali

http://slidepdf.com/reader/full/secventializarea-singer-vali 1/2

- una din primele metode de secvenţializare a fost descrisă în 1977 de Frederick Sanger care a primit cel de-al doilea p remiu Nobel pentru descoperirea sa

Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADN-ului monocatenar incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in functie de baza existenta insecventa de analizat de catre dideoxinucleotide.

Metoda de secven iere Sanger:ț

1. un ablon simplu de ADN,ș

. un primer ADN, !. enzima ADN polimeraz",#. deoxinucleozidetrifosfate normale $dN%&'(. di-deoxinucleozidetrifosfate modificate $ddN%&': ddA, ddC, ddG, ddT)

cele din urm" termin)nd prematur elongarea irului ADN.ș

ddN%&-urilor le lipsesc grupul *idroxil $+ ' de la cap"tul ! , deci nu pot forma leg"tura necesar" dintre dou" nucleotide, ceea ce mpiedic" polimeraza ADN s" extind" ADN-ul.

ddN%&-urile sunt etic*etate radioactiv sau fluorescent pentru a putea fi detectate automat de c"tre ma inile de secven iereș ț .

Mostra ADN este mp"r it" n patru reac ii separate, con in)nd fiecare toate cele patruț ț țdeoxinucleotide $dA%&, d/%&, d0%& i d%%&' i enzima ADN polimeraz". n fiecareș șdintre reac ii este ad"ugat" doar una dintre cele patru di-deoxinucleotide $ddA%&,țdd/%&, dd0%&, sau dd%%&', n timp ce celelalte nucleotide sunt nemodificate. Di-deoxinucleotidele modificate sunt ad"ugate n exces, n cantit" i de aproximativ 122 dețori mai mari dec)t deoxinucleotidele normale. &e scurt, este nevoie de patru reac iițseparate pentru a testa cele patru ddN%&. Dup" mai multe runde de extensie aablonului ADN, fragmentele rezultate de ADN sunt denaturate prin expunere la c"ldur"și sunt separate conform m"rimii prin procedura deș electroforez" pe gel.

Metoda “Dye-terminator”Secven ierea 3D4e-terminator5 utilizeaz" etic*etarea lan ului terminal al ddN%&s, careț ț

permite secven ierea ntr-o singur" reac ie.ț ț6iecare lant terminal din cei patru este etic*etat cu coloranti fluorescenti, care emitlumin" la diferite lungimi de unda.

7/21/2019 SecventializaRea SINGER Vali

http://slidepdf.com/reader/full/secventializarea-singer-vali 2/2

Fig. 12.2. Secvenţierea ADN prin metoda dideoxi (Singer)

1. Sanger 6, 0oulson A7 $1 mai 189('. A rapid met*od for determining se;uencesin DNA b4 primed s4nt*esis <it* DNA pol4merase5.J. Mol. Biol. 94 $!': ##1=>.

. a b Sanger 6, Nic?len S, 0oulson A7 $1 decembrie 1899'. DNA se;uencing <it*c*ain-terminating in*ibitors5.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 $1 ': (#@!=9.