Ing. György FESZT

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribu Ńii privind studiul fiziopatiilor şi a patofitozelor colecŃiei de cactacee de la Grădina

Botanică din Cluj-Napoca

Conducător ştiin Ńific: Prof.univ.dr.doc. Ioan BOBEŞ

CLUJ-NAPOCA 2009

UNIVERSITATEA DE ŞTIIN łE AGRICOLE ŞI

MEDICIN Ă VETERINAR Ă CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE AGRICULTUR Ă

MATERIALE ŞI METODE UTILIZATE ÎN STUDIUL BOLILOR CACTACEELOR DIN GRĂDINA BOTANIC Ă „ALEXANDRU BORZA”, CLUJ-NAPOCA

OBIECTIVELE PROPUSE PENTRU PARTEA EXPERIMENTAL Ă A TEZEI DE DOCTORAT

1. Analiza tipurilor de agenŃi patogeni şi îmbolnăviri în colecŃia de cactuşi a

Grădinii Botanice din Cluj-Napoca şi evaluarea stării de sănătate a colecŃiei.

2. Dezvoltarea unor metode specifice de analiză în vederea unei diagnosticări cât

mai timpurii şi exacte a rezervei de agenŃi patogeni (microscopie optică, microscopie

electronică).

3. Elaborarea tehnicii analizei dinamice a imaginilor digitale, în studiul

patogenezei unor boli ale cactaceelor.

4. Studiu biostatistic de analiză a evoluŃiei şi a modului de dispersie a unor agenŃi

patogeni în colecŃia de cactuşi de la Grădina Botanică din Cluj-Napoca.

5. Realizarea unei baze de date privind riscul apariŃiei, evoluŃiei şi dispersiei, pe o

suprafaŃă dată, a tipurilor de agenŃi patogeni în colecŃia de cactuşi.

6. Studiul microclimatic al serei în vederea depistării atât a factorilor abiotici

cauzatori ai unor fiziopatii, cât şi a optimizării condiŃiilor de mediu, favorabile unor grupuri

de plante periclitate sau aflate pe cale de dipsariŃie.

7. Elaborarea unor strategii de combatere generalizate pentru colecŃia de cactacee a

Grădinii Botanice din Cluj-Napoca.

8. Verificarea originii patogene sau nepatogene a formelor teratologice

(monstruosa, cristata) la speciile de colecŃie.

9. Crearea unor colecŃii sănătoase din punct de vedere fitosanitar, care să

funcŃioneze ca o reală bancă de gene în perspectiva creării unor colecŃii naŃionale.

STUDIUL MICROCLIMATIC AL SEREI DE CACTACEE A GR ĂDINII BOTANICE CLUJ-NAPOCA

Cu ajutorul termoumidometrului digital RHYTHM s-au înregistrat date privind

microclima serei. Aparatul este dotat cu senzori pentru înregistrarea umidităŃii relative a

aerului între 10 şi 95 % a temperaturii cu ajutorul a doi senzori, unul aflat la nivelul solului,

încorporat în aparat, iar o extensie măsoară temperatura la nivelul superior al serei.

Aparatul afişa temperatura şi umiditatea actuală cât şi maximele şi minimele

memorizate de la ultima ştergere a memoriei. Temperaturile au fost citite în fiecare zi şi

trecute în caiete speciale. Ora la care a fost efectuată citirea a rămas aceeaşi în sensul că ora

de iarnă 131/2 vara a fost 141/2. În caiet s-a notat ora la care s-a efectuat citirea, datele din

momentul citirii termometrului, (temperatură, umiditate) urmat de umiditate a aerului

minimă maximă, temperatura minimă maximă.

ORGANIZAREA ŞI EVALUAREA ST ĂRII DE SĂNĂTATE A COLEC łIEI DE CACTACEE

Inventarul a fost efectuat cu ocazia transplantării cactaceelor în perioada de repaus a

acestora. Transplantarea s-a efectuat de-a lungul unei perioade de patru luni din 0 4.11.2004

până la 0 4.03.2005.

Fiecare plantă a fost verificată separat, iar datele au fost trecute în tabel. În

manipularea plantelor este nevoie de foarte multă atenŃie, ca din greşeală lucrătorii să nu

schimbe etichetele între plante.

În urma observaŃiilor f ăcute s-a urmărit identificarea plantelor suspecte care urmau a

fi studiate în laborator. Astfel au fost alese plantele care:

• prezentau simptome de mozaicare;

• plante de import de origine necontrolată;

• cactuşii care se abat prin formă, culoare sau aspect de la normal: decolorări

nespecifice, forme de mătură de vrăjitoare, fasciaŃie, forme cristate, forme monstruosa,

creşteri în spirală, deformări ale florilor etc.

Plantele care prezentau semne de putrezire au fost tăiate în două părŃi aproximativ

egale, care să conŃină atât porŃiuni sănătoase cât şi bolnave. O bucată s-a introdus nesterilizat

într-un pahar de probă biologică de uz medicinal de 100 ml. Paharele au fost sterilizate în

prealabil cu hipoclorit de sodiu, concentraŃie 10 %. łesuturile nesterilizate au urmat calea

naturală de descompunere fără ca microflora existentă pe suprafaŃa plantei să fie modificată.

Cealaltă bucată a fost sterilizată prin spălări repetate de dezinfectare.

METODE DE APRECIERE A ATACULUI PRODUS DE AGEN łI FITOPATOGENI

ÎN COLECłIILE DE CACTACEE

Pentru a putea compara starea de sănătate a cactaceelor de la Grădina Botanică Cluj-

Napoca cu situaŃia din natură, respectiv din locul de origine a cactaceelor, s-a folosit scara de

notare a intensităŃii atacului indicat de James (1971) citat de DE LA TORRE (1998).

DE LA TORRE (1998) a luat în studiu un număr de 10 cactacee nativi din regiunea

Zapotitlan de las Salinas din Statul Puebla din Mexic.

În evaluarea stării de sănătate a colecŃiei de cactacee de asemenea putem calcula

frecvenŃa, intensitatea şi gradul de atac asupra diferitelor genuri sau chiar a speciilor din

cadrul unor genuri. Acestea se pot calcula, atât pentru suprafaŃa radiculară, cât şi pentru

tulpină.

TRANSMITEREA EXPERIMENTAL Ă A VIRUSURILOR

PE CALE MECANIC Ă

Au fost selectate următoarele plante test: Chenopodium quinoa; Chenopodium

strictum; Beta vularis; Gomphrena globosa; Petunia hybrida.

La alegerea sursei de inocul au fost alese specii cu grad mare de înmulŃire vegetativă

(butăşire, altoire) având starea fitosanitară necontrolată. Unele plante provin din reŃeaua de

magazine care comercializează plante de import.

Au fost luaŃi în studiu cactuşi clorofili deficitari care trăiesc numai altoiŃi pe un

portaltoi verde. În urma altoirilor repetate, ale operaŃiunilor de înmulŃire şi reîntinerire,

aceste plante sunt predispuse la infectări cu virusuri şi micoplasme.

S-au urmărit de asemenea diferitele mutaŃii somatice, formele horticole cristate şi

monstruosa, fasciaŃii şi proliferări care datorită înmulŃirilor vegetative repetate pot genera un

grad crescut de îmbolnăviri.

S-au ales din colecŃie plante care prezentau semne de atrofiere a organelor generative,

mozaicare sau cloroză nespecifică (care nu se datorează bolilor sistemului radicular sau a

bolilor de nutriŃie).

MICROSCOPIA ELECTRONIC Ă ŞI ANALIZA NUMERIC Ă A DATELOR

ASUPRA UNOR VIROZE LA CACTU ŞII DE CULTUR Ă

În microscopia electronică s-au folosit probele de material vegetal care s-au dovedit a

fi purtătoare de particule virale în testele de infectare artificială pe cale mecanică.

În literatura de specialitate, din motive tehnice, diametrul virusurilor nu este întotdeauna

reprezentat. Astfel, ca referinŃă, putem cita diametrul următoarelor virusuri:

Virusul mozaicului tutunului 18 nm.

Cactus X virus 13 nm SAMMONS şi CHESSIN;

Cactus virus 22 nm. AMELUNXEN (1958).

Cactus virus X 13,2 nm. AMELUNXEN (1967).

Saguaro cactus virus 32 nm. MILBRATH şi NELSON (1972).

Nu avem datele măsurătorilor diametrelor de Cactus virus 2, Brandes şi Wetter

(1959) şi Zygocactus montana X Potex virus CHESSIN şi GIRI (1975).

Pe baza datelor de mai sus s-a conturat ideea de a măsura şi compara diametrul

virusurilor la următoarele specii de cactacee:

Mammillaria bocasana „Fred” (MB)

Cereus jamacaru (CJ)

Opuntia monacantha f. variegata (OMV).

Gymnocalycium mihanovichii f. mov (GMM)

Gymnocalycium mihanovichii f. vărgat (GMV)

Rebutia krainziana f. cristata ( RKC).

Echinopsis tubiflora „Haku – Jo” (ETH).

În compararea distribuŃiei numărului de organisme virale pentru fiecare pereche de

probe, s-a aplicat testul exact Fisher, care face parte din categoria testelor neparametrice

(independent de tipul de distribuŃie a datelor).

Estimarea probabilităŃii de transgresiune s-a realizat printr-o simulare Monte Carlo

bazată pe 100.000 de permutări (WESTFALL şi YOUNG 1993). Nivelul critic al

probabilităŃi de transgresiune a fost fixat la 5%.

Analiza numerică şi reprezentarea grafică a distribuŃiilor s-au efectuat cu

ajutorul programului SAS / STAT, versiunea 8.02 (SAS. Institute Inc., 2000 ).

METODĂ DE TRANSMITERE A MICOPLASMELOR PRIN ALTOIRE

În cazul virozelor, infecŃia virală poate fi transmisă prin simpla menŃinere în contact a

suprafeŃelor rănite, chiar în absenŃa creşterii. Aceasta se realizează prin tehnica altoirii

tuberculilor (MIRCEA, 1977). Astfel, cu o ştanŃă, se scoate un cilindru din Ńesutul tubercului

sănătos şi se înlocuieşte cu alt cilindru identic din Ńesutul infectat.

În cazul cactaceelor, ca sursă de plantă bolnavă (altoi), s-a folosit o specie de

Opuntia (neidentificată) cu grad ridicat de proliferare şi semne particulare evidente de formă

de mătură de vrăjitoare. Ca portaltoi s-au ales, atât reprezentanŃi ai genului Opuntia (O.

mycrodasis, O. mycrodasis f. rufida), cât şi o rudă apropiată din punct de vedere evolutiv

Austrocylindropuntia subulata. Dintre cactuşii columnari şi globulari s-au ales mai multe

specii care proveneau atât din Mexic cât şi din America de Sud: Echinocereus pectinatus, E.

subinermis, Aylostera pseudodeminuta, Eriocactus leninghausii, Trichocereus bridgesii, T.

velutina, Cleistocactus strausii, Pilosocereus sartorianus.

TEHNICA ANALIZEI DINAMICE A IMAGINILOR

APLICA łII ÎN FITOPATOLOGIE

Procesele fitopatologice sunt procese dinamice, ce evoluează în timp, cu viteze

diferite în funcŃie de diverşi factori, de regulă din mediu.

Imaginile fotografice, pot surprinde un anumit aspect fitopatologic, la un moment dat.

Analiza computerizată a unei astfel de imagini poate transforma într-o cifră,

amploarea pe care procesul fitopatologic îl are în acel moment.

Pentru a avea o imagine în dinamică a procesului fitopatologic sunt necesare

succesiuni de imagini, fiecare din ele urmând să fie analizate separat, manual sau automat.

Scopul acestui studiu este de a însuşi tehnica realizării unor astfel de succesiuni de

fotografii digitale şi două metode computerizate, una manuală (disponibilă nivelului de

amator mediu/avansat) şi una automată (pentru nivel profesionist) de analiză a imaginilor

digitale rezultate.

S-a ales ca subiect de studiu Cereus peruvianus f. monstruosa cu atac vizibil de

Phoma cereicola.

REZULTATE OB łINUTE ÎN STUDIUL BOLILOR CACTACEELOR DIN

GRĂDINA BOTANIC Ă “ALEXANDRU BORZA”, CLUJ-NAPOCA

ImportanŃa Grădinilor Botanice în Strategia globală de conservare a plantelor este

unanim recunoscută. Acestea conservă “ex situ”, în culturi în aer liber sau sere, bănci de

seminŃe şi herbare, un genofond valoros pe care îl îmbogăŃesc permanent prin schimburile pe

care le realizează.

În sere apar anumite particularităŃi cum sunt: diminuarea radiaŃiei UV, reducerea

ventilaŃiei, efectul de seră etc., iar speciile de plante vegetează în condiŃii care încearcă să

imite condiŃiile fizico-chimice din natură.

Prezentul studiu s-a axat pe colecŃia de cactacee a Grădinii Botanice din Cluj-

Napoca şi a realizat în premieră evaluarea stării de sănătate a unei astfel de colecŃii ,

principalele boli identificate, ca şi intensitatea şi gradul atacului produs asupra diverselor

tipuri de organe ale cactuşilor, fiind cercetate în corelaŃie cu particularităŃile condiŃiilor de

mediu impuse de cultura într-un astfel de spaŃiu protejat.

ColecŃia de cactacee a Grădinii Botanice Cluj-Napoca însumează 94 de genuri din

totalul celor 241 recunoscute după sistemul Backeberg şi prezintă importanŃă prin:

diversitatea speciilor pe care le deŃine, materialul vegetal (butaşi, seminŃe) pe care îl

furnizează pentru schimburile pe care aceasta le realizează cu aproximativ 500 de instituŃii

similare.

Cu ocazia inventarierii şi sistematizării colecŃiei în vederea monitorizării eficiente a

părŃii experimentale a studiului, au fost verificate 4069 plante, din care 126 au fost uscate.

Din cele rămase, în număr de 3943, s-au ales pentru studiu 15 genuri (2884 taxoni)

reprezentaŃi fiecare în colecŃie de un număr de indivizi mai mare de 49.

Scopul studiului a fost evaluarea stării de sănătate şi identificarea principalelor boli

din colecŃia de cactuşi sus-amintită, elaborarea unor recomandări specifice de combatere şi

tratament a acestora şi identificarea unor viitoare direcŃii de cercetare, menite să aprofundeze

şi să clarifice unele aspecte încă neelucidate.

Astfel, studiul s-a bazat atât pe o amănunŃită documentare bibliografică, cât şi pe

partea experimentală, în care, utilizarea metodelor clasice sau îmbunătăŃirea acestora, a avut

în vedere identificarea principalelor categorii de agenŃi patogeni care provoacă îmbolnăviri

speciilor de cactuşi.

Documentarea bibliografică care a cuprins un interval de timp de la începutul

secolului XX până în prezent, şi 362 de lucrări (articole, cărŃi), a evidenŃiat stadiul actual al

cunoştinŃelor în domeniu, a lămurit unele aspecte nomenclaturale şi, prin datele furnizate, a

permis realizarea în cadrul studiului a unor comparaŃii ale stării de sănătate a speciilor de

cactacee spontane sau cultivate cu cele din colecŃia Grădinii Botanice.

Partea experimentală a avut în vedere următoarele: investigarea parametrilor

climatici ai serei, identificarea principalelor categorii de agenŃi patogeni care provoacă

îmbolnăvirea speciilor de cactacee din serele grădinii botanice, intensitatea şi gradul atacului

produs de aceşti agenŃi patogeni asupra rădăcinilor, respectiv tulpinilor diverselor specii de

cactuşi, evidenŃierea particularităŃilor morfologice ale unor agenŃi patogeni, efectul inducerii

artificiale a unor micoplasme precum şi al aplicării unor tratamente chimice.

Studiul efectuat a dus la identificarea unui număr de peste 40 de microorganisme

asociate cu cactaceele din colecŃie dintre care amintim: Aspergillus niger, Botryosphaeria

sp., Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum sp.,

Coniothyrium opuntiae, Erwinia carotovora, Fusarium oxysporum, Gloeosporium sp.,

Macrophoma sp., Mycoplasma sp., Mucor sp., Mycosphaerella sp., Penicillium sp., Phoma

cereicola, P. lingam, P, solitaria, Phoma sp., Phomopsis sp., Phyllosticta sp., Phyllosticta

concava, Phytophthora sp., Pseudomonas sp., Pythium sp., Rhizopus stolonifer, Sclerotium

sp., Septoria sp., Stagonospora sp., Trichoderma viride, Trichotecium roseum, Ulocladium

sp., Verticillium albo-atrum. PrezenŃa unui număr de aproximativ 5 tipuri de virusuri s-a

putut estima pe baza distribuŃiei diametrelor măsurate la aceste entităŃi. S-au mai identificat,

de asemenea, două cazuri de infecŃii multiple cauzate de micoplasmă asociată cu virus.

Investigarea colecŃiei de cactacee realizată cu ocazia prezentului studiu nu a evidenŃiat

prezenŃa bacteriozelor.

Apreciem că microorganismele amintite se instalează, în principal, odată cu seminŃele

şi butaşii primi Ńi în schimburile realizate şi se propagă ca urmare a aplicării unor tehnici de

cultură necorespunzătoare. Cu toate acestea, studiul a pus în evidenŃă o colecŃie relativ

sănătoasă, chiar comparativ cu situaŃia din natură (Mexic), subliniind, în plus, importanŃa

grădinilor botanice în păstrarea unui material vegetal valoros.

Pentru agenŃii patogeni identificaŃi s-a realizat şi evidenŃierea prin microscopie

(optică sau electronică) a particularit ătilor morfologice ale acestora. În acest sens, ca

rezultat al prezentului studiu s-a constituit o bază de date a organismelor saprofite şi

patogene care numără în prezent 6300 de fotografii executate la microscopul optic şi peste

1100 imagini de microscopie electronică.

Cu ajutorul tehnicii analizei dinamice a imaginilor (tehnică pusă la punct cu ocazia

prezentului studiu) s-au generat de asemenea, imagini care evidenŃiază evoluŃia unor

suprafeŃe afectate de diverşi agenŃi patogeni. Acestea, împreună cu 28 de tabele, un

număr de 32 figuri şi 20 anexe color constituie partea ilustrativă a prezentei teze.

Exemplu din cadrul de animaŃie

Studiul realizat a urmărit să evidenŃieze şi intensitatea şi gradul de atac produs

de către principalii agenŃi patogeni identificaŃi, atât pe rădăcini cât şi pe tulpini . În

acest sens, s-a efectuat o evaluare preliminară a stării de sănătate a cactaceelor din colecŃie,

care a arătat faptul că, în comparaŃie cu tulpinile celor mai bine reprezentate specii de

cactacee, sistemul lor radicular este mult mai afectat. Astfel, din cele 15 genuri, la 6 genuri:

Astrophytum, Aylostera, Echinocerus, Notocactus, Rebutia, Weingartia gradul de atac al

rădăcinii (evaluat prin scara de notare James (1971) citat De la Torre (1978)) a atins nota 2

(cu suprafaŃa afectată în proporŃie de 26-50%). Cea mai mare intensitate a atacului a fost

semnalată la genul Echinocereus (47,24%), în timp ce aceasta a fost de 36,34% pentru

Aylostera, 37,46% pentru Echinocereus, 37,83% pentru Rebutia; 33,37% Weingartia. Ca

manifestări ale diversilor agenŃi patogeni amintim: putregaiul uscat sau veştejirea fusariană

cauzat de mai multe linii de Fusarium oxysporum cu o patogenitate diferită; putregaiul sau

căderea plantulelor cauzat de Pythium sp. şi P. irregulare; mana de rădăcină Phytophthora

parasitica şi mana sau putregaiul bazei tulpinii cactaceelor provocat de Phytophthora

cactorum; rizoctonioza cactaceelor provocată de Rhizoctonia solani; verticilioza provocată

de Verticilium albo-atrum.

În ceea ce priveşte starea de sănătate a tulpinilor, din cele 15 genuri care sunt cele mai

bine reprezentate în colecŃie, doar într-un singur caz, la genul Cleistocactus, a fost semnalată

intensitatea atacului de gradul 2, în timp ce genurile: Cereus, Mammillaria, Eriocactus,

Lobivia, Pilosocereus sunt cele mai sănătoase şi echilibrate. Genul Rebutia s-a dovedit a fi

cel mai rezistent faŃă de atacul agenŃilor patogeni.

Diametrul particulelor virale, măsurat prin tehnicile microscopiei electronice, se

grupează în jurul valorilor de 9nm; 13nm; 15nm; ,18nm; 22nm; 32 nm putând fi asociate cu

viroze cunoscute ca: 13nm SAMMONS şi CHESSIN (1961); 13,2nm AMELUNXEN

(1967); 18nm mozaicul tutunului, 22 nm AMELUNXEN (1958); 32 nm MILBRATH şi

NELSON (1972).

DistribuŃia organismelor virale pe clase de diametre pentru proba MB

SăgeŃile indică limita aproximativă dintre distribuŃiile corespunzătoare tipurilor de viruşi.

Virusul de 9,4 nm nedescris până în prezent este cel mai subŃire dintre virusurile

măsurate şi a fost observabil într-un singur caz la Mammillaria bocasana “Fred” în asociere

cu o micoplasmă. Virusul de 15 nm a fost detectat în Cereus jamacaru, Opuntia monacantha

f. variegata, Gymnocalycium mihanovchii f. mov, G. mihanovchii f. vărgat, Rebutia

krainziana f. cristata.

În vederea realizării unui studiu cât mai complex al bolilor virale la cactuşi, având în

vedere prezenŃa singulară a virsului de 15 nm la Cereus jamacaru, propunem şi intenŃionăm

realizarea unor investigaŃii virologice la această plantă.

Prin producerea artificial ă, pe cale mecanică a unor infecŃii , din 32 de probe

presupuse a fi virulifere, s-au dovedit a fi pozitive 16 care au prezentat necroze locale, 7 au

fost cu semne de cloroză, 6 probe au fost negative, iar în trei cazuri materialul nu a putut fi

diagnosticat. Dat fiind faptul că Chenoodium quinoa răspunde prin simptome mult mai clare

la infecŃiile provenite de la virusurile cactaceelor, propunem folosirea acestei specii

preferenŃial faŃă de C. strictum.

Prin metoda de transmitere a micoplasmelor prin altoire, după o perioadă de

incubaŃie de 3-4 luni s-au obŃinut plante infectate artificial. Au reacŃionat pozitiv speciile de

Austrocylindroputia subulata, Opuntia microdasis, O. microdasis f. rufida şi Eriocactus

leninghausii. Prin infectarea mai multor specii, în unele cazuri altoiul a rămas în viaŃă, iar

apariŃia simptomelor infecŃiei nu a avut loc nici după mai mulŃi ani, fenomen care se

datorează, presupunem, rezistenŃei la acest agent. S-a mai constatat că viteza de propagare a

micoplasmei în planta gazdă diferă în funcŃie de locul de inoculare.

Originea patogenă a formelor „cristata” şi „monstruosa” nu a putut fi demonstrată,

dar s-a demonstrat că micoplasmele provoacă fasciaŃia în formă de „mătură de vrăjitoare”,

impropriu denumită forma „monstruosa”, motiv pentru care propunem realizarea delimitării

clare a acestora şi eventual atribuirea denumirii „prolifera”.

Etapele altoirii segmentului bolnav de Opuntia pe Eriocactus sănătos şi rezultatul final: proliferare datorată prezenŃei micoplasmei în Eriocactus după doi ani de la altoire.

Pentru a avea o imagine cât mai clară a condiŃiilor climatice pe care sera de cactuşi le

oferă au fost înregistrate pe o perioadă de timp, de circa trei ani temperatura şi

umiditatea. Datele au fost prelucrate şi analizate în dinamica lor diurnă şi sezonieră. Astfel,

temperatura medie anuală este de 23,68°C, aceasta fiind cu aproximativ 10,5°C mai ridicată

decât optimul necesar. În lunile de iarnă, temperaturile maxime în zilele însorite depăşesc

valorile optime de iernare a cactaceelor cu cel puŃin 10°C, iar în perioada verii s-a remarcat

depăşirea pragului maxim optim (35°C), înregistrându-se temperaturi de peste 40°C.

Valorile medii lunare anuale în comparaŃie cu temperaturile optime necesare culturii cactaceelor.

În timpul iernii, temperaturile ridicate favorizează apariŃia bolilor şi a dăunătorilor, în

timp ce scăderea temperaturii corelată cu lipsa udării favorizează o iernare optimă a

majorităŃii cactaceelor. Pentru a facilita iernarea plantelor în timpul perioadei de repaus

(decembrie, ianuarie, februarie) temperatura optimă pentru majoritatea cactaceelor (70,88%

dintre specii) ar trebui menŃinută între 5-15°C.

În perioada zilelor toride de vară, în cazul în care temperaturile în timpul nopŃii

depăşesc 20°C, cactuşii intră în repausul de vară. Cactuşii în general răspund favorabil

variaŃiilor diurne de temperatură care conferă călirea şi fortificarea acestora, în lunile în care

temperaturile nu depăşesc 35°C în timpul zilei, iar noaptea scad sub 20°C înregistrându-se

creşteri ale acestora.

Mediile lunare ale umidităŃii aerului în sera cactaceelor înregistrează valori cuprinse

între 30-47% (valori normale pentru spaŃiile acoperite), cu scăderi de 10% sau sub 10% în

perioada lunilor foarte călduroase de vară. Valori scăzute ale umidităŃii aerului sunt

înregistrate de asemenea în lunile de iarnă. InfecŃiile deja instalate în prezenŃa umidităŃii

scăzute a aerului, dar la temperaturi optime au o creştere endogenă folosind rezervele de apă

ale Ńesutului suculent. Din această cauză este foarte important, ca pe lângă scăderea

temperaturii mediului de iernare, aceasta să fie corelată cu sistarea udărilor.

Studiul rolului temperaturii şi umidităŃii relative în cultivarea diverşilor taxoni de

cactuşi din serele Grădinii Botanice „Alexandru Borza”, arată influenŃa decisivă a acestor

factori, asupra stării de sănătate şi de infecŃie patogenă a plantelor din familia Cactaceae.

Apreciem că este necesară cunoaşterea exactă a cerinŃelor de mediu pentru cactuşii cultivaŃi

şi aplicarea specifică, pentru fiecare taxon, a tehnologiilor şi metodelor celor mai adecvate

pentru creşterea şi dezvoltarea acestuia. Apreciem de asemenea, că se impune o specializare

a colecŃiei, prin introducerea în cultură, mai ales, a taxonilor care răspund favorabil

condiŃiilor de microclimă existente.

Cu toate imperfecŃiunile unei sere neautomatizate, observaŃiile noastre au arătat faptul

că sera de cultivare a cactaceelor a dispus de condiŃii favorabile, cu atât mai mult cu cât

numărul mare de taxoni (genuri, specii) ar fi pretins o diferenŃiere mai accentuată în

asigurarea parametrilor climatici. În sprijinul acestei afirmaŃii stau şi datele culese din

literatură cu privire la observaŃiile climatice din natură care indică o vulnerabilitate mai mare

a speciilor spontane în comparaŃie cu situaŃia din seră.

Pe baza tuturor datelor culese şi prelucrate, vis-à-vis de starea de sănătate a cactuşilor

din colecŃie, în teză se fac şi o serie de recomandări privind cultivarea acestora astfel

încât să se evite la maximum posibil infectarea plantelor. Astfel, se recomandă altoirea

speciilor sensibile pe portaltoi rezistenŃi, lipsiŃi de viroze, ca şi sistarea propagării de plante

purtătoare de particule virale.

Ca direcŃii de cercetare viitoare se intenŃionează completarea datelor obŃinute cu

date noi, rezultate prin compararea materialului din seră cu material spontan, obŃinut din mai

multe locuri de origine şi publicarea acestora într-o carte de specialitate, resimŃindu-se în

prezent lipsa de pe piaŃă a unui astfel de material.

Ing. György FESZT

SUMMARY of the PhD THESIS

Contributions regarding the study of physiopathies and pathophytoses of cacti collection from

Botanical Garden Cluj-Napoca

Scientific coordinator:

Prof.univ.dr.doc. Ioan BOBEŞ

CLUJ-NAPOCA 2009

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND

VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA

FACULTY OF

AGRICULTURE

MATERIALS AND METHODS USED IN THE STUDY OF CACTI DI SEASES FROM „ALEXANDRU BORZA” BOTANICAL GARDEN, CLUJ-NAPOC A

PROPOSED OBJECTIVES FOR THE EXPERIMENTAL PART OF TH E PH.D. THESIS

1. Analysis of the pathogenic agents and diseases of the cacti collection from the

Botanical Garden of Cluj – Napoca, and health assessment of the collection.

2. Development of specific analysis methods for the early and exact diagnosis of

the reserve of pathogenic agents (optical microscopy, electronic microscopy).

3. Preparation of the method for the dynamic analysis of digital images, in the

study of the pathogenesis of certain cacti diseases.

4. Biostatistical study of evolution analysis and the spreading of some pathogenic

agents in the cacti collection of the Botanical Garden from Cluj – Napoca.

5. Setting up of a data base concerning the risk of occurrence, evolution and

spreading of the pathogenic agents in the cacti collection, on a given surface.

6. Microclimatic study of the greenhouse to track down both the abiotic factors

causing physiopathies, and the optimization of the environmental conditions, favourable for

endangered or disappearing groups of plants.

7. Preparation of generalized fighting strategies for the cacti collection of the

Botanical Garden from Cluj – Napoca.

8. Examination of the pathogenic or non-pathogenic origin of the teratologic forms

(monstruosa, cristata) of the species in the collection.

9. Setting up a phytosanitary healthy collection, which should function as a real

gene bank in order to create national collections.

MICROCLIMATIC STUDY OF THE CACTI GREENHOUSE IN THE BOTANICAL GARDEN FROM CLUJ – NAPOCA

We registered data concerning the microclimate of the greenhouse by means of

RHYTHM digital thermometer and humidity meter. This device is equipped with sensors for

the registration of the relative humidity of air between 10 and 95%, of temperature, by

means of two sensors, one on the soil, included in the device, and an extension, which

measures the temperature at the superior level of the greenhouse.

The device showed the present temperature and humidity and the maximum and

minimum temperatures registered since the last memory erasing. We read the temperatures

every day and registered them in special notebooks. The hour for temperature reading

remained the same, namely the winter hour 13 ½ was 14 ½ in the summer. We registered the

hour for the reading of the temperature, then the data on the thermometer (temperature,

humidity), minimum – maximum humidity of air, minimum – maximum temperature.

ORGANIZATION AND HEALTH EVALUATION OF THE CACTI COL LECTION

We made the inventory when we moved the cacti, in their resting period. We moved

them for four months, as from 2004 November 4th until 2005 March 4th.

We verified each plant separately, and the data were registered in a table. When we

handle the plants, we need to be very careful, so that the workers do not change the labels by

mistake.

After making the observations, we identified the suspect plants that would be studied

in the laboratory. Thus, we chose plants that

• presented mosaic-like symptoms;

• uncontrolled imported plants;

• cacti that deviate from their normal form, colour or aspect: unspecific

discolorations, witch’s broomstick form, fasciation, cristata forms, monstrousa forms, spiral

growth, deformation of the flowers, etc.

We cut the plants that presented putrefaction signs in two equal parts that contained

both healthy and affected parts. One piece was put non-sterilized into a medicinal use

biological sample recipient of 100 ml. The recipients were sterilized with sodium

hypochlorite, of 10% concentration. The non-sterilized tissues followed the natural

decomposition phase, without any modification of the existing microflora on the plant.

The other piece was sterilized by repeated disinfection washings.

METHODS FOR THE EVALUATION OF THE ATTACK CAUSED BY

PHYTOPATHOGENIC AGENTS IN THE CACTI COLLECTIONS

In order to compare the health of the cacti from the Botanical Garden Cluj – Napoca

with the situation in nature, with the situation at the cacti place of origin, respectively, we

used a notation scale for the intensity of the attack indicated by JAMES (1071), quoted by

DE LA TORRE (1998).

DE LA TORRE (1998) studied ten cacti from Zapotitlan de las Salinas region, of

Puebla State, Mexico.

In the health evaluation of the cacti collection, we may also calculate the attack

frequency, intensity and degree on various genera or even species. These may be calculated

both for the root surface and also for the stem.

EXPERIMENTAL TRANSMISSION OF VIRUSES IN MECHANICAL WAY

We selected the following test plants: Chenopodium quinoa; Chenopodium strictum;

Beta vularis; Gomphrena globosa; Petunia hybrida.

When we selected the inoculation source, we chose species with a high degree of

vegetative reproduction (slipping, grafting), with uncontrolled phytosanitary state. Some

plants come from the stores that commercialize imported plants.

We studied deficit chlorophyll cacti that live only grafted on a green parent stock.

After repeated grafts, reproduction and maintenance operations, these plants are prone to

infection with viruses and mycoplasma.

We also observed the various somatic mutations, cristata and monstruosa horticultural

forms, fasciations and proliferations that due to repeated vegetative multiplications may

generate an increased degree of sickening.

Of the whole collection, we chose plants that presented atrophy of generative organs,

mosaic or non-specific chlorosis (which are not due to the root system diseases or nutrition

diseases).

ELECTRONIC MICROSCOPY AND NUMERICAL ANALYSIS OF DAT A

ON SOME VIROSES IN CULTIVATED CACTI

We used samples of vegetal material in electronic microscopy, which, in the

mechanical artificial infection test, proved to be bearing of viral particles.

Literature does not always present the diameter of viruses, because of technical reasons:

Tobacco mosaic virus 18 nm.

Cactus X virus 13 nm SAMMONS & CHESSIN;

Cactus virus 22 nm. AMELUNXEN (1958).

Cactus virus X 13,2 nm. AMELUNXEN (1967).

Saguaro cactus virus 32 nm. MILBRATH & NELSON (1972).

We do not have the data of the diameter measurements of the Cactus virus 2,

BRANDES & WETTER (1959) and Zygocactus montana X Potex virus CHESSIN & GIRI

(1975).

Based on the above-mentioned data, we had the idea of measuring and comparing the

diameter of viruses for the following cacti species:

Mammillaria bocasana „Fred” (MB)

Cereus jamacaru (CJ)

Opuntia monacantha f. variegata (OMV).

Gymnocalycium mihanovichii f. mauve (GMM)

Gymnocalycium mihanovichii f. striped (GMV)

Rebutia krainziana f. cristata ( RKC).

Echinopsis tubiflora „Haku – Jo” (ETH).

Comparing the distribution of the number of viral organisms for each pair of samples,

we applied the Fisher test, which is a part of the non-parametric tests (independent of the

data distribution).

The evaluation of the transgression probability was made by a Monte Carlo

simulation based on 100.000 permutations (WESTFALL and YOUNG 1993). The critical

level of the transgression probabilities was fixed to 5%.

The numerical analysis and graph representation of the distributions were made by

means of SAS / STAT program, version 8.02 (SAS Institute Inc., 2000).

MYCOPLASMA TRANSMISSION BY GRAFTING

In the case of virosis, the viral infection may be transmitted by the contact with the

injured areas, even in the absence of growth. This is made by the technique of tuber grafting

(MIRCEA, 1977). Thus, with a puncher, we take out a cylinder from the tissue of the

healthy tuber and replaced it with an identical cylinder of the infected tissue.

In the case of cacti, as a source of diseased plant (graft) we used a species of Opuntia

(unidentified) with a high degree of proliferation and evident particular signs in the form of

witch’s broomstick. As parent stock, we chose representatives of the genus Opuntia (O.

mycrodasis, O. mycrodasis f. rufida) and a close relative from an evolutionist point of view,

namely Austrocylindropuntia subulata. Of the column and globular cacti, we chose several

species that come from Mexic and South America: Echinocereus pectinatus, E. subinermis,

Aylostera pseudodeminuta, Eriocactus leninghausii, Trichocereus bridgesii, T. velutina,

Cleistocactus strausii, Pilosocereus sartorianus.

THE TECHNIQUE OF DYNAMIC ANALYSIS OF THE IMAGES APP LIED IN

PHYTOPATHOLOGY

The phytopathological processes are dynamic processes that develop at different rates

in time, according to various factors, usually found in the environment.

The images may present a certain phytopathologic aspect, at a given moment.

The computerized analysis of such an image may transform in a number the

proportion of the phytopathologic process nowadays.

To obtain a dynamic image of the phytopathologic process, we need a succession of

images, each being analysed separately, manually and automatically.

The purpose of this study is to appropriate the technique of achieving such

successions of digital photos and two computerized methods, one manual method (available

at the level of medium amateur / advanced) and one automatic method (for professional

level) for the analysis of the resulted digital images.

The subject of study was Cereus peruvianus f. monstruosa visibly attacked by Phoma

cereicola.

RESULTS OBTAINED IN THE STUDY OF CACTACEE DISEASES FROM

“ALEXANDRU BORZA” BOTANICAL GARDEN, CLUJ-NAPOCA

It is well known the importance of Botanical Gardens in The Global Strategy for

Plant Conservation. They conserve “ex situ”, in open-air or greenhouses, seed banks and

herbaria, a valuable gene fund which they permanently enrich by exchanges with similar

institutions.

In greenhouses there are some particularities such as diminution of UV radiation,

reduction of ventilation, greenhouse effect, etc., therefore the plant species vegetate in

conditions that simulates the natural physicochemical conditions.

The present study focuses on the cacti collection from the Botanical Garden of

Cluj-Napoca and evaluates, for the first time, the phytosanitary status of such a

collection, the main diseases and the attack’s intensity and degree on different cacti organs,

all these being correlated with the particularities of environmental conditions in a covered

area.

The cacti collection from the Botanical Garden of Cluj-Napoca has 94 genera of the

known 241 by Bakeberg system and is important because of the species diversity and the

offered plant material (seedlings, seeds) for exchanges with other 500 similar institutions.

4069 plants were verified, 126 of which were dried, on the occasion of inventory and

systematization of the collection for the efficient management of the experimental part of the

study. 15 genera (2884 taxa) represented each in the collection by more than 49 individuals

were chosen from the remained 3943 plants.

The purpose of the study was to evaluate the phytosanitary status and to identify the

main diseases in the above-mentioned cacti collection, as well as to draw up some specific

recommendations for their control and treatment, and to identify some future research trends

for thoroughly study and elucidation of some unclear aspects.

Thus, the study relies on a detailed bibliographic documentation as well as on the

experimental part, where the use of classical or improved methods allowed for the

identification of the main pathogens that cause diseases on cacti.

The bibliographic documentation includes papers from the beginning of the XXth

century until present and 361 works (articles, books), which underlines the actual knowledge

in the field, makes clear some nomenclatural aspects and, by provided information, allows

the comparison of the phytosanitary status of wild cacti species to those from the Botanical

Garden’s collection.

The experimental part focused on the investigation of greenhouse’s climatic

parameters, the identification of the main pathogenic agents that cause diseases to cacti from

the botanical garden’s greenhouses, the intensity and degree of the attack caused by these

pathogenic agents on roots and stems of different cacti species, the emphasis of the

morphological particularities of some pathogenic agents, the effect of artificial inducing of

some mycoplasmas, as well as applying some chemical treatments.

The present study made possible the identification of over 40 microorganisms species

associated with cacti collection, among we mention: Aspergillus niger, Botryosphaeria spp.,

Phyllosticta spp., Phyllosticta concava, Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum,

Colletotrichum acutatum, Colletotrichum spp., Coniothyrium opuntiae, Erwinia carotovora,

Fusarium oxysporum, Gloeosporium spp., Macrophoma spp., Mycoplasma spp., Mucor spp.,

Mycosphaerella spp., Penicillium spp., Phoma cereicola, P. lingam, P, solitaria, Phoma

spp., Phomopsis spp., Phytophtora spp., Pseudomonas spp., Pythium spp., Rhizopus

stolonifer, Sclerotium spp., Septoria spp., Stagonospora spp., Trichoderma viride,

Trichotecium roseum, Ulocladium spp., Verticillium albo-atrum. Five virus types were

identified on the basis of their diameters. There were also identified two cases of multiple

infections caused by mycoplasma associated with virus. The checking up of cacti collection

didn’t emphasize any bacterial infection.

We believe that the above mentioned microorganisms mainly set in with seeds and

seedlings from the exchanges and spread because of inadequate cultivation techniques. In

spite of all, the study emphasized a quite healthy cacti collection, even as compared to the

natural conditions (Mexico), underlining once more the importance of botanical gardens in

conserving a valuable plant material.

The morphological particularities of the identified pathogenic agents were

emphasized by means of microscopy (optic and electronic). This way, as a result of the

present study, there was made up a data base for saprophytic and pathogenic organisms

which counts up to 6300 optical microscopy photos and over 1100 electronic micrographs.

Illustration with animation framework

By means of images dynamic analysis technique (improved in the present study),

there were obtained images that emphasize the evolution of the affected surface by different

pathogens. These, along with 28 tables, 32 figures and 20 color annexes make up the

illustrative part of the present thesis.

The study also focused on emphasizing the intensity and degree of the attack caused

by the main identified pathogenic agents, on roots as well as on stems. Therefore, a

preliminary estimation of the cacti collection phytosanitary status was done, which showed

that their roots were more affected than the stems. Thus, among the 15 genera, to 6

(Astrophytum, Aylostera, Echinocerus, Notocactus, Rebutia, Weingartia) root’s degree of

attack (estimated by James (1971) scale cited by De la Torre (1978)) was of 2 (with the

affected surface of 26-50 %). The highest intensity of attack was recorded for Echinocereus

(47.24 %), while it was 36.34 % for Aylostera, 37.46 % for Echinocereus, 37.83 % for

Rebutia, and 33.37 % for Weingartia. Among the diseases caused by different pathogenic

agents we mention: dry rot or fusarian wilt caused by numerous Fusarium oxysporum strains

with different pathogenicity; rot or damping-off caused by Pythium spp. and P. irregulare;

root rot caused by Phytophthora parasitica and rot of cacti lower stems caused by

Phytophthora cactorum; cacti root and stem rot or canker caused by Rhizoctonia solani; wilt

caused by Verticillium albo-atrum.

Regarding stems phytosanitary status, among the 15 well represented genera in the

collection, the attack intensity was 2 only for Cleistocactus, while Cereus, Mammillaria,

Eriocactus, Lobivia, Pilosocereus were the healthiest. Rebutia genus proved to be the most

resistant to pathogenic agents attack.

The diameter of viral particles, measured by means of electronic microscopy, is of 9

nm; 13 nm; 15nm; 18 nm; 22nm; 32 nm and may be associated with viroses like 13 nm

SAMMONS and CHESSIN (1961); 13.2 nm AMELUNXEN (1967); 18 nm tobacco mosaic

virus (TMV); 22 nm AMELUNXEN (1958); 32 nm MILBRATH and NELSON (1972).

Distribution of viral particles on diameter classes for MB sample The arrows indicate the aproximally limit according with types of virus

The 9.4 nm virus not described yet is the thinnest of all the measured viruses and was

observed only in Mammillaria bocasana “Fred” associated with a mycoplasma. The 15 nm

virus was detected in Cereus jamacaru, Opuntia monacantha f. variegata, Gymnocalycium

mihanovchii f. mauve, G. mihanovchii f. striped, Rebutia krainziana f. cristata.

Considering a complex study of viral diseases in cacti and because of the unique

presence of 15 nm virus in Cereus jamacaru, we intend to make further virological

investigations on this plant.

By mechanical obtained artificial infections, among the 32 supposed virulent

samples only 16 proved to be positive and presented local necroses, while 7 had chlorosis, 6

were negative and 3 were not diagnosable. Because Chenoodium quinoa is more sensitive

and presents more clear symptoms of infections from cacti viruses, we propose the use of

this species instead of C. strictum.

There were obtained artificial infected plants by grafting transmission technique of

mycoplasmas, after 3-4 months of incubation. The sensitive species were

Austrocylindroputia subulata, Opuntia microdasis, O. microdasis f. rufida, and Eriocactus

leninghausii. By infection of numerous species, in some cases the graft remained alive and

the infection symptoms didn’t appear even after many years, and we suppose this is due to

the resistance to this pathogen. There was also recorded that the propagation speed of

mycoplasma in the host plant differs according to the inoculation point.

Stages of diseased segment grafting of Opuntia on healthy Eriocactus and the final result: proliferation and presence of mycoplasma in Eriocactus after two years since the moment of

grafting

The pathogenic origin of “cristata” and “monstruosa” formae could not be proved,

but there is evidence that mycoplasmas cause “the broom witch” improper called

“monstruosa” form, therefore we propose the clear delimitation of these and possible

appropriation of “prolifera” denomination.

The temperature and humidity were recorded during 3 years in order to have

clearer information of the climatic conditions that the cacti greenhouse offers. The data were

processed and analyzed in the daily and seasonal dynamics. Thus, the yearly medium

temperature is 23.68°C, being with approximately 10.5°C higher than the needed optimum.

The maximum temperatures in sunny days overpass the cacti hibernation optimum values

with at least 10°C, during winter months, and the optimum limit (35°C) during summer is

also surpassed by recorded temperatures of over 40°C.

Average monthly yearly values comparing to the optimum temperatures neccesary in cacti cultivation

The high temperatures during winter favor the diseases and pests, while low

temperatures correlated with lack of humidity lead to the optimum hibernation of the most

cacti species. The optimum temperature for the most cacti species (70.88 %) should be

maintained between 5-15°C, for favoring plant hibernation during the resting period

(December, January, February).

If temperatures during night are over 20°C, cacti will enter the summer resting

period, in hot summer days. Generally, cacti are sensitive to daily variations of temperature,

which cause their invigoration recorded as vegetative growth, when the temperatures don’t

go higher than 35°C.

The average of monthly air humidity in cacti greenhouse is between 30-47 % (normal

values for protected areas), with decreases of 10 % or less, during hot summer months. Low

values of air humidity are also recorded during winter months. The existing infections have

an endogenous development by using the succulent tissue’s water reserves, in the presence

of low air humidity and optimum temperatures. That is why it is very important to correlate

the environmental low hibernation temperature to the lack of watering.

The study of the role of temperature and relative humidity in cacti cultivation form

“Alexandru Borza” Botanical Garden greenhouses show the important influence that these

parameters have on the phytosanitary status of Cactaceae species. We consider that it is

necessary to know the environmental needs for the cultivated cacti and to specifically apply

the most adequate methods and technologies for the growth and development of each taxon.

We also believe that there is need of a specialized cacti collection by mostly introducing

sensitive taxa to the existing microclimatic conditions.

With all the lacks of a non-automatized greenhouse, our experimental observations

showed that cacti greenhouse had favorable conditions although the numerous taxa (genera,

species) would need a better differentiation of the climatic parameters. This affirmation is

also sustained by the literature data regarding the natural climatic observations, which show

a great vulnerability of wild species compared to the cultivated ones.

On the basis of all collected and processed data, regarding the phytosanitary status of

cacti collection, the thesis makes some recommendations regarding cacti cultivation to

avoid as much as possible the infection of plants. Thus, the grafting of sensitive plants on

resistant and lack of viroses parent stocks is recommended, as well as stopping the

multiplication of virus carrying plants.

As future research targets, we intend to complete our data with new ones, resulted

by comparing the cultivated plant material with the wild one, obtained from the origin areas

as well as their publication in a specialty book, which is presently missing.