rezumat teza petrescu marian

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007- 2013

Investete n oameni!

Universitatea de Vest Vasile Goldi din Arad

Conductor de doctorat,

Prof. univ. dr. DANIELA BRATOSIN

Doctorand,

PETRESCU

CONSTANTIN-MARIAN

- Arad-

2013

REZUMAT TEZ DE DOCTORAT

EVALUAREA ECOTOXICOLOGIC COMPARATIV

CU MICROALGE A IMPACTULUI POLUANT ASUPRA

MEDIULUI ACVATIC. APLICAII N

BIOMONITORIZAREA MEDIULUI, CONTROLUL

SIGURANEI I SECURITII ALIMENTELOR

OBINUTE DIN ECOSISTEME SUPUSE IMPACTULUI

ANTROPIC

CUPRINS

INTRODUCERE

PARTEA I- GENERALITI

CAPITOLUL 1.

POLUAREA ACVATIC - O PREOCUPARE GLOBAL. PRINCIPALELE CATEGORII

DE POLUANI

1.1. CONSIDERAII GENERALE PRIVIND POLUAREA

1.2. PRINCIPALELE CATEGORII DE POLUANI I COMPORTAMENTUL DINAMIC

AL POLUANILOR

1.2.1. Pesticidele

1.2.2. Metalele grele

1.2.3. Radionuclizii

1.2.4. Substanele petroliere

1.2.5. Azotaii i fosfaii

1.2.6. Poluarea termic

1.2.7. Poluarea cu suspensii

1.2.8. Poluarea apelor de suprafa

1.2.9. Poluarea apelor subterane

1.3. BIOMONITORIZAREA APELOR

1.4. BIOACUMULAREA I BIOAMPLIFICAREA POLUANILOR

CAPITOLUL 2.

TENDINE MODERNE N TOXI- I ECOTOXICOLOGIA MOLECULAR.

UTILIZAREA DE TESTE CELULARE I BIOMARKERI

2.1. DEFINIREA NOIUNII DE BIOMARKERI

2.2. DESCRIEREA DIFERITELOR TIPURI DE BIOMARKERI I ROLURILE

BIOLOGICE ALE BIOMARKERILOR

2.3. FUNDAMENTELE BIOLOGICE ALE UTILIZRII BIOMARKERILOR N

ECOTOXICOLOGIE I UTILIZAREA LOR PENTRU SUPRAVEGHEREA

MEDIULUI NCONJURTOR

2.3.1. Evaluarea riscului integrat i biomarkeri

2.3.2. Poluarea marin, organismele marine i biomarkeri

2.3.2.1. Biomarkeri moleculari

2.3.2.1.1. Enzime antioxidante de aprare

2.3.2.1.2. Citocromul P4501A (CYP1A) de inducie (n principal, hepatic)

2.3.2.1.3. Inhibarea acetilcolinesterazei (AChE)

2.3.2.1.4. Metalotioneinele (MT)

2.3.2.1.5. Stabilitatea lizozomal

CAPITOLUL 3.

BIOTESTELE PE BAZ DE ALGE UNICELULARE - UN INSTRUMENT UTIL DE

GESTIONARE A APELOR

3.1. NOIUNI GENERALE DESPRE ALGE UNICELULARE. APLICAII ALE

ALGELOR UNICELULARE N TOXICOLOGIE I ECOTOXICOLOGIE

3.2. BIOMARKERI BIOCHIMICI N ALGE

3.2.1. Sisteme de eliminare a xenobioticelor

3.3. PROTEINE DE STRES IN ALGE

3.3.1. Mecanismele de aprare mpotriva stresului oxidativ

3.3.2. Agenii chelatori - un rspuns al algelor la metalele grele

3.4. PRINCIPIUL TESTELOR PE BAZ DE ALGE UNICELULARE I METODELE DE

EVALUARE ALE ACESTORA

CAPITOLUL 4

IMPORTANA BIOTESTELOR ECOTOXICOLOGICE N CONTEXTUL ACTUAL AL

ECOECONOMIEI I BIOECONOMIEI PENTRU SECURITATEA I SIGURANA

ALIMENTELOR I FURAJELOR DIN ECOSISTEME ANTROPICE

4.1. SECURITATEA ALIMENTAR I A FURAJELOR

4.2. SIGURANA ALIMENTAR I ROLUL SU N EVOLUIA COMERULUI CU

PRODUSE ALIMENTARE

4.2.1. Sigurana alimentar concept si definiii

4.2.2. Comerul i sigurana alimentar

4.2.3. Situaia actual a comerului cu produse alimentare

4.2.4. Sigurana alimentului sub aspect nutritiv

4.2.4.1. Substanele nutritive i calorigene din alimente

4.2.4.2. Importanta algelor n nutriia uman i animal

PARTEA II - CERCETRI PROPRII

CAPITOLUL 5

MATERIALE I METODE UTILIZATE N CADRUL CERCETRILOR PROPRII

5.1. MATERIALE I PRODUSE BIOLOGICE

5.1.1. Produse chimice

5.1.2. Produse biologice

5.2. CULTIVAREA ALGELOR N CONDIII DE LABORATOR

5.3. METODA DE LUCRU PRIVIND SUBCULTIVAREA IN VITRO A ALGELOR

UNICELULARE N REALIZAREA PRII EXPERIMENTALE

5.3.1. Subcultivarea in vitro a algelor de Chlorella fusca

5.3.2. Incubarea microalgelor de Chlorella cu diferite categorii de poluani

5.4. METODE DE INVESTIGARE APLICATE N REALIZAREA PRII

EXPERIMENTALE

5.4.1. Analiza prin citometrie n flux

5.4.1.1. Noiuni generale de citometrie n flux

5.4.1.1.1.nregistrarea, exploatarea i prezentarea rezultatelor

5.4.1.2 Analiza i prezentarea datelor obinute prin citometrie n flux

5.4.1.3. Metode de analiz bazate pe citometrie n flux

5.4.1.3.1. Estimarea modificrilor de morfologie celular prin

msurarea absorbiei i difuziei luminii (FSC/SSC) prin citometrie n flux

5.4.1.3.2. Determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a

esterazelor cu Calcein-AM (test de viabilitate celular)

5.4.1.3.3. Msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS)

5.4.1.3.4. Determinarea potenialului de membran cu DIOC6

5.4.2. Metode de analiz pe baz de microscopie

5.4.2.1. Analiza prin microscopie n lumin direct

5.4.2.2. Analiza prin microscopie electronic

5.4.2.2.1. Microscopia electronic de scanare SEM n mod de operare ESEM

CAPITOLUL 6

STABILIREA CONDIIILOR DE ANALIZ PRIN CITOMETRIE N FLUX PENTRU

ALGELE UNICELULARE N VEDEREA REALIZRII UNOR BIOTESTE

ECOTOXICOLOGICE PRIN CITOMETRIE IN FLUX

CAPITOLUL 7

EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE N FLUX I METODE

COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE DE METALELE

GRELE ASUPRA ALGELOR UNICELULARE DE CHLORELLA FUSCA, CA BAZ DE

DETERMINARE A ECOTOXICITII MEDIULUI ACVATIC

7.1. ESTIMAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A MODIFICRILOR DE

MORFOLOGIE CELULAR PRIN MSURAREA ABSORBIEI I DIFUZIEI

LUMINII (LIGHT SCATTER MEASUREMENTS) N SISTEM FSC/SSC SI TEHNICI

DE MICROSCOPIE.

7.2. DETERMINAREA ACTIVITII METABOLICE PE BAZA NIVELULUI DE

ACTIVITATE A ESTERAZELOR CU CALCEIN-AM (TEST DE VIABILITATE

CELULAR).

7.3. MSURAREA NIVELULUI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN (ROS)

7.4. DETERMINAREA POTENIALULUI DE MEMBRANE CU DIOC6

CAPITOLUL 8

EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE IN FLUX I TEHNICI

COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE ASUPRA

MICROALGEI CHLORELLA FUSCA DE NANOARTICULE, CA POLUANI ACVATICI

PRODUSI PRIN NANOTEHNOLOGII

8.1. ESTIMAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A MODIFICRILOR DE

MORFOLOGIE CELULAR PRIN MSURAREA ABSORBIEI I DIFUZIEI

LUMINII (LIGHT SCATTER MEASUREMENTS) N SISTEM FSC/SSC I TEHNICI

DE MICROSCOPIE.



CELULAR).


CAPITOLUL 9

EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE PENTACHLOROFENOL ASUPRA

MICROALGELOR DE CHLORELLA FUSCA

9.1. ESTIMAREA MODIFICRILOR DE MORFOLOGIE CELULAR PRIN TEHNICI

DE MICROSCOPIE I CITOMETRIE N SISTEM FSC/SSC (LIGHT SCATTER

MEASUREMENTS)




CELULAR)

CAPITOLUL 10

STUDIU COMPARATIV AL GRADULUI DE POLUARE ACVATIC CU CHLORELLA

SP. N VEDEREA APLICRII BIOTESTULUI PENTRU BIOMONITORIZARE

DISCUTII I CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

LISTA LUCRRILOR TIINIFICE REALIZATE N CADRUL TEZEI DE DOCTORAT

6

INTRODUCERE

Apa reprezint un element important pentru existena vieii i dezvoltarea colectivitilor umane,

resursele de ap planetare fiind de 1,37 miliarde km3, din care 97,2 % localizate n mri i oceane i 2,7 % n

apele subterane i de suprafa. Din apele dulci, doar 1,44 % sunt lichide, restul fiind gheari

Fiind o resurs n parte regenerabil, apa este necesar de a fi protejat fa de impactul

activitilor umane deoarece poluarea afecteaz capacitatea sa de autoepurare. n acest sens directiva

2000/60/CE a Parlamentului european stabilete cadrul unei politici comunitare, durabile n Europa.

Aceasta ncurajeaz statele membre pentru a proteja i a restabili calitatea resurselor de ap n scopul

de a obine un statut chimic i ecologic bun n termen de cinci ani dup intrarea n vigoare a

directivei, ncurajnd oprirea treptat a evacurii substanelor periculoase. Consecinele polurii

asupra sntii publice oblig instituiile publice de a controla i reglementa mediile acvatice

naturale, respectiv de a asigura o protecie mpotriva polurii cu ape reziduale domestice i deeuri

industriale, reducerea surselor de poluare difuz de origine agricol, protecia apelor subterane prin

crearea de zone de protecie n jurul bazinului hidrografic i gestionarea atent a resurselor de ap.

Cercetrile actuale se focalizeaz pe gsirea rspunsurilor la intrebri eseniale: Cnd este un mediu

acvatic poluat? Care sunt diferitele surse de poluare? Care sunt riscurile pentru ecosisteme i om?

De o manier general, un mediu acvatic este poluat atunci cnd echilibrul a fost modificat

permanent prin aportul de cantiti excesive, fie substane mai mult sau mai puin toxice de origine

natural sau rezultate din activitile umane. Aceti poluani pot provoca diferite tipuri de poluare

producnd creterea mortalitii pentru anumite specii de animale i plante, modificarea capacitilor

lor fiziologice, degradarea calitii apei pn la punctul de a o face inutilizabil consumului uman.

Toti poluanii nu prezint aceleai riscuri pentru ecosisteme, unii fiind biodegradabili. Bogate

n specii animale i vegetale i n microorganisme, ecosistemele sunt n mod natural capabile de a

transforma i elimina n parte sau n totalitate substanele biodegradabile, asigurnd astfel

meninerea echilibrului sau i calitatea apei.

Dac abundena acestor substane depete un prag critic, capacitile de autoepurare devin

insuficiente, agentul poluant nu poate fi eliminat destul de rapid, se acumuleaz, perturb echilibrul

dinamic natural al mediului acvatic i poate chiar deveni toxic, ceea ce permite definirea unei stri

de poluare acvatic.

Ali ageni poluani precum plasticele, metalele i anumite pesticide, nu sunt, sau sunt foarte

puin biodegradabile, procesul de auto-epurare fiind inoperant i n consecin permind acumularea

substanelor n ecosistem i intoxicarea speciilor vii care le inger. Anumite substane precum

metalele grele sau pesticidele se acumuleaz n organisme, se concentreaz n esuturi i organe la

7

concentraii care cteodat sunt mult superioare celor msurate n ap, datorit fenomenului

de " bioacumulare" .

Creterea populaiei, urbanizarea crescut, industrializarea i agricultura intensiv sunt

nsoite inevitabil de o mrire a polurii acvatice. n aceste condiii nu este ntotdeauna uor de

identificat sursele de poluare i nici de a estima efectele acestora care depind att de natura ct i de

concentraia poluantului precum i de ecosistemul n care acioneaz, fenomenele fiind foarte

complexe. n consecin, este adesea dificil de a determina pentru fiecare substan toxic o

concentraie maximal acceptabil pentru un ecosistem, neexistnd dealtfel nici un consens asupra

pragului ce nu trebuie depit, iar n rare cazuri cnd exist legi care fixeaz norme, acestea variaz

n funcie de ar.

Cercetrile din prezenta tez de doctorat se nscriu n preocuprile actuale de cercetare

n domeniul ecotoxicologiei, respectiv pentru imaginarea unor noi bioteste sensibile de determinare

n laborator a toxicitii i ecotoxicitii substanelor. Cercetrile s-au derulat pe alge verzi

unicelulare, respectiv pe Chlorella fusca i s-au bazat pe analiza prin citometrie n flux, metod

extrem de sensibil, statistic i foarte rapid, ceea ce permite stabilirea EC50 cu mare exactitate i

uurin fa de metodele existente n prezent, dar i pe tehnici de microscopie. Elaborarea unor noi

metode, (bioteste) de determinare a gradului de poluare acvatic s-a dorit a fi un mijloc util i uor

de aplicat pentru orientarea gestionrii poluanilor de o manier adecvat i aprecierea cu titlu

preventiv a riscului de degradare a unui ecosistem. De aceea ele vor putea servi drept complement

datelor chimice pentru stabilirea criteriilor de calitate i a concentraiilor maxime de poluani admii.

Prin cercetrile intreprinse pentru elaborarea biotestelor s-au obinut deasemeni rezultate

tiinifice n plan fundamental referitoare la efectul diferitelor categorii de poluani asupra

microalgelor n sistem de cultur prin citometrie n flux i tehnici microscopice complementare

(microscopie optic i de scanare ESEM). Noile bioteste pe baz de alge unicelulare i analiz prin

citometrie n flux vor permite determinarea n laborator a toxicitii i ecotoxicitii unor noi

substane i produse chimice (fitosanitare, pesticide, detergeni, etc.) n vederea nregistrrii i

comercializrii acestora, conform recomandrilor Organizaiei pentru Cooperare i Dezvoltare

Economic (OCDE) i Uniunii Europene, pentru evaluarea riscurilor fa de mediul nconjurtor,

pentru supravegherea apelor uzate menajere i industriale la intrarea i ieirea din staiile de epurare,

pentru stabilirea ecotoxicitii deeurilor speciale i evaluarea riscului ecotoxicologic pentru siturile

contaminate. Aceste teste vor putea fi deasemeni introduse n programe de bio-supraveghere

(biomonitorizare).

*

* *

8

Totalitatea cercetrilor i rezultatelor prezentate au fost realizate n cadrul Institutului de

tiine ale Vieii din cadrul Universitii de Vest Vasile Goldi din Arad, Programul

POSDRU/CPP107/DMI 1.5/S/77082, Burse doctorale de pregtire ecoeconomic i bioeconomic

complex pentru sigurana i securitatea alimentelor i furajelor din ecosisteme antropice .

Multumiri deosebite aduc pe aceasta cale Laboratorului de Algologie din Institutul de

Cercetri Biologice Cluj-Napoca pentru furnizarea cu generozitate a microalgei Chlorella fusca

Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 din propria Colecie de Cianobacterii i Alge, (singura colecie

mare de tulpini de cianobacterii i microalge eucariote din Romnia, rezultatul unor cercetri

sistematice de aproximativ 30 de ani), fr de care prezenta tez de doctorat nu ar fi fost posibil.

Aduc pe aceast cale mulumiri, n mod deosebit doamnei Prof. univ. dr. Daniela Bratosin,

pentru efortul depus i rbdarea de care a dat dovad n formarea mea profesional.

Mulumirile mele se adreseaz i doamnei Conf. univ. dr. Turcu Violeta pentru ncrederea,

susinerea, ndrumarea competent i permanent pe parcursul elaborrii i redactrii tezei de

doctorat.

Mulumiri speciale aduc colegilor din cadrul Facultii de tiine ale Naturii, Inginerie i

Informatic, Institutului de tiine ale Vieii al Universitii de Vest Vasile Goldi din Arad,

Institutului Naional de Cercetare - Dezvoltare pentru tiine Biologice din Bucureti care mi-au

oferit sprijinul lor pe ntreaga perioad de elaborare a tezei.

CAPITOLUL 1. POLUAREA ACVATIC - O PREOCUPARE GLOBAL.

PRINCIPALELE CATEGORII DE POLUANI

Apa, aerul i solul, constitueni ai biosferei, sunt cunoscui sub denumirea de factori de

mediu. n fiecare din acetia se dezvolt o faun i o flor specific care, pentru a putea supravieui,

trebuie s i se asigure un mediu ambiant ct mai curat i sntos. Pentru aceasta este necesar s se

cunoasc sursele de poluare, respectiv poluanii, care ar putea prejudicia dezvoltarea vieii i apoi

impactul lor asupra mediului i vieii, conduc la msuri de prevenire i combatere a polurii

factorilor de mediu.

Calitatea apelor este stabilit prin standarde, datorit importanei pe care o prezint pentru

sigurana vieii i pentru desfurarea activitilor economice. Calitatea apelor se exprim prin

indicatori stabilizai i calculai n urma unor analize efectuate att la apele de suprafa, ct i la cele

subterane. Organizaia Mondial a Sntii, consiliile de sntate i cercetare medical i ageniile

de protecia mediului promoveaz o abordare preventiv, n vederea protejrii apei potabile utilizate

de ctre consumatori. Calitatea apei destinate consumului uman este un obiectiv important inclus n

directivele CE, obiectiv ce vizeaz protecia sntii publice

9

CAPITOLUL 2. TENDINE MODERNE N TOXI- I ECOTOXICOLOGIA

MOLECULAR. UTILIZAREA DE TESTE CELULARE I BIOMARKERI

Societatea uman n prezent se confrunt cu probleme care vizeaz direct calitatea vieii i a

sntii oamenilor: poluarea mediului i calitatea alimentaiei, i care de altfel se gsesc ntr-o

dependen direct. n acest context, evaluarea polurii mediului acvatic natural i a celui din

fermele piscicole n particular ca i aprecierea gradului de risc pe care l are asupra calitii viitorului

produs alimentar se impun cu mare necesitate. Evaluarea riscului ecologic trebuie s vizeze pstrarea

integritii ecosistemului. Poluarea mediului a crescut substanial n ultimele decenii din cauza unui

numr mare de deeuri industriale, agricole, comerciale i interne, a eflueni i emisiilor, precum i a

substanelor periculoase. Majoritatea poluanilor de mediu pun n pericol viaa uman i a mediului,

dar i integritatea i funcia ecosistemelor. Poluarea acvatic este forma predominant de poluare din

momentul ptrunderii poluanilor n mri, ruri, lacuri i zone umede. Ecosistemelor marine i de

coast sunt caracterizate prin complexitatea i sensibilitatea lor la diveri poluani organici i

anorganici. Domeniile prioritare de cercetare pentru evaluarea riscului uman i ecologic au

identificat i inclus diferii biomarkeri n procesul de evaluare a riscurilor cu scopul de a mbunti

integrarea si evaluarea riscurilor. Biomarkerii sunt definii ca msuri biologice funcionale aprute

din cauza expunerii la poluani sau factori de stres, care sunt exprimate la nivel fiziologic i

comportamental pentru un suborganism. n prezent se ncearc identificarea de noi biomarkeri

sensibili pentru imaginarea de noi teste biologice, biomarkeri sensibili pentru cunoaterea efectelor

imediate i a celor ndeprtate ale diverselor substane asupra vieii acvatice n general i asupra

sntii omului n particular.

CAPITOLUL 3. BIOTESTELE PE BAZ DE ALGE UNICELULARE - UN INSTRUMENT

UTIL DE GESTIONARE A APELOR

Microalgele sunt indicatori sensibili ai schimbrilor de mediu i datorit faptului c stau la

baza celor mai multor ecosisteme de ap dulce i marine, sunt utilizate pe scar larg n evaluarea

riscului de mediu. Toxicitatea unui anumit element sau compus poate fi testat la diferite niveluri de

organizare biologic. Pentru monoculturile de alge unicelulare, aciunile substanelor toxice pot fi

testate folosind una din proprietile: rata de cretere, motilitate, producia de gamei, diviziunea

celular, fluxul citoplasmatic, sinteza proteinelor, permeabilitatea membranei citoplasmatice,

blocarea zonelor de absorbie pentru un anumit nutrient, etc, producia sau fixarea de CO2,

asimilarea sau producia de O2. Chlorella este o microalg unicelular care crete n apele dulci i

exist pe Terra de aproximativ 2,5 miliarde de ani i a reuit s supravieuiasc exact n aceeai

form pn n zilele noastre datorit celor dou caracteristici extraordinare pe care le are: peretele

10

su celular unic i capacitatea de reproducere, microalg spre care se indreapta in prezent interesul

ecotoxicologilor.

CAPITOLUL 4. IMPORTANA BIOTESTELOR ECOTOXICOLOGICE N CONTEXTUL ACTUAL AL ECOECONOMIEI I BIOECONOMIEI PENTRU SECURITATEA I

SIGURANA ALIMENTELOR I FURAJELOR DIN ECOSISTEME ANTROPICE

Savantul american de origine romn Nicholas Georgescu Roegen, n urm cu 40 de ani, a

lansat conceptul de Bio-Economie, prin care acesta aduce n discuie rolul omului n ecosistemele

antropice, cu necesitatea demonstrat statistic privind bilanul energetic negativ n cazul

consumurilor excesive de materii prime. Chiar dac produsele de calitate au o siguran garantat

prin nsui compoziia lor ecologic, o amprent definitorie asupra evoluiei comerului cu astfel de

produse i nu numai, o are puterea de cumprare a consumatorilor finali. n ultimii ani s-a produs de

asemenea o sensibilizare a unui numr nsemnat de consumatori n ceea ce privete problema siguranei

alimentare, acetia devenind din ce n ce mai interesai, nu doar de calitatea, ci i de proveniena

produselor agroalimentare consumate. Se impune, n aceste condiii, eliminarea oricrei deficiene sau

puncte slabe din circuitul parcurs de produsele agroalimentare, de la poarta fermei la masa

consumatorului. Rezolvarea problemelor aprute presupune, ntre altele, o atent gestionare a resurselor

i a factorilor utilizai n producia agricol i alimentar, indiferent de natura acestora. Problema

siguranei alimentare capt astfel noi valene, unde biotestele de evaluare a polurii mediului acvatic

de proveniente a produsului piscicol capt un rol esenial.

CAPITOLUL 5. MATERIALE I METODE UTILIZATE N CADRUL CERCETRILOR

PROPRII

5.2. CULTIVAREA ALGELOR N CONDIII DE LABORATOR.

Subcultivarea in vitro a algelor de Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 a

impus parcurgerea urmtoarelor etape:1) Prepararea mediului de cultur BBM (Bold Basal

Medium), 2)Sterilizarea mediului de cultur, 3) Subcultivarea in vitro a algelor unicelulare n

perimentrul hotei cu flux laminar de aer steril, 4) cultivarea acestora pe rafturile din camera de

ctetere, sub lumina tuburilor fluorescente emitente de lumin alb. Culturile de alge au fost

biometrizate periodic la 7, 14 i 30 de zile prin efectuarea de observaii .

5.3.2.Incubarea microalgelor de Chlorella cu diferite categorii de poluani

n vederea evalurii efectelor toxice induse de diferite categorii de poluani (metale grele,

pesticide i nanoparticule) experimentele s-au efectuat n plcue cu 24 godeuri n care s-a realizat o

diluie serial (P1-P10) a poluanilor plecnd de la 0,5 mM/L .

5.4. METODE DE INVESTIGARE APLICATE N REALIZAREA PRII

EXPERIMENTALE

11

Metodologia i tehnicile de investigare utilizate n realizarea cercetrilor s-au bazat n

proporie de aproximativ 80 % pe citometrie de flux i tehnici complementare de microscopie optic

i electronic de scanare, tehnici moderne i de mare finee.

5.4.1. Analiza prin citometrie n flux

Analiza prin citometrie n flux s-a realizat pe 2 tipuri de citometre, respectiv FACScan

Becton Dickinson dotat cu Software ProCellQuest i Cytomics FC 500, cu Software CXP- Beckman

Coulter Company. Celulele au fost suspendate n mediul izoton i analizate prin citometrie n flux,

cte 10.000 de celule pentru fiecare tip de analiz. Toate analizele s-au realizat in triplicat.

5.4.1.3. Metodele de analiz bazate pe citometrie n flux utilizate au fost:

5.4.1.3.1. Estimarea modificrilor de morfologie celular prin msurarea absorbiei i difuziei

luminii (FSC/SSC) prin citometrie n flux

5.4.1.3.2. Determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-

AM (test de viabilitate celular)

5.4.1.3.3. Determinarea potenialului de membran cu DIOC6

5.4.2. Analize imagistice utiliznd diferite tehnici de microscopie

5.3.2.1. Analiza prin microscopie optic n lumin direct

5.4.2. 2. Analiza prin microscopie electronic de scanare n mod de operare ESEM

CAPITOLUL 6. STABILIREA CONDIIILOR DE ANALIZ PRIN CITOMETRIE N

FLUX PENTRU ALGELE UNICELULARE N VEDEREA REALIZRII UNOR BIOTESTE

ECOTOXICOLOGICE PRIN CITOMETRIE IN FLUX

Citometria n flux este o metod rapid pentru msurarea cantitativ a celulelor individuale

aflate ntr-un fluid n micare. Mii de celule sunt trecute prin faa unei surse de lumin (de obicei un

laser) fiind efectuate msurtori de densitate celular, dispersia luminii i fluorescent, masurtori ce

sunt colectate simultan i nregistrate. Dei aceast tehnic a fost introdus nti n studii

biomedicale, astzi fiind aplicat pe scar larg, citometria in flux a fost introdus mult mai recent i

n studii oceanografice, respectiv n ceva mai mult de un deceniu.

Pentru toate aceste considerente, microalgele pot fi considerate ca celulele ideale pentru a fi

analizate prin citometrie n flux. Microalgele conin n plus pigmeni de fotosintez precum clorofila

a, carotenoizi i cteodat ficobiline care sunt taxoni specifici i care depind de condiiile de

cultivare (iluminare, compoziia n nutrieni, temperatura, pH-ul mediului, expunerea la inhibitori de

fotosintez. Deoarece compoziia n pigmeni este specific pentru speciile de microalge, analiza

prin citometrie n flux a autofluorescenei este utilizat recent pentru clasificarea fitoplanctonului

prelevat din mediul nconjurtor. Mai mult dect att, autofluorescena clorofilei fiind un biomarker

unic al organismelor fotosintetizante, ea permite stabilirea unei pori sau ferestre (flow

12

cytometric gate) pentru separarea microalgelor de alte particule sau microorganisme din prob. n

plus, se pot utiliza ali colorani fluoresceni specifici ce pot furniza informaii despre starea

fiziologic a microalgelor.

Clorofila a este singurul pigment prezent n toate microalgele fotoautotrofe. Ea emite n

intervalul spectral rou (> 650 nm), deci n FL3. Celelalte clorofile, b, c i d, captureaz fotoni i trec

astfel la clorofila a. n urma cercetarilor noastre se poate obine o prim concluzie, respectiv aceea

c prin citometrie n flux direct (talie celular, coninut celular i autofluorescen conferina de

clorofil a) se poate obine o analiz a heterogenitii celulare (celule non-clorotice i clorotice) ceea

ce reflect implicit starea de sntate a unei culturi de microalge.

CAPITOLUL 7. EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE N FLUX I METODE COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE DE METALELE

GRELE ASUPRA ALGELOR UNICELULARE DE CHLORELLA FUSCA SHIHIRA ET

KRAUSS, TULPINA AICB 25, CA BAZ DE DETERMINARE A ECOTOXICITII

MEDIULUI ACVATIC

Cercetrile ntreprinse de noi s-au focalizat cu prioritate pe identificarea efectelor produse de

metalele grele pentru stabilirea concentraiilor de risc pentru sntate i mediu prin noi metode de

investigare celular bazate n special pe tehnici de citometrie n flux.

Pentru studiile noastre de ecotoxicitate n care am dorit s utilizm ca model celular,

microalgele unicelulare de Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 ne-am propus s

analizm n primul rnd metalele grele respectiv Al i Cd, (rezultatele fiind reprezentative, ele vor fi

prezentate n continuare) Hg, Cu, Zn i Pb care au generat rezultate similare (rezultate neprezentate).

Investigarea efectului toxic produs asupra microalgelor prin aciunea metalelor grele s-a fcut prin

tehnici de citometrie n flux i metode complementare de microscopie optic i electronic de

scanare. Scopul principal al acestor analize a fost identificarea unei metode capabil s evidenieze

de o manier sensibil un factor poluant precum metalele grele i care s fie transformat ulterior

ntr-un biotest pe baz de citometrie n flux.

n acest scop s-au analizat modificrile de morfologie prin citometrie n flux direct,

determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-AM (test

de viabilitate celular), msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS) i determinarea

potenialului de membrana cu DIOC6

7.1. ESTIMAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A MODIFICRILOR DE MORFOLOGIE

CELULAR PRIN MSURAREA ABSORBIEI I DIFUZIEI LUMINII (LIGHT SCATTER

MEASUREMENTS) N SISTEM FSC/SSC I TEHNICI DE MICROSCOPIE.

13

Modificrile de morfologie observate prin citometrie n flux n sistem dot-plot FSC/SSC

(talie celular/granularitate, densitate), parametrii cuantificai prin XGeoMean i respectiv

YGeoMean au fost corelate cu analiza prin microscopie optic i electronic de scanare (ESEM).

Experimentele au fost urmrite la 24h, 48h, 72h si 6 zile, n vederea identificrii perioadei de

timp optime de incubare a celulelor algale cu diluiile seriale

de metale grele, n vederea stabilirii unui protocol de aplicare

pentru biotestul (biotestele) ce dorim s l imaginm prin

citometrie in flux.

Rezultatele cele mai evidente i reprezentative au fost obinute

la 6 zile de incubare

Analiza comparativ n

sistem biparametric (dot-plot)

FSC/SSC (1) FL3/FSC

(autofluorescena conferit de

clorofila a /talie celulara) (2)

i FL3/SSC (autofluorescena

conferit de clorofila a

/coninut celular) (3) pentru

cultura de microalge de

Chlorella fusca cultivat la

momentul T0 al experienelor

de incubare cu metale grele

(A) i martorul de incubare

reprezentat de microalge

cultivate timp de 6 zile fr

metale grele (B).

Analiza prin microscopie

electronic de scanare

(ESEM) a culturii de

Chlorella fusca la momentul

T0. Rezultatele prezentate

sunt reprezentative pentru

experimentele realizate.

14

Analiza comparativ a curbelor doz-rspuns pentru calculul EC50 pentru Al i Cd. Abscis: concentraia de Al i Cd. Ordonat: % de celule moarte corespunztoare regiunii R2 din dot-ploturile de analiza.

7.2. DETERMINAREA ACTIVITII METABOLICE PE BAZA NIVELULUI DE ACTIVITATE A ESTERAZELOR CU CALCEIN-AM (TEST DE VIABILITATE

CELULAR).

Calcein-AM este o substan lipofil, non-fluorescent, care intr liber n celule, unde este

scindat de ctre esterazele nespecifice, genernd un produs fluorescent (fluoresceina), produs


electronic de baleiaj a

modificrilor de morfologie

pentru probele de Chlorella fusca

expuse concentraiilor 1, 5 i 9 de

Cd (diluii seriale) timp de 6 zile.

Rezultatele prezentate sunt

reprezentative pentru

experimentele realizate

15

reinut de celulele cu membrana intact. Fluorescena celular conferit de fluoresceina este

proporional cu activitatea enzimatic i deci i cu inhibarea acestei activitii esterazice, exprimnd

astfel nivelul de activitate metabolic. Metoda aplicat de noi a fost conform metodei elaborate de

Bratosin et al., 2005)

Analiza citogramei biparametrice n sistem FL3/FL1 (autofluorescena conferit de

clorofila a /fluorescenta verde a calceinei) pentru determinarea activitii metabolice pe baza

nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-AM (test de viabilitate celular). R1-regiunea

celulelor non-clorotice, R2-regiunea celulelor clorotice, T0-cultura de Chlorella fusca la momentul

debutului experienelor, T6 zile-martorul de incubare dup 6 zile n absena metalelor

Analiza comparativ a curbelor doz-rspuns pentru calculul EC50 pentru Al i Cd. Abscis: concentraia de Al su Cd. Ordonat: % de celule moarte corespunztoare regiunii R2, din citogramele biparametrice FL3/FL1 corespunztoare probelor de Chlorella incubate cu diferite concentraii de Al su Cd. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.

16


Generarea intracelular de specii reactive de oxigen (ROS) este produs prin stres oxidativ

care poate fi cauzat prin expunerea celulelor la metale grele. Aceast generare de ROS poate fi

monitorizat folosind dihydro-rhodamina 123 (DHR123) sau dihydroethidium

(EH), care sunt oxidate de radicali liberi, H2O2 sau NO3. O alternativ pentru msurarea lor o

reprezint 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) care este transformat de o esteraz

intracelular la un alt produs nonfluorescent, 2,7-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF). Cnd

formarea de ROS este indus n interiorul celulei, H2DCF este convertit la

2 ', 7'-diclorofluorescein (DCF), produs fluorescent ce poate fi cuantificat (Yoshida et al., 2004;

Saison et al., 2010). Stresul oxidativ n celulele microalgei Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina

AICB 25 a fost evaluat dup expunerea celulelor la diferite concentraii de metale grele, pe baza

determinrii prin citometrie n flux a nivelurilor intracelulare pentru radicalul anionic superoxid (O2

-) utiliznd ca substana fluorescent H2DCFDA.

Analiza comparativ a valorilor MFI (Mean Fluorescence Intensity) corespunztor fluorescenei

verde conferit de 2',7'-diclorofluorescein din celulele de Chlorella fusca non- clorotice/ROS+

corespunztoare probelor incubate cu diferite concentraii de Al.

7.4. DETERMINAREA POTENIALULUI DE MEMBRAN CU DIOC6

Potenialul de membran i rata respiraiei celulelor de Chlorella fusca Shihira et Krauss,

tulpina AICB 25 au fost monitorizate cu ajutorul unei sonde poteniometrice, care poate evidenia

dinamica schimbrilor n potenialul de membran ntre interiorul i exteriorul celulei. Depolarizarea

membranelor celulare poat fi detectat de colorani uor lipofili precum DiBAC4(3) sau DIOC6(3)

(Adler et al., 2007; Jamers et al., 2009). Intensitatea fluorescenei este influenat de ptrunderea i

17

eliminarea colorantului fluorescent prin membrana celulelor, respectiv de potenialul electrochimic

i de numrul de situri lipofile de legare din interiorul celulei. Acest tip de colorani prezentnd

dependenta de distribuia de sarcin, reprezint markeri sensibili n aprecierea viabilitii celulare.

Ca sond s-a folosit DIOC6 (3), colorant permeabil prin celul, lipofilic selectiv pentru membrane

intracelulare (Gregori et al., 2002). Emisia de fluorescent verde a acestui compus, cu un maxim la

516 nm, a fost colectata cu detectorul FL1 (505-550 nm).

Analiza prin citometrie n flux n sistem de citogram biparametric FL3/FL1

(autofluorescena conferit de clorofil a/potenial membranar conferit de fluorescen verde a

DIOC6) pentru determinarea variaiilor de potenial membranar.

Analiza % de celule non-clorotice normal polarizate din totalul de celule non-clorotice

Concentraia de

aluminiu

% Celule non-clorotice % Cellule non-clorotice/Celule

normal polarizate

24 h

expunere

6 zile expunere 24 h

expunere

6 zile

expunere

Martor 4 grade 95%

Martor de incubare

Aluminiu 1mg/ml 79,16 11,10 72,84 4,52

Aluminiu 0,5mg/ml 75,60 60,16 78,04 25,24

Aluminiu 0,25mg/ml 84,05 73,98 82,28 1,98

18

CAPITOLUL 8. EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE N FLUX I TEHNICI COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE ASUPRA

MICROALGEI CHLORELLA FUSCA DE NANOARTICULE, CA POLUANI ACVATICI

PRODUI PRIN NANOTEHNOLOGII

n vederea selectrii unor metode de analiz prin citometrie n flux care s poat servi ulterior

de bioteste ecotoxicologice lund drept model celular microalga Chlorella fusca Shihira et Krauss,

tulpina AICB 25, ne-am propus s investigm i efectele induse de nanoparticulele rezultate prin

nanotehnologii, naparticule (NPs) a cror toxicitate i impact asupra mediului sunt nc incomplet

cunoscute iar n unele cazuri chiar ignorate.


electronic de scanare a

modificrilor de morfologie

pentru probele de Chlorella

fusca expuse concentraiilor 1,

3 i 6 de nanoparticule

feromagnetice (P2) timp de

24h

Analiza comparativ a curbelor doz-rspuns pentru calculul EC50 pentru Pl i P2. Abscis: concentraia de Pl si P2. Ordonat: % de celule moarte corespunztoare regiunii R2, din citogramele biparametrice

FL3/FSC corespunztoare probelor de Chlorella incubate

cu diferite concentraii de P1si P2. La 24h, 48h si 6 zile.

19

CAPITOLUL 9. EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE PENTACHLOROFENOL

ASUPRA MICROALGELOR DE CHLORELLA FUSCA

Datorit utilizrile agricole precum i industriale, pentaclorofenolul (PCP) este omniprezent

n mediul nconjurtor i recunoscut ca un poluant prioritar n multe ri fiind unul dintre cele mai

utilizate biocide nainte de aciuni de reglementare pentru a anula i restriciona anumite utilizri.

Studiul de fa a investigat prin citometrie n flux i microscopie optic i ESEM modificrile

induse asupra microalgei Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 n urma expunerii la

concentraii variate de pentaclorofenol (PCP). n mod particular am investigat efectul PCP asupra

inducerii de ROS i asupra activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu

Calcein-AM.

Analiza prin microscopie electronic de scanare a

modificrilor de morfologie pentru proba de Chlorella

fusca expus concentraiei 1 de PCP, respectiv 0,079

g/L (0.3mM/L PCP), timp de 6 zile

Analiza comparativ a valorilor MFI (Mean Fluorescence Intensity) obinute prin determinarea

activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor intracelulare cu Calcein-AM

pentru probele de Chlorella incubate cu diferite concentraii de PCP pentru 24h, 48h i 6 zile.

20

CAPITOLUL 10.

STUDIU COMPARATIV AL GRADULUI DE POLUARE ACVATIC CU CHLORELLA SP. N VEDEREA APLICRII BIOTESTULUI PENTRU BIOMONITORIZARE

n vederea verificrii metodei de determinare a ecotoxicitatii prin citometrie n flux pentru

aplicaii de biomonitorizare, am evaluat la scar de laborator dou eantioane prelevate din rul

Mure, localitatea Svrin i respectiv Ndlac, pentru a evidenia efectele induse asupra microalgei

Chlorella.

n acest context, prezenta metoda propus spre brevetare este de maxim importan,

deoarece rezolv o problem cheie n ecotoxicologie i n particular n problematica national a

Romaniei, contribuind la evaluarea gradului de poluare a apelor, printr-o soluie original, simpl,

sensibil, i foarte puin costisitoare.

CONCLUZII GENERALE.

Din ansamblul rezultatelor obinute i prezentate n prezenta tez de doctorat, pe baza

situaiei tiinifice internaionale si a ipotezelor de lucru emise de noi, pe baza modelelor

experimentale i a procedeelor de analiz aplicate, s-au evideniat urmtoarele concluzii generale cu

caracter original i de noutate:

1. Citometria n flux direct (analiza taliei celulare, a coninutului celular i autofluorescenei

conferia de clorofila a) permite o analiz a heterogenitii celulare (celule non-clorotice i

clorotice) ceea ce reflect implicit starea de sntate a unei culturi de microalge.

2. Analizele prin citometrie n flux n sistem FSC/SSC a microalgelor de Chlorella incubate

pentru timpi variai (24h, 48h i 6 zile) n prezena unor diluii de poluani (metale, pesticide,

nanoparticule) permit o evideniere a modificrilor morfologice induse de factorul poluant,

modificri morfologice observate i prin tehnicile complementare de microscopie optic i

electronic de scanare.

3. Analiza prin citometrie n flux prezint avantajul posibilitii de cuantificare prin msurtori

valorice precum XGeoMean, YGeoMean, MFI, etc., precum i o prezentare statistic a

rezultatelor pe un numr foarte mare de celule (10 000 celule n cazul nostru).

4. Sistemul de analiz prin citometrie n flux a citogramelor permite obinerea % de celule vii din

regiunea R1 i moarte din regiunea R2 care comparate cu procentajele respective pentru martorul

de incubare conduc la posibilitatea trasrii curbelor doz-rspuns pentru calculul EC-50, unde

pe abscis este nscris concentraia de poluant, iar pe ordonat % de celule, moarte,

corespunztoare regiunii R2.

5. Msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS) generat sub actiunea metalelor grele prin

citometrie n flux prezint avantajul determinrii cu o mare acuratee a acestora, tiut fiind c

speciile de radicali liberi au o durat de via foarte scurt, fiind n plus o metod

21

multiparametric care reuete s cuantifice aceast producie n interiorul celulei, cu avantajul

posibilitii determinrii acesteia pe diferite subpopulaii celulare.

6. Cu toate aceste avantaje, msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS) generate sub

aciunea metalelor grele aduce doar informaii n plan general, transformarea acestei metode ntr-

un biotest fiind greu de realizat.

7. Determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-AM

(test de viabilitate celular) utiliznd ca model celular o cultur de Chlorella, reprezint o

posibilitate important de determinare a toxicitii unor poluani datorit sensibilitii i

posibilitii de cuantificare a rezultatelor.

8. Determinarea potenialului de membran i rata respiraiei celulelor de Chlorella fusca cu

ajutorul unei sonde poteniometrice demonstreaz c metalele grele induc o depolarizare a

membranei plasmatice ntr-o parte a populaiei microalgale analizate, respectiv n celulele

clorotice. Astfel, depolarizarea membranei citoplasmatice de Chlorella, dup 6 zile de expunere

la metale grele ar putea fi considerat un indicator celular de non-viabilitate, aceste efecte putnd

fi asociate cu alterri de membran provocate de peroxidarea lipidelor membranare ca o

consecin a atacului ROS.

9. Metoda original identificat de noi, de determinare prin citometrie n flux a procentului de

celule moarte pe baz de citometrie n flux sub aciunea substanelor poluante pentru calcularea

EC50 reprezint o soluie original, simpl i puin costisitoare, propus spre brevetare

(CHLORELLA-TOX biotest) care poate fi utilizat pentru aprecierea gradului de poluare a

apelor i pentru biomonitorizarea mediului acvatic.

22

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Bercea V., Nicoar A., Drago N., 2005, Activitatea fotochimic a fotosistemului PS II n

prezena luminii n exces i refacerea acesteia la ntuneric, la alga verde Chlorella fusca,

Studia universitatis Babe-Bolyai, Biologia, L, 1, pp. 47-58.

2. Bratosin D., 2007, Explorarea structurii si functiilor celulare prin citometrie n flux, Vasile

Goldi University Press, Arad, 245 pg., ISBN: 978- 973-664-213-5.

3. Brezeanu Gh., Zinevici V., 1984, La formation et l'volution du zooplancton du lac de

barrage Porile de Fier (le Danube inferieur) dans l'intervalle 1971-1980. Verh. Internat.

Verein. Limnol., vol. 22, pp. 1558-1561.

4. Brezeanu Gh., Roman N. Ionic D., Zinevici V., Nicolescu N., Teodorescu L., Simon-Gruia

A., 1997, Influena construciei barajelor i a lacurilor de acumulare asupra structurilor

ecosistemice din bazinul hidrografic Ialomia. Culegere de lucrri prezentate la Seminarul

ARDI, IMH, Bucureti, 31.01.1997, vol. 1, pp. 127-133.

5. Gill J.H., Dive C. Apoptosis: Mechanisms and Relevance to Toxicology. In Apoptosis in

Toxicology, edited fby Roberts R., British Library, Great Britain Ltd, ISBN 0-7484-0815-0,

2000.

6. Han X., Wong Y.S., Tam N.F., 2006, Surface complexation mechanism and modeling n

Cr(III) biosorption by a microalgal isolate, Chlorella miniata, Journal of Colloid and

Interface Science 303(2), pp. 36537115.

7. Lagadic L., Caquet T., Amiard J.C., Ramade F. Biomarqueurs en Ecotoxicologie, Aspects

fondamentaux. Masson Paris, 1997, ISBN:2-225, 1997.

8. Quiniou F., His E., Delesmont R., Caisey X. Bio-indicateur de la toxicite potentielle de

milieux aqueux: bio-essai,Editions Ifremer, INRA Editions, RD10,F-78026 Versailles Cedex,

ISSN 1637-1844, ISBN 2-84433-146-7. 2005.

9. Ramade F. Ecotoxicologie. Masson, Paris, ISBN:2-225 45530-9, ISSN:0335-7473, 1977.

10. Warren N., Allan I.J., Carter J.E., House W.A., Parker A, 2003, Pesticides and other

microorganic contaminants in freshwater sedimentary environments-A review. Appl

Geochem 18, pp.159194.

Titlul programului: Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Titlul proiectului: Burse doctorale de pregtire ecoeconomic i bioeconomic complex pentru sigurana i securitatea alimentelor i furajelor din ecosisteme antropice

Editorul Materialului: doctorand PETRESCU CONSTANTIN-MARIAN Data publicrii: 2013

12.pdfREZUMAT teza Petrescu final- 18,09,2013.pdf

rezumat teza petrescu marian

Documents