1

Raport stiintific final

privind implementarea proiectului „Bio-platforma miniaturizata pentru testarea simultana a

terapiei combinate si tumorigenicitatii melanomului”

131PED - MiniBioLab

in perioada Ianuarie 2017 – Iunie 2018

Context:

Statistici recente, plaseaza cancerul ca fiind una dintre pricipalele cauze ale morbiditatii si

mortalitatii din lume. Organizatia Mondiala a Sanatatii (WHO - World Health Organization) a

evidentiat ca ~14 milioane de cazuri noi de cancer au fost raportate in 2012, in timp ce 8.2 milioane

au fost cauzatoare de moarte. Din nefericire, perspectivele nu sunt deloc optimiste, incidenta

cancerului fiind asteptata sa creasca cu aproape 70% (22 milioane de cazuri) in urmatoarele doua

decenii [1]. Ne putem astfel gandi, ca populatia unei tari imaginare, avand populatia similara tarii

noastre ar putea probabil sa dispara complet! Cele mai agresive si mortale forme de cancer cunoscute

sunt cele ce afecteaza plamanii, ficatul si stomacul, insa si alte tipuri de cancer, ca de exemplu

melanomul (cancerul de piele) [2], s-a dovedit extrem de agresiv datorita rezistentei ridicate la

medicamente, ratei mari de recurenta si ratei de supravietuire foarte scazute [3]. La fel de agresive pot

fi considerate si alte tipuri de cancer ca cel de colon, de sani sau alte tipuri de boli degenerative.

Studii recente [4,5] au aratat ca celulele tumorale pot dezvolta un fenomen de „plasticitate”, ca

raspuns la caracteristicile micromediului. Lee et al. [6], au evidentiat cum proprietatile interfaciale ale

suprafetelor (ca de exemplu caracteristici geometrice ca forma si perimetrul microstructurilor)

influenteaza o populatie de celule tumorale, care pot ghida celulele canceroase spre o stare

asemenatoare celulelor stem. Pe de alta parte, desi s-a demonstrat o eficienta terapeutica ridicata in

tratamentul cancerului ca urmare a utilizarii de nanomateriale, aceasta reprezinta doar o latura a unei

probleme mult mai complexe. O intelegere avansata a mecanismelor implicate in eliberarea de

medicamente controlata si a tumorigenicitatii celulare sunt la fel de importante pentru a adresa

probleme clinice reale [3].

Scopul proiectului MiniBioLab il reprezinta designul, dezvoltarea si testarea

performantelor unei bio-platforme miniaturizate pentru investigarea simultana a :

i) efectului sinergistic al unui amestec combinatorial precis de inhibitori de cai de

semnalizare si modulatori epigenetici asupra celulelor de melanom; si

ii) evaluarea tumorigenicitatii celulelor de melanom ghidata de caracteristicile geometrice

ale patternurilor asamblate pe substraturi solide.

Intr-adevar, melanomul este cel mai periculos cancer de piele, fiind cauzat de transformarea

melanocitelor ce au suferit modificari genetice, generand astfel o proliferare si diseminare anormala.

Melanomul malign este o tumoare heterogena ce poate fi tratata daca este descoperita devreme, dar

care odata ajunsa in noduli limfatici sau alte organe, face ca supravietuirea medie a pacientilor sa scada

sub 9 luni, doar 15% dintre ei traind mai mult de 3 ani. Principalele terapii s-au dovedit ineficiente

pentru cresterea ratei de supravietuire deoarece celulele tumorale, dezvoltand o subpopulatie rezistenta

la medicamente, se comporta ca o „tinta miscatoare”. Cercetarile recente din domeniu au evidentiat ca

doar o terapie combinata reprezinta solutia pentru tratarea melanomului cu rezistenta ridicata.

Acest proiect reprezinta o dezvoltare fireasca a proiectului TE186 intitulat „Sinteza de

biblioteci compozitionale de filme subtiri prin procedee laser combinatoriale pentru selectarea

de agenti cu tinta moleculara in melanom – COLASMEL”, implementat de catre aceeasi echipa de

cercetare si care a fost finalizat in luna Noiembrie 2017. Am demonstrat ca acoperiri combinatoriale

realizate prin tehnici laser inovative de nanomateriale din familia grafenelor (GFN – din engleza

Graphene Family Nanomaterials) functionalizate cu proteine si inhibitori de cai de semnalizare

(BRAFi) si modulatori epigenetici (HDACi) sunt eficiente, si mai mult, prezinta un efect sinergistic

asupra celulelor de melanom (linia celulara SK28 izolata de la un pacient ce prezenta mutatie genetica

a proteinei BRAFV600E).

2

Proiectul a demarat cu reuniunea echipelor de cercetare INFLPR si IB-AR pentru stabilirea

planului de experimente si a directiilor de urmat in cadrul Etapei I, dar si pregatirea strategiei de

achizitii din 2017, pentru ducerea la indeplinire a obiectivelor propuse. Am acordat o atentie deosebita

selectiei inhibitorilor de cai de semnalizare si a modulatorilor epigenetici astfel incat sa fie eficienti la

concentratii cat mai mici, in domeniul nM, pentru a creste sansele de reusita ale proiectului. Inhibitorii

propusi in proiect fac parte din doua categorii: inhibitori ai unor enzime care moduleaza aparitia

cancerului prin mecanisme epigenetice (HDACi) si inhibitori de cai de semnalizare (BRAFi) care

targeteaza grupul majoritar de pacienti cu mutatie in BRAF care activeaza calea constitutiv. Tot in

aceasta etapa au fost achizitionate marea majoritate a reactivilor si kit-urilor pentru testele biologice si

biochimice pentru a asigura cursivitatea necesara experimentelor si caracterizarilor. Pe baza

experientei anterioare, am selectat urmatorii inhibitori din fiecare clasa :

- Din clasa HDACi: Trichostatin A (TSA) – are formula chimica C17H22N2O3, greutatea

moleculara 302.4, si este solubil in apa, DMSO si etanol, astfel ca va putea fi relativ usor

de pregatit sub forma unei tinte criogenice. Coeficientul IC50 (half maximal inhibitory

concentration) reprezinta o masura a eficacitatii unei substante de a inhiba o functie

biologica sau biochimica specifica. Studiile au aratat o valoare IC50 de ~1.8 nM pentru TSA

fiind folosit de asemenea in studii privind cancerul mamar sau de plamani [7].

- Din clasa BRAFi: Dabrafenib/GSK2118436 – are formula chimica C23H20F3N5O2S2,

greutatea moleculara 519.56, si este solubil in apa, DMSO si etanol. Coeficientul IC50 este

de ~3.2 nM pentru B-raf si 0.8 nM pentru B-RafV600E fiind folosit de asemenea in studii

privind cancerul melanomului mutant si de colon [8].

In continuare, am demarat experimente preliminare privind designul si fabricarea cu laserul de

masti ce vor fi utilizate pentru asamblarea micro-patternurilor si cofigurarea montajului experimental,

conform Obiectivului O.1 al proiectului. Prima activitate desfasurata a constat in selectia materialelor

si a designului asistat de calculator pentru fabricarea mastilor. Materialele utilizate vor trebui sa

indeplineasca simultan mai multe cerinte: sa prezinte rezistenta chimica si la coroziune ridicata fata de

solventii utilizati in experimentele ADD-MAPLE, sa fie stabile pe durata sterilizarii cu radiatie UV

sau la temperaturi ridicate, sa fie compatibile pentru a fi curatate in baia cu ultrasunete, sa aiba

stabilitate mecanica mare si sa asigure realizarea de patternuri cu rezolutie spatiala mare, sa fie

compatibile pentru procesare laser. Ne-am propus initial fabricarea de masti metalice din otel

inoxidabil si eventual polimerice.

Experimentele de procesare laser a mastilor au fost efectuate in cadrul CETAL, INFLPR

(http://cetal.inflpr.ro/), in Laboratorul de Procesarea Materialelor. Am ales sa utilizam o platforma

laser cu picosecunde (Lumera, Coherent) ce este prezentata in Figura 1, datorita versatilitatii

experimantale ridicate. Principalele caracteristici ale acesteia sunt sintetizate in Figura 1. Asa cum se

poate observa, este vorba de un laser cu durata pulsului de 5 ps, ce poate fi operat atat in UV, la

lungimea de unda de 355 nm, dar si in vizibil la 532 nm. Puterea laserului poate fi variata intr-o gama

larga de valori (5-500 mW) si rate de repetitie de pana la 500 kHz, ceea ce poate diminua semnificativ

timpul de procesare.

Platorma contine de asemena axe de translatie XY motorizate de mare precizie (PlanarDL

Aerotech), cu viteza de deplasare variabila de pana la 750 mm/s, controlate de calculator. Toata

platforma de scriere directa cu laserul este controlata de un software dedicat, ce permite designul unor

patternuri cu orice tip de forme si dimensiuni, stabilite de catre utilizator. Procesul este monitorizat cu

ajutorul unei camere CCD, utilizata si pentru ajustarea focalizarii fasciculului laser pe suprafata sau in

volumul probelor.

3

Figura 1. Reprezentarea schematica si imagine a platformei de scriere directa cu laserul

utilizata pentru fabricarea mastilor.

Asa cum spuneam, am inceput prin a testa posibilitatea de realizare a unor microprelucrari pe

probe din otel inoxidabil. Experimentele realizate (Figura 2) au evidentiat ca este posibila gaurirea

facila a unor folii cu grosimea de ~1 mm. Cu toate acestea, am observat ca gaurile realizate prezinta o

conicitate semnificativa, diametrele realizate intre fata de intrare si cea de iesire a laserului prezentand

o scadere de la ~50 µm (Figura 2.a stanga) la ~ 25 µm (Figura 2.a dreapta). Aceste efect este mai putin

evident atunci cand grosimea foliei este mai mica, 0.5 mm in Figura 2.b, diferenta dintre diametre

variind de la ~70 µm (Figura 2.b stanga) la ~ 60 µm (Figura 2.b dreapta). Pe de alta parte, folii cu

grosimea de sub 1 mm nu prezinta o stabilitate mecanica suficient de buna pentru a realiza patternurile

dorite. Mai mult, am observat ca si curatarea mastilor poate fi problematica (Figura 2.a necuratata

versus Figura 2.b curatata partial), astfel ca ne-am gandit la variante alternative.

Teste similare cu PTFE au fost de asemenea nesatisfacatoare. Iradierea laser de mare intensitate

a condus la topirea si arderea locala a polimerului, mai ales in conditii de focalizare a fasciculului laser

intr-un spot de 4 µm. Astfel, rezolutia spatiala a mastilor a fost compromisa, marginile prelucrate

prezentand o serie de neregularitati evidente.

Am schimbat astfel strategia din mers, si ne-am orientat spre posibilitatea de fabricare a

mastilor din sticla. Sticlele prezinta biocompatibilitate ridicata – deci nu va exista riscul de contaminare

a patternurilor, stabilitate mecanica si chimica superioara, si mai mult, posibilitatea de refolosire in

experimente multiple, printr-o curatare relativ usoara.

4

Figura 2. Gauri realizate prin iradiere directa cu laserul ps pentru o folie de hotel inoxidabil de 1

mm (a) si 0.5 mm (b). Imaginile din stanga reprezinta fata de intrare a laserului, cele din dreapta

fata de iesire. Imaginile de sus sunt realizate dupa prelucrare iar cele de jos dupa curatare. Bara de

marire este 200 µm in toate imaginile.

Am ales astfel sa utilizam sticle fotosensibile comerciale (Foturan), datorita avantajelor

enumerate mai sus. Cu toate acestea, protocolul de fabricare a mastilor este mai laborios, consumator

de resurse si timp deoarece consta in trei pasi succesivi, descrisi schematic in Figura 3. In prealabil,

sticlele avand dimensiunile 10 × 10 × 0.5 mm3, au fost curatate in bai cu ultrasunete succesive de

acetona, etanol si apa deionizata de cate 15 minute, urmate de uscare in flux de azot. Dupa realizarea

designului CAD/CAM al formelor si dimensiunii patternurilor, cat si a distantei de separare dintre

acestea, am realizat iradierea sticlelor fotosensibile cu pulsuri laser avand durata in domeniul

picosecundelor. Iradierile au fost realizate intr-o camera curata cu platforma de procesare descrisa mai

sus. Un exemplu reprezentativ al designului unei masti este prezentat in Figura 4, si contine forme

geometrice diferite (triunghi, patrat, cerc), avand dimensiuni in domeniul 50-500 µm. Primele teste au

fost efectuate la lungimea de unda de 532 nm, cu o viteza de scanare intre 0.05 si 0.1 mm/s, si o latime

a liniei de 10 µm. Fiecare pattern este realizat asadar prin iradierea unor forme cu dimensiuni din ce

in ce mai mici, plecand de la dimensiunea finala pe care dorim sa o obtinem. Initial scrierea laser a

formei se realizeaza pe suprafata sticlei, urmata de repetarea protocolului prin iradieri in volum, la

adancimi controlabile prestabilite. Am realizat un studiu parametric in care am investigat influenta

lungimii de unda (UV versus VIS) si a energiei, la rate de repetitie mari (500 kHz) pentru foto-

inscriptionarea substraturilor de sticla. Scopul a fost stabilirea unui protocol avansat pentru

identificarea conditiilor optime de procesare laser a mastilor.

Dupa iradiere, probele au fost supuse unui tratament termic la temperaturi si intervale de timp

specifice (Figura 3) pentru modificarea zonelor iradiate. Protocolul pentru tratamentul termic al

probelor, rezultat dupa optimizari multiple este descris in Figura 5. Pe scurt, probele au fost incalzite

pana la 500°C cu o rata de incalzire de 5°C/minut, mentinute 60 minute la aceasta temperatura,

incalzite pana la 605°C cu o rata de 3°C/minut, urmata de o noua mentinere la aceasta temperatura

pentru 60 de minute.

Figura 3. Reprezentarea schematica a protocolului pentru fabricarea laser a mastilor din sticla.

Ultimul pas din protocolul de fabricare a mastilor il repezinta corodarea chimica preferentiala

a zonelor iradiate si tratate termic din sticle. Experimentele au fost realizate sub nisa, utilizand 60 ml

de solutii de acid fluorhidric cu concentratia de 10%, timp de 20 de minute in baia cu ultrasunete. Dupa

corodare, probele au fost spalate de mai multe ori cu apa deionizata si uscate in flux de azot.

5

Figura 4. Exemplu de design CAD/CAM pentru fabricarea laser a mastilor din sticla.

Figura 5. Protocolul de tratament termic aplicat pentru fabricarea mastilor din sticla.

Imagini de microscopie optica ale probelor iradiate si tratate termic si corodate chimic sunt

prezentate in Figura 6.a si b. Asa cum se poate observa din imagini, mastile fabricate pe baza

protocolului substractiv de fabricare laser, ofera posibilitatea obtinerii de patternuri cu forme

geometrice si dimensiuni diverse cu o rezolutie spatiala mult imbunatatita fata de testele realizate pe

materiale metalice si polimeri. Ne asteptam la o posibila imbunatatire a calitatii acestora ca urmare a

iradierii cu lungimi de unda UV (355 nm) a acestora, asa cum vom vedea in continuare.

Figura 6. Imagini de microscopie optica a patternurilor rezultate dupa tratamentul termic a) si

corodare chimica b) pentru fabricarea mastilor din sticla. Bara de marire 500 µm.

6

In continuare, am trecut la realizarea de masti continand patternuri cu care vom putea investiga

pe aceeasi MiniBioPlatforma atat efectul formei, cat si al periodicitatii acestora. Am folosit de asemea

sticle fotosensibile, dar care au fost microprocesate cu laserul cu picosecunde ca urmare a iradierii UV

(355 nm). Am realizat designul CAD/CAM ce este reprezentat schematic in Figura 7. Am pregatit

astfel seturi de masti distincte ce contin patternuri de 100, 200, 300 si 500 µm, dar in care pentru fiecare

masca a fost variata periodicitatea. Putem deja anticipa fabricarea de platforme MiniBioLab

multiple pentru aplicatii biomedicale dintre cele mai diverse. O reprezentare schematica a cestora

este prezentata on Figura 7. Asadar, fiecare masca de sticla (10 × 10 mm2) a fost impartita in patru arii

egale. In fiecare dintre acestea am fabricat matrici de patternuri (5 × 5) separate de distante variabile.

Figura 7. Reprezentare schematica a noilor masti pentru testarea simultana a dimensiunii, formei

geometrice si periodicitatii patternurilor.

Imagini reprezentative ale acestora sunt prezentate in Figurile 8 si 9. Am prezentat comparativ

imagini ale mastilor dupa tratamentul termic si dupa corodarea chimica a acestora pentru diferite forme

si dimensiuni ale patternurilor. Putem astfel observa atat o rezolutie spatiala imbunatatita in comparatie

cu foliile metalice micro-procesate, dar si o reproductibilitate foarte buna.

Figura 8. Imagini ale mastilor fabricate in sticle fotosensibile avand forme circulare si dimensiuni

intre 100 si 500 µm, prezentate dupa tratamentul termic si respectiv dupa corodare chimica.

7

Figura 9. Imagini ale mastilor fabricate in sticle fotosensibile avand forme patrate si dimensiuni

intre 100 si 500 µm, prezentate dupa tratamentul termic si respectiv dupa corodare chimica.

Activitatea urmatoare a constat in testarea procedeului ADD-MAPLE (din engleza Additive

Matrix-Assisted Pulsed Laser Evaporation) pentru fabricarea de patternuri cu forme, dimensiuni si

periodicitati diferite. Tehnica ADD-MAPLE, implementata in cadrul acestui proiect are la baza

protocolul experimental descris in capitolele de carte publicate de membri echipei [9,10]. Pe scurt,

aceasta consta in iradierea unei tinte criogenice cu un laser cu excimeri (KrF*, λ = 248 nm, τ = 25 ns)

in interiorul unei camere de reactie (Figura 10).

Figura 10. Reprezentare schematica a montajul experimental pentru sinteza de patternuri

prin tehnica ADD-MAPLE (a), imagini din timpul sintezei patternurilor (b).

Principala deosebire fata de metoda de Depunere Laser Pulsata (PLD - din engleza Pulsed Laser

Deposition), o reprezinta pregatirea si iradierea tintei. In cazul MAPLE, materialul de transferat in

proportie de pana la 10 %wt este dizolvat intr-un solvent corespunzator iar solutia rezultata este

inghetata in azot lichid pentru a obtine o tinta solida criogenica. Tinta este racita continuu pe durata

8

procesului MAPLE cu ajutorul unui dispozitiv „cooler” din cupru, prin care se circula in permanenta

azot lichid (Figura 10.b). Solventul trebuie sa indeplineasca mai multe caracteristici cum ar fi: sa nu

interactioneze cu materialele de interes, sa fie volatil si sa absoarba lungimea de unda a laserului folosit

pentru evaporare.

In cadrul acestei activitati am ales sa testam metoda ADD-MAPLE pentru transferul si

asamblarea sub forma de patternuri a unor precursori carbonici. Este vorba de un amestec de materiale

polimerice, cu care am demonstrat ca putem obtine filme subtiri de Carbon poros [11], si pe care dorim

de asemenea sa-l folosim pentru eliberarea de inhibitori BRAF si HDAC. In urma iradierii tintelor,

solventul este evaporat si evacuat de sistemul de pompaj, iar materialul de interes este colectat pe

substraturi plasate paralel cu tinta, la o distanta variabila de cativa cm pentru crearea patternurilor.

Tinta este rotita in permanenta cu o frecventa variabila, pentru a evita gaurirea si a asigura conditii de

iradiere identice pentru fiecare puls laser consecutiv. Inainte de depuneri substraturile (Siliciu si sticla)

au fost curatate in bai succesive de acetona, etanol si apa deionizata intr-o baie cu ultrasunete. In timpul

depunerilor, este posibila incalzirea controlata a substraturilor (sub pragul de descompunere a

materialelor de interes) pentru a elimina solventul, si pentru a imobiliza pe suporti filme cu aderenta

crescuta. Grosimea filmelor poate fi controlata cu mare precizie prin controlul parametrilor de iradiere

(lungime de unda, fluenta laser, numarul de pulsuri aplicat si rata de repetitie a acestora).

Conditiile experimentale pentru sinteza patternurilor sunt descrise in Referinta [11]. Pe scurt,

tinta criogenica continand precursorii carbonici a fost iradiata cu un laser cu excimeri KrF*. Laserul a

fost setat la o energie de 150 mJ si operat la o rata de repetitie de 5 Hz. Ca urmare a focalizarii intr-un

spor de 30 mm2 omogenizat, fluenta laser pe suprafata tintelor a fost de 0.5 J cm-2. Experimentele au

fost realizate intr-o incinta vidata, la o presiune partiala de 10-1 mbar, distanta de separare tinta substrat

fiind de 5 cm. Am aplicat cate 3000 de pulsuri laser consecutive pentru sinteza tuturor patternurilor.

Montajul experimental, inainte si dupa experimentele ADD-MAPLE de sinteza a micro-structurilor

este prezentat in Figura 11. Patternurile au transferate pe substraturi de Siliciu, ce au fost curatate

conform ptotocolului descris anterior. Imaginea tintei dupa realizarea experimentului este prezentata

in insetul figurii.

Figura 11. Suport pentru masti si substraturi de Si inainte (stanga) si dupa depunere (dreapta).

Vom prezenta in continuare imagini reprezentative cu patternurile sintetizate in cadrul

proiectului prin tehnica ADD-MAPLE (Figura 12). Asa cum se poate observa din imagini, fiecare

substrat de Si, cu dimensiunea de ~10 × 10 mm2, contine cate 4 zone cu retele de 5 × 5 patternuri cu

dimensiuni de 100, 200, 300 si 500 µm, si periodicitati diferite. Este o prima confirmare a faptului ca

metoda functioneaza foarte bine, si ca activitatea propusa a fost indeplinita cu succes.

9

Figura 12. Imagini cu mastile si patternurile transferate pe substraturi de Siliciu.

Analiza detaliata a patternurilor obtinute prin protocolul ADD-MAPLE este prezentata in

continuare. Asa cum spuneam, ne-am propus testarea posibilitatii de obtinere de forme geometrice,

dimensiuni si periodicitati diferite si mai mult decat atat, controlate. Vom prezenta in continuare

imagini de microscopie pentru a investiga patternurile obtinute (Figura 13).

Figura 13. Imagini ale patternurilor transferate pe substraturi de Siliciu. Sus – Patternuri cu forme

patrate cu dimensiuni intre 100 si 500 µm si periodicitati diferite. Jos – aceleasi tipuri de structuri,

dar cu forme circulare.

Imagini SEM reprezentative ale unor patternuri circulare cu diametrul de aproximativ 200 µm

si periodicitati diferite sunt prezentate in Figura 14. Putem observa o similitudine cu imaginile de

microscopie optica, distantele de separare din imagini fiind in concordanta. Mai mult, efectul de

„umbrire”, ce apare frecvent in Figurile 12 si 13 este mult mai putin evident, merginile patternurilor

fiind mult mai bine definite. Rezultate fizico-chimice suplimentare ca urmare a investigatiilor (AFM,

FTIR, Raman, UV-Vis, …) a acestor compusi transferati se regasesc in Referinta [11].

10

Figura 14. Imagini SEM ale unor patternuri circulare cu diametrul de 200 µm si periodicitati

diferite transferate pe substraturi de Siliciu.

Studii recente, au demonstrat necesitatea absoluta de a crea suprafete bioactive inteligente

pentru a controla comportamentul celular, si mai mult, pentru a raspunde unor probleme clinice

specifice [12]. Stiintele combinatoriale in intreg spectrul lor de aplicatii, s-a situat in fruntea celor mai

eficiente domenii de cercetare deoarece s-au realizat progrese remarcabile in domenii diverse ale

nanostiintelor si nanotehnologiilor [13,14].

Sinteza de filme subtiri combinatoriale din materiale hibride prin Evaporare Laser Pulsata

Asistata Matriceal Combinatoriala sau C-MAPLE (din engleza Combinatorial Matrix-Assisted Pulsed

Laser Evaporation) a fost introdusa pentru prima data de catre membri echipei proiectului (Sima si

Axente et al. [15, 16]). Am demostrat recent posibilitatea de a controla proprietatile materialelor

(morfologie si/sau caracteristici chimice de suprafata) pentru a genera acoperiri bioactive, capabile sa

moduleze si sa controleze comportamentul celular [15,16].

In cadrul acestui proiect, am utilizat tehnica C-MAPLE pentru identificarea concentratiilor de

inhibitori ce vor fi transferati sub forma de patternuri, din matrici de GFN functionalizate cu proteine.

Pe scurt, in geometria de iradiere de baza, doua tinte criogenice sunt evaporate simultan de catre doua

fascicule laser. Designul experimental utilizat de noi a constat in divizarea optica a fasciculului unui

laser in doua fascicule, si focalizarea acestora pe suprafata tintelor, fiecare continand solutii din

materiale diferite, solidificate prin imersare in azot lichid. Materialele evaporate sunt colectate si

asamblate sub forma de filme subtiri pe substraturi solide, dar in acelasi timp este generat natural un

gradient compozitional datorita inter-amestecului celor doua fluxuri de molecule evaporate. Procesul

este controlat prin ajustarea independenta a parametrilor experimentali (realizarea protocolului de

procesare), pentru fabricarea de filme subtiri combinatoriale hibride, uniforme si functionale. Marea

versatilitate a metodei permite asadar controlul parametrilor cheie de depunere cum ar fi: fluenta laser

si rata de repetitie, tipul atmosferei de lucru si presiunea dinamica din interiorul camerei de reactie,

numarul de pulsuri laser ce va fi aplicat pentru fiecare compus, distanta de separare tinta-substrat si

distanta de separare dintre spoturile laser focalizate pe suprafata tintelor pentru controlul dispersiei

moleculelor evaporate. In plus, distributii compozitionale variate in cadrul bibliotecilor pot fi obtinute

usor prin simpla modificare a concentratiei initiale a materialelor de interes din compozitia tintelor

criogenice.

In cadrul acestei etape, am realizat sinteza de biblioteci combinatoriale de filme subtiri din

amestecurile GFN-BSA (GONB) si inhibitori prin C-MAPLE utilizand conditiile experimentale din

Tabelul 1.

Tabelul 1. Conditiile experimentale de sinteza a filmelor subtiri GONB-INH prin C-MAPLE.

11

Cod Tinta Substrat d

(cm)

Energie

(mJ)

Spot

(mm2)

Presiune

(mbar)

Rata

rep.

(Hz)

t°

(C)

No

pulsuri

GON-

BSA-

TSA

(x3)

GON-

BSA-

TSA

5x Sticla in

gradient

1x Siliciu 4

115

~13 2-4x10-2 10 RT

25000

25000

24500

GON-

BSA-

DAB

(x3)

GON-

BSA-

DAB

5x Sticla in

gradient

1x Siliciu 4

105

~10 2-4x10-2 10 RT

25000

25000

In continuare am realizat experimente ADD-MAPLE pentru transferul de materiale GFN

functionalizate prin masti fabricate conform detaliilor prezentate anterior. In Figura 15 sunt prezentate

imagini de microscopie a patternurilor obtinute. Acestea au forme si dimensiuni diferite ce variaza

intre 50 si 500 µm. Am investigat de asemenea suprafetele patternurilor prin profilometrie optica si

am obtinut detalii despre rugozitatea acestora. Putem evidentia astfel patternuri uniforme, cu grosimi

in intervalul 600-650 nm obtinute prin ADD-MAPLE. Au fost realizate de asemenea cu sistemul

DSA25 (Drop Shape Analizer) masuratori de unghi de contact si energia libera a suprafetelor

nanocompozitelor GONB-INH, datele fiind in curs de prelucrare.

Figura 15. Imagini SEM ale unor patternuri circulare cu diametrul de 200 µm si periodicitati

diferite transferate pe substraturi de Siliciu.

Caracterizarea in vitro avansata a structurilor nanocompozite

Selectia liniilor celulare si achizitia materialelor; Metode experimentale in vitro.

Linii celulare. In cadrul proiectului a fost folosit un panel de liniile celulare umane model din stocurile

Institutului de Biochimie, cum sunt:

a. melanocite normale, pigmentate (NHEM, Lonza CC-2504),

b. celule de melanom amelanotice (SKmel28 BRAF V600E),

c. celule de melanom pigmentate (SKmel23 BRAF wt).

d. fibroblaste dermale umane, utilizate ca si control.

Microscopie de imunofluorescenta pentru testarea efectului inhibitorilor. Am monitorizat prin

microscopie de fluorescenta expresia proteinei ERK fosforilate si a histonei 3 acetilate folosind

anticorpi anti-fosfo-ERK si anti-histona 3 acetilata. Dupa 72 de ore de cultivare in prezenta filmelor

de GONB ce incorporeaza inhbitori ce tintesc fie BRAF fie enzimele responsabile de deacetilarea

12

histonelor (HDAC), celulele au fost spalate cu PBS pentru indepartarea celulelor neatasate si a

proteinelor serice. Celulele aderate au fost fixate in urmatoarele conditii:

- pentru marcarea proteinei pERK celulele au fost fixate cu o solutie PFA 4%, pentru 15 minute

la temperatura camerei;

- pentru marcarea acetil histonei 3 celulele au fost fixate cu o solutie de metanol 100% pentru

5 min la -20 °C.

Celulele fixate au fost incubate, pentru o ora la temperatura camerei, intr-o solutie continand

BSA 1% și ser normal de capra 10%, in solutie PBS-Tween 0.1 % - glicina 0.3 M, pentru blocarea

situsurilor de legare nespecifice. Incubarea cu anticorpi primari a fost realizata in aceeasi solutie peste

noapte la 4°C:

-anticorpii primari anti-pERK (1:1000) peste noapte la 4°C;

-anticorpi primari fata de acetil histona 3 (1:1000) peste noapte.

Dupa indepartarea excesului de anticorp primar legat nespecific prin spalari repetate, detectia

antigenelor a fost realizata cu anticorpi secundari cuplati cu Alexa Fluor 594 pentru fiecare preparat

timp de jumatate de ora la temperatura camerei. Simultan s-a realizat si marcarea faloidinei cuplata cu

Alexa Fluor 488 pentru preparatele marcate cu anticorpi pentru pERK. Dupa indepartarea excesului

de anticorp legat nespecific, nucleii celulelor au fost marcati cu Hoechst - un colorant ce se leaga

specific de ADN-ul dublu catenar. Ulterior preparatele au fost montate pe lame utilizand Prolong Gold

Antifade Reagent ca mediu de montare. Celulele au fost vizualizate si analizate la microscopul ZEISS

Axio Imager Z1.

Identificarea raportului optim de inhibitori BRAFi si HDACi

Figura 16. Efectul eliberarii DAB si TSA din filme subtiri, asupra celulelor distribuite pe

intrega suprafata a dispozitivului ce contine filmele de compusi depuse prin C-MAPLE . Celulele au

fost marcate cu anticorpi anti-fosfo-ERK sau acetil histona, cuplata cu marcarea nucleilor utilizand

Hoechst.

In vederea identificarii unui raport optim al concentratiilor inhibitorilor folositi a fost comparat

efectul citotoxic al inhibitorilor eliberati din filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice

de GONB cu inhibitor BRAF (DAB), in gradient compozitional (C1-C4) si GONB cu inhibitor HDAC

(TSA), in gradient compozitional (C3-C1). S-a observat ca pentru ambii inhibitori concentratia optima,

cu un efect vizibil este la nivelul concentratiei maxime folosite, respectiv concentratia C1 pentru DAB

si concentratia C3 pentru TSA.

Studiile prezentate anterior pentru a determina corelatia compozitie-structura proprietati au fost

corelate cu evaluarea parametrilor optimi pentru evaluarea aspectelor biologice si biomedicale. In

prima etapa am urmarit evaluarea potentialului citotoxic al filmelor de nanoparticule de grafene

oxidate, si apoi am evaluat efectul inhibitorilor selectati asupra celulelor de melanom, dupa

13

incorporarea lor in matricea de grafene. Pentru a atinge acest obiectiv au fost folosite pentru

experimente linii de melanom in paralel cu linii celulare normale (fibroblaste sau melanocite) cultivate

2D pe suprafata grafenelor. In aceasta etapa am determinat expresia proteinei ERK fosorilate (pERK)

si traslocarea nucleara a acesteia in celule normale: fibroblaste dermale-FBD si melanocite umane

normale-NHEM si celule de melanom: SK23, linie de melanom metastatic care exprima B-Raf normal,

SK28 linie de melanom metastatic care exprima B-Raf cu mutatia V600E, ceea ce activeaza constitutiv

aceasta enzima. In Figura 17 se observa ca inhibitori ai B-Raf nu afecteza celulele normale FBD si

NHEM, insa acestia afecteaza proliferarea celulelor de melanom SK28, observandu-se o reducere a

expresiei proteinei pERK.

Figura 17. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman si

celule din piele normala cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de

GONB cu inhibitor BRAF (DAB), in gradient compozitional (C1-C4). Celulele au fost marcate cu

anticorpi anti-fosfo-ERK pentru punerea in evidenta a starii de activare a caii MAPK si in paralel

nucleii celulelor au fost marcati cu Hoechst.

De asemenea, folosind liniile celulare de melanom SK23 si SK28 si linia de melanocite normale

(NHEM) am urmarit expresia acetil-histonei H3 in celulele care au fost crescute pe filme subtiri in

prezenta inhibitorului proteinei HDAC (TSA) pentru a determina eficienta acestui inhibitor ce este

corelata cu acumularea de histone acetilate in nucleu. Dupa cum se observa in Figura 18, in liniile

celulare de melanom observam o crestere a acetilarii histonei H3 corelata cu concentratia de inhibitor

depusa in stratul subtire.

pERK Nuclei

DAB

14

Figura 18. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman si

melanocite normale cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de GONB

cu inhibitor HDAC (TSA), in gradient compozitional (C1-C4). Celulele au fost marcate cu anticorpi

anti-acetil Histona H3 pentru punerea in evidenta a acumularii histonelor acetilate in nucleu in

prezenta inhibitorului proteinei HDAC (TSA) si Hoechst pentru marcarea nucleilor.

Pe baza observatiilor de mai sus, am decis sa testam efectul amestecului celor doi inhibitori

depusi simultan in stratul subtire asupra liniilor de melanom uman model. Astfel, dupa 72 de ore de la

insamantare, celulele crescute pe filmele de GONB ce incorporeaza cei doi inhibitori au fost fixate si

pregatite pentru imuonfluorescenta urmarind protocolul descris mai sus. In Figura 19 sunt prezentate

imagini corespunzatoare pentru celulele SK23 (ctrl) si SK28 (BRAF V600E) care au fost marcate cu

anticorpi fata de proteina pERK, a carei expresie scade in linia SK28 proportional cu concentratiile

folosite de inhibitori, sugerand faptul ca inhibitorii incorporati in nanostructuri sunt eliberati si

actioneaza eficient asupra celulelor de melanom.

Celule de melanom SK28 si melanocitele, NHEM, crescute in aceleasi conditii ca mai sus au

fost folosite pentru monitorizarea expresiei histonei 3 acetilate cu anticorpi specifici. Imagini

reprezentative sunt prezentate in Figura 20.

Acetil-Histona Nuclei

TSA

15

Figura 19. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman SK23 si

SK28 cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de GONB cu gradient

combinatorial de inhibitori BRAF (DAB) si HDAC (TSA), in patru concentratii diferite (C1-C4).

Celulele au fost marcate cu anticorpi anti-fosfo-ERK pentru punerea in evidenta a starii de activare

a caii MAPK; marcarea nucleilor a fost facuta cu Hoechst.

DAB TSA

16

Figura 20. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman SK28 si

melanocite (NHEM) cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de GONB

cu gradient compozitional de inhibitori HDAC (TSA) si B-Raf (DAB), in patru concentratii diferite.

Celulele au fost marcate cu anticorpi anti-acetil Histona H3 pentru punerea in evidenta a acumularii

histonelor acetilate in nucleu in prezenta inhibitorului HDAC (TSA) si Hoechst pentru maracrea

nucleilor.

Acetil-Histona Nuclei DAB TSA

17

Etapa II a proiectului a avut in vedere validarea unei configuratii de amestecuri de inhibitori

optime, dar mai mult decat atat, dezvoltarea si eficientizarea unui dispozitiv MiniBioLab performant.

Ne-am propus chiar sa fabricam, utilizand tehnicile laser din cadrul proiectului, dispozitive similare

celor Lab-on-a-chip prin miniaturizare avansata si testare fizico-bio-chimica.

Rezultatele din etapa precedenta au reprezentat un punct de pornire consistent pentru

experimentele din aceasta etapa. Reamintim ca in 2017 am dezvoltat un protocol inovativ de fabricare

a unor masti din sticla pentru fabricarea de patternuri cu forme si periodicitati variabile. Acestea au

fost testate si validate prin diverse tehnici de caracterizare si descrise pe larg in raportul aferent etapei

precedente. Am continuat asadar sa fabricam si sa caracterizam o gama larga de masti si patternuri,

unele cu geometrie complexa, pentru a fi testate in continuare din punct de vedere al eficientei pentru

terapia melanomului.

Designul mastilor este prezentat in Figura 21, si consta din patternuri circulare cu diametrul de

500 µm pentru celule si 2 mm pentru sferoizi 3D. Am realizat si forme complexe, ca de exemplu

spirale cu diametrul total de 1 mm, si in care infasurarea alterneaza de la stanga la dreapta si invers.

Figura 21. Designul mastilor utilizate in aceasta etapa.

Mastile au fost realizate din sticle fotosensibile prin tehnici de scriere directa cu pulsuri

ultrascurte utilizand protocolul descris anterior. Imagini reprezentative dupa tratamentul termic si

corodarea chimica sunt prezentate in Figura 22.

Figura 22. Exemple reprezentative ale mastilor dupa tratamentul termic si corodarea chimica.

Mastile obtinute au fost ulterior utilizate pentru realizarea de patternuri prin tehnicile descrise

in cadrul proiectului. In Figurile 23 si 24, sunt prezentate cateva imagini reprezentative privind

18

transferul si asamblarea pe diverse substraturi de nanomateriale din familia grafenelor GON,

functionalizate cu proteina BSA si inhibitori (in exemplul de mai jos TSA). Asa cum se poate observa

din imagini, am reusit sa transferam cu succes matrici de patternuri cu forme si dimensiuni diferite pe

substraturi din sticla (si siliciu pentru caracterizari). Cu toate acestea, am constatat ca rezolutia spatiala

a patternurilor este doar partial satisfacatoare, prezentand neomogenitati vizibile si pe alocuri,

neuniformitati de grosime. Structurile sunt rugoase, iar in multe cazuri nanomaterialele transferate s-

au aglomerat spre partea exterioara a patternurilor.

Figura 23. Selectie de imagini la diverse mariri reprezentand atat masti cat si patternuri circulare

de ~500 µm de GON-BSA-TSA transferate pe substraturi solide.

Figura 24. Selectie de imagini la diverse mariri reprezentand atat masti cat si patternuri in forma de

spirala de ~1000 µm de GON-BSA-TSA transferate pe substraturi solide.

19

Investigatii morfologice obtinute prin Microscopie de Forta Atomica (AFM) au confirmat

caracterizarile prin microscopie optica. Structurile de GON sunt relativ netede, pe cand

functionalizarea acestora cu proteina si inhibitori de cai de semnalizare sau modulatori epigenetici a

condus la cresterea rugozitatii Ra de la 70 la 200 nm si Rms de la 84 la 330 nm (Figura 25).

Figura 25. Imagini topografice 2D si 3D ale patternurilor de GON (sus) si GON-BSA-TSA (jos)

obtinute prin AFM pe arii de 10 x 10 µm.

Toate patternurile transferate reproduc cu fidelitate ridicata atat forma cat si periodicitatea

structurilor fabricate in masca de sticla, optimizari ulterioare fiind posibile prin ajustari succesive ale

conditiilor experimentale. Cu toate acestea, o astfel de abordare ar presupune costuri semnificative, iar

metoda experimentala propusa nu ar mai fi atractiva din punct de vedere aplicativ. Intr-adevar, in mod

uzual, cantitatea de solutie GON-BSA-INH necesara realizarii unei tinte ADD-MAPLE este de 4-5

ml, ceea ce corespunde unui singur experiment. Pentru realizarea unor seturi de probe complete

necesare testelor biologice si biochimice (de obicei in triplicat), si pentru mai multe linii celulare este

necesara utilizarea unei cantitati de substante active foarte mari, si implicit costuri ridicate (sute, pana

la mii de Euro).

In aceste conditii, am recurs la eficientizarea dispozitivului MiniBioLab, prin microfabricarea

unei platforme miniaturizate inovative, si cu ajutorul careia pot fi reduse cantitatile de substante si

reactivi cu pana la cateva ordine de marime. Mai mult, noua platforma de teste biologice poate

acomoda analize pe scara larga de tip combinatorial. Vom prezenta in continuare pe scurt modul de

realizare si testare a dispozitivului. Protocolul are la baza utilizarea mastilor de sticla descrise anterior

in cadrul proiectului. Reamintim ca procedeele laser permit fabricarea de masti cu design foarte variat,

de la simplu la complex. In continuare, masca de sticla este utilizata ca si matrita peste care am turnat

PDMS [Poly-di-methyl-siloxane - (C2H6OSi)n], un elastomer utilizat in mod frecvent pentru fabricarea

de dispozitive microfluidice de tipul Lab-on-a-Chip.

Am ales PDMS in principal datorita proprietatilor de biocompatibilitate, transparenta ridicata

ce perimite interogarea facila a micropatternurilor la microscop, dar si faptului ca prezinta

autofluorescenta redusa. PDMS este permeabil la gaze, ceea ce il face foarte potrivit pentru culturi

celulare. Asa cum vom vedea in continuare, PDMS poate fi turnat cu usurinta in diverse matrite si

replicat cu mare acuratete deoarece dupa mixare cu agentul de cross-lincking acesta ramane lichid

pentru cateva ore inainte de solidificare. In plus, acest material este ieftin in comparatie cu Siliciul,

Sticla sau alte materiale. Mai mult decat atat, prin optimizari avansate, este posibila sinteza de structuri

cu dimensiuni foarte reduse, ce pot fi utilizate pentru studii cu rezolutie de pana la o singura celula.

Pentru fabricarea dispozitivelor, PDMS este amestecat cu un agent de legare incrucisata (cross-

linking) in proportie de 10:1, dupa turnarea pe matrita de sticla cu patternuri obtinandu-se o replica

20

flexibila a matritei Figura 26. Structurile din imagine au fost obtinute cu o masca cu patternuri patrate

cu dimensiunea de 1.5x1.5 mm2, separate pe orizontala de 1 mm si pe verticala de 2 mm.

Figura 26. Imagine a unei matrite din PDMS fabricata cu ajutorul unei masti din sticla.

Au fost realizate masti din sticla cu forme patrate si dimensiuni de 0.5x0.5 mm2, 1x1 mm2,

1.5x1.5 mm2 2x2 mm2 dar si circulare cu diametrul de 0.5 mm si 1.25 mm. O selectie de imagini ale

mastilor inainte de corodarea chimie este prezentata in Figura 27. Imagini ale mastilor finale rezultate,

dar si a matritelor de PDMS obtinute sunt prezentate in Figura 28, avand dimensiuni de 1.5x1.5 si 2x2

mm2. Investigatii prin Microscopie Electronica de Baleiaj (SEM), au evidentiat microfabricarea unor

structuri cu forme bine definite, o rezolutie ridicata si suprafete plane (Figura 29). Aceaste caracteristici

particulare ne vor permite realizarea unor dispozitive MiniBioLab avand matrici de mini-godeuri cu

volume controlate asa cum vom vedea in continuare.

Figura 27. Imagini ale unor patternuri cu forma patrata si dimensiuni variabile dupa iradierea cu

pulsuri laser ultrascurte si tratament termic.

21

Figura 28. Imagini ale mastilor cu forme patrate dupa corodare chimica (stanga) si a unor matrite

din PDMS obtinute dupa replicare (dreapta).

Figura 29. Imagini SEM a unei matrite din PDMS dupa replicare la diverse mariri.

In continuare, matritele de PDMS obtinute au fost acoperite cu filme subtiri de Aur si/sau

Platina pentru a putea fi folosite pentru replicarea retelelor de mini-godeuri tot cu PDMS, evitand astfel

lipirea si deteriorarea probelor. Protocolul experimental a fost similar celui descris anterior, un

exemplu reprezentativ al unui dispozitiv MiniBioLab obtinut fiind prezentat in Figura 30. Asa cum se

poate observa, am realizat un dispozitiv ce contine 8 x 3 mini-godeuri cubice identice, cu latura de 1.5

mm. Miniaturizarea controlata a structurilor obtinute va permite asadar reducerea substantiala

cantitatilor de inhibitori utilizati in proiect, dar si a substantelor si reactivilor necesari testelor biologice

pentru targetarea melanomului dar si pentru alte tipuri de cancer. De mentionat de asemenea ca matrita

de PDMS realizata poate fi refolosita pentru replicarea rapida si facila a unui numar mare de

dispozitive, cu forme, dimensiuni si periodicitati prestabilite.

22

Figura 30. Platforma MiniBioLab fabricata din PDMS pentru testarea efectului inhibitorilor si

tumorigenicitatii asupra celulelor melanom.

In cadrul acestei etape am investigat proprietatile de udabilitate, caracterul hidrofil/hidrofob al

substraturilor si structurilor obtinute, cu ajutorul echipamentului DSA25 achizitionat in etapa

anterioara a proiectului. Aceste analize au fost efectuate pe materiale ca: sticla, siliciu, PDMS, GON

si GON-BSA-INH. Principalele rezultate sunt prezentate in continuare (Figura 31).

Figura 31. Imagini ale unghiurilor de contact dintre picaturi de apa si Diodometan si structuri din

Sticla, Siliciu, PDMS, GON si GON-BSA-TSA.

23

Asa cum se poate observa din imagini, caracterul hidrofil/hidrofob variaza semnificativ in

functie de suprafata investigata. Am observat unghiuri de contact (CA – din engleza Contact Angles)

mici (caracter hidrofil), pentru sticla, siliciu si GON-BSA-TSA (25-50°), dar mari (caracter hidrofob)

pentru PDMS si GON (103-110°). O analiza detaliata a nanomaterialelor din familia grafenelor,

functionalizate conform planului de lucru descris in proiect este prezentata in Figura 32. In cadrul

acestui studiu, am analizat influenta parametrilor de fittare prin metodele Young-Laplace, Elipsa,

Tangenta, Cerc si Inaltime/Latime cu ajutorul softului Krüss Advance, comparativ pe structuri GON

si GON-BSA-TSA (Figura 32). Asa cum se poate observa, valorile CA variaza in domeniul 100-110°

pentru GON (caracter hidrofob) si 39-44° pentru GON-BSA-TSA (caracter hidrofil), semn ca

functionalizarea nanomaterialelor imbunatateste proprietatile de suprafata ale acestora. Aceste

rezultate sunt in concordanta cu studiile morfologice anterioare, realizate prin microscopie optica, de

forta atomica sau electronica de baleiaj.

Metoda de

fittare GON GON-BSA-TSA

Young-

Laplace

Elipsa

Tangenta

Cerc

24

Inaltime/

Latime

Figura 32. Unghiul de contact dintre picaturi de apa ultrapura de 0.5 µL si patternuri de GON si

GON-BSA-TSA au fost determinate prin fittari Young-Laplace, Elipsa, Tangenta, Cerc si

Inaltime/Latime cu ajutorul softului Krüss Advance.

In continuare, am demarat pregatirea structurilor realizate pentru testele finale cu celule

melanom. Deoarece am constatat un caracter hidrofob pronuntat, atat pentru PDMS cat si pentru GON,

toate structurile de patternuri sintetizate au fost supuse unui tratament in plasma de Oxigen, atat pentru

curatare/sterilizare, cat si pentru modificarea proprietatilor suprafetelor. Imagini reprezentative cu un

set de dispozitize MiniBioLab din PDMS sunt prezentate in Figura 33. Tratamentul a fost realizat in

plasma de oxigen la 15 sccm, o putere de 50 W, pentru 60 de secunde, in vederea optimizarii

performantelor structurilor in cadrul testelor biochimice.

Figura 33. Tratament in plasma de oxigen a dispozitivelor Minibiolab, in vederea sterilizarii si

modificarii proprietatilor suprafetelor pentru testele biochimice.

Prin optimizari avansate, este posibila sinteza de structuri cu dimensiuni foarte reduse, ce pot

fi utilizate pentru studii cu rezolutie de pana la o singura celula melanom. Vorbim asadar de procedee

de miniaturizare avansata si reducerea substantiala a cantitatilor de inhibitori si reactivi pentru teste

celulare. Protocolul experimental este similar cu cel dezvoltat in cadrul proiectului, si descris mai sus,

doar ca am redus dimensiunile MiniBioLab, si am crescut substantial numarul de microscructuri de pe

suprafata probelor (mii de structuri pe arii de 10 x 10 mm2). In Figura 34 este prezentat un exemplu

reprezentativ al unui astfel de dispozitiv ce contine mii de patternuri identice cu forme patrate avand

latura de aproximativ 150 µm si adancimea de 60 µm. Insa in functie de dimensiunile celulelor ce

urmeaza a fi investigate si/sau de tipul de cancer ce se doreste a fi tintit, este posibila reducerea in

continuare a dimensiunilor. In Figura 35, sunt prezentate structuri cu forme patrate avand latura de

aproximativ 50 µm si adancimea de 30 µm.

25

Figura 34. Exemple de micro-patternuri din PDMS realizate prin protocolul dezvoltat in cadrul

proiectului MiniBioLab.

Figura 35. Exemple de micro-patternuri (≈10 000 micro-patternuri pe o suprafata de 10x10 mm2)

din PDMS realizate prin protocolul dezvoltat in cadrul proiectului MiniBioLab.

Caracterizarea in vitro avansata a structurilor nanocompozite

Pregatirea nanoparticulelor de GON functionalizate cu BSA si inhibitori

Complexul BSA-inhibitori a fost pregatit prin adaugarea de dabrafenib (DAB) și respectiv de

tricostatin A (TSA) într-o solutie de 2 mg/ml albumina serica bovina (BSA) si incubate timp de 4 ore

la temperatura camerei sub agitare moderata. Pentru obtinerea complexului final, GON-BSA-

inhibitori, s-a adaugat peste amestecul BSA-inhibitori o suspensie oxid de grafena (GON) intr-o

concentratie de 2 mg/ml (raport 1:1). Pentru obtinerea unei suspensii omogene, probele au fost

incubate la 37 °C, peste noapte, sub agitare continua. Nanoparticulele de oxid de grafena au fost spalate

de 3 ori cu solutie de PBS sterila pentru a indeparta excesul de inhibitori neincorporati. Nanoparticulele

de oxid de grafena au fost resuspendate in mediu de cultivare al celulelor si pastrate pe gheata pana la

tratamentele aplicate celulelor de melanom.

Cultivarea celulelor in conditii standard - 2D

Celulele FBD - fibroblaste dermale umane, SK23 - celule de melanom uman BRAF WT si

SK28 - celule de melanom uman cu mutatia BRAF V600E au fost insamantate in placi de 96 de godeuri

26

sau in interiorul mini godeurilor MiniBioLab de PDMS, in mediu de cultivare DMEM (fibroblaste) si

respectiv RPMI (celule de melanom) suplimentate cu 10% ser fetal bovin. Insamantarea a fost facuta

la densitati diferite in functie de linia celulara folosita: 4000 celule/cm2 FBD, 16500 celule/cm2 celule

de melanom SK23 sau SK28. Dupa aproximativ 24 de ore de la insamantare, celulele au fost tratate cu

un gradient bidimensional a celor doi inhibitori (5-80/2,5-40 µM), conform schemei din Figura 36.

Celulele au fost incubate la 37 °C timp de 48 și respectiv 72 de ore, dupa care au fost analizate pentru

a determina efectul citotoxic al inhibitorilor eliberati din nanoparticulele de grafene.

80T/40D 40T/40D 20T/40D 10T/40D 5T/40D 0T/40D

80T/20D 40T/20D 20T/20D 10T/20D 5T/20D 0T/20D

80T/10D 40T/10D 20T/10D 10T/10D 5T/10D 0T/10D

80T/5D 40T/5D 20T/5D 10T/5D 5T/5D 0T/5D

80T/2,5D 40T/2,5D 20T/2,5D 10T/2,5D 5T/2,5D 0T/2,5D

80T/0D 40T/0D 20T/0D 10T/0D 5T/0D 0T/0D

Figura 36. Reprezentarea schematica a gradientului compozitional bidimensional cu concentratii de

la 80 µM la 5 µM tricostatin A (T) si de la 40 µM la 2,5 µM Dabrafenib (D).

Cultivarea celulelor sub forma de sferoizi - 3D

Celule SK23 si SK28 au fost insamantate in placi de 96 godeuri la o densitate de 6000

celule/100 µl mediu celule stem cu urmatoarea formulare: DMEM: Ham’s F12 1:1 suplimentat cu

2mM glutamina, B27 1×, 55mM β- mercaptoetanol si factori de crestere bFGF2 si EGF in concentratie

finala de 20ng/mL fiecare. La fiecare trei zile mediul de cultivare a fost schimbat cu mediu proaspat.

Formarea sferoizilor a fost urmarita prin preluarea de imagini la diferite intervale de timp (1, 3, 6, 12

zile), cu microscopul de inversie, dupa cum se observa in Figura 37.

27

Figura 37. Imagini preluate cu microscopul de inversie, care urmaresc evolutia celulelor SK28 si

SK23 cultivate in mediu de celule stem, care favorizeaza formarea de sferoizi, dupa cum se poate

observa la diferite intervale de timp, 1, 3, 6 si 12 zile (D).

Determinarea citotoxicitatii inhibitorilor eliberati din nanoparticule de grafene utilizand

testul metabolic MTS si testul live/dead bazat pe analiza fluorescentei

Intr-o prima faza celulele tratate cu nanoparticulele de oxid de grafena ce incorporeaza un

gradient combinatorial de DAB si TSA, au fost spalate de 3 ori cu PBS, astfel incat sa fie inlaturate

cat mai eficient nanoparticulele care ar interfera cu reactia. Celulele au fost incubate cu un mix de

mediu de cultura:reactiv de MTS (compus tetrazolium stabilizat cu un agent de cuplare) (raport 5:1),

pentru 2,5h la 37°C, timp in care a avut loc reactia de reducere a tetrazoliului la formazan - un compus

brun, solubil in mediul de cultura al celulelor. Reactia de reducere este in principal realizata de catre

enzima NADH sau NADPH din lantul respirator mitocondrial din celulele metabolic active (celule

viabile). Absorbanta compusului rezultat in urma reactiei de culoare a fost citita cu ajutorul

spectrofotometrului Mithras (Berthold) la 490 nm. Cea de-a doua metoda de determinare a

citotoxicitatii, cu ajutorul kitului Live/ Dead (Invitrogen), consta in marcarea simultana a celulelor

viabile si a celulelor moarte. Acesta este bazat pe utilizarea calceinei AM, un compus nefluorescent,

permeabil, care este transformat in calceina flourescenta (Ex/Em 495/515nm), in urma activitatii

enzimatice a esterazelor intracelulare functionale in celulele vii. Homodimerul de etidiu penetreaza

membrana celulelor moarte si se leaga de acizii nucleici, realizand astfel o crestere a nivelului de

fluorescenta de aproximativ 40 ori (Ex/Em 495/635nm). Pentru aceasta, celulele insamnatate in placi

sau in minigodeurile MiniBioLab de PDMS, tratate pentru 48 h cu nanoparticulele functionalizate cu

BSA-INH au fost spalate cu PBS de 3x, incubate tip de 45 min cu 10µM calceina si 4µM homodimer

de etidiu diluate in mediu de cultura, spalate de 2 ori cu PBS si fixate 20 min cu 4% paraformaldehida.

Probele fixate au fost scanate cu ajutorul sistemului automat TissueFAXS (TissueGnostics) la

lungimile de unda indicate.

28

Determinarea amestecului optim de inhibitori eliberati pentru distrugerea celulelor de

melanom

Amestecul optim de inhibitori a fost testat atat in conditii standard de cultivare a celulelor,

placi de 96 godeuri cat si in minigodeuri MiniBioLab din PDMS. Celulele insamnatate conform

descrierii din sectiunea materiale si metode au fost lasate sa adere aproximativ 24h, dupa care au fost

tratate cu amestecul de nanoparticule ce incorporeaza un gradient combinatorial de concentratii ai celor

doi compusi DAB si TSA pentru 48h. Mai mult, aderenta celulelor pe minigodeurile MiniBioLab, cu

hidrofobicitate crescuta in conditii normale, a fost verificata la 24 h dupa insamantare. Dupa cum se

poate observa in Figura 38 , tratamentul in plasma, urmat de expunere la UV, au crescut hidrofiliciattea

materialului, favorizand astfel atasarea celulelor la dispozitivele miniaturizate.

Figura 38. Adeziunea celulelor la suprafata minigodeurilor MiniBioLab urmarita la 24 de ore dupa

insamnatare cu diferite obiective (5×, 10× si 20×) ale microscopului de inversie.

Celulele crescute in regim 2D au fost tratate pentru aproximativ 48h cu nanoparticule de oxid

de grafena functionalizate cu BSA-INH, conform schemei prezentata in Figura 36. Dupa 48 h, efectul

citotoxic al compusilor eliberati din nanoparticule de GON, a fost masurat prin spectrometrie sau

29

microscopie de fluorescenta. Rezultatele obtinute in urma celor doua analize au indicat o eficienta

crescuta a activitatii citotoxice a inhibitorilor, in special TSA inca de la o concentratie scazuta,

aproximativ 5µM, dupa cum se poate observa in heat-map-urile din Figura 39.A, care transpun intr-un

cod al culorilor valorile de absorbanta determinate la 490 nm. In aceste conditii de cultivare,

fibroblastele dermale normale prezinta un gard scazut de afectare al viabilitatii. In Figura 39.B au fost

selectate valori cu concentratii variabile de TSA, care au indicat o citotoxicitate mai puternica

comparativ cu DAB si a fost determinata viabiliatea celulara, utilizand o formula standard, absorbanta

GONB/absorbanta GONB-INH*100. Dupa cum am pututut observa si in datele obtinute in urma citirii

absorbantei , nanoparticulele elibereaza inhibitorii care actioneaza preponderent pe liniile de melanom

si nu pe cea de control, FBD/CCD.

Figura 39. Reprezentarea schematica a valorilor de absorbanta la 490nm, sub forma de heat map

(A) si respectiv reprezentarea curbelor de viabiliatate celulara (B) determinata in conditii variabile

ale concentratiei de TSA si constante pentru DAB.

Mai mult, pentru a avea o masuratoare cat mai precisa, in continuare efectul citotoxic a fost

determinat utilizand o abordare diferita, bazata pe fluorescenta, respectiv acumularea de calceina

fluorescenta si a homodimerului de etidiu. Conform descrierii de la sectiunea materiale si metode,

celulele au fost marcate cu calceina si homodimer de etidiu, fixate si apoi achizitionate la TissueFAXS.

Dupa cum se poate observa in Figura 40.A, calceina poate fi vizualizata eficient numai in probele de

control (ultima coloana) si la concentratia de 2,5µM TSA, atat in SK23 cat si SK28, ceea ce indica

concentratia imediat urmatoare ca una optima pentru a produce moartea celulelor de melanom,

respectiv 5µM. O concluzie similara poate fi extrasa si din experimentul realizat pe minigodeurile

MiniBioLab, Figura 40.B.

30

Figura 40. Imagini de fluorescenta preluate la Tissue Faxs, scanare cu obiectiv 20× a celulelor din

placa de 96 godeuri (A) sau minigodeuri MiniBioLab (B), marcate cu calceina /homodimer de etidiu

Determinare amestecului optim de inhibitori eliberati pentru distrugerea celulelor de melanom-culturi

3D

Sferoizii formati timp de 6 zile de la insamantare au fost tratati cu solutie de GONB –INH,

concentratie maxima - 40µM DAB, 80µM TSA si control GONB. Efectul citiotoxic al inhibitorilor

nu a putut fi evaluat calitativ-imagini microscopul de inversie, datorita sedimentarii particulelor de

oxid de grafena simultan cu celulele. A fost facuta o evaluare cantitativa, bazata pe enumerarea

sferoizilor. Si in acest caz tratamentul cu concentratia de inhibitori maxima incorporata in particule de

GON determina o citotoxicitate crescuta (100%).

Pe baza acestui raport stiintific si tehnic detaliat apreciem ca obiectivele propuse in cadrul

proiectului „Bio-platforma miniaturizata pentru testarea simultana a terapiei combinate si

tumorigenicitatii melanomului” 131PED - MiniBioLab au fost pe deplin indeplinite.

Perspective inovative de continuare a proiectului MiniBioLab

Deoarece ne dorim continuarea si dezvoltarea investigatiilor fizico-bio-chimice si dupa

finalizarea proiectului, poate chiar la nivel international, au fost efectuate o serie de achizitii specifice.

Intr-adevar, toate testele celulare efectuate in cadrul proiectului, atat 2D cat si 3D, au presupus un

regim static. Insa pentru a simula un comportament cat mai apropiat de ce se intampla in corpul uman,

deci in vivo, am realizat designul unui sistem microfluidic ce permite perfuzarea controlata a lichidelor,

inclusiv pentru domenii de curgeri foarte mici. Vom putea asadar efectua teste cu biochipuri

31

microfluidice si cu structuri cu micropatternuri ca cele prezentate in Figurile 34 si 35, si avansa astfel

spre dispozitive MiniBioLab de tipul “Lab-on-a-Chip” si “Organs-on-a-Chip”, ce reprezinta varful de

lance al cercetarilor mondiale actuale din acest domeniu, pentru terapia cancerului. Designul setup-

ului experimental este prezentat in Figura 41, si este pus in functiune in cadrul grupului “Photonic

BioSystems” din cadrul CETAL-INFLPR. Aceasta platforma va fi testata in curand, si va fi utilizata

pentru un stagiu de practica de 3 luni de catre o studenta de la Universitatea Politehnica din Bucuresti.

Pe scurt, setup-ul este format din: 1) controler de curgere microfluidica, 2) Valva de distributie rotativa,

3) senzori de curgere, 4) rezervoare microfluidice, 5) tuburi si conectori, 6) biochipul microfluidic, 7)

sofware de control si automatizare.

Figura 41. Platforma de asamblare si testare microfluidica dezvoltata in cadrul proiectului.

Rezultate livrate proiect 131PED/2017:

√ 1. Am elaborat un protocol inovativ pentru fabricarea laser avansata a unor masti din sticla

fotosensibila; un montaj experimental al tehnici laser ADD-MAPLE si am realizat seturi de masti cu

forme, dimensiuni si periodicitati specifice.

√ 2. Am efectuat experimente complexe pentru identificarea amestecului optim de inhibitori in

nanostructuri pentru inhibitori cu coeficientul IC50 in domeniul nM ca de exemplu Dabrafenib si TSA.

Am elaborat un protocol ADD-MAPLE pentru cresterea de patternuri cu forme complexe, care

pastreaza proprietatile materialelor initiale.

32

√ 3. Am realizat bioplatforme miniaturizate constand in 100 de patternuri cu forme, dimensiuni si

periodicitati diferite pe suprafete de 10 x 10 mm2, caracterizate prin diverse metode ex-situ.

√ 4. Am realizat si caracterizat multiple bioplatforme miniaturizate din PDMS constand in micro-

godeuri cu forme, dimensiuni si periodicitati diferite pentru reducerea semnificativa a cantitatilor de

inhibitori si reactivi necesari experimentelor si implicit pentru reducerea costurilor. Am demonstrat

posibilitatea microfabricarii laser a pana la 10.000 de structuri pe suprafete de 10 x 10 mm2 pentru

monitorizarea si investigarea celulara pe scara larga.

√ 5. Am investigat in-vitro dozarea inhibitorilor si raspunsul celular fata de caracteristicile

suprafetelor (tumorigenicitate), atat pentru micro-patternuri cat si micro-godeuri pe linii celulare de

melanom in faza si primara dar si metastatice in timp ce celule fibroblaste dermale au fost utilizate ca

si control. Au fost crescute si investigate mini-tumorete (sferoizi 3D cuprinzand minim 50-100 de

celule) pentru a simula comportamentul in vivo si a evalua eficienta inhibitorilor (expresia pERK si

acumularea histonilor in nuclei), dar si alte teste biochimice.

√ 6. Am realizat analiza si interpretarea datelor pentru identificarea amestecului optim de inhibitori

pentru validarea unei configuratii MiniBioLab optime. Platformele miniaturizate realizate vor putea

fi utilizate pentru terapia personalizata a melanomului daca tratamentul presupune utilizarea de

inhibitori de cai de semnalizare si modulatori epigenetici.

√ 7. Am realizat si testat dispozitivul MiniBioLab si am creat premisele pentru fabricarea cu costuri

reduse si a altor tipuri de micro-patternuri pentru investigatii si terapia avansata a unor alte tipuri

de cancer sau boli degenerative.

√ 8. Au fost realizate o serie de achizitii strategice ce vor permite continuarea studiilor dezvoltate in

cadrul proiectului. In 2017 am achizitionat un sistem complet pentru investigarea caracterului

hidrofil/hidrofob si a energiei libere a suprafetelor, iar in 2018 un sistem unic la nivel national pentru

testarea dinamica a dispozitivelor MiniBioLab (Anexa 2).

√ 9. A fost realizat un website dedicat proiectului care este activ la adresa

http://lspi.inflpr.ro/2017/PED/PED131/Home.html.

√ 10. Au fost acceptate spre publicare doua capitole de carte: unul privind sinteza laser avansata de

filme subtiri combinatoriale pentru aplicatii biomedicale (Editura Springer) si unul referitor la

utilizarea nanomaterialelor din familia grafenelor pentru nanomedicina (Editura Elsevier). Au fost

sau urmeaza sa fie trimise spre publicare mai multe articole stiintifice si au fost efectuate prezentari

de postere la conferinte internationale. Am demarat redactarea unui Brevet de inventie pe tematica

proiectului. Toate diseminarile realizate aduc multumiri proiectului si sunt sintetizate in Anexa 1.

√ 11. A fost redactat raportul stiintific final si s-a realizat raportul financiar final al proiectului.

In numele Echipei proiectului 131PED,

Director proiect,

Dr. Emanuel AXENTE

33

Referinte:

[1] B.W. Stewart, C.P. Wild, editors (2014). World Cancer Report 2014. Lyon, France: International Agency

for Research on Cancer, ISBN 978-92-832-0429-9.

[2] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/melanoma/patient.

[3] J. Li et al., Recent advances in targeted nanoparticles drug delivery to melanoma, Nanomedicine:

Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 769–794.

[4] J. Liu et al., Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nature Mater. 11, 734-741

(2012).

[5] Y. Tan et al., Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and

Sox2 expression. Nature Commun. 5, 4619 (2014).

[6] J. Lee et al., Interfacial geometry dictates cancer cell tumorigenicity, Nature Materials (2016),

doi:10.1038/nmat4610.

[7] Vigushin DM, et al. Clin Cancer Res, 2001, 7(4), 971-76.

[8] Richon VM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(6), 3003-3007.

[9] Axente E, Sima F, et al. “Biopolymer thin films synthesized by advanced pulsed laser techniques” Chapter

4, in "Recent Advances in Biopolymers", Ed. F. Parveen, InTech ISBN 978-953-51-4613-1, 2016.

[10] Sima F, Axente E et al. “Bioresponsive surfaces and interfaces fabricated by innovative laser approaches”

Chapter 12, in “Advanced Materials Interfaces” (eds A. Tiwari, H. K. Patra and X. Wang), John Wiley & Sons,

Inc., Hoboken, NJ, USA. doi: 10.1002/9781119242604.ch12, ISBN 9781119242451, 2016.

[11] Axente E, Sopronyi M, Matei Ghimbeu C, Nita C, Airoudj A, Schrodj G, Sima F „Matrix-Assisted Pulsed

Laser Evaporation: A novel approach to design mesoporous carbon films” Carbon 122 (2017) 484-495.

[12] Hanawa, T., Biofunctionalization of metallic materials: creation of biosis–abiosis intelligent interface, in

Interface Oral Health Science 2014. 2015, Springer. p. 53-64.

[13] Wang, X. and X. Sun, G. Bricen o, Y. Lou, K.-A. Wang, H. Chang, WG Wallace-Freedman, S.-W. Chen

and PG Schultz. Science, 1995. 268: p. 1738-1740.

[14] Buenconsejo, P.J.S., et al., A New Prototype Two‐Phase (TiNi)–(β‐W) SMA System with Tailorable

Thermal Hysteresis. Advanced Functional Materials, 2011. 21(1): p. 113-118.

[15] Sima, F., et al., Combinatorial matrix-assisted pulsed laser evaporation: single-step synthesis of biopolymer

compositional gradient thin film assemblies. Applied Physics Letters, 2012. 101(23): p. 233705.

[16] Axente, E., et al., Combinatorial MAPLE gradient thin film assemblies signalling to human osteoblasts.

Biofabrication, 2014. 6(3): p. 035010.

34

Anexa 1 – Diseminarea rezultatelor

1. Interesul comunitatii stiintifice pentru Nanomaterialele din Familia Grafenelor este foarte

ridicat, tocmai datorita proprietatilor fizico-bio-chimice fascinante ale acestora. Astfel, la invitatia

editorului cartii Elsevier “Fullerens, Graphenes and Nanotubes: A Pharmaceutical Approach”, Dr.

Alexandru Grumezescu, am redactat un capitol de carte ce prezinta un review critic asupra ultimilor

progrese din domeniu, privind sinteza, functionalizarea si aplicatiile grafenelor si derivatilor acestora

in nanomedicina, cat si posibile dezvoltari ulterioare. Capitolul nostru este intitulat “Recent Advances

of Graphene Family Nanomaterials for Nanomedicine”, avand ca autori pe Irina NEGUT,

Valentina GRUMEZESCU, Livia SIMA* si Emanuel AXENTE*, si a fost publicat recent, avand

ISBN 9780128136911 si DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-813691-1.00011-7, si aduce

multumiri proiectului 131PED – MiniBioLab.

2. Stadiul cercetarilor dar si principale provocari in sinteza laser de biblioteci combinatoriale

de filme subtiri pentru aplicatii biomedicale a facut obiectul redactarii unui capitol ce a fost acceptat

pentru publicare in cartea “Advances in the Application of Lasers in Materials Science”, Editori M.

Dinescu. D.B. Geohegan, A. Miotello si P.M. Ossi, ce va fi publicata de editura Springer in 2018.

Titlul capitolului este “Combinatorial laser synthesis of biomaterial thin films: selection and

processing for medical applications”, avand ca autori pe: Emanuel Axente, Carmen Ristoscu,

Adriana Bigi, Felix Sima, si Ion N. Mihailescu, si aduce multumiri proiectului 131PED – MiniBioLab.

3. Tehnicile de microfabricare cu laseri si plasma prezinta un interes deosebit pentru

comunitatea stiintifica internationala. Am fost astfel invitati sa publicam o lucrare de tip Review pentru

jurnalul Current Medicinal Chemistry, ce va avea titlul „Biomimetic nanostructures with

compositional gradient grown by combinatorial matrix-assisted pulsed laser evaporation for

tissue engineering” si autorii: Emanuel Axente si Felix Sima. Lucrarea a fost submisa pe 14 Aprilie

2018 si se afla in evaluare, aducand de asemena multumiri proiectului 131PED – MiniBioLab.

4. Lucrarea cu titlul „Gradient multifunctional biopolymer thin film assemblies

synthesized by Combinatorial MAPLE” se bazeaza pe expertiza Directorului de proiect 131PED in

fabricarea de structuri in gradient multifunctionale si este in evaluare la jurnalul Applied Surface

Science. Sunt aduse multumiri proiectului 131PED – MiniBioLab.

5. Protocolul de microfabricare cu laserul a sticlelor fotosensibile utilizat pentru fabricarea

mastilor a facut obiectul redactarii unui articol stiintific intitulat „High repetition rate UV versus VIS

picosecond laser for fabrication of 3D microfluidic channels embedded in photosensitive glass”,

avand autorii: F. Jipa, S. Iosub, B. Calin, E. Axente, F. Sima, K. Sugioka si va fi submis in curand la

un jurnal ISI cu factor de impact din domeniu.

35

Anexa 2 – Achizitii realizate in cadrul proiectului In 2017 a fost achizitionat un echipament pentru investigarea caracterului hidrofil/hidrofob al

suprafetelor, deoarece atat morfologia cat si chimia suprafetelor pot influenta decisiv comportamentul celular

(in concordanta cu planificarea prevazuta in propunerea de proiect). Sistemul permite masurarea unghiului de

contact dintre picaturi de lichid (metoda sessile drop) si o suprafata solida si a energiei libere a suprafetelor. A

fost achizitionat de la firma Kruss GmbH, Germania, model DSA25, o imagine de ansamblu a sistemului si a

principalelor componente ale acestui fiind prezentate in figura A.1. Asa cum se poate vedea in figura,

dispozitivul este prevazut cu doua sisteme de dozare independente, controlate de calculator pentru dozarea

precisa si reproductibila a picaturilor, pana la volume de 0.5 µL. Unul dintre sisteme permite dozarea simultana

a doua lichide (apa si diiodometan) pe baza de presiune, denumit „double pressure dosing”, si care este utilizat

pentru determinarea rapida a energiei libere a suprafetelor (Figura A.2).

Sistemul DSA25 este prevazut cu o camera rapida (2000 fps) de mare rezolutie (1200 x 800 px),

conectata la calculator printr-un port USB 3.0. Colectarea imaginii se face cu un sistem optic cu marire de 6.5x.

Sursa de iluminare este LED monocromatic de mare putere, ce emite la lungimea de unda dominanta de 470

nm. Proba de analizat se monteaza pe un sistem de translatie x-y micrometric. Tot protocolul de masurare a

unghiului de contact si determinare a energiei libere a suprafetelor este realizat cu ajutorul software-ului

Advance. Acesta ofera un protocol de lucru intuitiv pentru pregatirea experimentului, masurarea, analizarea si

exportul datelor catre calculator. In plus, dispunem de o larga baza de date cu privire la lichidele de utilizat si

proprietatile acestora. Este de asemenea posibila realizarea de experimente de masurare a unghiului de contact

la diverse temperaturi, intre temperatura ambianta si 130°C, cu ajutorul unei camere speciale termostatate.

Figura A.1. Sistem pentru masurarea unghiului de contact si a energiei libere a suprafetelor.

Figura A.2. Sistem pentru dozare simultana a doua lichide si determinarea energiei libere a

suprafetelor. Exemplu al unei astfel de masuratori cu softul Advance.

36

In 2018 au fost achizitionate toate componentele necesare dezvoltarii si implementarii pentru prima data

la nivel national a unei platforme pentru asamblarea si testarea unor dispozitive MiniBioLab de tip Lab-on-a-

Chip dar si micropatternuri cu forme si geometrii diverse. Sistemul permite perfuzarea controlata a chipurilor

cu pana la 10 lichide diferite (Figura A.3.). Sistemul permite asigurarea unei curgeri constante de pana la 7

nL/min, ceea ce este absolut necesar in cazul culturilor celulare pentru a se elimina stresul indus asupra acestora.

Controlerul, distribuitorul si senzorii de curgere sunt controlati de acelasi soft, ce permite inclusiv automatizarea

experimentelor atunci cand se doreste testarea pe intervale lungi de timp. Intr-o configuratie usor modificata,

sistemul permite generarea controlata de picaturi cu ajutorul unui chip dedicat (Figura A.4.). Astfel de

experimente permit izolarea in fiecare picatura a unei singure celule in prezenta unei doze prestabilite de

inhibitori, ca cei utilizati in cadrul proiectului pentru terapia melanomului.

Figura A.3. Componentele achizitionate si montajul realizat pentru asamblarea si testarea dispozitivelor

MiniBioLab.

Figura A.4. Configurarea sistemului pentru generarea de picaturi „on demand” pentru izolarea si testarea

unei singure celule.