1

Program PNCDI III - Creşterea competitivităţii economiei româneşti prin cercetare, dezvoltare şi inovare

Subprogramul 2.1. Competitivitate prin cercetare, dezvoltare şi inovare - Proiect experimental demonstrativ

RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC (RST)

„DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA DE SOLUȚII FIABILE PENTRU PRODUCERE DE BIOGAZ DIN BIOMASA

ALGALA IN REZERVAȚIA BIOSFEREI DELTA DUNARII” (acronim BIOALG)

Cod proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2016-0068

Contract 170PED/2017

ETAPA DE EXECUŢIE NR. 2/2018

Realizare model demonstrativ, experimente de fermentare anaerobă, monitorizare procese, diseminare și brevetare

Contractor: Institutul Național de Cercetare Dezvoltare pentru Inginerie Electrică, (INCDIE ICPE-CA) Partener P1: Institutul Național de Cercetare Dezvoltare Delta Dunării, Tulcea (INCDDD) Termen de predare: 05.12.2018

OBIECTIV GENERAL: Obiectivul general al proiectului îl reprezintă dezvoltarea unui model demonstrativ experimental de laborator de nivel TRL 3 ce va fi folosit pentru validarea de soluții fiabile si eficiente de valorificare energetică a biomasei algale prelevată din Rezervația Biosferei Delta Dunării, cu producere de biogaz și fertilizanți ecologici. Modelul demonstrativ va permite efectuarea de cercetări preliminare de laborator necesare identificării speciilor algale care pot fi utilizate pentru implementarea de tehnologii de biogaz in regiunea deltei Dunării.

OBIECTIVELE ETAPEI 2/2018: Obiectivele specifice etapei 2/2018 sunt următoarele: Realizarea modelului demonstrativ de laborator de nivel TRL 3; Evaluarea disponibilității algale din ecosistemele studiate; Verificarea functionalitatii modelului prin efectuarea de experimente de fermentare pe diverse tipuri de

biomasă algală prelevată din Rezervatia Biosferei Delta Dunării; Monitorizarea proceselor de fermentare, evaluarea producției și calității biogazului generat; Organizare simpozion national și participare la evenimente științifice în tematica proiectului. Brevetarea procedeului de fermentare biomasă algală și a modelului demonstrativ experimental de laborator

REZULTATELE ETAPEI 2/2018: Model demonstrativ de nivel TRL 3; Studiu tehnologic ce include evaluarea disponibilității algale din ecosistemele studiate și verificarea

funcționalității modelului demonstrativ prin raportarea de rezultate experimentale; Simpozion national organizat la coordonatorul de proiect; Comunicări știintifice la manifestări științifice naționale și internaționale; Model demonstrativ și tehnologie de fermentare brevetate – 2 cereri de brevet înregistrate la OSIM.

Activitatea II.1 - Realizare model demonstrativ pentru experimentele de laborator, Evaluarea disponibilitătii algale din ecosistemele naturale Activitatea II.2 - Efectuarea experimentelor de fermentare anaerobă și monitorizarea proceselor biochimice, analiza gazelor de fermentare; Izolarea și testarea/analizarea capacității fermentative a biomasei algale Activitatea II.3 - Organizare simpozion, diseminarea rezultatelor Activitatea II.4 - Brevetarea procedeului de fermentare biomasă algală și a modelului demonstrativ experimental de laborator

2

REZUMATUL ETAPEI 2/2018 Activitățile etapei a 2-a au avut ca scop principal realizarea modelul demonstrativ experimental de laborator de nivel TRL 3 și efectuarea de experimente de fermentare anaerobă a biomasei algale pentru evaluarea potențiaului de biogaz al acestora. Modelul demonstrativ include două incinte de fermentare echipate cu mantale de încălzire cu termoreglare ce asigură un regim de temperatura constant si controlabil și permite efectuarea de experimente de fermentare în paralel, pe două tipuri de substraturi algale diferite, fiind dotat cu componente de control a parametrilor de proces și de purificare biogaz. Cercetările experimentale au urmărit evaluarea potenţialului de biogaz a două tipuri de macroalge, respectiv Ulva intestinalis prelevată de la Marea Neagră și Cladophora prelevată din lacul Ciuperca, precum și a biomasei fitoplanctonice (microalge), care au fost supuse fermentării anaerobe în regim mezofil în modelul demonstrativ realizat. De asemenea, activitățile etapei au inclus o evaluare a disponibilității algale în ecosistemele studiate, activități de prelevare și izolare a macroflorei algale precum și de cultivare și concentrare a microflorei algale pentru experimentele de fermentare. Rezultatele experimentelor care au utilizat ca substrat de fermentare probe de macroalge marine și dulcicole confirmă faptul că este oportună continuarea, dezvoltarea şi implementarea de soluţii pentru obţinerea de biogaz din biomasă algală pentru comunităţile defavorizate din localităţile din Delta Dunării, utilizând resurse vegetale alternative de tipul macroflorei algale autohtone. În schimb, substratul organic reprezentat de biomasă microalgală s-a arătat mai recalcitrant la descompunerea anaerobă, iar calitatea biogazului generat a fost mai redusă decât în cazul utilizării de biomasă macroalgală. Rezultatele de laborator au evidenţiat faptul că în cazul speciilor autohtone utilizate pentru experimentele de fermentare este necesară îmbunătățirea procesului de izolare a speciilor şi ulterior a tratamentelor la care trebuie supusă biomasa recoltabilă astfel încât materialul biologic utilizat în instalațiile de biogaz să atingă într-un timp rapid parametri optimi pentru producerea de biogas. Drepturile de proprietate intelectuală asupra elementelor inovative obținute prin conceperea, realizarea și operarea modelului demonstrativ au fost protejate prin înregistrarea la OSIM a două cereri de brevet de invenție care se adresează modelului experimental, respectiv optimizării tehnologiei de fermentare. În data de 25 octombrie 2018 institutul coordonator INCDIE ICPE-CA a organizat simpozionul national ORIZONTURI NOI ÎN VALORIFICAREA BIOMASEI ALGALE ȘI REMEDIEREA HABITATELOR ACVATICE, eveniment la care au participat peste 60 oaspeți din mediul academic universitar și de cercetare, reprezentanți ai asociațiilor si clusterelor din domeniul biocombustibililor, tineri cercetători, masteranzi și doctoranzi, reprezentanți ai mediului de afaceri cu tradiție în domeniul valorificării biomasei algale. CUPRINS: Pag. Capitol 1 Realizare model demonstrativ. Prezentarea componentelor și a principiului de funcționare……………………………………………………………………………………………….......................

3

1.1 Introducere…………………………………………………………….……............................................. 3 1.2 Descrierea componentelor modelului demonstrativ……………………............................................ 3 1.3 Prezentarea sistemului de încălzire termoreglabil………………….………………………………….. 4 1.4 Modul de operare pentru experimente de fermentare optimizate….……………….......................... 5 1.5 Analiza factorilor care influențează producția de biogaz……………................................................ 6 1.6 Efectul salinității asupra fermentării anaerobe a biomasei algale……............................................. 8

Capitol 2 Evaluarea disponibilității algale din ecosistemele naturale………………………..……………...... 10 2.1 Introducere……………………………………………………………………………………………...…... 10 2.2 Caracterizarea zonei de studiu şi metoda de investigare a acesteia…………………………………. 10 2.3 Prelevarea, sortarea și izolarea macroflorei algale în vederea testării capacității de producere a

biogazului……………………………………......................................................................................

12 2.4 Prezența și distribuția actuală a macroflorei și microflorei algale în Rezervația Biosferei Delta

Dunării……………………………………………………………………………………………………....

12 2.5 Izolarea si testarea capacității fermentative a biomasei algale………………………………………... 15

Capitol 3 Experimente de fermentare anaerobă și monitorizarea proceselor……………………………...… 17 3.1 Experimente fermentare anaerobă probe de macroalge …….……….……………………………...... 17 3.2 Experimentare de fermentare anaerobă probă de microalge…..…………………………………....... 18

Capitol 4 Organizare simpozion national și activități diseminare informații………………………………..... 19 4.1 Simpozion national……………………………………………….……………………………………….... 19 4.2 Activități diseminare rezultate…………………………………………………………………………..….. 20

Capitol 5 Brevetarea procedeului de fermentare a biomasei algale și a modelului demonstrativ experimental de laborator……………………………………………………………………………………………....

20

5.1 Brevetare model demonstrativ pentru evaluarea potențialului de biometan…………………………………………………………………………………………………......

20

5.2 Brevetare procedeu de pretratare enzimatică a biomasei algale……............................................... 21 Capitol 6 Concluzii și recomandări………………………………………………………………………………….... 21 Bibliografie………………………………………………………………………....….................................................. 22

3

CAPITOL 1 - Realizare model demonstrativ. Prezentarea componentelor și a principiului de funcționare 1.1 Introducere

Problema epuizării combustibililor fosili și creșterea preocupării pentru poluarea mediului au atras atenția asupra surselor de energie regenerabilă. Printre noile tipuri de biomasă, algele marine sunt considerate resurse regenerabile atractive datorită productivității ridicate și a potențialului mai mare de fixare a dioxidului de carbon.

Fermentarea anaerobă este o tehnică utilizata pentru comercializarea cu succes a biogazului și este folosită pe scară largă pentru tratarea materiilor organice cu conținut ridicat de umiditate (umiditate 80-90%). Mai mult decat atât, fermentarea anaerobă a biomasei algale prezintă un randament energetic mai ridicat de 14,4 kJg- 1 masa uscată în comparație cu fermentația alcoolica cu un randament energetic de 1,2 și 6,6 kJ g-1. Algele sunt materii prime adecvate pentru producerea de metan prin fermentarea anaerobă, deoarece prezinta un conținut ridicat de zaharuri ușor hidrolizabile (alginat, laminaran și manitol) şi cantitati scăzute de celuloză și lignină.

Metodele actuale de producție biocombustibili lichizi din microalge generează aproximativ 60-70% biomasă reziduală care este un produs secundar ce poate fi valorificat suplimentar. Fermentarea anaerobă a acestui reziduu algal asigură o cantitate semnificativă de biogaz care poate fi utilizat sub formă de gaz combustibil sau pentru a genera energie electrică și termică. Se cunosc numeroase instalații de biogaz, variantele constructive și funcționale fiind foarte diverse, depinzând de materia primă utilizată ca substrat de fermentare, dar și de scopul pentru care acestea sunt proiectate: producere de gaz combustibil, producere de energie electrică și termică. Acestea sunt instalatii de capacitate medie si mare (volum reactor de fermentare 50 - 5000 m3), construite în cadrul fermelor sau la diverși producători din industria alimentară, în scopul tratării reziduurilor organice generate.

Pentru conceperea și dezvoltarea instalațiilor de biogaz au fost utilizate rezultatele testelor de laborator privind potențialul de biogaz al biomasei utilizate, teste care au fost desfășurate fie pe bioreactoare comerciale de laborator cu aplicabilitate multiplă, fie pe baza unor teste de fermentare a probelor de biomasă în vase de laborator sau in montaje experimentale concepute si realizate în cadrul unor lucrări de cercetare, acestea din urma nefiind instalații patentate. Testele de laborator se efectuează fie în incinte sau vase de fermentare cu alimentare continuă, fie cu alimentare în șarje. Scopul testelor de laborator este optimizarea procesului de fermentare anaerobă în condiții de aplicabilitate practică, pentru stabilirea unui echilibru între condițiile optime de fermentare și balanța cost-beneficiu a întregului proces.

Prin proiectul BIOALG s-au deschis noi orizonturi în testarea şi utilizarea durabilă a resurselor regenerabile, respectiv în utilizarea în scop economic a speciilor care prin dezvoltarea lor explozivă pot provoca dezechilibre ale ciclurilor biogeochimice sau ale echilibrului piramidei trofice sau aduce prejudicii de natură economică. Utilizarea macroalgelor în testele demonstrativ-experimentale cu scopul de a evidenţia eficienţa acestora în producerea de biogaz, au creat premisele atât pentru noi direcţii de cercetare în Delta Dunării, cât şi pentru descoperirea unor surse de energie alternativă (producerea şi utilizare de biogaz pentru comunităţile izolate ale deltei din resurse locale, neexploatate până în prezent) ce ar putea fi pe viitor exploatate în beneficiul populaţiei locale (Angelidaki, 2009).

Unul dintre obiectivele specifice ale etapei a II-a a proiectului BIOALG îl reprezintă dezvoltarea unui model demonstrativ experimental de laborator de nivel TRL 3 pentru validarea de soluții fiabile și eficiente de valorificare energetică a biomasei algale prelevată din Rezervația Biosferei Delta Dunării. Modelul demonstrativ experimental de laborator realizat prin acest proiect este destinat proceselor de fermentare anaerobă a biomasei algale cu producere de biogaz, permițând efectuarea simultană a două experimente de fermentare anaerobă pentru reducerea timpului de lucru și eficientizarea studiului comparativ.

1.2 Descrierea componentelor modelului demonstrativ Experimentarile de fermentare anaeroba pentru probele de biomasă algală au fost efectuate în modelul

demonstrativ de laborator de nivel TRL 3 care permite efectuarea în paralel de experimente de fermentare pe două tipuri de substraturi organice algale diferite, ambele incinte asigurând aceleași condiții de mediu pentru descompunerea masei organice. De asemenea, modelul demonstrativ asigură un regim de temperatura constant si controlabil, in domeniu termic mezofil si/sau termofil, fiind dotat cu componente de control a parametrilor de proces (temperatură și presiune), porturi de intrare/iesire gaze, componenta de imbogățire în biometan, componenta de uscare biogaz si sistem de masurare a volumului de biogaz prin dislocuire. La alegere, masurarea volumului de biogaz in incintele de fermentare se poate realiza si manometric, din creșterea presiunii gazelor de proces. Modelul demonstartiv realizat în cadrul acestui proiect are în componența sa următoarele părți constituente: - Doua incinte de fermentare confecționate din inox, avand capacitatea de 5 litri, prevăzute cu capace detasabile în

care diverse gaze inerte precum argon, azot, pot fi folosite pentru crearea condițiilor anaerobe prin purjarea aerului din masa organică și din spațiul aflat deasupra masei organice, dar și pentru a presuriza substratul organic de fermentare în cazul efectuării de experimente în condiții de presiune hidrostatică ridicată; incintele de fermentare sunt echipate cu mantale de încălzire cu termoreglare, cu manometre de presiune, intrări/ieșiri gaze (gaz inert, biogaz) si gura de alimentare/evacuare prevăzută cu garnitură de etanșare pentru evitarea pierderilor de gaz;

- Două vase de purificare biogaz, adică de îmbogățire în biometan, cate un vas pentru fiecare incintă de fermentare; - Două vase de uscare a biogazului purificat, câte un vas pentru fiecare incintă de fermentare;

4

- Două pungi de prelevare și stocare biogaz, fiecare avand volumul de 5 litri, tip Supel-Inert Multi-Layer Foil, captusite cu folie de aluminiu impotriva permeabilizării, dotate cu valva si sistem de prelevare gaz pentru analiza chimica, câte o pungă pentru fiecare incintă de fermentare;

- Sistem de măsurare prin dislocuire a volumului de biogaz generat în incintele de fermentare;

- Rezervor portabil de alimentare probă de biomasă algală și rezervor portabil de evacuare nămol fermentat;

- Stand de sustinere componente model experimental, structurat pe trei nivele.

Imaginea de ansamblu a modelului experimental demonstrativ de laborator este prezentată în figura 1.1:

Fig. 1.1 Model experimental demonstrativ de laborator

1.3 Prezentarea sistemului de încălzire termoreglabil În cadrul procesului de fermentare au fost utilizate două incinte încălzite electric si monitorizate conform unui

regim de temperatura impus. Controlul temperaturii s-a realizat cu ajutorul unui termostat electronic, cu rolul de a furniza si menţine temperatura constanta, prestabilita în cele două incinte. Incalzirea a fost realizata cu ajutorul unui conductor de tipul Kanthal, avand diametrul de 0,2 mm, cu rezistenta electrica de 150, izolat din punct de vedere electric intr-o membrana de polimer, infasurat spiralat pe suprafata cilindrica a corpului incintei. Distanta intre spire a fost aproximata la 10mm, astfel incat sa se asigure un regim de temperatura constant in domeniul 37 0C ±20C. Incintele de fermentare prevăzute cu înfășurarea realizată din conductorul de Kanthal și banda de fixare sunt prezentare în imaginea din figura 1.2:

Fig. 1.2 Ansamblul general al incintelor cu termostat (fara mască/capac) Principalele date tehnice ale termostatului sunt urmatoarele:

- Gama de temperatură: +37 0C ±2°C; - Histerezis reglabil: 0,5…2°C; - lesire pe releu cu contacte NI/ND,6A/250V; - Tensiune de alimentare: 230Vca/50Hz

Temperatura mediului ambiant in laborator a fost asigurata in permanenta de un sistem de climatizare programat in jurul valorii de: +240C. Schema electrică de principiu a termostatului electronic cuprinde senzorul de temperatura, un circuit comparator cu histerezis, un etaj repetor de tensiune, elemente de comanda si control. S-a utilizat ca senzor de temperatură circuitul integrat specializat Lm135/335. Transmiterea comenzii la elementul de încălzire al incintei monitorizate este separata galvanic si se realizeaza printr-un releu electromagnetic. Senzorul de temperatură LM135 se conectează cu catodul la borna E, anodul la GND, iar pinul Adj rămâne neconectat. Senzorul de temperatura a fost amplasat si fixat in imediata apropiere a rezistentei termice pe suprafata incintei. In plus, avand in vedere ca incintele de fermentare trebuie incalzite un număr mai mare de zile, pentru evitarea oricaror evenimente nedorite a fost prevazut si un senzor cu termocuplu care sa decupleze sistemul la o temperatura de peste 80°C. La bornele A şi B se conectează un voltmetru electronic cu intrare flotantă cu ajutorul căruia se poate vizualiza atât temperatura din incintă (măsurată de senzor), cât şi temperatura prescrisă de operator. La bornele notate SET se montează un pushbuton care, dacă este acţionat, va determina afişarea temperaturii prestabilite, altfel voltmetrul va afişa temperatura din incintă. Cum senzorul de temperatură LM135 are o pantă liniară de 10mV/K pentru ca afişarea să se facă în grade Celsius este necesar translatarea tensiunii oferite cu cca. 2,73V, conform conversiei grad Kelvin - grad Celsius. Translatarea potenţialului de la borna A (corespunzătoare intrării pentru voltmetru) se face cu divizorul rezistiv R1- R2 –S1. Cu unul din cele două amplificatoare operaţionale din capsula circuitului integrat LM358 (CI1B) s-a realizat un comparator cu histerezis care compară potenţialul de pe borna cursorului potenţiometrului RV2 (temperatura prescrisă) cu potenţialul bornei In (temperatura incintei) la care este conectat catodul senzorului LM135. R9 şi RV3 formează calea de reacţie pozitivă, histerezisul comparatorului reglându-se în limitele stabilite din S3. CI1A este configurat ca un repetor de tensiune, potenţialul de pe borna neinversoare regăsindu-se şi la pinii C si D (bineînţeles şi la borna inversoare), dar pe o impedanţă foarte mică. Această situaţie face ca atunci când push-butonul este acţionat, la borna B să avem numai potenţialul de pe cursorul lui S2, deoarece potenţialul de pe catodul senzorului se aplica pe aceasta borna printr-o rezistenţă mult mai mare de 10k (R4). Divizorul R10-R11 asigură polarizare corectă pe baza tranzistorului comutator Q1 (BC547) care are ca sarcină bobina releului şi LED-ul indicator D1, (semnalizează închiderea contactului normal deschis al releului – Q1, este saturat). Termostatul se alimentează cu tensiune continuă de 5V, stabilizată cu regulatorul liniar de curent mic IC2, de tip LM7805. Tensiunea alternativă joasă, de 9Vca, se obţine de la transformatorul TR1. Puntea redresoare este de tip 1PM1 (1A,100V), iar releul utilizat, tip Omron, are contacte normal deschise şi normal închise.

5

1.4 Modul de operare pentru experimente de fermentare optimizate Activităţile experimentale desfăşurate în cadrul prezentei etape de proiect au avut ca scop realizarea unui

model demonstrativ care să valideze potențialul de biogaz al biomasei algale prelevată din Rezervația Biosferei Delta Dunării, în vederea valorificării energetice a caesteia în sisteme de biogaz. Cercetările experimentale au urmărit evaluarea potenţialului de biogaz a două tipuri de macroalge, respectiv Ulva intestinalis prelevată de la Marea Neagră și Cladophora prelevată din lacul Ciuperca, precum și a biomasei fitoplanctonice (microalge), care au fost supuse fermentării anaerobe în regim mezofil în modelul demonstrativ realizat. Experimentele au fost desfășurate în paralel în cele două incinte de fermentare, fiecare incintă având volumul de 5000 ml. In cadrul experimentelor pe modelul demonstrativ au fost efectuate urmatoarele activitati:

analize privind compozitia chimica a materiei prime alimentate si a biogazului generat în proces; monitorizarea parametrilor de lucru.

Experimentele de fermentare anaerobă au fost conduse în regim staţionar, respectiv instalaţia de laborator a fost alimentată şi lăsată să funcţioneze până la epuizarea substratului organic. Materialul de alimentare luat în studiu a fost substrat organic de biomasă algală diluată cu apă, la care s-a adăugat material de inocul de tip dejectii de vite în raport substrat/inocul=10/1. Amestecul a fost menţinut în reactor un timp necesar pentru ca bacteriile să descompună substanţele organice până la stadiul final de biogaz. S-a considerat că procesul este finalizat atunci cand cantitatea de biogaz produsă de instalaţie s-a redus semnificativ si s-a menţinut redusă cel puţin trei zile consecutiv. Monitorizarea modelului demonstrativ de fermentare anaerobă s-a realizat prin măsurarea volumului de biogaz produs şi determinarea compoziţiei acestuia. Analiza compoziţiei biogazului produs s-a realizat utilizând un gaz cromatograf Varian 450 dotat cu detector TCD. Măsurarea volumului de biogaz s-a realizat prin măsurarea volumului de apă dislocuit dintr-un cilindru gradat scufundat într-un vas de apă pentru asigurarea închiderii hidraulice. Experimentul de fermentare anaerobă cu producere de biogaz s-a desfăşurat la o temperatură de 371C. Ca sursă de incalzire s-a folosit o manta de incalzire electrică realizată dintr-un conductor de Kanthal conform descrierii de la punctul 1.3. Menţinerea procesului de fermentare la temperatură constantă s-a realizat cu ajutorul termostatului electronic. Omogenizarea substratului organic de biomasa algala din incintele de fermentare a fost asigurată de două ori pe zi, prin agitarea manuala ușoară a incintelor pentru prevenirea formării de cruste și depunerii de sediment la baza vaselor. Reprezentarea schematică a componentelor și modului de operare a instalației de laborator sunt prezentate în imaginea din figura 1.3. Fig. 1.3 Reprezentarea schematică a modului de operare a instalației de laborator (1-incinta de fermentare, 2–manta de încălzire, 3–vas de spălare biogaz, 4–vas de uscare biogaz, 5–sistem de măsurare volum, 6–sac biogaz

Experimentele s-au desfăşurat pe o durată totală de 70 zile, considerându-se finalizate când instalaţia nu a mai produs biogaz timp de trei zile consecutiv. Incintele de fermentare au fost alimentate manual, cu ajutorul unei pâlnii fixate în gura de alimentare a acestora, cu o masă organică formată din substrat de biomasă algală și inocul dejecții de vite în raport volumetric de 10:1. Alimentarea instalației s-a realizat astfel încât să nu se depășească un maxim de umplere de 70% din volumul incintelor, pentru ca mişcarea masei datorate omogenizării manuale dar şi spumării ca reacţie a procesului fermentativ, să nu determine antrenarea de material lichid pe tubul de evacuare biogaz. Înainte de alimentarea masei organice în incintele de fermentare, s-au determinat următorii parametri fizico-chimici ai biomasei algale: solide totale, solide volatile, umiditate, pH. Ținând cont de faptul că conţinutul de solide totale nu trebuie să depăşească concentraţia de 8%, s-a determinat cantitatea de apă care trebuie adăugată masei organice algale pentru atingerea consistenţei necesare şi s-a realizat amestecul de fermentare înainte de alimentarea în incintele de fermentare. Două din cele trei cauze majore care duc la eşuarea procesului de fermentare anaerobă şi a producţiei de biogaz sunt supraîncarcarea hidraulică şi organică. În primul caz, apa în exces distruge microorganismele formatoare de metan care sunt mai sensibile, făcând să crească concentraţia bacteriilor acidogene mult mai rezistente şi în consecinţă pH-ul masei. În cazul supraîncărcării organice, fie creşte cantitatea de solide volatile ca urmare a excesului de masă organică, fie este redusă capacitatea reactorului prin acumularea de crustă şi sediment, făcând ca volumul efectiv al reactorului să devină insuficient pentru masa organică alimentată. După pregătirea amestecului optim s-a determinat pH-ul amestecului pentru a se verifica că acesta se încadrează în domeniul de pH 7 – 8. S-a ajustat valoarea pH-ului cu ajutorul unei soluţii de hidroxid de sodiu 0,1N. După alimentarea incintelor de fermentare s-au creat condițiile anaerobe prin evacuarea aerului de la suprafața și din interiorul substratului, prin purjare cu azot puritate 5.5, timp de 3 minute, apoi gura de alimentare a fost închisă etanș şi s-a pornit încălzirea electrică care controlează ambele incinte. Temperatura de operare nu trebuie să varieze cu mai mult de 2 0C; controlul temperaturii trebuie să se facă astfel încât să nu aibă loc variaţii de temperatură mai mari de 0,50C pe zi, sau de 1,70C la zouă zile. Procesul de fermentare s-a desfăşurat la temperatură controlată de 37±1 0C.

6

Biogazul generat este evacuat prin gura de evacuare, fiind trecut prin componenta de spălare pentru reținerea bioxidului de carbon în solutie de hidroxid de sodiu 1 N, apoi prin componenta de uscare pentru reținerea valorilor de apă, după care ajunge în sacul de captare și stocare. Monitorizarea procesului de fermentare se efectuează periodic prin determinarea volumului de biogaz produs precum și prin măsurarea concentrației de biometan in biogazul generat. Prelevarea biogazului se face prin sistemul de prelevare prevazut cu port de prelevare. Volumul de biogaz stocat în sacul de colectare este masurat după fiecare analiză chimică, cuplând sacul de prelevare la sistemul de masurare a volumului prin dislocuire. Datele obținute privind volumul de biogaz și concentrația de metan sunt înregistrate tabelat iar producția de biogaz și concentrația de metan sunt reprezentate grafic pentru toată perioada de fermentare.

1.5 Analiza factorilor care favorizeză/inhibă producția de biogaz Cunoaşterea proceselor fundamentale implicate în fermentarea anaeroba cu producere de biometan este foarte importantă pentru proiectarea, construirea şi operarea instalaţiilor de biogaz. Deşi fermentarea anaerobă este un proces care se petrece în mod natural în zonele mlăştinoase încă de la formarea planetei, procesul tehnologic de obţinere a biogazului necesită o atenţie şi o monitorizare deosebită pentru menţinerea în reactor a unor condiţii optime de temperatură, pH, umiditate, agitare şi compoziţie a masei organice, în vederea descompunerii complete a substanţelor organice până la stadiul final de biogaz. Numeroşi factori ecologici afectează procesele biochimice care au loc în incintele de fermentare anaerobă pentru producerea biogazului (B.J. Gallagher, 2011). Principalii parametri tehnologici de care trebuie sa se tina seama in controlul si monitorizarea procesului de fermentare anaeroba sunt următorii: o Materia primă

Materia primă cu încărcare organică utilizată drept biomasă în reactoarele de fermentare anaerobă este principalul factor care determină producţia de biogaz pentru situaţia în care se doreşte obţinere de biogaz cu un excedent energetic semnificativ faţă de autoconsumul energetic adică faţă de biogazul necesar nevoilor termice proprii ale sistemului de producere a lui. Materia primă trebuie să asigure mediul prielnic dezvoltării şi activităţii microorganismelor ce concură la digestia substratului şi, în final, la producerea biogazului. Acest mediu trebuie să satisfacă următoarele condiţii [66]: să conţină materie organică biodegradabilă; să aibă o umiditate ridicată, peste 90%; să aibă un pH neutru sau aproape neutru (6,8 – 7,3); să conţină carbon şi azot într-o anumită proporţie (raportul C/N: 15-25); să nu conţină substanţe inhibitoare pentru microorganisme (metale grele, detergenţi, antibiotice, sulfaţi în concentraţii mari, formol, fenoli şi polifenoli etc. Conţinutul în materii organice al nămolurilor organice, natura şi structura acestora influenţează randamentul de fermentare. De obicei, randamente ridicate se obţin atunci când conţinutul iniţial de materii organice caracteristice este mare. o Calitatea inoculului

Cantităţi mari de inocul asigură un proces rapid de metanogeneză şi atingerea într-un timp mai scurt a nivelului de concentraţie optim al biomasei active în reactor. Totuşi, aceasta ridică mult costurile operării. Dimpotrivă, din cantităţi iniţiale mici de inocul biomasa activă se dezvoltă greu şi inegal (ţinând seama că microorganismele din „consorţiul” de metanogeneză nu au aceeaşi rată de creştere). o Temperatura din reactor

Producţia de biogaz este puternic influenţată de temperatura din reactorul de fermentare. Temperatura optimă care asigură o activitate microbiană maximă este de 35-370C pentru microorganismele mezofile şi de cca. 600C pentru cele termofile. La temperaturi mai mici de 20oC, producerea de biometan decurge cu viteză redusă deşi fermentarea in general este mai puţin afectată (Murphy, 2011). În general se foloseşte domeniul 30-38C, corespunzător fermentării mezofile. Pentru cantităţi de nămol reduse, se foloseşte fermentarea criofila. Fermentarea termofila (50-55C) prezintă avantajul reducerii duratei de fermentare dar implică consum energetic suplimentar şi favorizează formarea de cruste şi spumă în rezervoarele de fermentare. Prin urmare, in experimentele de fermentare abiomasei algale s-a ales regimul termic mezofil, mai stabil. o Presiunea hidrostatică

Presiunea are o mare importanţă în procesul de metanogeneză. S-a arătat că, atunci când presiunea hidrostatică în care lucrează microorganismele metanogene creşte peste 4–5 metri coloană de apă, producerea de metan practic încetează. Ea reîncepe atunci când presiunea hidrostatică scade la valori mai mici. Această constatare este foarte importantă la proiectarea fermentatorului (Raja, 2008). Pentru înlăturarea acestui inconvenient major, au fost realizate fermentatoare în flux orizontal, la care înălţimea substratului nu depăşeşte 3,5 metri, degajarea de metan producându-se în intreaga masă a materialului supus fermentării.

In prezentul studiu de cercetare experimentele de laborator sunt realizate in conditii de presiune hidrostatica foarte apropiate de presiunea atmosferica, cresterea maxima acceptabila in incinta de fermentare pentru a nu deranja procesele biochimice fiind de 0,5 bari. o Încărcarea specifică a reactorului

Încărcarea organică reprezintă cantitatea de CCOCr introdusă în reactor într-o zi şi pe unitatea de volum a reactorului sau în kg materie organica/m3 de digestor /zi. Ea indică încărcarea nominală care poate fi acceptată de digestor pentru un randament de degradare optim şi permite compararea cantităţii de poluant tratat în diverse tipuri de fermentatoare. Este exprimată în unităţi de masă de materie primă (transformată în materie uscată, materie

7

organică sau CCOCr) pe 1 unitate de volum util al reactorului şi pe zi. Debitul de alimentare cu nămol proaspat şi cel de evacuare a nămolului tratat trebuie optimizate, pentru a evita şocurile în dezvoltarea microorganismelor.

Modelul demonstrativ realizat in aceasta etapa de proiect permite desfasurarea de experimente in sarja, incarcarea organica a incintelor de fermentare fiind calculata astfel incat sa existe un raport optim de substrat/inocul cu co compozitie de solide totale si solide volatile organice in intervalul recomandat in datele de literatura, pentru o productie de biometan optima. o Timpul de retenţie hidraulică (durata de staţionare în reactor)

TRH-ul permite cunoaşterea volumului de influent care poate fi tratat în fiecare zi în reactor. TRH-ul este un parametru operaţional, un timp de retenţie lung permitand un grad de biodegradare ridicat dar şi gernerarea unui volum mare de biogaz.

Timpul de retentie hidraulica este in general minim 4 săptămâni pentru deşeurile solide şi semisolide (nămoluri reziduale, inclusiv biomasa algala) şi poate fi de câteva ore pentru substraturile foarte biodegradabile, cum sunt anumiţi efluenţi industriali proveniti din industria zaharului sau de procesare a materialelor bogate in amidon; o Aciditatea masei organice

În cursul procesului de fermentare anaerobă, este necesară menţinerea unui echilibru dinamic între formarea acizilor volatili (produşii primei faze de degradare) şi consumarea lor de către bacteriile metanogene, adică un conţinut de acizi volatili relativ scăzut (500 mg CH3COOH/l). Având în vedere sensibilitatea deosebită a bacteriilor metanogene la variaţii mici ale pH-ului, funcţionarea corectă a procesului impune menţinerea pH-ului în limite relativ restrânse.

Perturbarea metabolismului bacteriilor metanogene determină acumularea în mediu a acizilor volatili, datorită procesului lent de asimilare a acestora. Deşi, până la un punct, ei sunt neutralizaţi de alcalinitatea nămolului, care are capacitate de tamponare datorită prezenţei bicarbonaţilor, după epuizarea acestora se încetineşte activitatea bacteriilor metanogene şi se produce un dezechilibru care perturbă procesul până la blocarea acestuia.

Nivelul pH-ului nămolului în interiorul reactorului este un factor critic în fermentarea anaerobă şi trebuie menţinut cât mai aproape de 7, intervalul 6,6-7,4 fiind considerat acceptabil. Pentru menţinerea pH-ului în domeniul 6,6-7,4 se impune ca alcalinitatea datorată bicarbonatilor să se situeze la un nivel de minim 1000 mg CaCO3/l, iar aciditatea datorata acizilor volatili sa nu depaseasca 50% din aciditatea totala. o Omogenizarea masei organice

În interiorul fermentoarelor au loc nu numai procese biochimice, ci şi procese fizice. Astfel, s-a constatat că în cursul fermentării are loc o segregare a materialului supus fermentării. Microbulele de gaze care se degajă în masa substratului antrenează, prin fenomenul de flotaţie, particulele mai uşoare de suspensii spre suprafaţa lichidului. În consecinţă, se formează o crustă cu tendinţă de întărire şi deshidratare chiar dacă materialele organice din ea nu au apucat să fie degradate prin fermentare.

O altă parte a suspensiilor, mai grele prin natura lor, sau fracţiuni care au fermentat şi care sunt parţial sau total mineralizate, au tendinţa să se lase spre partea de jos a fermentatorului. Între aceste două straturi se găseşte un strat de lichid în care fermentarea şi epuizarea materiei organice continuă din ce în ce mai lent.

Amestecarea adecvata uniformizează temperatura şi concentraţia în materii organice în masa reactorului şi măreşte şansele de contact între microorganisme şi substrat. Intensitatea amestecării poate explica şi valoarea mai mare a randamentului obţinut în laborator, comparativ cu cel industrial. Cu toate acestea, trebuie tinut cont de faptul ca omogenizarea masei prin agitare mecanica implica un consum energetic care scade balanda energetica a intregului sistem.

Experimentele efectuate in cadrul acestui proiect de cercetare prevad o omogenizare discontinua, manuala, a substratului de biomasa algala, astfel incat sa se evite riscurile de formare crusta si sediment in incintele de fermentare dar fara un consum energetic suplimentar. o Raportul Carbon/Azot

Azotul este în primul rând important pentru creşterea celulelor biomasei active. Necesarul este de cca 1,7g azot/100 g materie primă şi dacă nu este asigurat prin compoziţia materiei prime, se recurge la nutrienţi introduşi odată cu aceasta (de ex., uree). Mineralizarea azotului produce amoniac şi ioni amoniu, cu rol de tampon asupra alcalinităţii soluţiei. Valorile optime ale raportului C/N sunt în intervalul 15 – 25.

Substraturile organice de biomasa algala conţin necesarul de nutrienţi pentru desfăşurarea normală a reacţiilor biochimice, insa trebuie avutin vedere caraportul carnon/azot al acestora se situeaza in general sub intervalul recomandat, deci codigestia cu materiale organice bogate in carbon este recomandata. o Prezenţa unor micronutrienţi

Metanogeneza necesită prezenţa nichelului, cobaltului, molibdenului, tungstenului, seleniului şi fierului. Nichelul este esenţial metanogenelor pentru formarea factorului F430 şi în plus faţă de molibden, tungsten şi seleniu este necesar şi altor anaerobe. Fierul în concentraţie de 0,4-2,0 mM, a stimulat digestia optimă a celulozei de către culturi îmbogăţite. Sulfatul în concentraţii de până la 0,8mM poate îmbunătăţi metanogeneza în culturi îmbogăţite, iar sulfurile sunt necesare la nivele de concentraţie mai mari de 0,1mM pentru creşterea câtorva metanogene. Ionii toxici de metale grele şi ionii metalici în concentraţii mici sunt precipitaţi ca sulfuri, în acest fel fiind înlăturată acţiunea lor toxică. Sulfurile disponibile pot fi un factor limitativ. [82].

8

Nivelul de ioni de sodiu trebuie să fie de cca 50mM, iar concentraţia de Fe2+ trebuie să se situeze în intervalul 2 – 100 mM. Alte metale, precum Co in concentratie in jur de 50nM si Ni in concentratie in jur de 100 nM sunt şi ele esenţiale metanogenezei. o Efectul unor substanţe toxice (metale grele, etc.)

Dereglarea procesului de fermentare se poate datora prezenţei substanţelor toxice Anumite substanţe prezente în mediu pot limita capacitatea metabolică a microbiotei de fermentare. Principali potenţiali inhibitori ai metanogenezei sunt metalele grele, hidrocarburile clorurate, detergenţii, cloroformul, amoniacul, clorura de sodiu etc., cu menţiunea că un compus este toxic sau nu, în funcţie de concentraţia şi de disponibilitatea sa în mediu. Metalele grele, metalele alcaline şi alcalino-pământoase, detergenţii, sulfurile intră în categoria substanţelor cu acţiune toxică.

S-a constatat că orice substanţă în cantitate prea mare poate exercita o acţiune toxică. În plus, procesele sinergice, antagonice şi de aclimatizare modifică concentraţia la care o substanţă devine toxică. Chiar amoniacul generat de proces poate deveni toxic, la concentraţii de peste 1.7 g amoniu/l (nivel uşor de in aplicatii industriale care trateaza substrat organic bogat in azot). Ionii de metale grele au efect inhibitor deşi, în cantităţi mici, aceştia sunt convertiţi în sulfuri insolubile şi părăsesc sistemul, precipitând. Pentru a uşura acest proces, este necesară introducerea unor cantităţi de ioni sulfat în masa de reacţie şi se impune urmărirea nivelului de microorganisme capabile să reducă ionii sulfat. De fapt procesul de precipitare a metalelor grele ca sulfuri, în epurarea unor ape uzate cu conţinut ridicat de metale grele este bine cunoscut şi aplicat la scară industrială. o Influenţa altor substanțe inhibitoare

Unele substanţe organice, cum ar fi urme de antibioticele prezente în hrana animalelor sau in apele de acvacultura, inclusiv in mediul acvatic de unde este recoltata biomasa algala, inhibă procesul de metanogeneza. Substanţele dezinfectante pe bază de CS2/ cloroform inhibă metanogeneza nămolului urban aproape complet (inhibiţie 90% la concentraţii de 0,03ml/l). Restabilirea procesului nu se produce nici atunci când dezinfectanţii care conţin aldehide, alcoli, fenoli şi compuşi cuaternari de amoniu sunt usor toxici .

1.6 Efectul salinităţii asupra fermentării anaerobe a biomasei algale Algele marine conţin un procent ridicat de minerale (~ 3% din greutate în stare proaspătă), care poate afecta

activitatea microorganismelor implicate în procesul fermentării anaerobe (A.J. Ward, 2014). Studiile anterioare demonstrează că un conținut redus de minerale este esențial pentru creșterea microbiană deoarece stimulează metabolismul celular al microorganismelor, în timp ce un conținut ridicat de minerale este extrem de toxic pentru bacteriile metanogene și interferează cu metabolismul bacterian. Sărurile minerale includ în principal ioni de metale ușoare cum ar fi sodiu, calciu și magneziu. La concentrații scăzute, acești ioni metalici sunt surse necesare de nutrienți pentru cresterea microbiana. De exemplu, calciul și magneziul sunt componente importante în sinteza macromoleculelor biologice și magneziul acționează ca un activator al enzimelor biologice (S. Wang, 2017). În ceea ce priveşte ionii metalici, s-a constatat că pentru a îmbunătăți performanța fermentarii anaerobe, concentrațiile ionilor de sodiu, potasiu și calciu trebuie sa fie mai mici de 350, 400 și respectiv 200 mg/l. La concentrații mari, acesti ioni pot împiedica creșterea microbiană, și chiar provoca inhibarea fermentării anaerobe. De asemenea, o concentrație de potasiu de 5,85 mg/l determină o inhibare de 50% a bacteriilor metanogene care utilizează acetat, iar concentrații de sodiu cuprinse între 3,5-28 g/l determină diferite grade de inhibare a performanței fermentării anaerobe. Anumite specii de alge care au fost identificate pentru potențialul lor ca materie primă pentru biocarburanții lichizi sunt cultivate într-un mediu salin. Utilizarea apei sărate pentru producerea acestora reprezintă o alternativă durabilă datorită capacității de a folosi terenuri nearabile și apa de mare, reducând astfel presiunea asupra terenurilor agricole actuale și a resurselor limitate de apă dulce (Y. Zhang, 2017). În literatura de specialitate, speciile marine Macrocystis pyrifera, Tetraselmis sp. şi Cianobacteria Spirulina sp au fost folosite ca substrat pentru fermentarea anaerobă, fiind, de asemenea considerate ca având potențial de a fi cultivate în apele saline. Se constată că sărurile de metale alcalico-pamantoase sunt necesare în concentraţii foarte scăzute pentru metabolismul celular al bacteriilor, întrucât la concentraţii mai mari, acestea pot fi extrem de toxice pentru bacteriile metanogene. Salinitatea, şi mai specific cationii divalenti de Na reprezintă o problemă pentru bacteriile asociate fermentării anaerobe. Vergara-Fernandez și colab. au demonstrat că fermentarea microalgelor marine în condiţii saline este posibilă cu o salinitate reală a substratului mai mică decât cea a de apei de mare (A.J. Ward, 2014). Nivelurile ridicate de salinitate s-au dovedit a fi inhibitoare, deoarece pot determina deshidratarea celulelor bacteriene din cauza presiunii osmotice crescute. Salinitatea poate varia în funcție de sursa de apă și de mediul asociat. Asa cum am precizat anterior, ionii metalici ușori incluzând sodiu, magneziu, calciu și aluminiu pot fi toxici la concentraţii ridicate. Ionul de sodiu inhibă cel mai mult ferementarea anaerobă, gasindu-se într-un procent ridicat în apa de mare. Totuși, inhibarea datorată sodiului variază în funcție de sursa inoculului și de compoziția elementară globală a apei saline și a substratului care este fermentat (Y. Zhang, 2017). Întrucât producția de metan în procesele de fermentare anaerobă a microalgelor marine este inhibată de sărurile de mare, studii recente îşi propun să investigheze performanța fermentării anaerobe a algelor marine prin aclimatizarea inoculului la variaţia salinităţii și analiza influenţei asupra randamentului teoretic şi specific al metanului. Randamentul teoretic al metanului pentru substrat este calculat folosind relația stoechiometrică raportată de Buswell și Boruff. În ecuația (1) a, b, c și d reprezintă conținutul de carbon, hidrogen, oxigen și, respectiv, azot.

9

𝐶𝑎𝐻𝑏𝑂𝑐𝑁𝑑 + (4𝑎−𝑏−2𝑐+3𝑑

4) 𝐻2𝑂 → (

4𝑎+𝑏−2𝑐−3𝑑

8) 𝐶𝐻4 + (

4𝑎−𝑏+2𝑐+3𝑑

8) 𝐶𝑂2 + 𝑑𝑁𝐻3 (1)

Randamentul teoretic al metanului exprimat în mL CH4 g-1 de solide volatile (VS) este dat de urmatoarea relaţie: 𝜂𝑡 = (

4𝑎+𝑏−2𝑐−3𝑑

12𝑎+𝑏+16𝑐+14𝑑) ∗ 𝑉𝑚 (2)

unde Vm este volumul molar normal de metan. Randamentul specific de metan exprimat în ml CH4 pe gram de solide volatile (VS) are urmatoarea expresie :

𝜂𝑠 = (𝑉1−𝑉2

𝑉𝑆) (3)

unde V1 este volumul cumulat de metan (mL) V2 este volumul de metan în proba martor (mL) VS reprezinta solidele totale volatile din materia prima (g VS) Performanţa fermentării anaerobe a algelor brune la diferite grade de salinitate Pentru evaluarea performantei fermentării anaerobe a algelor brune la diferite grade de salinitate, în literatura de specialitate s-au efectuat numeroase experimentări din care reiese potenţialul biochimic al metanului (BMP).

Într-un studiu de analiză al potențialului de biometan realizat de Yi Zhang şi colaboratorii săi pentru macroalga Laminaria japonica în stare uscată, se constată că randamentul teoretic de biometan al substratului este de 422 ml CH4 /g VS, iar randamentul specific de metan este de 267,46 ± 20,8 ml CH4 /g VS. De asemenea, randamentul cumulat de metan reprezintă mai mult de 90% din producția totală de metan pe fermentare, în ziua 10, conținutul de metan atingand aproximativ 65% după fermentarea din ziua 5. Prin urmare, biomasa algelor poate fi transformată eficient în metan prin fermentare anaerobă în conditii de non-salinitate. Rezultatele sunt similare cu cele obtinute de Mussgnug și colab. Aceste studii demonstrează că Laminaria japonica poate fi un substrat adecvat pentru fermentarea anaerobă în conditii de non-salinitate. Tabelul 1.1 arată performanța de producere a biogazului prin fermentare anaerobă la diferite grade de salinitate pentru o proba martor (S0) şi probele cu concentraţii diferite de sare (S1: 15 g/l; S2: 25 g/l ; S3: 35 g/l1 (conditiile apei de mare); S4: 45 g/l; S5: 55 g/l; S6: 65 g/l; S7: 75 g/; S8: 85 g/l). Salinitatea este modificată prin adăugarea sărurilor anorganice în stare cristalină, compoziţia principalilor ioni fiind similară cu cea conţinută în apa de mare : NaCl, MgSO4, MgCl, CaCl2 si KCl.

Tabel 1.1 Performanţa producției de biogaz obţinută prin fermentarea anaerobă a algelor marine la diferite grade de salinitate

Proba Randamentul de biogaz (ml/gVS)

Randamentul de metan (ml CH4/ gVS)

Conţinutul de metan (%)

S0 480.22 ± 24.22 258.91 ± 8.11 53.94 ± 1.03 S1 494.9 ± 11.86 275.78 ± 0.66 55.74 ± 1.02 S2 418.71 ± 52.39 247.85 ± 17.22 59.4 ± 2.47 S3 401.93 ± 8.9 220.88 ± 5.05 54.98 ± 2.47 S4 265.45 ± 51.65 146.83 ± 22 55.56 ± 2.52 S5 179.64 ± 18.29 79.53 ± 11.04 44.18 ± 1.65 S6 108.7 ± 32.13 17.66 ± 5.82 16.16 ± 0.58 S7 72.35 ± 5.44 10.97 ± 0.26 15.2 ± 0.78 S8 73.4 ± 6.92 9.61 ± 0.15 13.15 ± 1.04

Din analizarea rezultatelor, se observă că randamentul

maxim de biogaz și metan este obținut la 494,9 ± 11,86 ml/ g VS și 275,78 ± 0,66 ml CH4 /g VS în proba S1, care creşte cu 3,06% și, respectiv, 6,52%, comparativ cu grupul martor. Randamentele specifice de metan și conținutul de metan se reduc de la 247,85 ± 17,22 ml CH4 /g VS și 59,4 ± 3,32% până la 9,61 ± 0,15 mL CH4 /g VS și respectiv 13,15 ± 1,04% între probele S2 și S8. Timpul de producție al metanului este cuprins între 25 și 60 de zile pentru probele S1-S5, iar viteza de producție a metanului scade de la 8 la 2 ml CH4 g-1 VS d-1.Randamentul maxim de metan se obţine la o valoare a salinitatăţii de 15 g/l, sugerând faptul că acest nivel de salinitate are un efect pozitiv asupra performanței fermentarii anaerobe. De asemenea, inoculul aclimatizat produce metan în mod eficient şi la o valoare mai mare a salinităţii, de 35 g/l, cu un randament specific de metan de 220,88 ml CH4 /g

VS. Totodata, o valoare mult mai ridicata a salinităţii (>35 g/l - salinitatea apei de mare) conduce la inhibarea activităţii metanogene. Cantitatea de sare de mare adăugată conține sodiu, magneziu, calciu, și potasiu cu concentrații de 1,53, 0,13, 0,18 și respectiv 0,03 g/l, această combinație prezentand un efect benefic asupra randamentului de metan. Studii precum cele realizate de A.J. ward si Y. Zhang confirmă veridicitatea rezultatelor expuse pentru exemplificare. Influenţa gradului de salinitate asupra unor parametrii (pH, cantitate de CO2, cantitate de acizi graşi volatili) Un alt aspect important în analizarea performanţei producţiei de biogaz prin fermentarea anaerobă a algelor marine, îl reprezintă influenţa gradului de salinitate asupra valorilor de pH ale mediului, a producţiei de CO2, şi nu în ultimul rand, a cantităţii de acizi grasi volatili ca metaboliţi intermediari. Initial, concentraţia de acizi grasi volatili crește

10

brusc, iar la valori ale salinitatăţii cuprinse între 15 g/l si 35 g/l, majoritatea sunt consumaţi complet pentru producerea metanului. Productia de CO2 urmează un trend similar cu cel al acizilor grasi volatili. Cantitatea de CO2 se acumulează rapid în primele 48 de ore datorită hidrolizării substratului de către bacterii. Adăugarea sărurilor influenţează în mod diferit valorile de pH. În primele 48 de ore, pH-ul descreşte brusc, recăpătându-şi valorile iniţiale după etapa de hidroliză, datorită folosirii acizilor grasi de către bacteriile metanogene. În concluzie, prin investigarea efectului salinităţii (cu inocul aclimatizat) asupra performanţei fermentării anaerobe a algelor marine se pot concluziona urmatoarele: Biomasa algală poate fi transformată eficient în metan prin fermentare anaerobă în conditii de non-salinitate; Un nivel scazut de salinitate (intre 15 g L-1 si 35 g L-1- salinitatea apei de mare) are un efect pozitiv asupra performanței fermentarii anaerobe (randamentul de metan atinge valori de aproximativ 250 mL g−1 VS); În cazul unui grad crescut de salinitate (>35 g L-1) fermentarea anaerobă şi implicit producţia de biogaz este inhibată; Relaţia dintre salinitate şi randamentul specific de metan este reprezentată printr-o ecuaţie polinomială de gradul al treilea : y = 271.533 + 6.449X -0.261X2 + 0.002X3 (R2 = 0.999); Odată cu creşterea gradului de salinitate, atât concentraţia de acizi grasi volatili, cât şi cantitatea de CO2 cresc considerabil, spre deosebire de valoarea pH-ului care prezintă un tendință descrescătoare în primele 48 de ore de fermentare anaerobă. Rezultate experimentale prezentate în acest subcapitol și obținute din studiile de literatură privind efectul salinității asupra proceselor de fermentare justifică și comportamentul algelor marine luate în lucru în experimentele de fermentare desfășurate în acest proiect. Specia Ulva intestinalis prelevată din Rezervația Biosferei Delta Dunării, zona Chitus, utilizată în testele de fermentare cu modelul experimental realizat a demonstrat un potențial de fermentare în conformitate cu obiectivele propuse, adică un conținut maxim de metan de 65%, dar a necesitat un timp de retenție hidraulică foarte îndelungat (70 zile), care este pus pe seama efectului inhibitor al salinității din masa de fermentare, microorganismele implicate în toate etapele de fermentare necesitând o perioadă mai lungă de acomodare la condițiile de mediu.

CAPITOL 2 - Evaluarea disponibilității algale din ecosistemele naturale 2.1 Introducere

Acest capitol este contribuția partenerului P1: Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare Delta Dunării, Tulcea la implementarea obiectivelor prevăzute în cadrul celei de a 2-a etapă de derulare a proiectului: “Dezvoltarea și validarea de soluții fiabile pentru producere de biogaz din biomasă algală în Rezervația Biosferei Delta Dunării” (Acronim: BIOALG), cod proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2016-0068, finanțat de la bugetul de stat prin Programul 2 - Creșterea competitivității economiei românești prin cercetare, dezvoltare și inovare, proiect experimental – demonstrativ. Raportul prezintă în mod detaliat situația prezenței și distribuției în anul 2018 a macroflorei algale precum și a potențialului său ca resursa vegetală recoltabilă din Rezervația Biosferei Delta Dunării, în vederea utilizării acesteia pentru producerea de biogaz. Materialul documentar include metoda de recoltare, izolare și conservare a macroflorei alglae în vederea testării capacității sale fermentative. De asemenea, sunt incluse rezultatele testelor de laborator pentru izolarea specilor fitoplanctonice și fitobentonice prelevate din mediile naturale și cultivate în laborabor pentru producerea de biomasă recoltabilă și testarea capacității lor fermentative. Adâncimea apei, dimensiunea lacului, a substratului, a distanței față de Dunăre, a timpului de rezidență cumulat, variaţia nivelului apei sunt determinanți importanți ai stării ecologice în Delta Dunării (Oosterberg et al., 2000). Evoluţia deltei este rezultatul transpunerii la nivel local a modificărilor hidro-chimice ale Dunării, continua sa transformare fiind sub impactul debitului lichid şi solid adus de Dunăre (Gâştescu et. al., 2006). Ținând cont de aceste caracteristici în etapa a II-a de derulare a proiectului pe lângă cercetarea bibliografică care a urmărit semnalarea modificărilor apărute în evoluţia şi structura populaţiilor de macroalge de lungul timpului, în perioada mai - august 2018 au fost realizate investigații în teren cu scopul de a evalua starea actuală a macroflorei algale din următoarele tipuri de ecosisteme acvatice din Rezervația Biosferei Delta Dunării:

Ecosisteme de tip lentic: În conformitate cu anexa XI a Directivei Cadru, lacurile deltaice aparţin Ecoregiunii Pontice -12 sunt situate

la altitudini <200m, au adâncimi mici (3-15m) şi foarte mici (<3m), au suprafaţe cuprinse între 0.5 – 1km2 (lacuri de tip S), 1 – 10km2 (lacuri de tip M), 10 – 100 km2 (lacuri de tip L) şi >100 km2 (lacuri de tip XL), iar substratul geologic al acestora este calcaros, silicios sau de origine organică – turbă (****, 2009; ****, 2015). În Rezervaţia Biosferei Delta Dunării există 479 de corpuri de apă ce intră în categoria ecosistemelor de tip lentic.

Ecosisteme de tip lotic: Reţeaua de canale din Delta Dunării este reprezentată de 45 gârle în regim natural de circulaţie a apei în

lungime de 1742 km şi 26 de canale în lungime de 1753 km (****, 2009). Această reţea intră în categoria ecosistemelor de tip lotic care au o contribuţie esenţială la reglarea nivelului de apă din lacuri şi la aportul de nutrienţi din acestea.

2.2 Caracterizarea zonei de studiu şi metoda de investigare a acesteia Caracterizarea zonei s-a realizat în baza obsevaţilor şi măsurătorilor efectuate în teren, precum şi a

informaţiilor extrase din sursele bibliografice (Gâştescu, 2006; Oosterberg et al. 2000; ****, 2009). În Tabelul 2.1 sunt incluse imaginile satelitare şi traseele urmate pe parcursul investigaţiilor realizate în anul 2018 pentru realizarea obiectivelor prevăzute în cadrul etapei 2 de derulare a proiectului BIOALG, precum şi caracteristicile zonelor în care

11

au fost realizate evaluările în teren. Investigarea prezenţei şi distribuţiei macroflorei algale a fost realizată în 7 lacuri amplasate în cele 4 complexe lacustre ale deltei şi în complexul lagunar Razim –Sinoe după cum urmează:

din complexul lacustru Șontea – Fortuna a fost investigat lacul Fortuna (Fig. 2.1); din complexul lacustru Isac – Uzlina a fost investigat lacul Isac (Fig. 2.2) din complexul lacustru Roșu – Puiu au fost investigate lacurile Iacub (Fig. 2.3) și Puiu (Fig. 2.5); din complexul lacustru Matița-Merhei au fost investigate lacurile Matița (Fig. 2.4) şi Trei Iezere (Fig. 2.7) din complexul lagunar Razim –Sinoe a fost investigat lacul Razim (Fig. 2.6).

Tabelul 2.1 – Caracteristicile lacurilor investigate

Suprafaţa lac + plaur: 969 ha. Amplasare: în partea de vest a Deltei Dunării. Distanţa hidrologică până la Dunăre este mică. Retenţia apei: martie–octombrie de 8 zile. Adâncimea apei < 3 metri. Transparenţa apei (vara) poate fi egală cu adâncimea apei. Biomasă fitoplanctonică în perioada estivală, a fost evaluată utilizând spectrofluorometrul bbFluoroProbe, fiind exprimată în valori ale concentraţiei de clorofilă-a (µg/l). Evaluarea prezenţei/ absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare albă (Fig. 2.1)

Fig. 2.1 - Lacul Fortuna

Suprafaţa lac + plaur: 1393 ha. Distanţa hidrologică până la Dunăre este mică. Retenţia apei: martie–octombrie de 12 zile. Adâncimea apei mai mica de 3 metri şi cu tendinţe de umplere a cuvetei lacustre. Transparenţa apei (vara) poate fi de 40 cm. Biomasă fitoplanctonică a fost evaluată cu spectrofluorometrul bbFluoroProbe, fiind exprimată în valori ale concentraţiei de clorofilă-a (µg/l). Evaluarea prezenţei/absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare albă (Fig. 2.2)

Fig. 2.2 - Lacul Isac

Suprafaţa lac + plaur: 1415 ha. Distanţa hidrologică până la Dunăre este mică. Retenţia apei: martie–octombrie de 300 zile. Adâncimea apei între 3-4 m. Transparenţa apei (vara) 40 cm. Turbiditate ridicată. Vegetaţie acvatică palustră în zona malurilor. Macroalgele apar rar şi foarte rar. Biomasa fitoplanctonică a fost evaluată utilizând spectrofluorometrul bbFluoroProbe, fiind exprimată în valori ale concentraţiei de clorofilă-a (µg/l). Evaluarea prezenţei /absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare albă (Fig. 2.3)

Fig. 2.3 - Lacul Iacub

Suprafaţa: 642 ha luciu de apă. Suprafaţa plaur plutitor: 260 ha. Distanţă hidrologică până la Dunăre mare. Timpul de stagnare a apei în cuveta lacustră în perioada martie–octombrie de 23 zile. Adâncimea apei între 2-3 m. Transparenţa apei (vara) poate ajunge la 40 cm. Turbiditate ridicată. Biomasă fitoplanctonică maximă înregistrată cu spectrofluorometrul bbFluoroProbe. Evaluarea prezenţei/absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare alba (Fig. 2.4).

Fig. 2.4 - Lacul Matița

12

Suprafaţa: 825 ha luciu de apă. Suprafaţa plaur plutitor: 450 ha. Distanţă hidrologică până la Dunăre mare. Timpul de stagnare a apei în cuveta lacustră în perioada martie–octombrie de 18 zile. Adâncimea apei între 3-4 m. Transparenţa apei (vara) poate ajunge la 40 cm. Biomasă fitoplanctonică maximă înregistrată cu spectrofluorometrul bbFluoroProbe Evaluarea prezenţei/absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare alba (Fig.2.5).

Fig. 2.5 - Lacul Puiu

Suprafaţa: 41.500 ha Distanţă hidrologică până la Dunăre mică Adâncimea apei între 3-4 m. Transparenţa apei (vara) poate ajunge la 40 cm. Turbiditate ridicată. Înfloriri masive cu cianobacterii. Biomasă fitoplanctonică mare, înregistrată cu spectrofluorometrul bbFluoroProbe Macroalgele apar rar şi foarte rar. Vegetaţie acvatică submerse în special în zona malurilor. Evaluarea prezenţei/absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare alba (Fig.2.6)

Fig. 2.6 - Lacul Razim

Suprafaţa: 458 ha. Distanţă hidrologică până la Dunăre mare. Transparenţa apei în perioada de vară poate fi egală cu adâncimea apei. Biomasa fitoplanctonică scăzută, înregistrate cu spectrofluorometrul bbFluoroProbe. Acoperire cu vegetaţie acvatică pe suprafeţe întinse. Prezenţa macroalgelor în perioada mai – iulie în cantităţi relativ mari. Evaluarea prezenţei/absenţei macroalgelor s-a realizat în direcţia indicată prin săgeţile de culoare alba (Fig.2.7).

Fig. 2.7 - Lacul Trei Iezere Investigarea prezenței macroflorei algale în reţeaua de canale a deltei s-a realizat prin metoda transectelor

aleatorii în direcția de curs a apei, în următoarele canale: Canal Mila 35, Gârla Şontea, braţ Dunărea Veche, Canal Eracle, Canal Crişan-Caraorman, Canal Litcov, Canal Tatanir, braţ Sfântul Gheorghe, Canal Dranov, Canal Dunavăţ. Atât în cazul ecosistemelor de tip lentic cât și în cazul celor de tip lotic macroflora algală a fost înregistrată ca şi prezența/absența. Distribuția macroflorei algale în zona costieră s-a realizat în porțiunile de plajă accesibile din dreptul brațului Sf. Gheorghe, precum și în partea sudică a rezervaţiei la limita teritoriului administrativ al acesteia, în dreptul localităţii Vadu. Evaluarea biomasei ca şi potenţial recoltabil s-a realizat sub forma studiului de caz: bazin de acostare nave localitatea Sf. Gheorghe. 2.3 Prelevarea, sortarea și izolarea macroflorei algale în vederea testării capacității de producere a biogazului

Macroflora algală au fost prelevată prin desprinderea manuală, prin răzuire cu ajutorul unui cuţit, în cazul speciilor fixate sau prin dragare cu ajutorul unei ancore, la suprafața vegetație acvatice în cazul speciilor identificate în asociere cu vegetatia acvatică. Macroflora algală recoltată a fost transportată în laborator în genți frigorifice dotate cu elemenți de răcire. Transportul probelor s-a realizat la o temperatura de 8°C. În laborator macroflora algală a fost sortată în vederea izolării acesteia de fragmentele de vegetație acvatică. După izolare fragmente de thallus au fost examinate la microscopul optic (Laborlux) utilizând: obiectiv de 40X pentru realizarea identificării taxonomice. Aceasta s-a realizat la nivel de gen sau specie. Descrierea speciilor identificate s-a realizat conform nomenclaturii de specialitate originale sau traduse (Jaworski G în 1975) (Collins, 1902; Starmach, 1972; Leliaert, 2004; Leliaert et al. 2013); obiectiv de 100X, în vederea stabilirii spectrului taxonomic cu care macroalgele se află în asociere și a gradului de puritate a thallusului prelevat din medii acvatice naturale. Identificarea speciilor s-a realizat în conformitate cu Krammer et al., 1986, 1988, 1191 a și 1991 b. 2.4 Prezența și distribuția actuală a macroflorei și microflorei algale în Rezervația Biosferei Delta Dunării

Analiza datelor istorice cu privire la prezenţa şi răspândirea macroflorei algale în Rezervația Biosferei Delta Dunării a scos în evidenţă existenţa unor semnalări ce provin din perioada anilor 1990 - 2000 şi înainte de aceasta perioadă. Semnalările anterioare anului 2018, înregistrate în bazele de date referitoare la biodiversitatea algală din

13

Rezervaţia Biosferei Delta Dunării conţin informaţii cu privire la prezenţa pe teritoriul rezervaţie a 19 genuri considerate că aparţin macroflorei algale deltaice şi a 80 de specii (Fig. 2.8). Încadrarea taxonomică a acestor genuri în 5 încrengături: Chlorophyta, Rodophyta, Charophyta, Chromista, Ochrophyta, scoate în evidenţă existenţa unei mari diversităţi algofloristice, diversitate care nu a mai fost semnalată în cursul investigaţiilor realizate în anul 2018, an în care au fost regăsite doar 4 genuri ce aparţin încregăturilor: Chlorophyta şi Charophyta.

Fig. 2.8 - Diversitatea macroalgelor din Rezervaţia Biosferei Delta Dunării

Cel mai frecvent întâlnite genuri au fost: Cladophora, Spirogyra, Hydrodictyon și Ulva. Diversitate taxonomică mică a fost semnalată şi în etapa anterioară de derulare a proiectului (Etapa I, anul 2017). Cu toate acestea, din lipsa unor studii recente care să aibă ca obiectiv reevaluare şi validarea în teren a acestor semnalări nu se poate trage o concluzie fermă legată de dispariţia speciilor care nu au fost regăsite în perioada de studiu.

a. Macroflora algală utilizată în testele de fermentare anaerobă 1. Cladophora glomerata (L.) Kuetzing (Fig. 2.9)

Thallus alcătuit din filamente uniseriate ramificate de culoare verde deschis având apical sau intercalar ramuri de creștere ce se aglomerează în partea superioara a thallusului. Ramurile conțin în interiorul axelor principale celule cilindrice de dimensiuni mari ce au variat între 160 - 240 μm lungime și 90 – 100 μm lățime, celule apicale au fost de dimensiuni mai mici până la 160 μm în lungime și 40 μm în lățime.

Fig. 2.9 - Aspect thallus de Cladophora glomerata Specia are o distribuire aproape în întreaga lume, fiind întâlnită într-o mare varietate de habitate de la râuri

și lacuri montane până la estuare, de la ape aflate într-o stare ecologică bună până la ape poluate (fiind cunoscută în literatura de specialitate ca un important indicator al poluării chimice având o capacitate ridicată de a acumula metalele grele: crom, plumb și cadmiu) (Boedeker et al., 2010; Ebadi et al., 2018; Malkin, 2007; Whitton, 1970).

Cladophora glomerata oferă microbiotei perifitonice numeroase nișe ecologice, asigurând derularea unor procese și funcții (autotrofia, reacții redox și de degradare a materiri organice) ce permit realizarea circuitului materiei în mediul acvatic (Higgins et al., 2008; Zulkifly et al. 2012; Zulkifly et al. 2013). În mediile în care apare deține un rol ecologic însemnat ca urmare a rolului pe care îl deține în menținerea echilibrului intraspecific al lanțului trofic, putând adăpostii în densități mari o varietate ridicată de nevertebrate acvatice (Dodds et al. 1992). Specia a fost întâlnită rar în cursul anului 2018 în Delta Dunării, fiind găsită atașată de substrate artificiale (cala navelor, pontoane de acostare) în zone adăpostite, cu un curent de curgere al apei lent, formând aglomerări delicate și pufoase, în partea superioară a substratului la interfața dintre apă și aer. 2. Cladophora sp. Kützing

Thallus alcătuit din filamente ramificate fie în mod regulat fie neregulat, având diferențiere bazală distală. Filamentele sunt atașate în fazele primare ale ciclului biologic devind la unele specii liber-plutitoare. În ape curgătoare, formează smocuri de baza pe substraturi; cu ramificație alternativă, opusă sau uneori di sau trichotomă, ramificațiile mai mici decât axa principală sau cel puțin îngustând ușor către celulele apicurilor groase cilindrice sau umflate și lamele la majoritatea speciilor. Uneori subțiri și ferme; cloroplastul este un reticul parietal care uneori devine fragmentat și apare ca numeroase discuri; pirenoidul prezent; reproducerea asexuală la zoospores; reproducerea sexuală de către celulele nespecializate. 3. Ulva intestinalis Linnaeus (Fig. 2.10) Ulva (Enteromorpha) intestinalis Linnaeus este o algă verde a cărei culoare se modifică pe parcursul ciclului vital de la verde închis pâna la verde deschis sau verde gălbui. Are aspect de tub neted la începutul dezvoltării sale. Dimensiunile sale pot varia de la 1-2 mm până peste 2 cm. Pe măsură ce se dezvoltă are loc o încrețire a thallusului, ceea ce îi conferă aspect de intestin. Ramificarea la această specie apare chiar de la bază. Ciclul de dezvoltare al speciei are 2 faze: haploid și diploid. În fază haploidă produce gameți biflagelati iar în cea haploidă produce gameți biflagelați, care pot sau nu să fuzioneze. Gametofitul se dezvoltă din zoospori quadriflagelați. Specia Ulva intestinalis este foarte larg răspândită în mod natural atât în medii cu apă dulce cât și în cele cu apă salmastră. Puternic invazivă, domină în macroflora algală din ecosisteme marine, estuare sau din zonele de coastă puternic afectate de eutrofizare (Fong et al., 2004; Messyasz et al 2008; Ruangchuay et al., 2012; Parthiban et al., 2013; Serrano et al., 2014; Shankhadarwar, 2015; Siddik et al., 2015; Cardoso et al. 2017; Sabunas et al. 2017; Tabarsa et al. 2018).

Datorită caracterului său invaziv şi a capacităţii de a supravieţui şi în medii dulcicole specia apare şi în ecosistemele acvatice din interiorul deltei. În perioada evaluărilor specia a fost identificată în lacurile Isac şi Fortuna.

14

b. Microflora algală atașată pe macroflora algală Caracteristicile taxonomice, morfologice și ecologice

Rezultatele analizei microscopice au scos în evidență o abundență ridicată a speciilor epifite atașate de filamentele de Cladophora (Fig. 2.11) în comparație cu cele existente în cazul speciei marine Ulva intestinalis. Existența unei miroflore algale rare pe filamentele de thallus ale speciei Ulva intestinalis fiind probabil datorată stadiului de dezvoltare a filamentelor. Astfel de diferențe fiind semnalate atât în cazul asocierilor interspecifice ale microbiotei epifite cu fitoplanctonul cât și cu algle macrofite (Bagatini et al. 2014; Eigemann et al. 2013; Bondoso et al. 2017).

Prelevarea macroflorei algale din zona marină a fost realizată în cursul lunii mai, acest fapt constituind probabil una din cauzele pentru care colonizarea cu microorganisme a thallusului nu a fost optim. Spre deosebire de macroflora algală prelevată din mediul marin, în cazul celei prelevate din mediu dulcicol s-a constatat dominanța în micorbiota atașată de filamente a speciilor procariote ce aparțin de regnul Monera (bacterii și cianobacterii). Spectrul algofloristic din componența microbiotei epifite a fost relativ uniform şi rar, comparativ cu speciile procariote ataşate de macroflora algală. Microalgele dominante au fost cele din încrengătura Bacillariophyta, speciile: Cocconeis placentula, Cocconeis pediculus, Rhoicosphaenia abbreviata, Gomphonema olivaceum, specii ferm fixate de thallus.

Asocierile mai sus menționate: macroalge -microfloră sesilă - microorganismele epifite au în mediile naturale un rol important în modul de desfășurare a ciclurilor biogeochimice. Cunoscându-se existența unor astfel de interacțiuni se poate emite ipoteza că astfel de asocieri pot contribui la influențarea capacităţii fermentative a macroalgelor și implicit la cantitatea de biogaz pe care acestea o pot produce.

c. Distribuția macroalgelor și microalgelor în zonele luate în studiu Investigațiile efectuate în cursul anului 2018 au scos în evidență următoarele caracteristici ale distribuția

substratului vegetal reprezentat de macroflora algală din ecosistemele acvatice deltaice și din zona costieră marină a rezervație: În ecosistemele acvatice lotice diversitatea macroflorei algale a fost redusă fiind dominantă de specia Cladophora glomerata. Aceasta a fost întâlnită pe parcursul investigaţiilor: rar și foarte rar în sistemul de canale deltaice. În zonele în care a fost semnalată, a produs cantități mari de biomasă în asociație cu plantele acvatice, în special în zonele de mal cu stuf şi în gârlele și canalele cu circulație deficitară a apei. Relativ frecvent a fost însă semnalată în zonele de confluență dintre lacuri și canale. rar și foarte rar Cladophora sp. a fost semnalată atașată de substratul dur al braţului Sulina (zona Dunărea Veche) şi pe porţiunile îndiguite ale canalului Crişan-Caraorman. Variaţiile regimului hidrologic al Dunării influenţând puternic dezvoltarea speciei aflată în permanene sub impactului generat de modificările nivelului apei. Specia a fost întâlnită relativ frecvent în zona de acostare a navelor sau pe ambarcaţiunile ancorate la mal din dreptul localităţilor (Maliuc, Partizani, Gorgova, Sulina, Chilia Veche), putând înregistra în funcţie de natura substratului abundenţe mari pe suprafeţele înguste a pontoanelor de acostare.

În ecosistemele acvatice lentice macroflora algală se găsește: rar sau în mod accidental în lacurile puternic eutrofizate, turbide, cu înfloriri ale cianobacterilor, lipsite de vegetație acvatică și puternic expuse acțiunii valurilor, ca de exemplu în lacurile de tip 1 (Oosterberg et al., 2000) (Puiu şi Matiţa) (Fig. 2.16). Dezvoltarea macroflorei algale fiind supusă competiţie acesteia pentru aceleaşi tipuri de resurse ca şi microflora algală care-i împiedică dezvoltarea datorită abundenţei ridicate şi limitarea accesului la lumină şi nutrienţi. în lacurile de tip 2 (Oosterberg et al., 2000) caracterizate printr-un aport relativ ridicat de apă din Dunăre și cu puternice variații ale nivelului apei, macroalgele au fost abundente și în general au fost întâlnite plutind la suprafața plantelor acvatice și/sau în asociație cu Potamogeton trichoides şi Ceratophyllum demersum. În astfel de lacuri cel mai frecvent întâlnite au fost speciile Hydrodiction reticulatum și Spirogyra majuscula. În mod accidental şi în cantităţi reduse a fost idendificată specia Ulva intestinalis.

Macroflora algală din lacurile de tip 2 a înregistrat în ultimii 15 ani modificări semnificative în structura cantitativă şi calitativă, constatându-se diminuarea până la dispariţie a specie Hydrodiction reticulatum care înregistra abundenţe ridicate pe toată suprafaţa lacurilor de acest tip. în cazul lacurilor de tip 3 (Oosterberg et al., 2000) (Fig. 2.19) caracterizate prin izolare față de Dunăre, adâncimi și suprafețe mici ale apei, cu abundențe ridicate ale vegetației acvatice și transparența ridicată a apei, s-a constatat că macroflora algală are aceleași caracteristici ca în cazul lacurilor de tip 2.

În zona costieră în zona costieră aflată sub influența apelor dulci provenite din Dunăre, zonă care aparține de Rezervația Biosferei Delta Dunării macroflora algală a fost găsită rar și foarte rar. În cursul investigațiilor au fost identificate fragmente de dimensiuni mici (1-2 cm) ale speciei Ulva intestinalis, specie care ajunge în zona de vărsare în mare a brațului Sf. Gheorghe, probabilă adusă de curenţii marini. La sud de brațele Dunării macroflora algală a fost identificată doar izolat, la limita rezervației în zona de mal, atașată pe stabilopozi/pietre, fiind expuse permanent valurilor și în mod temporar la insolație și a deshidratării, la fel ca şi în cazul speciilor de apă dulce identificate pe canalul Crişan-Carorman din Delta Dunării.

15

Potențialul recoltabil al algelor microfite de tip fitoplanctonic în RBDD în anul 2018 În evaluarea potențialului recoltabil de alge fitoplanctonice din Rezervația Biosferei Delta Dunării s-a pornit

de la ipoteza că acestea ar putea fi recoltate în perioada înfloririlor algale (lunile iulie-august) astfel încât biomasa extrasă din mediul natural să poată fi utilizată ca materie primă pentru producerea de biogaz. Verificarea ipotezei de lucru a vizat următoarele etape: Analiza datelor istorice cu privire la amploarea înfloririlor din Rezervația Biosferei Delta Dunării; Evaluarea fenomenului de înflorire algală din vara anului 2018; Evaluarea în teren a timpului necesar recoltării unei cantități de biomasă suficient de mare pentru a putea începe derularea testelor de fermentație

Din analiza datelor referitoare la biomasă fitoplanctonică s-a putut observa existența unei similarități mari (> 80%) a lacurilor din Delta Dunări (Török, 2014). În ultimii 30 de ani cea mai mare biomasa algală (96,05 µg/L) fiind înregistrată în lacul Roșu, valori cu mult mai mari decât cele înregistrate ca urmare a activităților derulate în cadrul proiectului în anul 2018. Spre deosebire de lacurile deltaice, în complexul lagunar Razim – Sinoe valorile înregistrate au fost mult mai mari. Rezultatele investigaților estivale din anul 2018 au arătat că pe parcursul aceleiași zile, concentraţia de clorofilă-a se distribuie neuniform la suprafaţa lacului. În luna august aceasta a variat între 4,74 și 129,08 µg/L. Dacă se compară biomasa algală exprimată în valori ale concentraţiei de clorofilă-a, înregistrată în lacul Razim în august 2018 cu valorile standard din “Normativului 161/2006 privind clasificarea calităţii apelor de suprafaţă în vederea stabilirii stării ecologice a corpurilor de apă”, se observă că prin compararea acestora cu valorile referitoare la elementele biologice de calitate pentru lacuri, că lacul Razim este unul hipertrof (***, 2006), aceste valori mari putând sugera ideea că se întrunesc condițiile pentru ca algele fitoplanctonice să poată fie recoltate în perioadele de înflorire algală. Testele efectuate în teren pentru verificare ipotezei mai sus enunţate au arătat că filtrarea este un proces anevoios. Concentrarea biomasei prin fileu planctonic nespecific prelevării speciilor fitoplanctonice (fileu cu dimensiunea ochiului de plasă > de 100 microni) chiar şi prin filtrarea unui volum mic de apă provenită din lac (30 litri) poate să dureze în perioada în care algele au atins pragul de înflorirea algală peste 4 ore.

Prin urmare, metoda de recoltare a microalgelor prin filtrare cu ajutorul fileelor planctonice este una ineficientă din puncte de vedere economic, utilizarea microalgelor ca materie primă pentru obținerea de biogaz fiind în acest caz extrem de costisitoare şi ineficientă.

2.5 Izolarea si testarea capacității fermentative a biomasei algale

Macroalgele utilizate în testele de producere biogaz au provenite din următoarele zone: Ponton de acostare canal Tatanir – Chilia Veche Bazin de acostare (zonă de studiu pilot) nave figura 2.22 (zona delimitata în culoarea roşie şi având cifra

1 în interiorul cercului care delimitează perimetru din care s-a realizat recoltarea). Zona costieră marină a Rezervaţiei Biosferei Delta Dunării din dreptul localităţii Vadu

Pontonul de acostare amplasat pe canalul Tatanir în dreptul localităţii Chilia Veche cu o lungime de 3 metri, prezenta la interfaţa acestuia cu apa o proţiune imersată cu lăţimea de 20 cm pe care macroalgele o foloseau ca suport de fixare. Macroalgele au fost raclate pe toată suprafaţa de fixare, cantitatea maximă prelevată fiind de 3 kg. Din aceast cantitate au fost extrase subprobe care au fost utilizate în testele de fermentabilitate. Operaţiunea de recoltare a durat o oră. În cazul bazinului de acostare nave de la Sf. Gheorghe, macroalgele s-au putut recolta cu uşurinţă şi într-un timp scrut. Recoltarea s-a realizat prin dragare într-un perimetru stabilit astfel încât prin extrapolare valorilor de biomasă recoltabilă să se poată estima care este cantitatea potenţial recoltabilă/sezon. Zona selectată nu prezenta vegetaţie acvatică şi prin urmare în procesul de recoltare nu a existat şi o etapă de izolare a macroalgelor de vegetaţia acvatică. Macroalgele provenite din ecosistemele naturale au fost utilizate doar pentru evaluarea timpului necesar izolării acestora de vegetaţia acvatică. Conţinutul ridicat de vegetaţie acvatică care nu a putut fi îndepărtat din probă a fost considerat ca factor ce poate influenţa puternic randamentul de producere de biogaz din macroalge. Din acest motiv, probele prelevate din lacuri nu au mai fost utilizate în testele de fermentare. Fig. 2.10 – Etapele de izolare a macroalgelor de vegetaţia acvatică

Macroalgele recoltate (Fig. 2.11) din bazinul de acostare nave Sf.

Gheorghe au fost cântărite, stabilindu-se că din bazinului de acostare, în perioada sezonului estival, în cazul în care se menţin aceeaşi parametri ai calităţii apei, s-ar putea recolta/sezon aproximativ 100 kg macroalge. Eşantioanele de material biologic utilizat pentru teste (600-650 g) au fost congelate şi păstrate la -4°C până la momentul începerii experimentelor de fermentare.

Fig. 2.11 – Masă de macroalge recoltate din bazinul de acostare nave de la Sf. Gheorghe

16

Materialul biologic utilizat în testele de fermentare alcătuit din macroflora algală prelevată din ecosistemele cu apă marină, ca urmare a faptului că la analiza microscopică thallusul nu prezenta pe suprafața acestuia specii perifitonice atasate, poate fi considerată de o puritate ridicată. Datele obținute după realizarea testelor de fermentație nefiind în acest caz influențate și de capacitatea fermentativă a speciilor algale asociate speciei Ulva intestinalis. În cazul speciilor de Cladophora (prelevate din ecosistemele dulcicole ale Rezervației Biosferei Delta Dunării, respectiv din perimetrul bazinului de acostare nave de la Sf. Gheorghe) care prezentau o microbiotă foarte bogată atașată de thallus, testele de fermentabilitate ar fi putut fi influențate de existența acestei asocieri. Prin urmare, în studiile viitoare se recomandă ca în astfel de cazuri înainte de punerea la fermentat a masei vegetale să se realizeze în prealabil o îndepărtarea a microbiotei perifitonice, deoarece diatomeele, specii dominante pe filamentele de macroalge, au perete celular silicios şi pot să influenţese capacitatea de fermentare a materialului biologic.

Este cunoscut faptul că pentru a obține biomasa fitoplanctonică necesară producerii de biogaz se utilizează diverse metode ca: sedimentare, filtrare, centrifugare, flocularea pentru concentrarea acestora și că au fost dezvoltate numeroase scenarii la diferite scări de la cultivarea în laborator până la stimularea dezvoltării acestora în iazuri (Rogers et al., 2014). Aceste studii au arătat că este necesar să se obțină în urma recoltării o suspensie cu cel puțin 2 - 7% alge (materie solidă totală) pentru ca recoltarea acestora să fie una sustenabilă (Bruton et al., 2009). Recoltarea eficientă a algelor din mediile naturale este considerată cheia succesului economic, iar cea mai bună experiență în recoltarea biomasei microbiene până în prezent provine de la operatorii de stații de epurare a apelor reziduale (Bruton et al., 2009). Prin urmare, datorită faptului că prezentul studiu a început după perioada de înflorire a algelor fitoplanctonice în Delta Dunării iar în România operatorii stațiilor de epurare nu urmăresc și îndepărtarea

din apă a biomasei algale, au fost realizate evaluări ale biomasei algale și în laborator. Izolarea microalgelor în vederea testelor de fermentabilitate a fost realizată în condiţii de laborator. În perioada noiembrie 2017 – martie 2018 au fost realizate întreținerea și evaluarea biomasei recoltabile din vase de cultură.

Fig. 2.12 - Vase de cultură în stadii diferite de dezvoltare a microflorei algale Atingerea unei concentrații de biomasă microalgală de 200µg/l şi modificarea culorii apei au reprezentat

momentul începerii procesului de recoltare a biomasei. Recoltarea s-a realizat în mai multe etape şi a constat în concentrarea biomasei algale prin filtrarea probelor prin 4 filee planctonice de dimensiuni diferite (Fig 2.13) şi reciclarea apei filtrate şi îmbogăţită cu nutrienţi pentru un nou ciclu de recoltare. Biomasa microalgală a prezentat pe parcursul menţinerii vaselor de cultură variaţii mari şi nu s-au putut menţine condiţii optime de dezvoltare a acestor culturi astfel încât biomasa recoltată să poată atinge parametrii necesari pentru testele de fermentabilitate. Prin analiza microscopică periodică realizată pe toată perioada de menţinere a vaselor de cultură s-a evidenţiat modificarea treptată a compoziţiei specifice a microflorei algale. Comunitatea fitoplanctonică provenită din lac a fost dominată de cianobacteria Planktothrix agardhii şi de specii de Scenedesmus la începutul experimentelor. Abundenţa numerică a acestora a scazut şi au fost înlocuite de către algal verde Ankistrodesmus sp.

Compoziţia soluţiei nutritive adăugată în mediile de cultură (****, 2017) a fost una nespecifică şi probabil că datorită existenţei unei puternice competiţii interspecifice şi a imposibilităţii de a reporduce la scară mică (în laborator)

condiţiile din mediul natural a avut loc eliminarea până la dispariţia totală a majorităţii speciile provenite din mediul natural. Algele verzi: Ankistrodesmus sp., Scenedesmus spp, Chlorela vulgaris şi specia Planktothrix agardhii (cianobacteria) au asigurat 50% din totalul biomasei de microalge utilizată în testele de fermentabilitate. Pereţii vaselor de cultură au fost utilizaţi ca suport de speciile de diatomee care au contribuit la dublarea biomasei recoltabile pe parcursul menţinerii culturilor.

Fig. 2.13 – Recoltarea microalgelor prin filtrare

Suspensia apoasă obţinută prin filtrare probelor provenite din vasele de cultură a fost ţinută la 2°C timp de 24 ore şi după concentrarea prin sedimentarea filtratului s-a realizat izolarea fracţiunii de microalge (diatomee şi alge verzi) de cianobacterii. Rezultatele au scos în evidenţă faptul că prin filtrarea probelor s-a produs o acelerare a procesului de liza a microalgelor din culturi, iar prin distrugerea peretelui celular a avut loc eliminarea unei cantităţi mari de pigmenţi în masa apei. Acest fapt a contribuit la intensificarea culorii verzi a apei şi la crearea senzaţiei că există o biomasă algală mare în vasele de cultură. Reciclarea apei din aceste vase de cultură, chiar dacă s-a realizat o îmbogăţire/tratare a apei cu substanţe nutritive, nu a mai condus la o creştere a biomasei microalgelor, ceea ce a determinat o scădere treptată a materialului biologic recoltabil.

17

CAPITOL 3 - Experimente de fermentare anaerobă și monitorizarea proceselor

Experimentele de fermentare anaerobă au fost efectuate pentru următoarele specii de alge: - Macroalge: Cladophora glomerata (L.) Kuetzing, Cladophora sp. (Biasoletto) Kützing, Ulva (Enteromorpha)

intestinalis Linnaeus. - Microalge dominante au fost cele din încrengătura Bacillariophyta, speciile: Cocconeis placentula, Cocconeis

pediculus, Rhoicosphaenia abbreviata, Gomphonema olivaceum Biomasa macroalgală a fost mărunțită după care a fost ajustată umiditatea astfel încât substratul să conțină

92% apă. În experimentele de fermentare au fost utilizate o specie de macroalgă de apă marină și două specii de macroalgă de apă dulce, precum și o probă de microalgă mixtă. De asemenea, a fost utilizate două tipuri de material de inocul de tip dejectții de vite, dar recoltate în perioade și din surse diferite. Caracterizarea fizico-chimică a probelor de biomasă algală și a inoculului a fost efectuată conform metodelor APHA 2012 și AOAC 2012, caracterizările incluzând solide totale TS, solide volatile VS, umiditate. ABAI Task Group 2006 pentru experimente în șarje, în vase de sticlă cu volume de 0,1 litri. Experimentele de fermentare au fost efectuate în regim de temperatură mezofil (37±10C), duratele de fermentare fiind de 70 zile. Inoculul a fost adăugat la substratul vegetal în proporție de 10% (procente de masă). Caracteristicile fizico-chimice ale probelor algale utilizate în experimentele de fermentare sunt prezentate în tabelul 3.1.

Tabel 3.1 Caracterizarea biomasei algale

Substrat TS (% din masă umedă)

VS (% din masă uscată) Umiditate (%)

Macroalga Cladophora glomerata 42,11 87,24 57,89 Macroalga Ulva intestinalis 24,27 40,71 59,29 Macroalga Cladophora sp. 61,53 58,12 38,47 Microalgă 1,17 93,28 66,42

Atât gazul de fermentare anaerobă (biogazul) cât și metanul etalon au fost analizate cu ajutorul unui cromatograf de gaze tip Varian 450, echipat cu detector de ionizare în flacără FID, o valvă de prelevare cu șase porturi (Vici Valco Instruments Co. Inc.) și cu injector de tip split/splitless. Temperatura detectorului FID a fost stabilită la 1500C, debitele de gaze fiind: 25 ml.min-1 pentru N2, 30 ml.min-1 pentru H2, respectiv 300 ml.min-1 pentru aer. Volumul de injecție a fost de 0,125 l cu o rată de splitare de 40:1, temperatura injectorului fiind de 500C. S-a utilizat o coloană capilară cu polaritate redusă CP-Sil 5 CB Chrompack, cu material de umplutură 100% polidimetilsiloxan, coloana având lungimea de 15 m și diametrul de 0.25 mm, grosimea filmului fiind de 0.25 m. Temperatura cuptorului a fost menținută la 350C timp de 6 minute. Pentru calibrarea echipamentului în vederea determinării concentrației de metan în biogaz s-a utilizat metan etalon 5.5 furnizat de Linde. Curba de calibrare s-a obținut prin măsurarea ariei picurilor rezultate pentru următoarele rapoarte de concentrație CH4/aer: 100:0; 75:25; 50:50; 0:100. Timpul de retenție al metanului a fost de 4,774 minute. Pentru fiecare raport de concentrație, măsurătorile au fost efectuate în triplicat. În continuare sunt prezentare rezultatele experimentale privind volumul de biogaz și conținutul de metan pentru probele de biomasă algală luate în lucru. Trebuie menționat faptul că experimentele care au avut ca material de fermentare biomasa algală Cladophora sp. nu au generat biogaz cu valoare energetică, conținutul de metan fiind sub limita de detecție acceptabilă, rezultatul fiind pus pe seama structurii materialului algal cu prezența de structuri lignocelulozice recalcitrante. Prin urmare aceste rezultate nu au fost raportate în prezentul raport de experimentări.

3.1 Experimente de fermentare anaerobă probe de macroalge

Rezultatele analizei biogazului generat de substratul reprezentat de macroalga Cladophora glomerata inoculat cu dejecții de vite au indicat următoarele valori pentru volumele de biogaz și concentrație de metan, pe durata întregului experiment de fermentare.volumul de biogaz a înregistrat o creștere bruscă și constantă în primele 8 zile de fermentare, corespunzătoare etapei de hidroliză a substratului algal, când populațiile de bacterii hidrolitice sunt majoritare în microbiota de fermentare. Deși această etapă nu generează gaze de fermentare metanogenă, creșterea volumului de gaz poate fi dată de azotul introdus în exces la suprafața masei de fermentare (Annette Bruhn, 2011). Această argumentare este susținută și de faptul că în primele 8 zile de fermentare, concentrația de metan este foarte redusă (< 0,0025%). Începând cu ziua a 8-a, generarea de gaz de fermentare începe să scadă ușor, acesta fiind practci momentul în care reacțiile biochimice de descompunere a substratului organic generază gaze de fermentare, predominant bioxid de carbon dar și biometan. Volumul maxim de biogaz s-a înregistrat în ziua a 42-a de la demararea experimentului de fermentare, după care volumul de biogaz, dar și conșinutul de metan au început să scadă constant, concentrația de biometan în biogaz scăzând la 10% Volumul cumulat de biogaz pe parcursul întregii perioade de fermentare a fost de de 8610 ml. Potențialul de biometan al speciei algale Cladophora glomerata s-a determinat prin raportarea volumului total de biometan la cantitatea de solide volatile din masa organică utilizată în experimentele de fermentare, acesta situându-se în intervalul 300-400 ml CH4/ g VS, în concordanță cu valorile prezentate în datele de literatură raportate la etapa I-a, pentru speciile de macroalge prelevate din alte locații.

18

În ceea ce privește alga marină Ulva intestinalis, experimentele de fermenatre desfășurare pe acceași durată totală de fermentare de 70 zile, au arătat o intensificare a proceselor biochimice de descompunere după 15 zile de fermentare anaerobă, un salt accentuat în producția de biogaz înregistrându-se după 20 zile. Producția de biogaz a atins un maxim la 30 zile de fermentare după care a început să scadă până la finalul duratei de fermentare de 70 zile, anumite creșteri ușoare fiind observate pe parcursul acestei tendințe de scădere, ele fiind puse pe seama balanței instabile a microbiotei reprezentată în special de microorganismele acidogene și cele metanogene. Conținutul de biometan în biogazul rezultat din fermentarea macroalgei Ulva intestinalis a fost foarte redus în primele 30 zile de fermentare, concentratia de metan in biogaz situându-se în domeniul 0-1,62%. Această întârziere în producție de metan este datorată cel mai probabil efectului inhibitor al salinității asupra microorganismelor metanogene, numeroase studii de literatură analizând și confirmând acest efect în cercetări experimentale realizate pe diverse specii de macroalge marine. Chiar și în conditii de salinitate crescută, metanogenele sunt capabile să se adapteze la mediul salin însă această nevoie de adaptare la condițiile de mediu se reflectă în final asupra extinderii fazei de acomodare din etapele creșterii microbiene și implicit a extinderii duratei totale de fermentare. După 30 zile de acomodare a microbiotei la condițiile saline, producția de biometan a început să crească constant, concentrația maximă de biometan obținută în experimentele de fermentare anaerobă a macroalgei Ulva intestinalis atingând un maxim de 65% în ziua 58 de fermentare. După această creștere, concentrația de biometan a început să scadă, deși producția de biogaz a înregistrat scădere încă din ziua 30 de fermentare. Volumul cumulat de biogaz pe întreaga durată de fermentare de 70 zile a ajuns la 15.173 ml. Potențialul de biometan al speciei macroalgale Ulva intestinalis s-a determinat prin raportarea volumului total de biometan la cantitatea de solide volatile din masa organică utilizată în experimentele de fermentare, acesta fiind de 156,79 ml CH4/ gVS.

Comparativ cu specia de macroalgă de apă dulce Cladophora glomerata, macroalga Ulva intestinalis are un potențial de biometan semnificativ mai redus ca urmare a efectului inhibitor al salinității, însă acesta este totuși comparabil cu cel al altor specii de macroalge marine studiate în lucrări de cercetare.

3.2 Experimente de fermentare anaerobă probă de microalge

Pentru biomasa microalgală, datele de literatură prezentate în raportul etapei I indică o producție de biogaz ce variază între 287 si 611 ml metan /gram solide volatile (Sialve și colab., 2009; Mussgnung si colab., 2010). Variațiile mari în producția de biometan din microalge sunt date de diversitarea tulpinilor microalgale care prezintă diferențe semnificative în structura și compoziția pereților celulari. Unele tulpini nu prezinta perete celular, alte tulpini prezinta un perete celular proteic, fara celuloza sau hemiceluloza. Aceste atribute le confera o degradabilitate mai usoara (Mussgnug et al. 2010). În cazul în care o specie de interes prezintă un perete celular rigid, rezistent la fermentarea anaerobă, este necesară o pretratare in prealabil care poate permite o productivitate mai mare de biogaz.

Proba de biomasă microalgală utilizată pentru experimentele de fermentare în modelul demonstrativ a dovedit o capacitate de fermentare mai slabă decât probele de macroalge testate în acest proiect, iar potențialul de biometan a fost mai redus comparativ cel prezentat în datele de literatură. Producția de biogaz a înregistrat o creștere constantă încă din primele zile de fermentare, volumul cumulat de biogaz la sfârșitul perioadei de fermentare fiind de 13220 ml. În ceea ce privește calitatea biogazului generat de proba de microalgă, conținutul de metan a înregistrat un maxim de 46,5% biometan la 48 zile de fermentare, după care concentrația de metan a scăzut constant până la finalul experimentelor de fermentare. Procentul mediu zilnic de biometan generat prin fermentarea anaerobă a microalgei a fost de 6,58%, rezultând astfel un volum cumulat de biometan de 870 ml. Pentru cantitatea totală de 75 g probă de microalgă luată în lucru, la parametrii TS 1,17 mg/l și VS 93,28% rezultă un potential de biometan de 37,05 ml CH4/ gVS, care este mult mai redus decât potențialul de biometan al microalgelor analizate în studiile documentare. Explicația potențialului scăzut de biometan poate fi pusă pe seama peretelui silicios al diatomeelor care împiedică accesul enzimelor de fermentare la nutrienții organici din compoziția microalgelor. Pentru intensificarea fermentării anaerobe şi creşterea capacităţii de fermentare a biomasei algale se pot aplica diverse tipuri de pretratări, aceste cercetări de importanță economică putând face obiectul unor proiecte de cercetare viitoare.

În figura 3.1 sunt prezentate comparativ producțiile de biogaz pentru speciile de macroalge Cladophora glomerata, Ulva intestinalis și biomasa fitoplanctonică (microalge). Din reprezentarea grafică se observă că cea mai mare producție de biogaz a fost înregistrată de macroalga Ulva intestinalis, deși timpul necesar pentru ca fermentarea anaerobă să ajungă la etapa de metanogeneză a fost ceva mai îndelungat. Specia de macroalgă dulcicolă Cladophora glomerata a demonstrat o producție de biometan mai slabă, dar calitatea biogazului, adică concentrația în biometan care dă valoarea energetică a biogazului, a fost mult superioară macroalgei marine Ulva intestinalis. În imaginea din figura 3.2 este prezentată comparativ calitatea energetică a biogazului pentru cele trei experimente de fermentare, adică concentrația sa în biometan.

Comparând figurile 3.1 si 3.2 se constată că un procent mare de metan este înregistrat pentru probele algale care au dovedit o producție mai scăzută de biogaz, alături de metan biogazul conținând o pondere considerabilă de bioxid de carbon care afectează negativ calitatea energetică a biogazului. Această observație este mai evidentă la macroalga Cladophora glomerata prin a cărei fermentare anaerobă s-a generat un conținut maxim de 68,2% metan.

19

Fig. 3.1 - Variația volumului cumulat de biogaz în functie de specia

algala utilizată Fig. 3.2 - Variația conținutului de metan în functie de specia algală

utilizată

Substratul organic reprezentat de biomasă microalgală s-a arătat mai recalcitrant la descompunerea anaerobă, acest comportament putând fi pus pe seama faptului că proba nu este constituită dintr-o specie unică, ci dintr-un amestec de diverse specii microalgale, dominate fiind cianobacteriile Planktothrix agardhii şi speciile de Scenedesmus. Asocierile între specii diferite de microalge pot influența capacitatea fermentativă și implicit cantitatea de biogaz pe care acestea o pot produce.

CAPITOL 4 - Organizare simpozion national și activități diseminare informații

4.1 Simpozion national În ziua de 25 octombrie 2018 institutul coordonator INCDIE ICPE-CA a organizat în sala de Conferințe a

instituței simpozionul national ORIZONTURI NOI ÎN VALORIFICAREA BIOMASEI ALGALE ȘI REMEDIEREA HABITATELOR ACVATICE. Afișul de anunț a evenimentului este prezentat în imaginea din figura 4.1. Obiectivul principal al simpozionului l-a reprezentat diseminarea rezultatelor experimentale obținute în cadrul proiectului PN-III-P2-2.1-PED-2016-0068, cu titlul „Dezvoltarea și validarea de soluții fiabile pentru producere de biogaz din biomasă algală în Rezervația Biosferei Delta Dunării” (acronim BIOALG), contract nr. 170PED/2017, privind potențialul de valorificare al biomasei algale din Rezervația Biosferei Delta Dunării, precum și metode inovative de remediere a mediilor acvatice. Simpozionul a fost un bun motiv pentru diseminarea si promovarea cercetarilor stiintifice, cunoasterea celor mai noi realizari in domeniul tematic abordat, dezvoltarea de noi directii de cercetare si, nu in ultimul rand, identificarea unor solutii la problemele actuale cu care se confrunta societatea. Aspectele abordate in cadrul simpozionului au vizat: provocari pentru revigorarea producerii de biogaz/biometan in Romania, dezvoltarea unor solutii fiabile pentru producerea de biogaz din biomasa algala, monitorizarea factorilor care influenteaza productia de biogaz in vederea cresterii biodegradabilitatii masei de fermentare, evaluarea efectului inhibitor al salinitatii asupra proceselor de fermentare anaeroba, efectul tratamentului cu microunde asupra dezvoltarii microalgelor, valorificarea maselor microalgale ca stabilizatori de oxidare in degradarea materialelor polimerice, remedierea habitatelor acvatice din avalul centralelor hidroelectrice, remedierea apelor uzate cu recuperarea energiei prin tehnologia celulelor cu combustibil microbian, obtinerea unor fitopreparate in convergenta cu productia unor biocombustibili prin prelucrarea complexa a unor plante industriale.

Fig. 4.1 Anunț de informare simpozion național BIOALG La eveniment au participat peste 60 oaspeți incluzând invitați din mediul academic între care specialiști de la

institutul coordonator INCDIE ICPE-CA și institutul partener INCD Delta Dunării, cadre didactice de la Universitatea București și Institutul Politehnic București, cercetători științifici de la INCDCP ICECHIM cu competențe de specialitate în domeniul bioprocesării materialelor algale, reprezentanți ai asociațiilor si clusterelor din domeniul biocombustibililor, tineri cercetători, masteranzi și doctoranzi, reprezentanți ai companiei Hofigal SA cu tradiție în domeniul valorificării biomasei algale etc. Invitația de participare la eveniment și programul simpozionului sunt prezentate mai jos.

Sesiunea de lucrări I a fost adresată în special valorificării biomasei algale pentru sectorul biocombustibililor. În cadrul acestei sesiuni au fost prezentate lucrări științifice privind activitatea clusterului BiogasInno pentru produdcerea de biogaz/biometan în România, a fost efectuata o prezentare generală a proiectului BIOALG și lucrări

20

vizând potențialul de biomasă algală în Delta Dunării, monitorizarea proceselor de producere a biogazului din biomasă algală, obținerea de fitopreparate în convergență cu producerea de biocombustibil, efectul tratamentului cu microunde asupra dezvoltării biomasei microalgale etc. Sesiunea a doua de lucrări a inclus prezentări adresate în special valorificării biomasei algele în diverse moduri (industria farmaceutică și cosmetică, materiale polimerice îmbunătățite prin adaos de microalge), servicii de furnizare date privind distribuția biomasei algale, utilizarea biomasei algale în bioremedierea apelor, în special prin adsorbția de metale grele, dezvoltarea de tehnologii cu combustibil microbian, sisteme de remediere a apelor în avalul centralelor hidroelectrice, activități de inițiere a tinerilor în cercetarea științifică etc. 4.2 Activități diseminare rezultate

Activitățile de diseminare a rezultatelor desfașurate în cadrul proiectului au inclus participări ale membrilor echipelor de lucru de la institutul coodonator INCDIE ICPE-CA București și partenerul de proiect INCDDD Tulcea la diverse evenimente științifice naționale și internaționale. Lucrările prezentate sunt enumerate mai jos: Carmen Mateescu, Liliana Török, Reducing the impact of invasive algae by energy recovery in biogas systems,

Conferința internațională "Sinergii strategice la Marea Neagra”, in cadrul Zilelor Academiei de Stiințe Tehnice din România, 05-07 octombrie 2017, Constanța, România;

Carmen Mateescu, Liliana Török, Eduard-Marius Lungulescu, Zsolt Török, Nicoleta Oana Butoi, Ana-Maria Luchian, Robert Ducu, Cercetări privind potențialul de biogaz al algelor Cladophora sp. si Ulva intestinalis din Rezervația Biosferei Delta Dunării și zonele limitrofe, simpozionul BIOTA, 16-17 martie 2018, Cluj-Napoca, România;

Butoi Nicoleta Oana , Mateescu Carmen, Lungulescu Eduard-Marius, Ducu Robert, Luchian Ana-Maria, Experimental research in stimulating algal growth and biomass productivity by electrophysical actions, The 26th International Symposium "DELTAS AND WETLANDS" 2018, Tulcea, România;

Török Liliana, Mateescu Carmen, Ducu Robert, Török Zsolt, Establishing a protocol to analyze harvesting and exploitation of phytoplankton algae for biogas production, The 26th International Symposium "DELTAS AND WETLANDS" 2018, Tulcea, România, publicare la pag. 38 în Deltas and Wetlands (Book of Abstract), vol. 5, 62 pag., Tulcea, România, ISSN 2344-3766;

Carmen Mateescu, Nicoleta Oana Nicula, Eduard-Marius Lungulescu, Innovative method for stimulating biogas production in anaerobic bioreactors, Conferința internațională „Energie și mediu – provocări majore ale secolului XXI”, în cadrul Zilelor Academiei de Stiințe Tehnice din România, 18-19 octombrie 2018, Ploiești, România;

Ana-Maria Lupu, Evaluarea efectului inhibitor al salinității asupra proceselor de fermentare anaerobă, prezentare orală la Simpozionul national BIOALG, 25 octombrie 2018, București

Oana M., Török L., Török Z., 2018, Mass development episodes of some opportunistic macroalgae during summer season along the Romanian Black Sea Coast in the last decade, The 26th International Symposium "DELTAS AND WETLANDS" 2018, Tulcea, România, publicare la pag. 35 în Deltas and Wetlands (Book of Abstract), vol. 5, 62 pag., Tulcea, România, ISSN 2344-3766.

Török Liliana, Török Zsolt, Bozagievici Raluca, Evaluarea potenţialului de biomasă algală recoltabilă din Delta Dunării în vederea producerii de biogaz, prezentare orală la Simpozionul national BIOALG, 25 octombrie 2018, București

CAPITOL 5 - Brevetarea procedeului de fermentare a biomasei algale și a modelului demonstrativ experimental de laborator

În etapa a II-a de derulare a proiectului 170PED/2017 având titlul DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA DE SOLUȚII FIABILE PENTRU PRODUCERE DE BIOGAZ DIN BIOMASĂ ALGALĂ ÎN REZERVAȚIA BIOSFEREI DELTA DUNĂRII (Acronim BIOALG) au fost incluse activități de brevetare a rezultatelor proiectului, prin care să se protejeze drepturile de proprietate intelectuală asupra modelului demonstrativ de laborator și a tehnologiei de laborator. În cadrul acestei activități, un accent deosebit a fost pus pe dezvoltarea unui procedeu de optimizare a fermentării anaerobe pentru creșterea randamentului de biometan din fermentarea anaerobă a biomasei algale, în scopul reducerii efectului inhibitor al salinității și al structurilor macromoleculare greu fermentabile precum celuloze, hemiceluloze și lignină. Astfel, au fost elaborate și înregistrate la OSIM două cereri de brevet de invenție, care vor fi prezentate succint în continuare.

5.1 Brevetare model demonstrativ pentru evaluarea potențialului de biometan Cerere de brevet nr. A 00053/2018 „Model experimental pentru testarea potențialului de biometan al biomasei”, Autori: Mateescu Carmen, Lipcinski Daniel, Lungulescu Eduard-Marius, Tanase Nicolae, Török Liliana Rezumat

Invenţia se referă la un model experimental demonstrativ pentru testarea potențialului de biometan al biomasei, ce integrează într-un sistem unitar două bioreactoare de fermentare anaerobă care operează în paralel, în regim de temperatură mezofil, adaptabil și pentru regim termofil, fiecare bioreactor fiind echipat cu o linie de purificare biogaz și un recipient de recoltare biogaz purificat, permițând totodată cuantificarea producției de biogaz prin metode volumetrice, manometrice și cromatografice, precum și prelevarea manuală sau automată a probelor de biogaz pentru analize de laborator. Modelul experimental demonstrativ conform invenției este alcătuit din două incinte de fermentare

21

(1) și (2), fiecare cu volum de 5 litri, încălzite electric printr-o manta de încălzire (3), de tipul conductor din aliaj pe bază de Fe-Ni înfășurat spiralat pe suprafața cilindrică a corpului incintei, asigurând un regim de temperatură mezofil, adaptabil pentru regim termofil, controlul temperaturii realizându-se cu ajutorul unui controller de temperatură (4), incintele de fermentare fiind prevăzute cu câte un manometru (5), substratul organic de biomasă depozitat în rezervorul de alimentare (6) fiind introdus în incinta de fermentare, iar nămolul fermentat fiind evacuat și depozitat în rezervorul de evacuare (7), biogazul fiind purificat prin trecerea fluxului prin câte două vase de spălare (8), biogazul purificat fiind colectat în doi recipienți de recoltare biogaz (9), modelul experimental fiind echipat cu un recipient de azot (10) pentru crearea condițiilor de anaerobioză, componentele modelului experimental fiind integrate într-un sistem unitar prin amplasarea etajată pe un stand de susținere (11) cu trei nivele.

Fig. 5.1 Model demonstrativ experimental – schema de concept conform CBI A00053/2018

5.2 Brevetare procedeu de pretratare enzimatică a biomasei algale Cerere de brevet nr. A 00523/2018 „Procedeu de pretratare enzimatică a biomasei algale pentru producere de biogaz”, Autori: Mateescu Carmen, Nicula Nicoleta Oana, Lungulescu Eduard-Marius, Török Liliana, Török Zsolt Rezumat

Invenţia se referă la un procedeu de pretratare enzimatică a biomasei algale Ulva intestinalis utilizată ca substrat de fermentare în reactoarele anaerobe de producere biogaz, proba de biomasă algală fiind pretratată cu un amestec enzimatic fungic realizat prin utilizarea speciilor Trichoderma reesei, Trichoderma versicolor, Penicillinum chrysosporium, Fusarium solani, Chaetomium thermophile si Myrothecium verrucaria, cultivate în mediu nutritiv, biomasa algală inoculată cu material de inocul de tip dejecții de vite și pretratată enzimatic fiind fermentată anaerob în vas de sticlă brună, închisă etanș cu dop de cauciuc butiric, fixat cu bandă siliconică, volumul de aer din sticlă fiind evacuat prin purjare cu argon, vasul de sticlă fiind condiționat în incubator în regim termic mezofil, volumul de biogaz generat, colectat în recipient de stocare biogaz, fiind măsurat prin metoda dezlocuirii iar concentrația de metan din biogaz fiind determinată cromatografic, proba de biomasă algală pretratată enzimatic fiind comparată cu o probă martor, pregătită și condiționată în același mod ca proba pretratată, dar fără expunere la amestecul enzimatic, rezultatele experimentale indicând o creștere a producției de metan în biogaz cu 83% pentru proba pretratată enzimatic, comparativ cu proba martor, reprezentând un efect stimulativ al amestecului fungic asupra biodegradării structurilor compacte din materialul algal.

CAPITOL 6 - Concluzii și recomandări Producerea de biogaz din biomasă algală este viabilă din punct de vedere comercial în primul rând pentru

faptul că această opțiune este o alternativă cu multe avantaje economice și de mediu. Biomasa algală nu necesită pentru cultivare teren arabil, asigură o îmbunătățire a calității aerului prin absorbția bioxidului de carbon atmosferic și utilizează resurse de apă mai reduse decât culturile agricole. Cu toate acestea, trebuie menționat faptul că biocombustibilii din microalge prezintă unele dezavantaje față de cei obținuți din culturi agricole și din macroalge, între care producția de biomasă microalgală mai redusă cantitativ față de volumul biomasei rezultate din culturi agricole, dar mai ales faptul că dimensiunea mică a celulelor microalgale îngreunează procesul de recoltare și crește semnificativ costurile de fabricație. Aceste dezavantaje pot fi depășite prin îmbunătățirea procedeelor de recoltare și uscare, prin dezvoltarea de tehnici de inginerie genetică care să permită crearea unor căi metabolice capabile să ofere rate de creștere ridicate și un conținut mai mare de lipide sau prin dezvoltarea și implementarea unor tehnici de stimulare a creșterii celulare, precum stimularea prin acțiuni electrofizice.

Rezultatele experimentale prezentate în acest raport științific, atât pentru probele de macroalge cât și pentru cele de microalge, sunt în concordanță cu datele prezentate în literatura de specialitate și analizate în etapa a I-a a proiectului. Totuși, pentru proba de microalgă volumele de biometan și concentrațiile de biometan în biogaz obținute se situează sub nivelul minim de 50% CH4 necesar pentru ca biogazul să fie utilizat în aplicații din domeniul energetic, fiind necesare operații de îmbunătățire a procesului astfel încât să se realizeze un proces de valorificare fezabil din punct de vedere economic.

În ceea ce privește experimentele având ca substrat de fermentare probe de macroalge marine și dulcicole, rezultatele proiectului confirmă faptul că este oportună continuarea, dezvoltarea şi implementarea de soluţii pentru obţinerea de biogaz din biomasă algală pentru comunităţile defavorizate din localităţile din Delta Dunării, utilizând resurse vegetale alternative de tipul macroflorei algale autohtone.

Experiența acumulată în cursul derulării proiectului a scos în evidenţă faptul că în cazul speciilor autohtone utilizate pentru testele de fermentare este necesară îmbunătățirea procesului de izolare a speciilor şi ulterior a

22

tratamentelor la care trebuie supusă biomasa recoltabilă astfel încât materialul biologic utilizat în instalațiile de biogaz să atingă într-un timp rapid parametri optimi pentru producerea de biogaz. Studiile de acest tip trebuie sa continue chiar dacă procesul este unul dificil, care necesită o perioadă semnificativă de timp și spațiu pentru a produce rezultate eficiente. Considerăm totodată că este necesară dezvoltarea unor etape de pre-tratament care să contribuie la îmbunătățirea performanței instalaţiilor de producere a biogazului din alge autohtone.

De asemenea, se recomandă realizarea şi implementarea unor viitoare proiecte de cercetare care să vizeze testarea pe loturi experimentale şi evaluarea calităţii de material fertilizant a macroalgelor care produc în zonele de dezvoltare durabilă din Delta Dunării cantităţi mari de biomasa algală și a materialului fermentat rezultat după utilizarea acestuia în procesul de obţinere a biogazului Bibliografie: Angelidaki I, Alves M, Bolzonella D, Borzacconi L, Campos JL, Guwy AJ, Kalyuzhnyi S, Jenicek P, Van Lier JB (2009). Defining the

biomethane potential (BMP) of solid organic wastes and energy crops: A proposed protocol for batch assays. Water Science and Technology p. 927-34.

Annette Bruhn, Jonas Dahl, Henrik Bangs Nielsen Lars Nikolaisen, Michael Bo Rasmussen, Stiig Markager, Birgit Olesen, Carlos Arias, Peter Daugbjerg Jensen (2011) Bioenergy potential of Ulva lactuca: Biomass yield, methane production and combustion. Bioresource Technology 102, 2595–2604

A.J. Ward, D.M. Lewis, F.B. Green, Anaerobic digestion of algae biomass: A review, Algal Research 5 (2014), pp. 204–214 Bagatini IL, Eiler A, Bertilsson S, Klaveness D, Tessarolli LP, Vieira A. A. H., 2014, Host-Specificity and Dynamics in Bacterial Communities

Associated with BloomForming Freshwater Phytoplankton. PLoS ONE 9(1): e85950. B. J. Gallagher, “The economics of producing biodiesel from algae,” Renewable Energy, vol. 36, no. 1, pp. 158–162, 2011. Boedeker C., Eggert A., Immers A., Wakana I., 2010, Biogeography of Aegagropila linnaei (Cladophorophyceae, Clorophyta): a

widespread freshwater alga with low efficative dispersal potential shows a glacial imprint in its distribution. Journal of Biogeography 37Ș 1491 -1503

Borowitzka MA. Microalgae for aquaculture: opportunities and constraints. J Appl Phycol. 1997;9(5):393–401. Collins F.S., 1902, The Marine Clodophoras of New England. Rhodora, 4(42): 111-127 Dodds W.K., Gudder D.A., 1992, The ecology of Cladophora. Rev. J. Ph. 28: 415 – 427 Bondoso J., Godoy-Vitorino F., Vanessa Balagué V., Gasol J. M., Harder J., Lage O. M. 2017, Epiphytic Planctomycetes communities

associated with three main groups of macroalgae. FEMS Microbiology Ecology, , 93 (3): fiw255, doi: 10.1093/femsec/fiw255 Cardoso C, Ripol A, Afonso C, Freire M., Varela J., Quental-Ferreira H., Pousão-Ferreira P., Bandarra N., 2017, Fatty acid profiles of the

main lipid classes of green seaweeds from fish pond aquaculture. Food Sci Nutr. 5:1186–1194. https://doi.org/10.1002/fsn3.511 Collins F.S., 1902, The Marine Clodophoras of New England. Rhodora, 4(42): 111-127 Dodds W.K., Gudder D.A., 1992, The ecology of Cladophora. Review. J. Phycol. 28: 415 – 427 Ebadi A.G., Hisoriev H., 2018, Cladophora glomerata L. as indicator of chemical pollution Revista Publicando, 5 No 14. No. 2. 183-191.

ISSN 1390-9304 Eigemann F., Hilt S., Salka I., Hans-Peter Grossart H-P., 2013, Bacterial community composition associated with freshwater algae: species

specificity vs. dependency on environmental conditions and source community. FEMS Microbiol Ecol 83: 650–663, DOI: 10.1111/1574-6941.12022

Fabrowska J., Łęska B., Schroeder G., 2015, Freshwater Cladophora glomerata as a new potential cosmetic raw material, CHEMIK, 69(8): 645-647

Fong P., Fong J. J., Fong C. R., 2004, Growth, nutrient storage, and release of dissolved organic nitrogen by Enteromorpha intestinalis in response to pulses of nitrogen and phosphorus, Aquatic Botany 78: 83–95

Funk A., Trauner D., Hein T., Mattheiss V., Clément Charbonnier C., Krautkraemer A., Strosser P., Costea G., Pusch M., Marin E., Török L., Török Z., 2018, D9.2 Case Study Report. Case Study 3: Danube River Basin - harmonising inland, coastal and marine ecosystem management to achieve aquatic biodiversity target, 38 pag

Gâştescu P, Ştiucă R., 2006, ’’Delta Dunării Rezervaţie a Biosferei’’, ISBN 973-8044-72-3, Constanţa Guiry M.D., Guiry G.M. 2018. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway.

http://www.algaebase.org Guschina IA, Harwood JL. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Prog Lipid Res. 2006;45(2):160–186. Higgins S.N., Malkin S.Y., Howell E.T., Guildford S.J., Campbell L., Hiriart-Baer V., Hecky R.E., 2008, An ecological review of Cladophora

glomerata (Chlorophyta) in the Laurentian Great Lakes, Journal of Phycology 44(4): 839-854, https://doi.org/10.1111/j.1529-8817.2008.00538.x

Hoek C. van den. (1963). Revision of the European species of Cladophora. E.j. Bill. Leiden, pp.1-32. Jerry D. Murphy, Bernhard Drosg, Eoin Allen, Jacqueline Jerney, Ao Xia, Christiane Hermann, A perspective on algal biogas, IEA

Bioenergy, broșura tehnică ISBN 978-1-910154-18-2 (editie electronica); Krammer (K.), Lange-Bertalot (H.), 1986, Bacillariophyceae. Naviculaceae. Vol. 2 / 1, pp. 1 - 875. Krammer K., Lange-Bertalot H., 1988, Bacillariophyceae. Bacillariaceae, Epithemiaceae, Surirellaceae. 2/2: 1 - 596. Krammer K., Lange-Bertalot H., 1991a, Bacillariophyceae. Achnanthaceae, Navicula, Gomphonema. 2/4: 1 - 437. Krammer K., Lange-Bertalot H., 1991b, Bacillariophyceae. Centrales, Fragilariaceae, Eunotiaceae. 2/3: 1 - 576. Khuantrairong T, Traichaiyaprn S. 2011, The nutritional value of edible freshwater alga Cladophora sp. (Chlorophyta) grown under different

phosphorus concentrations Int J Agric. Biol.; 13:297-300. Lago, M., Boteler, B., Jähnig, S., Iglesias-Campos, A., Delacámara, G., Piet, G., Hein, T., Nogueira, A.J.A., Strosser, P., Robinson, L., De

Wever, A., O’Higgins, T., Schlüter, M., Török, L., Reichert, P., van Ham, C., Villa, F., & Rouillard, J., 2018, Introducing the H2020 AQUACROSS project: Knowledge, Assessment, and Management for AQUAtic Biodiversity and Ecosystem Services aCROSS EU policies, Science of the Total Environment 652: 320–329; https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2018.10.076

Laungsuwon R., Chulalaksananukul W., 2014, Chemical composition and antibacterial activity of extracts from freshwater green algae, Cladophora glomerata Kützing and Microspora floccosa (Vaucher) Thuret J. BioSci. Biotech., 3(3): 211-218.

Leliaert F. Boedeker C., 2013, Chlorophyta. Cladophorales. IN: Burrows E.M (ed.), Seaweeds of the British Isles, Volume 2: Chlorophyta, 238 pag., ISBN-13: 9781907807725

23

Leliaert, F. 2004, Taxonomic and phylogenetic studies in the Cladophorophyceae (Chlorophyta). University of Wisconsin, Milwaukee Press.

Malkin S. Y., 2007, The Ecology of the Nuisance Macroalga, Cladophora glomerata, and its Resurgence in Lake Ontario, Teza de doctorat, University of Waterloo, p. 137, Ontario, Canada

Messyasz B., Rybak A., 2008, Macroalga Ulva intestinalis (L.) occurrence in freshwater ecosystems of Poland: A new locality in Wielkopolska, Teka Kom. Ochr. Kszt. Środ. Przyr. – OL PAN, 5, 126–135

Oosterberg, W., Staraş, M., Bogdan, L., Buijse, A.D., Constantinescu, A., Coops, H., Hanganu, J., Ibelings, B.W., Menting, G.A.M., Năvodaru, I., Török, L., 2000, Ecological gradients in the Danube Delta lakes - Present state and man-induced changes, RIZA rapport 2000.015., ISBN 90.369.5309x, The Netherlands: 1-168.

Molina Grima E, Belarbi EH, Acien Fernandez FG, Robles Medina A, Chisti Y. Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics. Biotechnology Advances. 2003;20:491–515. doi: 10.1016/S0734-9750(02)00050-2.

Murphy J, Braun R, Weiland P., Wellinger A. (2011) Biogas from Crop Digestion. IEA Bioenergy, http://www.iea-biogas.net/_content/publications/publications.php

Murphy, J.D., Thamsiriroj, T. (2011) What will fuel transport systems of the future? Materials Today, 14, (11) 518 – 524 Murphy, J.D., Power, N.M. (2008). How can we improve the energy balance of ethanol production from wheat? Fuel, 87 (10-11)1799 –

1806 Mussgnung, J.H., Klassen, V., Schluter, A. and Kruse, O. (2010) „Microalgae as substrates for fermentative biogas production in a

combined biorefinery concept,‟ Journal of Biotechnology, vol 150, pp51-56 Ólafsson E., Aarnio K., Bonsdorff E., Arroyo N. L., 2013, Fauna of the green alga Cladophora glomerata in the Baltic Sea: density, diversity,

and algal decomposition stage, Marine Biology 160(9): 2353–2362 Parthiban C., Saranya C., Girija K., Hemalatha A., Suresh M., Anantharaman P., 2013, Biochemical composition of some selected

seaweeds from Tuticorin coast, Advances in Applied Science Research, 4(3):362-366 Raja R, Hemaiswarya S, Kumar NA, Sridhar S, Rengasamy R. A perspective on the biotechnological potential of microalgae. Critical Rev

Microbiol. 2008;34(2):77. Ruangchuay R., Dahamat S., Chirapat A., Notoya M., 2012, Effects of culture conditions on the growth and reproduction of Gut Weed,

Ulva intestinalis Linnaeus (Ulvales, Chlorophyta), Songklanakarin J. Sci. Technol. 502 34 (5), 501-507 S. Wang, X. Hou, H. Su, Exploration of the relationship between biogas production and microbial community under high salinity conditions,

Sci. Rep (2017), pp. 1-10, DOI:10.1038/s41598-017-01298-y Sabunas A., Romagnoli F., Pastare L., Balina K., 2017, Laboratory algae cultivation and BMP test with Ulva intestinalis from the Gulf of

Riga, Energy Procedia 113: 277 – 284 Serrano Jr. A. E., Aquino J. I. L., 2014 Protein concentrate of Ulva intestinalis (Chlorophyta, Ulvaceae) could replace soybean meal in the

diet of Oreochromis niloticus fry. AACL Bioflux 7(4):255-262. Shankhadarwar S. D., 2015, Phytochemical screening of marine algae Ulva lacuta (Linn.) and Enteromorpha intestinalis (Linn.) Chem.

Pharm. Res., 7(12):419-423 Sialve B, Bernet N, Bernard O. Anaerobic digestion of microalgae as a necessary step to make microalgal biodiesel sustainable. Biotechnol

Advances. 2009;27(4):409–416. Siddik M. A. B., Anh N. T. N. 2015, Preliminary assessment of the Gut weed Ulva intestinalis as food for herbivorous fish, Int Aquat Res

7:41–46, DOI 10.1007/s40071-014-0091-5 Starmach K., 1972, Flora Slodkowodna Polski, 10: 227-263 Tabarsa M., Sang Guan You, Elham Hashem Dabaghian, Utoomporn Surayot, 2018, Water-soluble polysaccharides from Ulva intestinalis:

Molecular properties, structural elucidation and immunomodulatory activities. J. of Food and Drug An. 26: 599 -608 Török, L., 2011, The trend of phytoplankton development in Danube Delta’s lakes, Scientific. Annals of the Danube Delta Institute, 17: 89-

98, Tulcea Török, L. 2014, Assessment of phytoplankton variation by spectral fluorescence in the Danube Delta Biosphere Reserve Journal of

Environmental Protection and Ecology, 15 (2): 517-525 Uttaro AD. Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids in lower eukaryotes. IUBMB Life. 2006;58(10):563–571. Zulkifly S., Hanshew A., Young E. B., Lee Ph., Graham M. E., Graham M. E., Piotrowski M., Graham L. E., 2012, The epiphytic microbiota

of the globally widespread macroalga Cladophora glomerata (Chlorophyta, Cladophorales) American Journal of Botany 99(9): 1541–1552, doi:10.3732/ajb.1200161

Zulkifly S. B., Graham J. M., Young E. B., Mayer R.J., Piotrowski M. J., Smith I., Graham L. E., 2013, The genus Cladophora Kützing (Ulvophyceae) as a globally distributed ecological engineer. J. Phycol. 49: 1-17

Y. Zhang, M. Asraful Alam, X. Kong, Z. Wang, L. Li, Y. Suna, Z. Yuana, Effect of salinity on the microbial community and performance on anaerobic digestion of marine macroalgae, J. Chem Tchnol Biotechnol (2017), DOI 10.1002/jctb.5246

Yoon M., Kim M.K., Kim G.H., 2009, Conjugation Process in Sprirogyra varians Monitored with FITC-lectins (Zygnemataceae, Chlorophyta). Algae 24 (1): 39-45

Whitton B.A., 1970, Biology of Cladophora in freshwaters, Water Research Pergamon Press, 4: 457-476 ****, 2006: Ordinul nr. 161 din 16.02.2006 al Ministerului Mediului şi Gospodăriruu Apelor pentru aprobarea Normativului privind

clasificarea calităţii apelor de suprafaţă în vederea stabilirii stării ecologice a corpurilor de apă. IN: Monitorul Oficial al României, no.511 (publicat în 13.06.2006) Bucureşti

***, 2009, Planul de management al fluviului Dunărea, Deltei Dunării, spaţiului hidrografic Dobrogea şi apelor costiere/ Management plan of the Danube River, the Danube Delta, the hydrographic space of Dobrogea and the coastal waters, vol. 1, 594 pag., ANAR http://www.rowater.ro

****, 2015: Planul naţional de management aferen porţiunii din bazinul hidrografic internaţional al fluviului Dunărea care este cuprinsă în teritoriul României. Sinteza planurilor de management la nivel de bazine/spaţii hidrografice, 345 pag., Bucureşti

****, 2017, Studii de cercetare, elaborare concept model demonstrativ, prelevare și evaluare probe de biomasa, achiziție materiale și echipamente, 34 pag., Raport etapă I / 11.2017 (Coord.(P1) Liliana Török al contractului nr. 170PED ⁄ 2017, (executant: INCDDD). Tulcea, România.

**** 2018, CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), Dunstaffnage Marine Laboratory, UK, Web: www.ccap.ac.uk