referat de doctorat - producerea de 1.4-butandiol prin fermentare

Universitatea POLITEHNICA din Bucureti

Splaiul Independenei nr. 313, Bucureti RO-060042, ROMNIA

Tel. + 4021 402094064; Fax. +4021 318 10 03

www.upb.ro

Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

microorganismelor modificate genetic prin inginerie metabolic

Referat de doctorat

Dobos Alpr

Coordonator tiinific:

Prof. Dr. Ing. Lnyi Szabolcs


microorganismelor modificate genetic prin inginerie metabolic.

2

Cuprins

1 Introducere .......................................................................................................................... 3

2 Obiectivele cercetrii .......................................................................................................... 4

3 Studiu bibliografic .............................................................................................................. 5

3.1 1,4-Butandiol ............................................................................................................... 5

3.2 Biologia sistemic i ingineria metabolic .................................................................. 6

3.3 Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor ........................................... 9

3.4 Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru construirea modelelor ... 12

3.5 Modele metabolice folosite n ingineria metabolic ................................................. 14

3.6 Metoda OptStrain ...................................................................................................... 15

3.7 Analiza fluxurilor ...................................................................................................... 17

3.8 Programul OptFlux .................................................................................................... 21

4 Metode i materiale .......................................................................................................... 22

4.1 Ci pentru producerea de 2,3-butandiol .................................................................... 22

5 Rezultate i discuii ........................................................................................................... 30

6 Bibliografie ....................................................................................................................... 49



3

1 Introducere

1,4-Butandiol este un produs chimic important la producerea polimerilor, iar n momentul de

fa producerea lui se bazeaz pe industria petrolier, mpreun cu acetilen, butan,

propilen,butadien etc. Consumul anual de 1,4-butandiol este mai mult de 2,5 milioane de

tone, producerea lui din produse petroliere nu este fezabil i sustenabil [1].

ntre factorii care duc la concluzia c tehnologia pentru producerea de 1,4-butandiol trebuie

s fie schimbat se afl creterea constant a preului produselor petroliere i creterea

emisiilor de gaze cu efect de ser. O alternativ a cilor de producere convenionale ar fi

producerea de 1,4-butandiol din biomas. Balana emisiilor de gaze cu efect de ser devine

mai favorabil cnd 1,4-butandiol este produs din biomas, aceste fiind absorbite via

fotosintez, i costul biomasei este semnificativ inferior fa de produse petroliere [2].

Niciuna dintre microorganisme cunoscute nu produc 1,4-butandiol, astfel microorganismele

trebuie s fie modificate prin ingineria metabolic pentru a atinge scopul propus [1].

Primele ncercri au constat din dou trepte: producerea acidului succinic din biomas (zahr

provenit din biomas) prin fermentare, dup care producerea de 1,4-butandiol din acid

succinic folosind metode convenionale. ncercrile cel mai recente au avut ca scop

fermentarea direct de 1,4-butandiol din zahr [2].

Fermentarea direct de 1,4-butandiol necesit identificarea noilor ci metabolice, producerea

lui este inexistent n natur, astfel nu exist nici o cale metabolic complet. Pentru

identificarea cilor metabolice, modele matematice trebuie s fie folosite. Rezultatul

modelrii este un set de ci care n teorie ar duce la 1,4-butandiol, iar dintre aceste variaii

trebuie s fie selectate cele mai optime, baznd pe numrul pasurilor metabolice, randamentul

procesului, criterii termodinamice, etc. Variaiile selectate apoi trebuie s fie experimentate n

laborator, variaia care funcioneaz i are cel mai mare randament este soluia la problem

[1]. Cercetrile n domeniu exist, variaia cel mai fezabil a fost patentat de o firm

american, GENOMATICA, care este specializat n producerea produselor petroliere prin

procese biologice. Ei vor nfiina o firm cu o capacitate de 18000 tone pe an pentru

producerea de 1,4-butandiol prin fermentare [3].



4

ns tehnologia cercetat exist, tema rmne deschis, ar putea exista posibiliti de

optimizare i identificare a cilor cu randament mai mare. Tehnologia poate fi adaptat la

diferite condiii geografice ct i la diferite substraturi de intrare.

2 Obiectivele cercetrii

Obiectivul global al cercetrii este producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul

microorganismelor modificate prin ingineria metabolic: identificarea cilor noi, analiza

cilor identificate de ctre firma Genomatica, alegerea celor mai potrivite ci, identificarea

enzimelor care particip n lanul de reacii, modelarea computaional a procesului

biochimic, planificarea vectorului i implementarea procesului n laborator.

Obiectivul referatului este analiza literaturii n domeniu. Exist diferite metode pentru

modelarea cilor metabolice i pentru preconizarea cilor care ar duce la un produs de interes.

Scopul principal a studiului este analiza metodelor existente, identificarea i cunoaterea

funcionrii programelor n domeniu.

O evaluare preliminar a programelor i a metodelor disponibile va fi fcut pentru

verificarea capabilitii lor pentru a identifica ci metabolice pentru producerea de 2,3-

butandiol. Scopul la faza asta este inventarierea programelor n domeniu, dei nu am ales

identificarea cilor pentru producerea de 1,4-butandiol, care este o sarcin mult mai

complicat, aceste ci nu pot fi gsite la nici una dintre organismele cunoscute n momentul

de fa, nu ca i n cazul 2,3-butandiolului, care este prezent la diverse organisme.

Substratul cel mai obinuit pentru producerea butandiolului este glucoza provenit din

agricultur, cea ce impune problema creterii preurilor de mncare. Concurena ntre

alimentaia populaiei i asigurarea materialelor prime pentru industrie ar putea deveni o

problem. Pentru evitarea acestuia am decis s folosim glucoza produs din deeuri i

glicerol, cea ce este un produs secundar la producerea biodieselului.

Deeurile conin o cantitate mare de celuloz care poate fi transformat n glucoz prin cale

biologic [4]. n deeuri este disponibil o cantitate mai mare de celuloz dect n amidon,

care se afl n cantiti mai mari n plante industriale sau alimentare. Amidonul se afl n

condiie relativ pur, n comparaie cu celuloz, care este mixat cu lignin care se



5

descompune mai greu. Celuloza nu este uor de transformat n glucoz, dar nu este imposibil,

o varietate de enzime sunt necesare pentru realizarea procesului.

Biodieselul se formeaz prin transesterificarea lipidelor cu alcool, formndu-se glicerol ca

produs secundar conform reaciei de mai jos.

Figura 1: Reacia de formare a biodieselului [5]

Glicerolul a devenit un produs secundar ieftin, la fiecare 100 L de biodiesel produs se

formeaz inevitabil 10 L de glicerol. Dezvoltarea intens a industriei de biodiesel rezult un

surplus semnificativ de glicerol micornd preurile. Aceast reducere a preurilor este o

problem pentru industria de glicerol, la fel i pentru industria de biodiesel. Conversia

glicerolului la un produs cu un pre mai mare este o soluie promitoare [6].

3 Studiu bibliografic

3.1 1,4-Butandiol

1,4-Butandiol este un lichid necolorat, derivat din butan prin punerea grupelor de alcool la

fiecare capt a lanului. Este una dintre cele patru izomere stabile a butandiolului.

Figura 2: Molecula de 1,4 butandiol [7]



6

1,4-butandiol este folosit ca solvent la lichide de curire industriale, de exemplu

tetrahidrofuran, este folosit i la producerea plasticelor, de exemplu polibutilen tereftalat,

fibre, poliuretane. Majoritatea productorilor, cum sunt BASF, DuPont, Linde i

LyondellBasel, pentru producerea de 1,4-butandiol folosesc o varietate de procese

nesustenabile, bazate pe petrochimie[8].

Procesul cel mai vechi pentru producerea de 1,4-butandiol este procesul Reppe, n care

acetilena reacioneaz cu dou molecule de formaldehid formnd 1,4-butandiol. n 1990

LyondellBasel a dezvoltat un proces fr acetilen. Procesul ncepe cu conversia oxiduli de

propilen n alcool alilic. Prin hidroformilare, alcoolul alilic se transform n 4-

hidroxibutiraldehid, care este hidrogenat n 1,4-butandiol. Exist i alte procese pentru

producere de 1,4-butandiol bazate pe butadien, acetat de alil i acid succinic, dar aceste

procese au produse secundare care au efect negativ asupra mediului [8].

Dependena producerii de 1,4-butandiol de produse petroliere a forat dezvoltarea metodelor

sustenabile prin fermentare cu ajutorul microorganismelor. Primele ncercri au avut dou

trepte: producerea acidului succinic prin fermentare, apoi transformarea acestuia n dimetil

ester i n final n 1,4-butandiol. Conform metodelor cele mai recente, este posibil i

producerea direct de 1,4-butandiol prin fermentare. Metoda asta va fi relatat n continuare.

Tabel 1: proprietile de 1,4 butandiol [7]

Formula molecular C4H10O2

Mas molecular 90,12 g/mol

Densitate 1,0171 g/cm3 (20 C)

Punct de topire 20,1 C

Punct de fierbere 235 C

Solubilitate n ap Miscibil

Solubilitate n etanol Solubil

3.2 Biologia sistemic i ingineria metabolic

Biologia sistemic asigur un cadru pentru construirea modelelor sistemelor biologice. De la

invenia tiinei, analiza computaional a msurrilor efectuate privind funcionarea celulelor

pentru modelarea i descoperirea proceselor s-a dezvoltat semnificativ [9]. Biologia sistemic



7

este tiina care are ca obiectiv nelegerea felului n care macromolecule prind via atunci

cnd fac parte dintr-un sistem. Aceast tiin propune studierea organismelor n ansamblu,

ca un tot unitar, fcnd legtur ntre genom, proteom i metabolom. Concepia a fost

rspndit n 2000 ca o tiin interdisciplinar, combin multe alte ramuri a biologiei ca

biologie molecular, biochimie, bioinformatic i metabolomie. Biologia sistemic analizeaz

cile metabolice, modeleaz procesele biochimice, asigur informaii privind funcionarea

acestora.

Beneficiarul cel mai important a biologiei sistemice este ingineria metabolic, care folosete

informaiile asigurate de acesta. Ingineria metabolic const n optimizarea genetic a

proceselor de regulare a celulelor pentru producerea compusului de interes. Ingineria

metabolic ntr-un fel a precedat biologia sistemic, prin crearea necesitii de analizare

sistematic a cilor metabolice i optimizarea lor [10].

Ingineria metabolic are o dimensiune distinct industrial, fiindc se adreseaz proiectrii

unor microorganisme care pot fi folosite ca bio-catalizatori pentru producerea

combustibililor, chimicalelor i produselor farmaceutice. Fa de biologia sintetic, ingineria

metabolic nu doar asambleaz genele pentru construirea cilor metabolice, ci i creeaz un

proces economic pentru producerea chimicalelor, optimiznd procesul. Elementele de baz al

ingineriei metabolice sunt planificarea, construirea i optimizarea cilor.

Celulele modificate genetic pentru producerea chimicalelor de interes pot fi considerate i ca

bio-reactoare mici, avnd materii de intrare i produse de ieire. Procesul de dezvoltarea a

celulelor modificate pot fi divizate n trei grupe: faza de planificare, faza de cercetare i faza

de evaluare. Procesul este prezentat n urmtoarea diagram [11].

Ar fi ideal c procesul s fie linear, iar dup cum se vede i n diagrama, sunt multe repetiii

n lanul activitilor. Modelul dezvoltat trebuie s fie ajustat dup experimentele in vivo. Este

necesar analiza cantitativ a fluxelor intracelulare i actualizarea variabilelor. Unul dintre

obiectivele cercetrii este construirea i ajustarea modelului metabolic pentru producerea de

1,4 butandiol. n continuare vor fi relatate metodele de modelare i construirea modelelor.



8

Figura 3: Procesul de dezvoltare, modificare genetic a microorganismelor [11]



9

n ani receni un set de metode au fost dezvoltate pentru preconizarea cilor metabolice cu

scopul de producere de chimicale prin fermentare microbiologic [12]. Cercetarea reelelor

metabolice impune dou probleme: analiza i sinteza. Analiza implic studierea reaciilor

biochimice i identificarea fiecrei cale metabolic, pentru producerea unui compus

biochimic dintr-un set de compui i reacii biochimice cunoscute. Sinteza implic

identificarea reaciilor i compuilor biochimice inexistente, non-native [13].

Bazat pe cunotinele despre un sistem metabolic, putem manipula sau modifica organismele

pentru a maximiza producerea compusului dorit [14].

Metodele pentru preconizarea cilor pot fi clasificate prin baza abordrii [12]:

1. Metode bazate pe schimbrii de structuri chimice

Metodele din grupul acesta sunt folosite pentru reconstruirea reelelor de relaii ntre compui

biochimici, folosind analiza omologiilor bazate pe structur. Aceast metod genereaz o

varietate de ci non-native, iar preconizarea enzimelor este dificil [12].

2. Metode bazate pe informaii enzimatice

Metodele bazate pe informaii enzimatice se concentreaz la eliminarea genelor i

combinarea cilor existente la diferite microorganisme. Aceast metod este util, dar

preconizrile efectuate sunt limitate la compui biochimici cunoscute [12].

3. Metode bazate pe mecanisme de reacii

Metodele bazate pe mecanisme de reacii sunt capabile pentru identificarea cilor pentru

producerea produsului de interes, dintr-un set de substraturi. Aceste metode au capacitatea de

a identifica ci non-native conform cilor i regulilor cunoscute, dar sunt limitate la reaciile

de biodegradare [12].

3.3 Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor

Programele menionate n capitolele anterioare pot fi combinate, pot fi folosite la acelai scop

diferite programe , [15].



10

Figura 4: Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor i programe utile la fiecare pas [15]

1. Preconizarea cilor metabolice

n primul pas un numr mare de ci posibile sunt identificate, bazate pe reguli chimice i hri

metabolice. La faza asta avem deja o idee general despre posibiliti de producere a

compusului de interes, fr s avem cunotine privind proprietile termodinamice etc.

2. Prioritizarea cilor metabolice

Prioritizarea cilor metabolice are rolul de a reduce numrul cilor identificate la primul pas,

dup criterii termodinamice, distana cii, numrul pasurilor non-native etc. Cile selectate au

o ans mai mare c pot fi introduse ntr-un organism cu succes i vor fi exprimate. Numrul

pasurilor la calea metabolic nu influeneaz rata produceri produsului de interes, iar

Sinteza

RBS Calculator, Gene Designer, GeneDesign,

DNAWorks, Clotho, Thinker Cell, GenoCAD,

SynBioSS

Proiectarea genelor i integrarea

cii

Selectarea cii cel mai potrivite

COBRA toolbox, SurreyFBA, CycSim, Biomet

toolbox, IPATH2, GLAMM

Modelarea cilor metabolice

Desharky, Retro Path Prioritizarea cilor metabolice

BNICE, Desharky, FMM, RetroPath Preconizarea cilor metabolice



11

producia enzimelor n plus consum mai mult energie. Efectul pozitiv a reducerii numrul

pasurilor non-native pentru creterea eficienei nu este evident. Exist o competiie ntre

cile metabolice native i ci metabolice introduse artificial. Cu ct mai multe enzime sunt n

comun cu reeaua metabolic a organismului gazd, cu att competiia va deveni mai mare,

astfel mai multe gene trebuie eliminate pentru asigurarea producerii compusului dorit.

Separarea complet a cilor non-native de la ci native nu este o soluie, trebuie s existe o

conexiune ntre ele.

3. Modelarea cilor metabolice

Modelarea cilor metabolice asigur informaii privind comportamentul cii la organismul de

gazd, folosind analiza fluxului. Aceast analiz asum c sunt condiii steady-state i

fluxurile sunt determinate n funcia coeficienilor stoichiometrice. La modelarea cilor

criteriile de optimizare trebuie s fie definite, criteriul cel mai frecvent ales este producerea

maxim a biomasei, iar acesta poate fi combinat cu producerea compusului de interes.

4. Selectarea cii cel mai potrivite

Calea cu cel mai mare rat de producie va fi selectat, dup simularea comparativ a

modelelor elaborate.

5. Proiectarea genelor i integrarea cii

Prile cii metabolice trebuie s fie analizate, trebuie identificate enzimele, secvenele de

ADN trebuie s fie determinate.

6. Sinteza

Ordinea pasurilor nu este linear, iteraii pot exista ntre ele, aceste sunt necesare pentru

optimizarea procesului, informaiile dobndite la sfritul procesului de proiectare pot fi

folosite la reevaluarea informaiilor la nceput [15].



12

3.4 Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru construirea

modelelor

Exist o gam larg de programe care sunt accesibile gratuit pe internet, care sunt utile i

pentru non-profesioniti, dar sunt i programe fr o interfa sofisticat. n tabelul de mai jos

sunt prezentate programele cel mai rspndite n domeniu.

Tabel 2: Lista programelor [15]

Sistem Descripie

Preconizarea cilor

BNICE Biochemichal Network Integrated Computational Explorer, cadru pentru

identificarea i evaluarea termodinamic a cilor posibile pentru degradarea

sau producerea compusului dorit.

System of Cho et al. Cadru pentru identificarea i prioritizarea cilor metabolice pentru sinteza

compusului chimic specificat de utilizator

Desharky Algoritm pentru identificarea cilor. Identific cile metabolice, care sunt cel

mai corespunztoare cu reea metabolic a unui organism gazd i identific

secvenele de aminoacizi a enzimelor corespunztoare de la organisme care

sunt similare

RetroPath Este un web server pentru gzduirea cadrului pentru proiectarea retro-sintetic

a cilor de metabolism, integreaz preconizarea i clasificarea cilor,

preconizeaz i compatibilitatea cu gene a organismului de gazd

FMM From Metabolite to Metabolite, este un web server pentru identificarea cilor

metabolice folosind baza de dat KEGG

CarbonSearch Un algoritm pentru identificarea cilor metabolice prin urmrirea conservrii

atomilor

OptStrain Este un cadru care ajut la optimizarea reelei metabolice a organismului de

gazd prin adugarea sau tergerea reaciilor

Identificarea prilor

Registry of Standard

Biological Parts

Registrul al Massachusetts Institute of Technology, coninnd diverse feluri de

pri biologice, de exemplu secvene de promotori, secvene terminatorii,

plasmide. Registrul conine informaii colectate de la competiii iGEM.

Standard Biological

Parts knowledgebase

O baz de date (inclusiv pri din Registry of Standard Biological Parts), care

a fost transformat n formatul Synthetic Biology Open Language pentru a face



13

informaii calculabile

IMG Integrated Microbial Genomes, mediu pentru analiza comparativ i evolutiv

a genelor microbiale

antiSmash Identificarea, adnotarea i analiza comparativ a genelor pentru sinteza

metaboliilor secundari

KEGG Colecia cea mai important a metaboliilor i cilor metabolice, include ci

specifice a organismelor, hri generale cu ci metabolice, corelaii ntre gene

i enzime, informaii ortologice etc.

ASC Activ Site Classification, folosete structura proteinelor pentru identificarea

reziduurilor lng site-ul activ al enzimelor.

Refactorarea i sinteza prilor

RBS calculator Proiectarea automat a site-urilor de legtur ribozomal, bazat pe modele

termodinamice

RBS Designer Algoritm pentru preconizarea eficienelor de traducere de ARNm, este

capabil pentru proiectarea site-urilor de legtur ribozomal pentru un nivel

de expresie a proteinelor

Gene Designer 2.0 Pachet de programe pentru proiectarea genelor, operonelor i vectoarelor,

optimizarea codonilor

Gene Design Un server cu algoritmi pentru optimizarea codonilor, introducerea grafic a

site-urilor de restricie la secvene de nucleotide

Gene Composer Program pentru proiectarea genelor

Optimizer Web server pentru optimizarea codonilor, folosind tabelul cu rolul codoanelor

Programe pentru proiectarea cilor metabolice

Biojade Program pentru proiectarea i simularea circuitelor genetice

Clotho Interfa flexibil pentru proiectarea sistemelor sintetice biologice, este

capabil pentru folosirea plugin-elor cu ajutorul crora este posibil

vizualizarea, importarea i editare secvenelor ADN

Tinker Cell Un program CAD pentru simularea sistemelor biologice

Asmparts Instrument computaional pentru generarea modelelor prin asamblarea prilor

GenoCAD Un program CAD pentru proiectarea secvenelor ADN, cu posibilitatea

evalurii gramaticale a genelor

WebGEC Un simulator fabricat de Microsoft pentru evaluarea i simularea circuitelor

genetice

SynBioSS Program pentru proiectarea, modelarea i simularea sistemelor genetice.



14

Programul poate fi folosit pentru transformarea secvenelor BioBrick (de la

Registry of Standard Biological Parts) sau altor pri ntr-un model care poate

fi simulat la programul SynBioSS Desktop Simulator

Cell Designer Program pentru desenarea reelelor biochimice, care pot fi salvate n System

Biology Markup Langueage (SBML) format

BionetCAD Este un plug-in pentru CAD i simularea reelelor biochimice

Modelarea metabolic i analiza fluxurilor

Cobra Toolbox Un program standard pentru modelarea metabolic i analiza fluxurilor

Surrey FBA Instrument pentru modelarea sistemelor la nivel genetic

CycSIM Web server pentru analizarea modelelor metabolice, include i simulri de

eliminare a enzimelor

BioMet Toolbox Instrument online pentru analiza modelelor metabolice, include i eliminri de

gene, optimizri de flux

iPath2 Vizualizarea interactiv a datelor cilor metabolice, elementele hrilor

metabolice bazate pe KEGG pot fi colorate dup preferina utilizatorului

GLAMM Vizualizarea interactiv a cilor metabolice, poate folosi reele metabolice

specifice organismului de gazd i permite detectarea cilor

3.5 Modele metabolice folosite n ingineria metabolic

Exist mai multe tipuri de modele metabolice folosite pentru analiza, simularea sistemelor

metabolice n celule. Modelele mai simple sunt utile la descrierea metabolismului la o scar

mai larg, de exemplu la nivelul celulei, iar modelele mai complexe sunt utile la descrierea

metabolismelor la o scar mai mic, de exemplu numai pentru modelare glicolizei. Modelele

mai complexe necesit mai multe informaii care de multe ori nu sunt disponibile la scar mai

mare.

Modelele topologice includ interaciuni ntre metabolii i enzime, sunt folosite ca puncte de

nceput la analiza datelor i la cutarea cilor metabolice prin metode de teoria grafurilor.

Modelele stoichiometrice bazate pe constrngeri sunt modele statice cu aplicaii largi n

identificarea intei pentru modificarea genomului a organismelor. Aceste modele includ

relaii stoichiometrice ntre enzime i produi n reacii. Direcia reaciilor i constrngerii

fluxului pot fi obinute de exemplu de la valori termodinamice i capaciti enzimatice.



15

Cteva dintre aceste modele sunt adnotate cu reguli de reacii a genelor, cea ce asigur un

link direct cu genomul i permite simulaii a efectelor schimbrii genomului n organism.

Modelele stoichiometrice atom-maped include i transfere atomice la reacii metabolice.

Pentru aplicaii care includ i analiza fluxului cu 13C este necesar folosirea modelelor

stoichiometrice atom-maped. Modelele cinetice includ i ecuaii de rat a reaciilor

metabolice, ori ecuaii simplificate ori ecuaii complexe. Ecuaii simplificate au rolul de a

prezenta reacii enzimatice cu parametri cunoscute limitate, fr complexitate. Ecuaii

complexe descriu comportamentul reaciei dependente de mecanismul enzimatic [11].

Figura 5: Modele metabolice folosite n ingineria metabolic [11]

3.6 Metoda OptStrain

Metoda OptStrain este o metod care se bazeaz pe informaii enzimatice. OptStrain este

capabil de modificarea cilor prin adiia sau eliminarea reaciilor ntr-o reea microbian

pentru producerea compusului biochimic dorit [16].

Procedura Optstrain are patru trepte, fiecare dintre ele rezolv o problem diferit [17]:

Treapta 1: Descrcarea i verificarea reaciilor, dintr-o baz de date

Modele cinetice: Modele stoichiometrice atom-maped:

Acid piruvic Acid oxaloacetic

1 1

2 2

3 3

Modele stoichiometrice:

X1: ATP+glucose=> G6P+ADP

X2: G6P=>F6P

X3: G6P+2NADP=>R5P+2NADPH+O2

X4: F6P+ATP=>2G3P+ADP

X5: 2R5P=>S7P+G3P

Modele Topologice:



16

Metoda are nevoie de un set de reacii enzimatice, care sunt descrcate de la una dintre baze

de date disponibile pe internet, de exemplu KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes). Baze de date open source au dezavantajul c nu toate informaiile ncrcate sunt

verificate, astfel credibilitatea lor trebuie s fie analizat. Analiza const din calcularea

atomilor la partea reactanilor, ct i la partea produilor. Reaciile care nu sunt echilibrate

sunt excluse din lista reaciilor [16].

Treapta 2: Estimarea randamentului maxim

Pasul al doilea const din determinarea randamentului maxim de formare a produsului de

interes, de la o gam de substraturi, fr restricii la numrul reaciilor i la originea reaciilor.

Randamentul maxim teoretic este estimat pentru o unitate de substraturi, prin maximizarea

sumei fluxurilor de reacie care produce minus fluxurile de reacie care consum metabolitul

de int, ponderat cu coeficieni stoichiometrici [16].

Treapta 3: Identificarea cilor cu cel mai puine reacii strine pentru organismul gazd

Pasul urmtor folosete randamentul maxim teoretic identificat pentru a determina numrul

minim de reacii non-native care trebuie s fie adugate la reeaua organismului de gazd.

Rezultatele pasului sunt variaiile cilor metabolice clasate n ordinea eficienei, dar innd

cont de numrul reaciilor non-native. n etapa aceasta sunt analizate diferite opiuni de

organisme gazde, organismul cu cel mai mic numr de reacii non-native va fi cel mai potrivit

[16].

Treapta 4: ncorporarea reaciilor non-native la modelul stoichiometric a organismului

gazd

Analiza continu cu extinderea reelei cilor metabolice la organism gazd, cu reacii non-

native. Numai adugarea genelor necesare n sistemul metabolic a organismului nu va rezulta

n producia produsului de interes, fiindc metabolismul organismelor este proiectat pentru

corespunderea presiunilor de selecie: organismul cu cel mai mare randament de reproducere

va supravieui. Genele inutile din punctul de vedere a producerii produsului de interes trebuie

s fie eliminate pentru rezolvarea problemei [16].



17

Scopul metodei OptStrain este asigurarea ideilor despre cum s reformm sistemul metabolic

a organismelor pentru producerea compusului chimic dorit. Metoda este util nu doar n cazul

moleculelor mici, dar i n cazul producerii moleculelor mari i compleci. Validitatea i

relevana rezultatelor primite este influenat de completitudinea i precizia bazei de date a

reaciilor i modelelor de metabolism, astfel acestea trebuie s fie verificate cu grij.

Metoda OptStrain a fost examinat pentru mai multe produse, de exemplu: 1,3-propandiol,

inozitol, piruvat, hidrogen i vanilin. Cel mai promitor dintre ele este molecula 1,3-

propandiol care e o molecul apropiat de 1,4-butandiol, produsul nostru de interes [16].

3.7 Analiza fluxurilor

Dup identificarea cilor, pasul urmtor este analiza ratelor de producere a cilor i modului

de control al acestora. Diferena dintre ingineria metabolic i biologia molecular este c

primul se ocup cu ci metabolice integrate n locul reaciilor individuale [10].

Metoda primar pentru analiza reelelor metabolice este analiza fluxurilor metabolice.

Analiza fluxurilor metabolice este o tehnic pentru examinarea ratelor de producie i de

consum a metaboliilor ntr-un sistem biologic. Prin folosirea modelelor metabolice

stoichiometrice i spectroscopiei de mas cu izotope 13C, putem descoperi informaii privind

reeaua reaciilor [18]. La analiza fluxurilor metabolice fluxurile sunt calculate prin folosirea

modelelor stoichiometrice pentru reacii intracelulare i echilibre de mas pentru calcularea

interaciunilor extracelulare. Rezultatul final al analizei este reea fluxurilor metabolice

mpreun cu estimarea ratelor de reacii steady-state (flux).

Analiza controlului metabolic este cadrul matematic pentru descrierea cilor, metaboliilor,

semnalizrii i reelelor genetice. Analiza controlul metabolic determin cum variabilii, de

exemplu fluxuri i concentraia metaboliilor depind de parametrii reelei. n original analiza

controlului metabolic a fost dezvoltat pentru descrierea controlului cilor metabolice, iar

ulterior a fost dezvoltat pentru descrierea reelelor de semnalizare i genetice.

Analiza echilibrului de flux este o metod matematic pentru simularea metabolismului la

scar genomic. n comparaie cu metode tradiionale de modelare analiza echilibrului de flux

necesit mai puine date pentru construirea modelului, i necesit o capacitate computaional

mai mic.



18

Aplicaiile analizei echilibrului de flux sunt urmtoare:

- Eliminarea reaciilor

Este o tehnic folosit frecvent pentru identificarea reaciilor critice pentru producerea

biomasei, deci pentru viabilitatea organismelor. Prin eliminarea reaciilor pe rnd i

msurarea fluxului prin fluxul biomasei, fiecare reacie poate fi clasificat ca reacie esenial

sau neglijabil.

- Eliminarea reaciilor n perechi

Eliminarea reaciilor n diferite perechi posibile este folosit cel mai mult de medicin pentru

identificarea medicamentelor cu mai multe inte. Metoda este folosit i n cuantificarea

interaciunilor ntre diferite ci.

- Eliminarea genelor

Genele sunt conectate la reaciile catalizate de enzime prin expresii Boolean cunoscute ca

expresii gene-protein-reacie corespunztor pentru fiecare reacie. Metoda este capabil de

evaluarea relaiilor logice ntre enzime, de exemplu relaia ntre dou gene este AND cnd

amndoi sunt necesare pentru expresia proteinei, iar relaie este OR cnd enzimele sunt

isoenzime. Astfel este posibil analiza eliminrii genelor singure sau multiple.

- Inhibarea reaciilor

Efectul inhibrii reaciilor, nu eliminarea total, poate fi simulat cu analiza echilibrului de

flux prin restricionarea fluxului prin reacie. Efectul inhibrii poate fi clasificat fiind mortal

sau fiabil.

- Optimizarea mediului de cretere a organismelor

Analiza echilibrului de flux este capabil pentru optimizarea mediului de cretere a

organismelor n privina supra-producerii compusului de interes sau n privina maximizrii

altor fluxuri.



19

Matematica n analiza echilibrului de flux

mpotriva metodelor tradiionale, analiza echilibrului de flux nu necesit folosirea ecuaiilor

difereniale ordinare, necesit foarte puine informaii referitor la parametri cinetici i

concentraia metaboliilor n sistem. Asta este obinut prin implicarea urmtoarelor

presupuneri: sistemul este steady-state i optimal. Steady-state nseamn c concentraiile

sunt constante i sistemul optimal nseamn c organismul a fost optimizat pentru inte

biologice, de exemplu creterea optim sau conservarea resurselor. Presupunerea steady-state

reduce sistemul la ecuaii lineare, care sunt rezolvate pentru identificarea distribuiei ntre

fluxuri care satisface condiiile steady-state i constrngerile stoichiometrice. Presupunerea

steady-state se bazeaz pe ecuaia urmtoare:

Dac sistemul este steady-state, acumularea este zero, astfel ecuaie devine:

Reelele metabolice aveau mai multe reacii dect metabolii, rezultnd un sistem de reacii

lineare sub-determinate, coninnd mai multe reacii dect variabile. Abordarea standard

pentru rezolvarea problemei este folosirea programrii lineare. Aceste probleme pot fi

exprimate n forma canonic:

Unde x este vectorul variabililor care trebuie s fie determinat, c i b sunt vectorii

coeficienilor cunoscute, A este matricele cunoscut a coeficienilor, i este transpunerea

matricei. Expresia care trebuie s fie maximizat sau minimalizat este numit funcia obiectiv,

( n cazul asta). Inegalitile sunt constrngeri la care funcia obiectivei trebuie

s fie optimizat.



20

Programarea linear necesit definirea funciei obiectiv, soluia optim este cea care

maximalizeaz sau minimalizeaz funcia obiectiv, dup caz. n cazul analizei echilibrului de

flux, funcia obiectiv pentru programare linear, n majoritatea cazurilor, este producia de

biomas. Producia biomasei este simulat printr-o reacie care reprezint suma reaciilor care

transform precursori de biomas n biomas.

Astfel forma canonic a analizei echilibrului de flux devine:

Unde v reprezint vectorul fluxurilor care trebuie s fie determinat, S este matricea

coeficienilor care sunt cunoscute. Inegalitile definesc

rata maxim a fluxurilor pentru fiecare reacie corespunznd coloanelor matricei S. Aceste

rate pot fi determinate experimental pentru a constrnge i a mbunti precizia de

preconizare a modelului.

Avantajul cel mai important a analizei echilibrului de flux este c nu necesit cunoaterea

concentraiilor de metabolii i cinetica enzimatic a reaciilor. Coeficienii stoichiometrici

sunt suficiente pentru maximizarea matematic a funciei obiectiv [18].

Construirea modelelor pentru analiza echilibrului de flux

Prile cel mai importante la construirea modelelor pentru analiza echilibrului de flux sunt:

- Crearea reelei complete a proceselor metabolice

- Adugarea constrngerilor n model

- Adugarea funciei obiectiv

Cerina principal a reelei este s fie complet, asta nseamn c o evaluare excesiv este

necesar. Pachetele de software pentru construirea modelelor sunt prezentate n capitolul

anterior.

Partea cheie la analiza echilibrului de flux este abilitatea de a aduga constrngeri la rata

fluxurilor de reacii, fornd acestea s rmn ntr-un interval predefinit, asta face modelul s



21

fie real. Sunt dou feluri de constrngeri: constrngeri la sfritul metabolismului, care

limiteaz absorbia i excreia nutrimentelor, i constrngeri interne pentru limitarea

fluxurilor ntre reacii.

Fiecare organism are un mediu de cretere la care absoarbe nutrieni i triete n condiii

bune. n general rata de absorbie este influenat de disponibilitatea nutrienilor, concentraia

lor. Dac rata de absorbie a nutrienilor este msurabil experimental, informaia asta poate

fi adugat ca constrngere n model, prin rate de flux la sfritul sau la nceputul modelului

metabolic. Asta asigur c nutrieni care nu sunt prezeni, sau nu sunt absorbite de organism,

s nu intre n metabolism, pentru ei, rata de flux este zero.

n principiu toate reaciile sunt reversibile, totui n practic reaciile se desfoar numai

ntr-o singur direcie. Asta poate fi datorit concentraiei mai mari a reactanilor n

comparaie cu concentraia produselor, dar de multe ori este datorit entalpiei libere mai mici

a produselor n comparaie cu reactanii, astfel direcia de nainte este mai favorabil [18].

Analiza echilibrului de flux folosete modele stoichiometrice la nivelul genelor. Recent o

mulime de astfel de modele au fost dezvoltate, de exemplu, pentru Escherichia coli. Modelul

acestuia include 2077 reacii, 1039 metabolii. Cu ajutorul modelului, prin folosirea analizei

echilibrului de flux, cercettorii au reuit de exemplu supra-producerea licopenului [10].

Modele similare au fost dezvoltate pentru Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis,

Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Arabidopsis thaliana, chiar i

pentru oameni [10].

3.8 Programul OptFlux

Programul OptFlux este o platform pentru ingineria metabolic pentru identificarea

reaciilor care trebuie s fie adugate n genomul microorganismelor, cum i pentru

identificarea reaciilor care trebuie s fie eliminate pentru producerea compusului de interes,

pstrnd viabilitatea organismului [19]. Programul este open-source, accesibil gratuit pentru

toi, ncorporeaz mai multe algoritme pentru optimizarea cilor metabolice.

Optimizarea cilor are limitaii cnd modelele metabolice sunt incomplete sau cnd compusul

de interes nu poate fi produs. n aceste cazuri trebuie s fie adugate la model reacii



22

adiionale, un plug-in separat a fost dezvoltat n aceast privin, care face posibil adugarea

reaciilor dintr-o baz de date extern [19].

Programul poate lucra cu formatul SBML (Systems Biology Markup Language), dar are i o

bibliotec online proprie cu modelele cilor metabolice care sunt verificate de echipa OptFlux

i pot fi de ncredere. OptFlux determin valorile fluxurilor de reacii care sunt incluse n

model, corespund condiiile mediului (fluxul substraturilor) i condiii genetice [20].

4 Metode i materiale

4.1 Ci pentru producerea de 2,3-butandiol

Dup vasta analiz a metodelor pentru preconizarea cilor metabolice ncercm s folosim n

practic programele menionate. Scopul este s avem o idee simpl despre producerea de 2,3-

-butandiol prin fermentare i s avem o idee despre folosirea programelor.

Platforma online FMM a gsit ase ci cu diferene foarte mici pentru producerea de 2,3-

butandiol din D-glucoz, fiecare cale avnd 9 trepte. Nu toate dintre enzimele identificate

sunt disponibile la un organism, astfel la organismul de gazd trebuie adugate genele

necesare. Calea identificat de platforma FMM atinge calea pentoz-fosfat, sinteza acidului

pantotenic i coenzimei A i metabolismul butanoate. Calea identificat este prezentat n

Figura 3.

Calea identificat de FMM este similar cu calea gsit la baze de date Metacyc, care este

prezentat n Figura 2 [21].



23

Figura 6: Calea gsit la date de baze Metacyc pentru producerea de 2,3-butandiol



24

Figura 7: Rezultatele primite la platforma online FMM [22]



25

Pasul urmtor ar fi implementarea cii prezentate n Figura 3, i simularea modelului, sau

identificarea unui organism la care se gsesc toate enzimele necesare procesului. Dup cum

se vede din Tabelul 2, nici una dintre organismele din natur nu conine toate enzimele

necesare procesului, cel mult ase din nou enzime se gsesc la organisme. Ca un pas urmtor

ar fi alegerea unuia dintre organismele din tabelul de mai jos, i completarea lui cu cile

necesare producerii de 2,3-butandiol.

Tabel 3: Speciile i enzimele din procesul determinat de FMM [22]

Numrul

enzimelor Enzime Specii

6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4 Agrobacterium tumefaciens str. C58

6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4 Sinorhizobium meliloti 1021

6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Pseudoalteromonas atlantica T6c

6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4 Sinorhizobium medicae WSM419

6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Serratia proteamaculans 568

6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Enterobacter sp. 638

Proiectul path2models este un mare ajutor, fiind o iniiativ pentru transformarea cilor

metabolice de la baza de date KEGG, n format SBML, iar sunt i transformate modele

metabolice complete al organismelor [23]. Obstacolul cel mai mare este standardizarea

insuficient a modelelor n formatul SBML, muli dintre ele nu pot fi folosite de programele

menionate n capitole anterioare. Chiar i dac modelele sunt cunoscute de programe, sunt

deschise parial, muli dintre valori nu sunt completate, cel mai frecvent lipsesc valorile

ratelor cinetice a reaciilor.

Astfel decizia a fost construirea numai a unei pri a modelului responsabil pentru producerea

de 2,3-butandiol, cu ajutorul programului Matlab Simbiology, folosind datele cinetice din

baza de date BRENDA. Conform literaturii, producerea industrial a 2,3-butandiolului se

face cu ajutorul organismului Enterobacter [24], ceea ce apare i n Tabelul 2. Astfel

organismul ales este Enterobacter sp. 638 unde se gsesc valorile cinetice. Valorile Km sunt

alese pentru varianta slbatic a enzimelor unde a fost disponibil.



26

Tabel 4: Valorile Km pentru enzimele necesare pentru producerea de butandiol conform FMM

Numele enzimelor Numr EC Valoarea Km

mM

Kcat

1/s

quinoprotein glucose dehydrogenase 1.1.5.2 0,95 3860

glucose dehydrogenase (acceptor) 1.1.99.10 2,5 ??

gluconolactonase 3.1.1.17 9,4 162

gluconate dehydratase 4.2.1.39 2 760

2-dehydro-3-deoxygluconokinase 2.7.1.45 1 11

2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase 4.1.2.14 1,9 0,0063

acetolactate synthase 2.2.1.6 4,8 40,3

acetolactate decarboxylase 4.1.1.5 ?? ??

(R,R)-butanediol dehydrogenase 1.1.1.4 3 ??

Regulile reaciilor au fost determinate conform cineticii enzimatice Michaelis Menten,

folosind valorile din Tabelul 3. Fiecare reacie a fost verificat pe rnd, toi dintre ele sunt

reacii reversibile, modelul elaborat ine cont i de coeficienii stoichiometrici.

Figura 8: Modelul la platforma Simbiology



27

Fluxurile reaciilor sunt prezentate pe Figura 4, este exact aceeai ca i n cazul Figurii 3,

adic urmrete rezultatele platformei FMM. Modelul nu ine cont de alte reacii care sunt

necesare pentru viabilitatea organismului, astfel exerciiul are numai un scop orientativ

asupra funcionrii programelor.

Am realizat o analiz de flux la programul Simbiology, rezultatele sunt prezentate n Figura

5.

Figura 9: Concentraiile metaboliilor

Cantitatea de glucoz este 5 mM la intrare, valoarea lui nu este constant, deci se consum la

reacie. Poate fi observat c concentraia de butandiol va ajunge numai la jumtatea

concentraiei originale a glucozei. Acest fapt este datorit reaciei de formare a 2-acetolactat

din piruvat, la care din dou piruvat se formeaz o 2-acetolactate, conform reaciilor

prezentate n continuare, reacia este reversibil.



28

D-Glucose + Quinone D-Glucono-1,5-lactone + Hydroquinone

D-Glucono-1,5-lactone + H2O D-Gluconic acid

D-Gluconic acid 2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate + H2O

ATP + 2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate ADP + 2-Dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-

gluconate



29

2-Dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconate D-Glyceraldehyde 3-phosphate + Pyruvate

2-Acetolactate + CO2 2 Pyruvate

(S)-2-Acetolactate (R)-Acetoin + CO2



30

(R,R)-Butane-2,3-diol + NAD+ (R)-Acetoin + NADH + H+

Dac ar fi vorb despre un sistem metabolic complet, care a fost dezvoltat cu reacii

necesare pentru producerea compusului chimic de interes, o analiz Optknock ar fi necesar

pentru identificarea reaciilor de eliminare, pstrnd viabilitatea organismului i maximiznd

rata de producere a compusului chimic de interes. Pentru analiza Optknock avem nevoie de

alte programe, de exemplu Optflux sau Cobra Toolbox.

5 Rezultate i discuii

Barierele cei mai mari al preconizrii cilor metabolice sunt:

- Standardizarea insuficient a formatului SBML

- Lipsa datelor cinetice

Pentru rezolvarea problemelor menionate, programele folosite la pasurile descrise la

Capitolul 3.2 trebuie s fie combinate cu grij, de exemplu: avem o ans mai mare de

compatibilitate ntre programe Cobra toolbox i Simbiology, fiindc amndou sunt operate

n cadrul programului Matlab. Modelul elaborat n Simbiology nu a fost recunoscut de

programul Optflux, n ciuda faptului c modelul a fost salvat n format SBML level 2 version,

cea ce este compatibil cu programul.

Colectarea datelor cinetice este una dintre cel mai grele sarcini la modelarea proceselor

biochimice. Sunt mai multe baze de date pe internet cu valori cinetice a enzimelor de

exemplu: Brenda. Problema este c valorile cinetice sunt specifice, sunt influenate de

organismul gazd, substrat, condiii de mediu: temperatura i pH. Metoda cea mai uoar este

identificarea organismului de gazd care conine cel mai muli dintre enzime necesare pentru

producerea compusului chimic de interes, dar n acelai timp este disponibil i modelul lui

complet i verificat n colecia modelelor SBML. Modelul asta apoi trebuie s fie completat

cu reacii non-native, care sunt inexistente n organismul gazd. Este recomandat

determinarea valorilor cinetice prin experimente n laborator, cnd acestea nu sunt

disponibile.



31

Exerciiul realizat n Capitolul 3.8 a avut inta de a identifica o cale pentru producerea de 2,3-

butandiol, cea ce exist ca un metabolit n organismele naturale, iar inta original este

identificarea cilor pentru producerea de 1,4-butandiol cea ce nu exist la nici una dintre

organismele naturale cunoscute n momentul de fa. La Capitolul 3.8 am optat la 2,3-

butandiol din motive simplificatoare. Modificarea, modelarea organismelor pentru

producerea de 1,4-butandiol este o sarcin mult mai mare. Cei din Genomatica au ales

Escherichia coli ca organism de gazd, din motive practice: este cel mai rspndit i cunoscut

organism folosit n industria biochimic. Modelul detaliat a lui este disponibil. Ei au folosit

o metod bazat pe operatori de reacii n schimb de metodologiile bazate pe reacii

enzimatice cunoscute, astfel au identificat i ci non-native, cea ce este esenial cnd este

vorba de un compus de interes care nu se gsete la nici una dintre organismele cunoscute

[1]. Metodologia folosit de ei este foarte similar cu metodologia descris la Capitolul 3.4.:

Figura 10: Metodologia folosit de Genomatica [1]

Planificarea operatorilor de reacii bazat pe reguli chimice i clase de enzime

Adugarea operatorilor de reacii la baze de date al programului SimPheny Biopathway Predictor

Definirea metabolitelor

Managementul operatorilor de

reacii

Selectarea compusului de int de la baze de date

Selectarea dimensiunii reelei

Selectarea limitei de mrime a moleculelor

Calcularea reelei: pentru fiecare nivel, operatori de reacii sunt aplicate

Calcularea reelelor

Adugarea metabolitelor secundari la reeaua reaciilor

Calcualrea speciilor dominante i ncrcate la pH neutru

Echilibrarea reaciilor

Calcularea proprietiilor termodinamice

Semnarea reaciilor i metaboliilor cunoscui

Integrarea automat cu

ajutorul SimPheny

Selectarea manual a metaboliilor de intrare de la reea calculat

Selectarea manual a lungimei maxim a cii

Urmrirea automat a cilor de la metabolii de intrare selectat

Calcularea automat a reaciilor i termodinamica cilor

Urmrirea cilor

Calcularea ratei maxime de producere teoretic n modelul metabolic

Selectarea i prioritizarea cilor conform criteriilor de selecie

Evaluarea manual a rezultatelor

Prioritizarea i evaluarea cilor



32

Folosind metoda prezentat n Figura 10, au obinut mai muli de 10000 de ci alctuite din 4

sau 6 trepte, de la metabolii obinuii cum sunt acetil-CoA, -ketoglutarate, succinil-CoA i

glutamat. Dup prioritizarea cilor innd cont de rata maxim teoretic, lungimea cii,

numrul treptelor non-native, numrul treptelor native i fezabilitatea termodinamic a

procesului au redus numrul cilor la 10 procente. Cile rmase au fost prioritizate folosind

alte criterii: numrul treptelor fr enzime caracterizate (bazat pe Kyoto Encyclopedia a

Genelor i baza de date intern), numrul treptelor non-native, numrul treptelor din

metabolismul central. Fiecare dintre procesele selectate au atins 4-hidroxibutirat [1]:

Figura 11: Calea metabolic adugat la E. Coli de Genomatica, Enzimele numerotate sunt: 1. 2-oxoglutarate decarboxylase, 2. Succinil-CoA synthetase, 3. Succinate semialdehyde dehydrogenase dependent de CoA, 4. 4-

hydrixybutirat dehidrogenase, 5. 4-hydroxybutyryl-CoA transferase, 6. 4-hydroxybutyryl-CoA reductase, 7. Alcohol

dehydrogenase [1].

Treptele 2 i 7 exist n natur n sistemul metabolic al Escherichia Coli, celelalte trepte au

fost introdui artificial. Din motive de validare au ales mprirea procesului la dou pri:

partea pentru producerea de 4-hidroxibutirat i partea pentru producerea de 1,4-butandiol.

Partea pentru producerea de 4-hidroxybutirat are dou opiuni, amndou ncep cu compuse

din ciclul acidului citric, una de la succinat, alta de la -cetoglutarate. Versiunea cu -

cetoglutarate este mai fezabil din punct de vedere termodinamic, conine mai puine trepte,

fr reacii reversibile.

Partea pentru producerea de 1,4-butandiol necesit dou trepte de reducie, catalizate de

dehidrogenaze. Enzimele necesare procesului nu au fost identificate, astfel o list de enzime

candidate au fost identificate pe baza activitii lor cu 4-hidroxibutirat sau cu molecule



33

similare. Dup un numr de experimente, enzimele alese au fost 4-hydroxybutyril-CoA-

reductaz i 4-hydroxybutyril-CoA-reductaz. Astfel sa produs o cantitate de 138 M 1,4-

butandiol.

Obiectivul propus esteproducerea de 1,4-butandiol ntr-un singur pas, , folosind acelai

organism. Cercettorii la Genomatica au combinat plasmidele necesare proceselor discutate

mai sus, la prima parte au insertat genele necesare pentru producerea de 4-hidroxybutirat, din

ambele substraturi: succinat i -cetoglutarate. Astfel au reuit s produc 1,3 mM de 1,4-

butandiol n 40 de ore.

Dup producerea de 1,4-butandiol, dovedind c procesul este viabil, s-a urmrit optimizarea

procesului prin eliminarea genelor pentru a pstra metabolismul pe calea bine definit. Dup

o analiz OptKnock s-au identificat enzimele care trebuie s fie eliminate pentru obinerea

ratei maxime. Producerea de etanol, metanoate, lactat i succinat au fost blocate, astfel

fornd organismul pentru producerea de 1,4-butandiol pentru balansarea potenialului redox.

95% a carbonului a fost transferat spre calea pentru producerea de 1,4-butandiol dup

optimizare. Enzimele la sfritul cii au fost reconsiderate, au fost alese acelai enzime, dar

de la diferite organisme, tot rezultnd n creterea ratei de producere de 1,4-butandiol.

Substratul preferat a fost zaharoza, fiind mai ieftin i rspndit dect glucoza, iar au i

ncercat mai multe feluri de carbohidrai, iar la nici una dintre ele nu s-au obinut o producie

mai mare dect n cazul glucozei.

n final cercettorii la Genomatica au obinut o producie de 1,4-butandiol la o concentraie

de 20 g/L, cea ce momentan nu este economic, o concentraie n jur de 100 g/L este necesar

pentru ca procesul s fie fezabil [1].

Cercetrile n continuarea au rolul de a proiecta un proces ct mai economic, nu doar prin

optimizarea procesului de fermentare, dar ct i prin identificarea noilor ci.

Identificarea noilor ci pentru producerea de 1,4-butandiol este un proces foarte complicat, i

necesit o expertiz de nivel nalt. Astfel am decis evaluarea i evidenierea unor dintre cele

cinci ci identificate de Genomatica (Figura 12). Evaluarea const din urmtoarele:

- Identificarea enzimelor care particip la proces



34

- Construirea modelului n format SBML

- Analiza echilibrului de flux a modelului

- Identificarea genelor care trebuie s fie eliminate

- Construirea plasmidelor i efectuarea experimentelor n laborator

- dezvoltarea modelului, folosind rezultatele experimentelor

Procesul ncepe cu alfa-ketoglutarate, metabolit de la ciclul acidului citric. Enzimele

prezentate n Figura de mai sus sunt numai propuneri, sunt enzime ale cror funcii cunoscute

sunt similare cu funcia care trebuie s fie ndeplinit n calea metabolic pentru producerea

de 1,4-butandiol. Un set de enzime au fost identificate, ele sunt prezentate n Tabelul 5:

Alpha - ketoglutarate

5 hydroxy 2

oxopentanoic acid

4 - hidroxybutanal

1,4 - butanediol

Alfa ketoglutaryl -

CoA

2.8.3 6.2.1

1.1.1

4.1.1

1.1.1

Figura 12: drumul metabolic ales dintre cei 5 ci identificate

de Genomatica



35

Tabel 5: Enzimele identificate pentru procesul prezentat n Figura 12

Numr

EC

Numele

genului

ID de gene

bank Numele enzimei

Substratul

cunoscut

Numrul

acidelor

amino

KM

mM Organism

2.8.3.18 cat1

succinyl-

CoA:acetate CoA-

transferase succinate 505 0.9 Acetobacter aceti

2.8.3.18 cat1 P38946.1

Succinyl-

CoA:coenzyme A

transferase succinate 538 n/a

Clostridium

kluyveri

2.8.3.8 cat2

acetate CoA-

transferase Acetate 216 110 Acetobacter aceti

2.8.3.- cat2 P38942.2

4-hydroxybutyrate

coenzyme A

transferase

4-hydroxi

Butyrate 429 n/a

Clostridium

kluyveri

2.8.3.12 gctA CAA57199.1

glutaconate CoA-

transferase glutarate 320 0.7

Acidaminococcus

fermentans

2.8.3.8 atoA P76459.1

acetate CoA-

transferase butanoate 216 n/a Escherichia coli

2.8.3.8 atoD P76458.1

acetate CoA-

transferase butanoate 220 n/a Escherichia coli

3.1.2.18 tesB NP_414986

acyl-CoA

thioesterase 2 adipyl-CoA 286 n/a Escherichia coli

6.2.1.5 sucCD NP_415256.1

Succinate-CoA

ligase succinate 388 0.25 Escherichia coli

6.2.1.5 sucCD AAC73823.1

Succinate-CoA

ligase succinate 289 0.25 Escherichia coli

6.2.1.14 bioW NP_390902.2

6-

Carboxyhexanoate-

CoA ligase

6-carboxy

hexanoate 258 n/a Bacillus subtilis

1.1.1.c adhE2 AAK09379.1

alpha-ketoglutaryl

CoA reductase

butanoyl-

CoA 858 -

Clostridium

acetobutylicum

1.1.1.c mcr AAS20429.1

alpha-ketoglutaryl

CoA reductase malonyl-CoA 1220 30

Chloroflexus

aurantiacus



36

4.1.1.a pdc P06672.1

5-hydroxy-2-

oxopentanoic acid

decarboxylase

2-

oxopentanoic

acid 568 4.7

Zymomonas

mobilus

4.1.1.a mdlC P20906.2

5-hydroxy-2-

oxopentanoic acid

decarboxylase

2-

oxopentanoic

acid 528 0.056

Pseudomonas

putida

1.1.1.a yqhD NP_417484.1

1,4-butanediol

dehydrogenase >C3 387 0.67 Escherichia coli

1.1.1.a 4hbd L21902.1

1,4-butanediol

dehydrogenase

Succinate

semialdehyde 371 0.055

Clostridium

kluyveri

La identificarea enzimelor am folositbaza de date NCBI (National Center of Biotechnological

Information), pentru identificarea informaiilor cinetice sursa a fost baza de date BRENDA.

Dup cum se vede i n Tabelul 5, enzimele sunt specifice, activitatea lor depinde de substrat,

de organism n care sunt prezente, i de condiii de mediu (pH i temperatura). Valorile

prezentate n tabel sunt numai orientative, un set de experimente trebuie s fie efectuate

pentru a determina activitatea specific a enzimelor n calea pentru producerea de 1,4-

butandiol.

Enzimele identificate i substraturile sunt examinate, dac sunt capabile pentru formarea

complexului enzim-substrat, prin metoda andocare molecular. Metoda andocare molecular

este o metod care precizeaz orientarea preferat de o molecul ctre alta cnd se leag s

formeze un complex stabil. Cunoaterea asocierilor preferate poate fi folosit pentru a prezice

puterea de asociere ntre dou molecule, folosind funciile scoring. Majoritatea funciilor

scoring se bazeaz pe cmpul forelor de mecanic molecular. O energie negativ sczut

indic stabilitatea sistemului. De asemenea, andocarea (docking) este o unealt esenial

pentru procedeele de screening virtual, n cadrul crora o categorie de compui sunt andocai

ntr-o int i sunt calculate cele mai bune interaciuni. Din acest motiv, andocarea este

utilizat frecvent i n prezicerea afinitii de legare a unor molecule mici (medicamente) de

proteine int sau a activitilor biologice ale acestor molecule (medicamente) [25].

Noi am folosit programul AutoDock Vina pentru andocarea substraturilor i enzimelor.

AutoDock este unul dintre cel mai citate softwareruri in literatur de specialitate, programul



37

este open-source, este disponibil gratuit pentru toi. Rezultatele andocrii sunt prezentate n

tabelul urmtor:

Tabel 6: Afinitate de legare a substraturilor cu enzimele [26]

Substraturi Substraturi cunoscute

Numele enzimelor

Organisme gazde

Afinitatea de legare

sb1 kcal/mol

Afinitatea de legare

sb test kcal/mol

Alfaketoglutarate Succinate

Succinyl-CoA:coenzyme A transferase

Clostridium kluyveri(pighearth)

-4.7 -4.6

Alfaketoglutarate Succinate

succinyl-CoA:acetate CoA-transferase Acetobacter aceti

-5 -4.7

Alfaketoglutarate Butanoate acetate CoA-transferase Escherichia coli

-5 -3.7

Alfaketoglutarate adipyl CoA acyl-CoA thioesterase 2 Escherichia coli

-5.6 -7.7

Alfaketoglutarate Succinate Succinate-CoA ligase Escherichia coli

-5.2 -5.1

Alfaketoglutarate Succinate Succinate-CoA ligase

Escherichia coli (AAC738231)

n/a n/a

AlfaketoglutarylCoA n/a

3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Escherichia coli

-8.1 n/a

AlfaketoglutarylCoA Butanoyl CoA

alcohol dehydrogenase (NADP+)

Clostridium acetobutylicum

-6.3 -6

AlfaketoglutarylCoA Malonyl CoA alpha-ketoglutaryl CoA reductase

Chloroflexus aurantiacus

-7.8 -8.2

5 hydroxy 2 oxopentanoicacid

2 oxopentanoic acid

pyruvate decarboxylase Zymomonas mobilus

-5.3 -5

4 hydroxybutanal >C3 (9) 1,4-butanediol dehydrogenase Escherichia coli

-3.9 n/a

Afinitatea de legare este capabilitatea de asociere a ligandelor cu un receptor. Afinitatea de

legare depinde de forele de atragere ntre liganzi i receptoare. Valorile de afinitate de legare

mai mici nseamn o legtur ntre receptor i ligand mai mare.

n tabelul de mai sus (Tabel 6) sunt prezentate afinitile de legare ntre enzimele care

particip la calea pentru producerea de 1,4-butandiol propus de genomatica (Figura 12) i



38

substraturile intermediare. Lng asta am fcut i simulri pentru identificarea afinitilor de

legare ntre enzimele menionate i substraturile lor cunoscute, n cazul crora tim c

complexul enzim-substrat se formeaz. Dup cum se vede nu sunt diferene semnificative

ntre valorile cu substraturi cunoscute i cu substraturi din calea identificat de Genomatica.

Putem trage concluzia c teoretic reacia ntre substraturile i enzimele propuse este posibil.

n continuare sunt prezentate rezultatele detaliate al andocrii. Imaginile de 2D prezint

structurile moleculare a liganzilor i modul de legare a lor cu receptoare. n tabelul urmtor

sunt definite simbolurile folosite la prezentarea detaliat al andocrii:

Simbol Descriere

Reziduuri implicate n legturi de hidrogen

Reziduuri implicate n legturi Van der Waals.

Molecule de ap

Atomi de metal

Reziduuri implicate n legtur covalent

Suprafaa accesibil de solveni a reziduului

Suprafaa accesibil de solveni a atomului

Interaciuni de legtur de hidrogen cu reziduuri care nu sunt aminoacizi

Interaciuni de legtur hidrogen cu aminoacizi din lanul primar

Interaciuni de legtur hidrogen cu aminoacizi din lanul secundar

Interaciuni electromagnetice

Interaciuni Pi



39

Numele enzimei: Succinyl-CoA:coenzyme A transferase

Organism gazd: Clostridium kluyveri(pighearth)

Numele substratului: Alfaketoglutarate. -4.7 kcal/mol

Numele substratului: Succinate. -4.6 kcal/mol



40

Numele enzimei: succinyl-CoA:acetate CoA-transferase

Organism gazd: Acetobacter aceti

Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5 kcal/mol

Numele substratului: Succinate. -4.7 kcal/mol



41

Numele enzimei: acetate CoA-transferase

Organism gazd: Escherichia coli

Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5 kcal/mol

Numele substratului: Butanoate. -3.7 kcal/mol



42

Numele enzimei: acyl-CoA thioesterase 2


Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5.6kcal/mol

Numele substratului: adipyl CoA. -7.7kcal/mol



43

Numele enzimei: Succinate-CoA ligase


Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5.2kcal/mol

Numele substratului: Succinate. -5.1kcal/mol



44

Numele enzimei: 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase


Numele substratului: AlfaketoglutarylCoA. -8.1kcal/mol

Numele enzimei: 1,4-butanediol dehydrogenase


Numele substratului: 4 hydroxybutanal. -3.9kcal/mol



45

Numele enzimei: alcohol dehydrogenase (NADP+)

Organism gazd: Clostridium acetobutylicum


Numele substratului: Butanoyl CoA. -6kcal/mol



46

Numele enzimei: alpha-ketoglutaryl CoA reductase

Organism gazd: Chloroflexus aurantiacus


Numele substratului: Malonyl CoA. -8.2kcal/mol



47

Numele enzimei: pyruvate decarboxylase

Organism gazd: Zymomonas mobilus

Numele substratului: 5 hydroxy 2 oxopentanoicacid. -5.3kcal/mol

Numele substratului: 2 oxopentanoic acid. -5kcal/mol

n imaginile de mai sus sunt prezentate interaciunile ntre atomii liganzilor i aminoacizi a

receptoarelor. Liganzii sunt prezentate la nivel atomic, receptoarele sunt prezentate la nivel



48

molecular. Pentru o analiz mai detaliat, identificarea interaciunilor la nivel atomic la

ambele pri ar fi necesar. Majoritatea interaciunilor sunt legturi intermoleculare de

hidrogen, iar sunt i exemple de interaciuni pi i de interaciune electrostatice.

n continuare vom analiza interaciunile ligand-receptor la nivel atomic.



49

6 Bibliografie

[1] Harry Yim, Robert Haselbeck, Wei Niu, Catherine Pujol-Baxley, Anthony Burgard, Jeff

Boldt,Julia Khandurina, John D Trawick, Robin E Osterhout, Rosary Stephen, Jazell

Estadilla, Sy Teisan, H Brett Schreyer, Stefan Andrae, Tae Hoon Yang, Sang Yup Lee,

Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1,4 - butanediol,

Nature Chemical Biology, vol. 7, 2011.

[2] Prospectus, Is Bio-Butandiol here to stay?, Chemsystems Online, New York, 2012.

[3] Genomatica, Inc., Genomatica Sustainable Chemicals, [Interactiv]. Available:

http://www.genomatica.com/products/genobdoprocess/. [Accesat 01 06 2014].

[4] B. C. Stockton, D. J. Mitchell, K. Grohmann, M. E. Himmel, Optimum-D-glucosidase

supplementation of cellulase for efficient conversion of cellulose to glucose,

Biotechnology Letters, vol. 1, pp. 57-62, 1991.

[5] Wikipedia contributors, Biodiesel production, Wikipedia, The Free Encyclopedia., 10

07 2014. [Interactiv]. Available:

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Biodiesel_production&oldid=616326940.

[Accesat 14 07 2014].

[6] S. S. Yazdani i R. Gonzalez, Engineering Escherichiacoli for the efficient conversion

of glycerol to ethanol and co-products, Metabolic Engineering, vol. 10, p. 340351,

2008.

[7] Wikipedia contributors, 1,4-Butanediol, Wikipedia, The Free Encyclopedia., 08 07

2014. [Interactiv]. Available: http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=1,4-

Butanediol&oldid=616101300. [Accesat 14 07 2014].

[8] R. E. Bibolet, G. E. Fernando i S. M. Shah, Renewable 1,4-Butanediol, Pennsylvania:

Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Pennsylvania,

2011.



50

[9] Han-Yu Chuang, Matan Hofree, Trey Ideker, A Decade of Systems Biology, Annual

Review of Cell and Developmental Biology, vol. 26, pp. 721-744, 2010.

[10] B. M. Woolston, S. Edgar i G. Stephanopoulos, Metabolic Engineering: Past and

Future, Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, vol. 4, p. 25988,

2013.

[11] P. Jouhten, Metabolic modelling in the development of cell factories by synthetic

biology, Computational and Structural Biotechnology Journal, vol. 3, 2012.

[12] Ayoun Cho, Hongseok Yun, Jin Hwan Park, Sang Yup Lee, Sunwon Park, Prediction

of novel synthetic pathways for the production of desired chemicals, BMC Systems

Biology, 2010.

[13] Vassily Hatzimanikatis, Chunhui Li, Justin A. Ionita, Christopher S. Henry, Matthew D.

Jankowski and Linda J. Broadbelt, Exploring the diversity of complex metabolic

networks, Bioinformatics, vol. 21, pp. 1603-1609, 2005.

[14] J. Nielsen, Applied Microbiology and Biotechnology, Metabolic Engineering, vol. 55,

pp. 263-283, 2001.

[15] Marnix H. Medema, Renske van Raaphorst, Eriko Takano and Rainer Breitling,

Computational tools for the synthetic design of biochemical pathways, Glasgow, 2012.

[16] Priti Pharkya, Anthony P. Burgard, Costas D. Maranas, OptStrain: A computational

framework for redesign of microbial production systems, Genome Research, vol. 14,

pp. 2367-2376, 2004.

[17] Priti Pharkya, Costas D. Maranas, OptStrain: A hierarchical metabolic pathway

discovery and design framework for microbial production systems.

[18] Edwards, J., Ibarra, R. & Palsson, B, In silico predictions of Escherichia coli metabolic

capabilities are consistent with experimental data, Nature Biotechnology, vol. 19, p.

125130, 2001.



51

[19] Sara Correia, Miguel Rocha, Computational tools for strain optimization by adding

reactions.

[20] Bioinformatics and Systems Biology Interdisciplinary Interactive, OptFlux 3 Beginner'

tutorial, 2012.

[21] Superpathway of (R,R)-butanediol biosynthesis, MetaCyc , [Interactiv]. Available:

http://biocyc.org/META/new-image?type=PATHWAY&object=P125-PWY&detail-

level=2&ENZORG=TAX-1718#. [Accesat 09 06 2014].

[22] From Metabolite to Metabolite, Department of Biological Science and Technology,

Institute of Bioinformatics National Chiao Tung University, Hsinchu, Taiwan,

[Interactiv]. Available: http://fmm.mbc.nctu.edu.tw/index.php. [Accesat 09 06 2014].

[23] Finja Bchel, Nicolas Rodriguez, Neil Swainston, Clemens Wrzodek, Tobias Czauderna,

Roland Keller, Florian Mittag, Michael Schubert, Mihai Glont, Martin Golebiewski,

Martijn van Iersel, Sarah Keating, Matthias Rall, Michael Wybrow, Henning

Hermjakob, etc., Path2Models: large-scale generation of computational models from

biochemical pathway maps, BMC System Biology, 2013.

[24] W. contributors, Butanediol fermentation, Wikipedia, The Free Encyclopedia., 29 10

2013. [Interactiv]. Available:

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Butanediol_fermentation&oldid=579296550.

[Accesat 12 06 2014].

[25] Denisa-Constantina Amzoiu, Prof. univ. dr. Florica Popescu, Cercetri farmacologice i

modele virtuale predictive asupra implicrii unor derivai din clasa oxicamilor n tresul

oxidativ la pacieni cu boal artrozic, Universitatea de Medicin i de Farmacie din

Craiova , 2011.

[26] O. Trott, A. J. Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking

with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of

Computational Chemistry, vol. 31, pp. 455-461, 2010.



52

referat de doctorat - producerea de 1.4-butandiol prin fermentare

Documents