1

Raport stiintific

privind implementarea proiectului pe perioada iulie 2012-decembrie 2015

Proiectului de cercetare PN-II-ID-PCCE-2011-2-0024, a inceput la data 1/07/2012 cu titlul “Suprarasucirea ADN-ului indusa transcriptional orienteaza selectiv in cis recombinarea V(D)J”avandu-l Director de Proiect pe Dr.Ciubotaru Mihai. Prezentul raport stiintific sintetic intermediar descrie evolutia proiectului pe toata perioada desfasurarii sale iulie2012-decembrie 2015.

Rezumatul proiectului

Recombinarea somatica asambleaza si diversifica genele receptorilor antigenici, ai limfocitelor B si T(1). Pentru initierea recombinarii recombinaza RAG(Recombination Activating Gene proteins 1 &2 ) se leaga de 2 situs-uri complementare de ADN (12 cu 23-RSSs Recombination Signal Sequence), printr-un proces de formare a complexului imperecheat (PC) sau sinapsa. Sinapsa este urmata de clivaj si apoi de repararea fragmentelor dublu catenare, proces care fiziologic se produce numai intre segmente genice localizate intracromozomial. Sinapsa mentine integritatea genomului, prevenind jonctiunile intercromozomiale implicate in fiziopatologia limfoamelor B sau T la copii. Acest proiect are drept scop studierea mecanismelor biochimice si a factorilor ce regleaza sinapsa, contribuind astfel la intelegerea modului in care sinapsarea defectuoasa duce la translocatii. Aproape 50% din cancerele la copii apar in celule limfoide si aproximativ 40% din aceste boli maligne se datoreaza translocatiilor aparute in urma recombinarii defectuoase. Ne propunem sa testam modul in care suprarasucirea ADN-ului stimuleaza formarea PC-ului si vom identifica conformatia topologica optima a RSS-urilor in sinapsa. Vom determina cum transcrierea ce afecteaza local suprarasucirea ADN-ului, directioneaza recombinarea in cis. Folosind ADN circular cu topologie cunoscuta vom studia mecanismul prin care RAG discerne intre situs-uri de ADN distinct suprarasucite. Rezultatele acestor studii isi gasesc aplicabilitatea in design-ul si folosirea compusilor metaloelicoidali in profilaxia bolilor mentionate.

OBJECTIVUL D2A (identificat in propunerea de proiect la pg. 25 cu subobiectivele D3A1 si D3A2 )

D3A.Identificarea mecanismului prin care suprarasucirea ADN-ului activeaza cataliza recombinazei

RAG

D3A Purificarea proteineinelor RAG1, RAG2 si HMGB1.

Majoritatea studiilor in vitro au folosit domeniile esentiale "core" ale RAG1 (secventa de aminoacizi 384-1008 din totalul de 1040aa)(2) si RAG2 murin (regiunea 1-383 din 527aa), (3) care sunt mult mai solubile decat proteinele intregi si mai lesne de purificat. RAG1 core interactioneaza direct cu elementele nonamer, si heptamer ale RSSs si joaca un rol central in legarea ADN-ului (4). Deasemenea, RAG1 interactioneaza cu RAG2 si cu el insusi dimerizand si toate resturile aminoacidice cu rol catalitic cunoscute pana in prezent sunt localizate in structura sa (D600, D708, E962). Mult mai putin se stie despre proteina RAG2 core. Desi este esentiala pentru sinapsa si cataliza, studiile de mutageneza intreprinse pana in prezent nu au identificat inca pozitii critice de aminoacizi pentru nici una din aceste functii (4,5). RAG mediaza formarea complexului sinaptic, astfel controland atat selectivitatea (segmentele genice alese pentru recombinare), cit si cea mai mare parte a diversitatii raspunsului imun dobandit (conferita de continutul segmentelor genice unite). Desi RAG leaga eficient RSS-uri in mod individual formand complexul unic (single complexes (SC)), pentru sinapsa are nevoie aditional de prezenta proteinelor HMGB1 sau 2 (high mobility group proteins)(5). Acestea sunt proteine ce indoaie nespecific ADN-ul avand un rol arhitectural in modelarea

2

configuratiei proprii ADN-ului in sinapsa. Pentru testarea mecanismului de activare al recombinazei RAG in vitro am purificat din diferite surse urmatoarele proteine:

a) MBP-cRAG1(384-1008)H6 domeniul catalitic RAG1 exprimat in E. coli fuzionat la capatul N terminal cu Maltose Binding Protein (MBP) si poli 6xHis la capatul C terminal. Purificarea s-a facut in 2 trepte prin cromatografie de afinitate pe o coloana de amiloza(eluare cu maltoza) si ulterior pe una de Nichel(eluare cu Imidazol).( Fig1 godeurile 3 si 4, 102kDa)

b) HMGB1 exprimat in E. coli fuzionat la capatul C terminal cu o terminatie poli 6xHis, purificat prin coloana de afinitate pe Nichel ( Fig1 godeurile 1 si 2, 29KDa).

c) GST-RAG2 (1-387), domeniul catalitic al RAG2 fuzionat N terminal cu Glutation-S-transferază (GST) a fost exprimat in fibroblaste umane HEK 293T in urma transfectiei cu un vector purtator al unui promotor pEBV (Epstein Barr Virus). Purificarea s-a facut pe o coloana de afinitate cu GST-Sepharoza, prin elutie cu Glutation (Fig. 2 godeul 3, 62kDa). Proteinele exprimate si purificate la punctele a), b) si c) servesc scopului identificarii rolului individual jucat de fiecare din aceste componente in procesul de asamblare a sinapsei. Cu toate acestea activitatea catalitica a complexului reconstituit MBP-RAG1 (384-1080) &GST-RAG2(1-387) este mai redusa decat cel al complexului de proteine coexprimate(vezi d).

d) MBP-RAG1(384-1040) si MBP-RAG2 (1-387) coexprimate in fibroblaste umane HEK 293T in urma cotransfectiei cu vectori de tip pcDNA(Fig. 3.RAG1 120kDa si RAG2 87kDa). Acest amestec de RAG1 si RAG2 este optim pentru testarea catalitica a recombinazei RAG(5).

D3A1a Sinapsa RAG In cis

evidentiata cinetic prin reactii

de ligare facilitata cu substrat

IS264.

3

In proiectul propus prezentam date preliminare demonstrand printr-un assay de ligare facilitata cum

RAG crestea eficienta circularizarii unui ADN liniar de 431bp IS264(din constructul pJH290)ce contine o

pereche 12/23-RSSuri(Fig. 4A pg24). Prin ligare in prezenta HMGB2 acest ADN liniar de 431bp genera 3

specii circulare topoizomerice:a)cerc relaxat RlxC1, b)cerc usor dezrasucit UnwC2 si c) cerc dezrasucit

UnwC3. Prezenta D708ARAG1 a RAG2 si a HMGB2 in amestecul de ligare(ligare facilitata cu amestec

RAG complet) duce la o crestere de aproape 5 ori a generarii de cercuri suprarasucite negativ in special a

topoizomerului UnwC3. Pentru caracterizarea acestor topoizomeri cercurile de ADN au fost purificate din

gel dupa izolare si apoi supuse vizualizarii prin microscopie cu fascicol de electroni (EM), in colaborare cu

grupul condus de Dr. Jack Griffith's de la University of North Carolina at Chapel Hill. Fig. 4 arata chiar

aceste imagini de EM. Speciile RlxC1 si UnwC2 (Fig. 4A si B) ilustreaza ADN-uri al caror contur continuu

circular este continut intr-un singur plan fara a se intretaia cu parti adiacente. Pe baza acestor imagini

precum si folosind tratamentul diferential cu topoizomeraze am concluzionat RlxC1 si UnwC2 sunt

topoizomeri circulari, unul cercul relaxat de Lk = 41(Lk=linking number) si celalalt cercul dezrasucit cu o

tura elicoidala completa caracterizat prin Lk = 40 (in absenta writhe, Lk =Tw (twist number) = N/10.5 cele

doua numere coincid cu raportul dintre numarul total de baze N (431bp) divizat la Nr corespunzand

perioadei ADN-ului B nativ de 10.5bp/tura). Spre deosebire de acestea specia UnwC3 din Fig. 4C are multe

incolaciri cu intretaieri (acestea duc la Writhe-

pentru o ilustrare optima le-am inclus in contur

oval in Fig.4C) cu cele mai multe imagini descrise

ca ’tigaie cu maner’ diagramatic reprezentate in

Fig4C ca un cerc’tigaia’ cu un maner impletit

plectonemic (writhe). Fiindca RAG cliveaza

catalitic considerabil mai bine UnwC3 decat

speciile liniare sau ceilalti doi topoizomeri (Fig4B

pg 25 a proiectului propus-date preliminarii) acum

atribuim acest efect naturii sale plectonemice. Am

investigat apoi cinetica prin RAG a facilitarii

reactiilor de ligare a substratului IS264 subliniind

in special initierea producerii si a acumularii

produsului UnwC3. Reactii de ligare urmarite in

timp cu ADN liniar IS264 au fost executate in

4

paralel folosind fie un amestec RAG complet (HMGB2∆C, MBPcR1D708A si GST-RAG2), fie cu

amestecuri control executate in conditii similare dar in absenta GST-RAG2(no RAG2 control). Amestecurile

de reactie au fost separate prin migrare pe geluri native PAGE (similar cu reactiile descrise in Fig. 4A pg 24

a propunerii de proiect) si speciile produsi de reactie marcate radioactiv cuantificate prin PhosphorImager.

Fig. 5A ilustreaza Eficienta Ligarii (Lig. Eff. = Lig. Product/Total linear DNA substrate) in timp cumulativa

a tuturor cercurilor formate in 60 mins., in timp ce Fig. 5B, ilustreaza eficienta de producere prin ligare a

UnwC3. Curbele cu patrate negre desemneaza reactiile cu amestec RAG total iar cele ale reactiilor control

sunt ilustrate cu romburi deschise (no

RAG2). RAG creste considerabil rata si

eficienta de generare a cercurilor in primele 5

minute ale reactiei si efectul satureaza in

platou in urmatoarele 20 minute. Efectele

descrise capata aspectul cel mai dramatic

pentru UnwC3 a carei generare depinde de

prezenta RAG complet chiar si dupa 60 min.

de ligare. Aceste rezultate sugereaza fara

echivoc ca RAG nu se leaga in mod pasiv de

ADN-ul suprarasucit cu writhe numai

stabilizand formarea acestor specii in cursul ligarii (caz in care UnwC3 ar fi trebuit sa fie in mod similar

generat in reactiile cu amestec RAG complet precum si-n cele de control macar la inceputul reactiei),ci

dimpotriva arata ca RAG induce activ writhe. Pe langa efectul de imperechere a secventelor consens 12/23-

RSSs, sinapsa prin RAG induce impletirea ADN-ului ce flancheaza RSS-urile. Acest rezultat a fost

neasteptat pentru noi. In concluzie impletirea negativa a ADN-ului este facilitata prin sinapsa RAG in cazul

substratului cu orientare deletionala iar acest tip de substrat cu suprarasucire negativa plectonemica este

folosit catalitic preferential de RAG. Asa cum aratam in Fig. 4A a propunerii noastre de proiect (pg. 24),

ligarea constructului IS264 genereaza pe langa produsii monomerici circulari dimeri si trimeri liniari produsi

care presupun sinapsa in trans prin RAG. In experimentul de cinetica pe constructul IS264 am cuantificat si

cantitatile infime de multimeri geerate prin sinapsa in trans de RAG rezultatele fiind prezentate in Fig. 6. In

primul rand notam eficientele reduse de ligare ilustrate pentru acesti produsi (nivelele de ligare in reactiile

cu amestec RAG sunt de aproape douazeci de ori mai reduse la saturatie decat cele de formare de cercuri

monomerice si de cinci ori mai reduse decat cele de formare a topoizomerului UnwC3). Totusi, foarte

timpuriu ligarea este facilitata prin sinapsa RAG in trans dar in mod remarcabil dupa 13 minute prezenta in

amestecul de ligare a RAG-HMGB are un efect inhibitor, foarte probabil datorat folosirii substratului indus

suprarasucit prevalent in reactiile de ciclizare monomerice.

5

D3A1b, D3A2. Testarea efectului suprarasucirii ADN-ului asupra catalizei RAG;evidentierea unei configuratii preferentiale.

Strategia propusa in proiectul nostru la punctul D3A2 de a studia configuratia modului de indoire al RSS-

urilor in complexul unic si-n cel sinaptic prin ligare in prezenta de IHF(integration host factor protein) s-a

dovedit a fi defectuoasa. Spre

deosebire de prezenta RAG si

HMGB1 , prezenta IHF la

circularizare reducea dramatic

eficienta ligarii, facand detectia

produsului de reactie greu

decelabila. Din acest motiv a

trebuit sa abordam o strategie

noua.

Cinetica circularizarii

IS264 arata ca formarea timpurie

a complexului sinaptic precede

aparitia topoizomerilor circulari

suprarasuciti cu writhe ceea ce

sugereaza ca RAG impreuna cu

HMGB induc in PC o

configuratie topologica

asemanatoare topoizomerului

UnwC3(astfel favorizeaza

ipoteza H3 sugerata de noi la

pg. 26 a propunerii de

proiect ‘Modelul RSS-ului

indus suprarasucit ‘. Ramanea

sa verificam si modul cum

cataliza RAG a ADN-ului este

influentata de o configuratie constransa topologica restrictionand cele doua RSSuri intr-o orientare fixa

rigida. Logica experimentelor descrise mai jos este aceea de a constrange intr-un substrat mic circular prin

lungime (redusa), torsiune(suprarasucire) si orientare rotationala de faza o pereche 12/23 RSS pozitionarea

acestora. Cataliza RAG pe aceste substraturi va testa validitatea ipotezelor H1, H2 si H3 propuse in proiectul

original. Este stiut faptul ca AND-urile circulare ale caror lungimi de contur(‘contour length’) este mai mic

6

decat dublul lungimii de persistenta a ADN-ului(a)(a=50nm la25o C pentru dsDNA, ceea ce este echivalent

cu o lungime de 145bp) nu pot adopta incrucisari writhe astfel fiind constranse intr-un singur plan. Pentru a

inlocui strategia neproductiva a constrangerii ADN-urilor circulare prin IHF (asa cum propusesem) am

izolat in loc, ADN-uri circulare mici de lungimi<300bp, a caror lungime intersemnal IS dintre nonamerii 12

si 23-RSS (in orientarea deletionala acestia sunt la interior) a fost variata in incremente de 3 bp respectiv: IS-

77bp, 80bp, 83bp, 86bp, 89bp, 92bp, 95bp, 98bp, 101bp si 104bp. Pentru fiecare din aceste constructe cele 2

brate emergente heptamerilor (la capatul opus al RSS-urilor fata de nonameri) au fost construite de 50bp

fiecare terminandu-se cu un sit Xba I care prin taiere capata avantajul hibridizarii monocatenelor rezultate, la

ligare crescandu-i eficienta. Anterior studiasem efectul ciclizarii cu ligare prin T4DNA Ligaza a acestor

substraturi liniare (Ciubotaru et. al 2007)(1).

Figura 7 prezinta acest effect observabil in

reactiile de ligare in prezenta unui amestec

complet RAG (HMGB2∆C, MBPcR1D708A

si GST-RAG2) pentru IS92 si IS104 Sinapsa

mediata de RAG sporeste circularizarea

acestor ADN-uri si impreuna cu HMGB2

induce topoizomeri lenti(slowSlw-relaxat) si

rapizi (F-overwound) topoizomerici ca

mobilitate la electroforeza. Prin aceasta

metoda de ligare facilitate am demonstrat ca

RAG sinapseaza preferential doi nonameri la o orientare de aproximativ 220o intre nonameri la constructele

IS80 si IS101 cu o dependent ciclica de faza elicoidala. Aceasta noua strategie cu cercuri mici topoizomerice

cu grad variat de suprarasucire are avantajul ca poate testa efectul taierii monocatenare prin RAG asupra

disiparii energiei inmagazinate in suprarasucire fara a mai fi nevoie de activitatea unei enzyme suplimentare

cu activitate de acest gen. (StrategiaD3A1 pg 26 in propunerea originala). Acest lucru se realizeaza simplu

prin compararea eficientei activitatii RAG catalitice pe topoizomeri ai aceluiasi construct relaxati sau

suprarasuciti.

Folosind metoda de circularizare in prezenta de HMGB2 la scara preparativa pentru fiecare din acesti

constructi am izolat si purificat din gel fiecare topoizomer si apoi i-am supus clivajului folosind in amestecul

RAG complet wt MBPcRAG1(384-1008). In Fig.8 este prezentata radiograma produsilor de clivaj prin

RAG asupra speciilor liniare si circular topoizomerice ale constructilor IS83 si IS86(SC si DC desemneaza

produsi taiati unic sau dublu). Doua observatii majore frapeaza de la o prima privire. Intai, ambele tipuri de

topoizomeri cresc considerabil eficienta clivajului dublu comparativ cu cea obtinuta la acest produs cand se

foloseste drept substrat AND liniar. (in Fig.8 compara DC in godeurile 2&3(duplicate) sau 6&7 cu 10&11

pentru IS86, sau godeurile 16&17 sau 20&21 cu 24&25). In al doilea rand, activitatea RAG de clivare

7

monocatenara intrinseca converteste topoizomerii F suprarasuciti migrand rapid in topoizomeri Slw chiar in

absenta sinapsei(vezi interconversia din godeurile 4 si 19 cu reactiile fara HMGB2). Reactii similare cu cele

prezentate in Fig. 8 s-au obtinut in alte trei experimente individuale pentru fiecare tip de substrat ADN si

acelasi tip de observatii s-au facut pentru toti cei zece constructi. Inainte insa de a discuta rezultatele de

dublu clivaj cumulativ obtinute pentru toti cei zece constructi, vom incerca sa revizuim cele trei ipoteze (H1-

3) ale proiectului propus initial (pg.26) si vom trece in revista ipotezele de lucru atunci formulate asupra

acestor experimente. H1 " modelul ADN-ului tip resort elastic” presupune ca intreaga energie de

suprarasucire este convertita in energie mecanica necesara desfacerii ADN-ului la treapta a IIa de formare a

acului de par. Daca aceasta ipoteza ar fi adevarata deoarece taierea monocatenara indeparteaza complet

energia torsionala de suprarasucire la treapta premergatoare formarii acului de par, H1 prezice ca n-ar trebui

sa existe nici o diferenta intre eficientele de dublu clivaj obtinute la topoizomerul Slw fata de cel F al

aceluiasi construct (cum am aratat anterior clivajul monocatenar ii interconverteste inainte de taierea dublu

catenara). H2 "Modelul complexului proteina-ADN elastic” propune conversia intregii energii de

suprarasucire intr-o reconfigurare proteica in timpul tranzitiei de la SC la PC, chiar inaintea formarii acului

de par. Asadar H2 prezice eficiente de clivaj mai crescute in mod consistent la toate reactiile folosind

substrat F fata de cele folosind topoizomeri Slw pentru acelasi construct, in toate cele zece cazuri. H3

"Modelul RSS-urilor configurate prin suprarasucire " potrivit careia RAG necesita la cataliza o anume

configuratie a ADN-ului RSS mult mai usor de indus in complexul cu RAG-HMGB daca ADN-ul porneste

de la starea suprarasucita decat de la cea relaxata(bariera energiei de activare mai redusa). Orientarea fazei

elicoidale optime a perechilor 12/23-RSS determinata in assay-ul de circularizare prin legare ar trebui sa

favorizeze si clivajul cuplat prin RAG. Histograma din Fig. 9 ilustreaza rezultatele cumulative de clivaj

dublu obtinute cu amestec complet activ RAG pentru toti constructii; cu negru pentru substratul liniar, cu

rosu Slw- cercuri relaxate si in albastru F-topoizomeri suprarasuciti. Cu rosu linia punctata denota aspectul

rezultat din eficientele de legare ale acestor constructi/(formarea sinapsei) anterior publicate (Ciubotaru et.

al. 2007)(1). Notabil toate substratele sub forma de ADN liniar sunt clivate cu eficienta scazuta similara de

5-8% la toti constructii. In mod neasteptat insa substratele circulare cuprinse intre IS77 si IS92 sunt in

general mai bine dublu clivate de RAG decat constructii cu distante mai mari inter-RSS(de la IS95 la

IS104). In mod considerabil pentru toti constructii, topoizomerii circulari sunt sensibil mai bine clivate decat

variantele lor liniare. Pentru trei dintre constructi RAG nu discerne intre variantele lor de topoizomeri F sau

Slw (IS83, IS92, IS98), dar in cazul celorlalti 7 constructi topoizomerii F sunt substrate mai bune pentru

cataliza RAG. Aceasta observatie invalideaza ambele ipoteze H1 si H2 care asa cum am afirmat anterior fie

presupun echivalenta la clivaj a tuturor topoizomerilor (H1) sau presupun preferinta clar catalitica a

topoizomerilor suprarasuciti F fata de cei Slw (H2). Un alt argument pledand serios impotriva mecanismelor

propuse de ipotezele H1 si H2 este gradul mare de variabilitate observat la eficienta de clivaj intre diferitii

constructi (H1 si H2 prezic eficienta asemanatoare intre aceleasi forme ale diferitilor constructi). Desi

8

eficienta de clivaj nu urmeaza caracterul "sinusoidal" si periodicitatea stricta prezenta la experimentele de

ligare (linia punctata rosie) putem spune totusi ca aceasta tendinta apare vizibil mai voalat la clivajul pe

forma F suprarasucita. Deoarece lungimea ADN-ului intersemnal IS afecteaza eficienta clivajului prin RAG

rezultatele topoizomerilor F ale constructilor IS80 si IS101 trebuie interpretate ca maxime locale in grupul

lor. Puse impreuna aceste observatii experimentale favorizeaza ipoteza H3 demonstrand mai ales ca sub

constrangerile impuse de suprarasucire activitatea de cataliza a RAG este orientata de o topologie

preferentiala a ADN-ului, configuratie ce nu poate fi simplu reprodusa doar de orientarea unui nod de

intretaiere prin writhe.

In continuare am facut experimentele de clivaj

dublu mediat prin RAG intreprinse pe substrate ADN

similare cu cel IS264 de 431bp (prezentate in

propunerea de proiect D2A, Fig. 4A pg24) dar de data

aceasta avand o pereche 12/23-RSSuri orientate

inversional. Rezultatele unui gel reprezentativ sunt

ilustrate in Fig. 9B si a cuantificarilor rezultate in Fig.

9C. Aceste rezultate vin sa confirme faptul ca

suprarasucirea negativa prezenta la Unwc1,UnwC2 si

Unwc3 la o orientare inversionala a RSS-urilor

substratului inhiba in mare parte clivajul RAG fata de

cel liniar de referinta, un rezultat diametral opus celui

obtinut pe IS264 del 431bp prezentat in propunerea de

proiect(D2A, Fig. 4A pg24). Acest experiment

confirma puternic ipoteza noastra caci suprarasucirea

negativa ar facilita o aranjare a configuratiei optime a

RSS-urilor in cis numai in orientarea negativa si ar avea efect invers pe orientarea inversionala.

Ne-am decis sa investigam cu amanuntime detaliile si proprietatile structurale ale celor doua RSS-uri in

complexul sinaptic aspecte ce vor fi descrise la sectiunea D3B1.

D2B. Efectul suprarasucirii ADN-ului asupra synapsei RAG deficitare in trans

(obiectivul D2B este adresat in sectiunile experimentale D3B1, D3B2 a propunerii noastre de proiect, D3B2

adresand experimental si prima parte a obiectivului D2C.

9

Obiectiv 2 D3B1. Configuratia 23 si 12-RSS in complexul sinaptic. Pentru a investiga sinapsa in cis

versus trans precum si pentru a orienta design-ul modului cum metalohelicatii se leaga de ADN-ul

suprarasucit trebuie sa intelegem pe deplin detaliile topologice si structurale ale dispunerii celor doua RSS-

uri in complexul sinaptic. Avand in vedere faptul ca un nod cu

impletire writhe simplu nu poate reproduce configuratia celor

doua RSS-uri in PC ne-am decis sa folosim metodologia FRET

pentru adezvalui in detaliu aspectul elementelor ADN 12 si 23-

RSS in acest complex. Experimentele de FRET ce urmeaza in

descriere au fost desfasurate in colaborare cu grupurile Dr.

David G. Schatz si Dr. Elizabeth Rhoades's de la Yale

University iar asamblarea modelelor structurale 3D a fost

desavarsita in colaborare cu grupul domnului Dr. Andrei J.

Petrescu de la Institutul de Biochimie al Academiei Romane

din Bucuresti. Aceasta metodologie avea sa inlocuiasca cu

succes strategia propusa in proiectul initial cu topoizomeri

indusi prin IHF (D3A2 pg. 27) neproductiva si pe baza ei am

reusit sa descifram configuratia celor 2 RSSuri in PC. Pentru

a determina gradul de indoire al RSS-urilor am folosit

oligonucleotide dublu catenare fiecare individual marcate cu

o pereche de fluorofori Acceptor/Donor (A/D) localizati in

cis (marcare duala), necesari evidentierii fenomenului de

FRET (Fluorescence resonance energy transfer)(Fig. 10A si

B). Fiecare fluorofor a fost cuplat in cursul sintezei de ADN

prin intermediul unei punti amino modificate continand sase grupari de metilen C6 pentru a reduce la minim

posibilele interactiuni proteine-fluorofori din complexul cu RAG. Design-ul oligonucleotidelor 12 si 23-RSS

foloseste ca principiu orientarea fluoroforilor in raport cu directia indoiturilor induse de RAG (Fig. 10).

Studiul nostru compara eficienta fenomenului FRET a aceleiasi perechi. Acceptor/Donor in absenta fata de

eficienta detectata in prezenta proteinelor necesare formarii sinapsei (amestec RAG complet MBP-

cRAG1wt, GST-cRAG2 HMGB1 si un partener RSS nemarcat). Schimbarile de eficienta a fenomenului

FRET induse de fiecare tip de complex in parte detecteaza o schimbare a pozitionarii perechii A/D in

contextul creat de legarea RSS-ului. Principiul experimental este schematizat in desenele din Fig. 10C. In

cazul unor indoituri ascutite a caror convexitate este pozitionata intre fluoroforii A/D distanta dintre

fluoroforii perechi localizati pe aceeasi fata a elicei creste (scazand eficienta fenomenului FRET). Cand

indoiturile din RSS-uri sunt pozitionate cu concavitatea lor intre perechile de A/D, aceasta duce la o scadere

10

drastica a distantei dintre fluoroforii localizati pe aceeiasi fata a elicei (corespunde unei cresteri a eficientei

FRET).

Desi am evidentiat indoirea ADN-ului RSS folosind multe din substratele descrise in Fig 10A, substratele 12

si 23RSSdR2a (Fig.11-Spectre de Emisie Fluorescenta pt 23RSSdR2a) au fost cele mai informative si de

aceea au fost studiate in amanuntime. Experimentele descrise mai jos pentru 23RSSdR2a au fost intreprinse

si pentru 12RSSdR2a si fiindca rezultatele obtinute sunt similare la ambele elemente ADN prezentam in

acest raport doar varianta celor de la 23-RSS. In aceste substrate donorul este pozitionat 3bp 3' fata de

nonamer(cercul galben) si acceptorul

la 9bp 5' fata de heptamer(cutia

albastra) fiind sunt separate in cazul

23-RSS de 51bp(distanta 171-180Å)

iar in 12-RSS de 40bp(distanta 131-

140Å ). Cum transferul de energie

nu este detectabil la distante mai mari

90Å, nu ne-am asteptat sa obtinem

FRET in absenta proteinelor cand ADN-ul este liber. Acest lucru a fost confirmat experimental(in raport

ilustrat doar pentru 23-RSS in Fig. 11A, spectrele de emisie pentru 23RSSdR2a (linia rosie; indicata

"(d+a)") este similara cu reactia control in care donorul si acceptorul sunt pozitionate in trans pe substrate

23RSS distincte (un amestec echimolar de 23RSSdR si 23RSS2a; curbele negre continue; "(d) + (a)"). Aceste

spectre se caracterizeaza prin maxima de emisie la ~ 520 nm, caracteristic donorului FAM, fara a evidentia

emisia acceptorului sau diminuarea emisiei donorului in situatia in care fluoroforii sunt pozitionati in cis sau

in trans pe ADN. Spectrele din Fig11 au fost corectate pentru fluorescenta reziduala a

acceptorului.Adaugarea la 23RSSdR (contine numai donor-) a amestecului complet RAG proteic si a 12-RSS

duce la o reducere substantiala a

fluorescentei donorului (linia

neagra punctata; "(d) + proteins")

(Fig. 11A), datorata interactiunilor

locale dintre donorul FAM si

proteine. Cand sustratul dublu

marcat 23RSSdR2a este incubat cu

amestec complet RAG (curba

albastra; "(d+a) + Proteins"), observam o scadere suplimentara a fluorescentei donorului precum si

sensitizarea acceptorului (max. emisie intre 570-595 nm) (Fig. 11A, compara spectrul trasat in albastru cu

cel in negru punctat). Aceste modificari spectrale ce trebuiesc atribuite sensitizarii acceptorului, indica

11

transferul de energie intre fluorofori indus de complexul protein-ADN. Acest fenomen a fost consistent

reprodus in 17 experimente independente din a caror cuantificare s-a obtinut o eficienta FRET medie (E-

FRET) de 18.0% ± 1.2%. Acest lucru indica faptul ca in complexul PC RAG-DNA donorul si acceptorul

sunt separate de o distanta mai mica de 90Å. Folosind teoria FRET radiativa Forster am calculate distanta

dintre fluorofori in sinapsa pe 23RSSdR2a de 71Å ± 10Å. Acest lucru este posibil numai daca ADN-ul este

supus unei distorsiuni/indoiri majore in regiunea cuprinsa intre cei doi fluorofori.Pentru a descrie o harta cit

mai exacta a tuturor indoiturilor aparute la nivelul secventelor 12 sau 23-RSS, am studiat un nr de 14 perechi

de fluorofori in cis pentru 23-RSS si 16 perechi cis pentru 12-RSS (Fig.10A si B). Distantele interfluorofori

masurate in complexul synaptic si in signal complex SC (doar pentru 12-RSS) au fost folosite pentru

construirea modelelor structural moleculare a 23 si respectiv 12-RSS in PC si SC. Experimentele descriind

masuratorile FRET efectuate pentru 23-RSS in PC iar 12-RSS in SC si PC precum si modelele rezultate au

fost descrise in amanunt si publicate in ianuarie anul curent Ciubotaru et. al. 2013 si 2015 in revista Nucleic

Acids Research Oxford University Press (3,8).

Masuratorile si modelele structurale privind 12-RSS au fost submise spre publicatie in luna noiembrie anul

in curs, la aceeiasi revista stiintifica

fiind in prezent in stadiul de revizie

stiintifica. Fig. 12 prezinta

comparativ structurile moleculare

rezultate din masuratorile FRET

pentru 23-RSS si 12RSS in PC si

cu sageti situs-urile de maxima

hipersensibilitate la DNAazaI. Doua

concluzii majore se desprind din

aceste modele structurale. Atat 12

cat si 23-RSS sunt indoite de RAG

si HMGB1 in mod considerabil,

ADN-ul lor adoptand forma literei

U(23) sau V(12) intoarse cu

heptamerul si nonamerul fiecareia

(colorate pe ambele structuri)

localizate pe bratele literelor model

la jonctiunea cu regiunea

intermediara ce le separa si care

preia arcuirea maxima. La ambele

elemente ADN regiunile de contact

cu componentele proteice sunt

12

localizate la nivelul concavitatii curburii. Acest aspect este de maxima importanta pentru noi caci putem

orienta acum modul cum RSS- urile suprarasucite vin in contact cu complexul RAG-HMGB in PC. Singura

structura de inalta rezolutie disponibila a unui domeniu al RAG1 in complex cu elementul consens nonamer

(descris de F. F. Yin, din grupul Dr. Schatz's in colaborare cu cel al Dr. Tom Steitz's de la Yale

University)(2) este cea a peptidului de 75 aminoacizi Nonamer Binding Domain NBD of RAG1 (389-456)(F.

F. Yin et. al. 2009). Pentru a completa aceasta structura cu detaliile relationale dintre cele doua structuri

consens ale 12/23-RSS si RAG in interiorul PC am ancorat "in silico" cei doi nonameri proveniti de la doua

23 RSS-uri indoite din PC rezultate din FRET la sirul de interactiuni Aminoacid-baze descrise la motivul de

legare GGRPR din dimerul NBD. Deoarece structura 12-RSS este mult prea compacta pentru a permite

acomodarea in trans a NBD, modelarea s-a facut cu doua structuri 23RSS. Structura rezultata din “targeted

docking” a fost ulterior supusa modelarii molecular dinamice, cu minimizarea eventualelor conflicte sterice

si de potential electrostatic. Rezultatul este ilustrat in Fig.13 fiecare 23-RSS colorat distinct(unul rosu si

unul verde), literele N desemnand fiecare din nonameri iar cu H heptamerii celor 2 RSS-uri. Acest model a

fost descris de noi in articolul review teoretic publicat in acest an in revista Discoveries Ciubotaru et. al

2014(7). Desi structura model rezultata in Fig.13 provine din ancorarea unui domeniu restrains (NBD) al

RAG1 si cu siguranta prezinta o viziune mult simplificata a complexului RAG synaptic (PC), totusi ea ne

ofera cateva repere structurale importante ce ne ajuta sa interpretam rezultatele cinetice obtinute la ligarea

IS264 precum si cele de clivaj pe ADN-urile circulare topoizomerice prezentate la paginile 3-4 si 7 ale

acestui raport. Deoarece miezul complexului proteic RAG-HMGB pare sa fie chiar si partial inchis inlauntrul

plectonemelor (arcelor impletite) celor 2 RSS-uri acest lucru exclude contactul direct dintre regiunile lor de

ADN “spacer”, asa cum s-ar fi intamplat daca RAG ar fi legat un nod pozitiv sau negativ preformat ADN

impletit cu “writhe”. Asadar RAG ar lega preferential cu

afinitate sporita fiecare din cele doua RSS-uri in stare

suprarasucita formand 12 sau 23SC mult mai degraba decat

RSSuri in stare de ADN relaxat deoarece suprarasucirea

prefigureaza o stare de indoire plectonemica(mult mai

apropiata de starea indusa RSS-ului de RAG in PC). Totusi

formarea PC nu este in mod pasiv facilitat de simpla

juxtapunere a celor doua RSS-uri intr-un singur nod

suprarasucit preformat( asa cum propuneam in mod gresit in

ipoteza noastra de lucru prezentata in propunerea de proiect

la pg. 22 si 25). Dimpotriva, sinapsa este mediata de

interactiuni proteina-proteina care ancoreaza doua RSS-uri

suprarasucite complementare in sinaptozom. Tocmai

aceasta orientare optima impreuna cu adiacenta de orientare a interactiunilor protein-proteina (dupa

formarea SC) ceea ce faciliteaza sinapsarea preferentiala si optimizeaza cataliza constructelor IS80 si

IS101. Deoarece cele doua RSS-uri indoite in PC adopta structuri considerabil distincte (Fig.12) modelul

din Fig.13 propune o intrebare noua, si anume cea referitoare la modul cum sinaptozomul se formeaza

13

izotropic sau anisotropic(necesita o orientare unica a celor doua elemente 12 deasupra RAG la mijloc 23

subiacent sau vice versa)? In continuare am decis sa abordam acest tip de intrebari folosind fenomenul de

transcriere ca un factor regulator al semnului suprarasucirii (vezi sectiunea D2C-D3C).

Obiectiv3-D2C, D3C. Suprarasucirea ADN-ului indusa prin transcriere factor selectiv in favorizarea formarii PC in cis.

(objectivul D2C este addresat in sectiunea experimentala a propunerii de proiect subsectiunea D3C la pg

29). Ipoteza de lucru a proiectului propunea ca transcrierea initiata in preajma de la promotorilor din

proximitatea segmentelor V si D incorporeaza RSSurile lor in suprarasuciri ce le activeaza recombinarea.

Ca sa testam aceasta idee am propus un set de experimente paralele in vitro/in vivo folosind un vector ADN

substrat cu doua RSS-uri

identice (unul reporter si

celalalt constitutiv) localizate

langa un promoter heterolog al

fagului T7 drept activator si un

RSS distal complementar cu

cele 2 pentru imperechere. Am

modificat un pic design-ul

initial din propunerea de

proiect (pg. 29, Fig.7), in asa

fel incat noul substrat sa

raspunda mai bine efectelor

structurale dovedite in

experimentele anterioare cu

topoizomeri si FRET. Avand in vedere ca 23-

RSS are afinitate mai mica pentru legarea

RAG si necesita pentru aceasta prezenta

proteinei HMGB in noii constructi atat RSS –

ul constitutiv cat si cel reporter au fost alesi

12-RSS. Drept vector de baza am folosit

secventele pJH290 unde alaturi de 12-RSS-ul

sau am inserat unul identic cu acesta si un

promoter al RNA polimerazei fagului T7 intre

ele. Constructii au fost asamblati cu cei 2x12-RSS in orientare deletionala si inversionala fata de 23-RSS-ul

distal cum este ilustrat in Fig. 14. Pentru a testa efectele orientarii sinaptozomului ambele 12-RSSuri au fost

14

pozitionate in imediata vecinatate a promoterului T7 astfel incat transcrierea induce in 12-RSSul din aval

suprarasucire pozitiva(12-2 pt. T7Inv sau 12-1pt. T7del.) si negativa in cel pozitionat in amonte fata de

sensul sau(12-1 pentru T7 Inv si 12-2 pt T7 del.). Pentru oprirea transcrierii am folosit cate un terminator

pozitionat la 200 de baze in josul promotorului pt. fiecare orientare. In gelul din Fig.14 sunt migrate produsii

de amplificare PCR cu primerii 1M si4M care amplifica regiunea din construct dintre 12/23 RSS distal in

lipsa recombinarii. Atat pentru experimentele in vitro cat si pentru cele in vivo am obtinut date

preliminarii doar pentru substratul 2x12RSS T7Inv. Experimentele de recombinare in vivo au fost efectuate

cotransfectand fibroblaste umane 293T HEK cu substrat 2x12RSS T7Inv, vectori pEBB exprimand RAG1 si

RAG2 proteine intregi si vectorul pAR3132T7RNP_NLS(6) exprimand RNA polimeraza fagului T7. Fig.

15A ilustreaza schematic procesul de recombinare pe vectorul inversional mediat prin RAG fie la nivelul

12-1 sau al 12RSS-2, si pozitionarea primerilor folositi in amplificari PCR individualizate pentru detectia

fiecarui tip de produs de recombinare; P1(12-1) and P2(12-2). In Fig. 16B este ilustrat gelul de separare al

unui set tipic de amplificari PCR incluzand reactiile control si folosind drept matrite de copiere vectori

extrasi din celule transfectate si mentinute in cultura 48h. posttransfectii. PCR1 detecteaza referinta ADN-ul

intersemnal (1M si 4M) de pe vectorul nerecombinat PCR2 evidentiaza produsul P1 iar PCR3 produsul P2.

Cinci seturi de amplificari PCR au fost executate pentru fiecare tip de transfectie si produsii de reactie dupa

separare pe 5% PAGE si colorare cu SybrGreen au fost cuantificati folosind un scanner Typhoon

Fluorescent. Rezultatele provenind de la 5 seturi de amplificari corespunzatoare a trei experimente cu

transfectii individuale sunt ilustrate cumulativ ca medii in histograma din Fig. 16C. Rezultatele sunt

exprimate fie ca raport relativ ai produsilor detectati P1 (rosu) sau P2(albastru) in prezenta(+T7) sau

absenta(-T7) T7RNA polimerazei, sau a raportului P1/P2(verde) in conditii cu transcriere T7 divizat la

raportul dintre produsi obtinuti in absenta transcrierii. Fig. 15 D ilustreaza analiza de tip imunoblot aratand

prezenta sau absenta expresiei proteice dupa 48 h posttransfectii complet dirijate de acest process. Fig. 16A

ilustreaza reactii de RT-PCR facute cu diferite dilutii de ARN din extracte celulare tratate cu DNAase I,

urmate de +/-Reverse Transcriere si amplificare PCR cu un set de primeri flancand transcriptul de la

promoterul T7. Se vede clar prezenta marcata a transcrierii initiate de acest promoter in celulele transfectate

cu vector exprimand T7RNA polimeraza (+T7) spre deosebire de cele crescute in absenta acestui vector(-

T7). In Fig. 16 B sunt descrise dilutii ale reactiilor specifice de PCR folosite pentru cuantificarile obtinute in

Fig.15C.

Transcrierea initiata specific de la promoterul T7 activeaza doar moderat recombinarea RAG in

special la nivelul lui 12RSS-1 (Transcrierea aproape dubleaza eficienta recombinarii la acest sit, vezi P1

+T7/-T7 din Fig15C) care in acest regim devine suprarasucit negativ. Mult mai putin dramatica este

cresterea recombinarii P2 la 12RSS2 ceea ce ar corespunde in timpul unei initieri sustinute a transcrierii unei

stari de suprarasucire pozitiva. Faptul ca transcrierea la acest construct activeaza recombinarea la ambele

12RSS-uri este pus in evidenta indirect si de raporturile P1/P2 ce par putin afectate de transcriere desi asa

15

cum am evidentiat fiecare produs in parte este activat. Aceste rezultate sugereaza ca sinaptozomul s-ar forma

izotropic acceptand RSS-uri suprarasucite atat negativ cat si pozitiv ambele semne facilitand indoirea

extrema a ADN-ului.

Pentru descifrarea detaliilor de mecanism de reactie am investigat si efectele transcrierii T7 polimerazei pe

un substrat asemanator celui de la transfectii liniar de 600bp 2x12RSS T7Inv, prin reactii in vitro de clivaj

dublu. Astfel de reactii au fost executate in prezenta 8.5mM MgCl2, and 2mM rNTPs, si a proteinelor

purificate MBP-cRAG1(384-1040), MBP-cRAG2(1-387)(coexprimate) si HMGB1, T7RNA polimerazei.

Fiecare reactie de clivaj

este executata in duplicat

una fiind analizata dupa

deproteinizare pe PAGE

nativ cu Fluorescenta prin

colorare cu Sybr Gold,

cealalta reactie fiind

supusa digestiei cu

DNAase I , extragerii de

ARN urmata de Reverse

transcriere cu un primer

specific complementar T7

transcriptului si apoi

amplificat prin PCR. Fig.

17A arata efectul de

stimulare RAG impresionant al transcrierii T7RNAP

atat asupra clivajului dublu la P1 cat si la P2 dupa

2hrs la 37oC (compara al doilea -T7 RNAP godeu cu

cel de-al treilea +T7RNAP). Fig. 17B ilustreaza

reactiile de RT- PCR si reactiile control in absenta de

substrat (godeurile 1&7), -RT(godeurile 2&3) or

+RT(godeurile 4&5) cu evidentierea specifica a

produsului de amplificare in godeul 6 unde a reactiei

cu transcriere. Am investigat prin reactii in timp

efectul cinetic al transcrierii asupra clivajului RAG (Fig. 17C, un gel cu reactiile de clivaj in timp in prezenta

transcrierii iar Fig.17D prezinta curbele de saturare P1, P2 +T7/-T7 precum si raportul lor ca histograma

provenite de la trei experimente independente). In Fig.18 sunt reprezentate reactiile de RTPCR rezultate in

timp fie in prezenta sau absenta T7 RNA polimerazei. Efectul transcrierii asupra formarii de ac de par prin

16

cataliza RAG sunt neglijabile pe acest tip de substrat liniar (Fig17D) ceea ce confirma faptul ca transcrierea

in sine nu produce un efect direct asupra eficientei sau ratei de cataliza prin RAG.

Urmatorul pas l-a constituit verificarea similara in vitro a efectului transcrierii asupra catalizei RAG

folosind un promoter T7 adiacent elementelor 12RSS martor (similar cu cel verificat in Fig. 17) pe

minicercuri ADN in care 12/23 sunt in ambele orientari functionale de tip deletional cat si inversional(Ob3

descris la D3C pg. 29-31 propunerea originala de proiect). Pentru obtinerea unor minicercuri cu grade

variate de suprarasucire am aplicat aceeasi strategie de ligare prin T4DNA ligaza a unor constructe liniare de

520bp (2x12T7 inv/del) cu capete coezive, si izolarea in urma migrarii prin PAGE a diversilor topoizomeri

circulari rezultati. In Fig. 19 A sunt illustrate

rezultatele clivarii prin RAG +/-T7RNAP

transcriere pe patru astfel de topoizomeri

suprarasuciti negativ (UnwC1-UnwC4), precum

si a substratului initial liniar 2x12T7del. Spre

deosebire de Fig.4B pg25 din propunerea de

proiect unde separarea produsilor de reactie

fusese facuta pe un gel de acrilamida pe format

mare de scevntializare (33x35cm) de aceasta data

migrarea s-a facut pe geluri conventionale

ProteanII XL Biorad (18.5x20cm). Din acest

motiv migrarea nu poate evidentia simultan

diferenta de mobilitate a topoizomerilor substrat

netaiati si ai produsilor liniari (P1, P2, SC)

rezultati in urma clivajului RAG. Topoizomerii

sunt sesizabili la capatul de sus al godeurilor

indicati prin sageti, iar cantitatea introdusa din

fiecare in reactie fiind masurata prin fluorescenta

(Qubit- fluorescence Life Technologies). In Fig. 19B sunt ilustrate prin histograme efectele cuantificate ale

acestor reactii. In cazul substratului liniar prezenta transcrierii prin T7RNAP este de usoara stimulare la

ambele 12RSS martori, efect asteptat pe baza reactiilor prezentate anterior in Fig. 17. In cazul tuturor

topoizomerilor circulari efectul stimularii prin transcrierea T7RNAP a clivajului cuplat RAG este observabil

la ambii produsi dar considerabil mai accentuat la 12RSS-2 (proximal localizat fata de partenerul 23RSS de

referinta-Produsul P2), in special pentru topoizomerul UnwC2. Taierea la un singur RSS (SC-single cut-

sinapsa in trans) ce linearizeaza substratul este redusa si abia observabila la majoritata topoizomerilor cu

exceptia UnwC4 unde pare similara cu reactia obtinuta la substratul liniar. Este demn de remarcat ca efectul

17

transcrierii prin T7RNAP la 12RSS-2 este acela de suprarasucire indusa negativ, pentru orientarea in

cauza(del). In continuare am analizat efectul transcrierii prin T7RNAP asupra clivajului cuplat RAG pe

substratele circulare 2x12T7inv prezentate in Fig. 20. De aceasta data se observa faptul ca efectul de clivaj

cuplat(sinapsa in cis) este fie puternic(UnwC1, Unwc2) ori moderat (UnwC3) inhibata(Fig20A,B), iar in

cazul UnwC3 se observa o canalizare aproape exclusiva a reactiei catre sinapsa in trans si producerea de

produs SC(Fig20C). Interesant de remarcat faptul ca efectele mentionate par nemodificate de prezenta sau

absenta transcrierii, ceea ce ne indreptateste sa le atribuim configuratiei plectonemice defavorabile orientarii

sinapsei in aceste suprarasuciri ale substratului.

Ob. 4 D3D-1. Interactiunea LacI repressor-

AND Operator modulatoare a interactiunii

ADN-ADN in trans. . Pentru indeplinirea ob. 4

asa cum descriam in propunerea de proiect la

pg. 31 si 32 era necesara construirea unui

sistem artificial de ancorare ADN mediat prin

intermediul unei proteine accesorii capabile sa

lege elementul sau ADN cooperativ in

trans(legare simultana a doi protomeri proteici

pe doua elemente situate pe doua molecule

distincte de ADN). Incercarile noastre

preliminarii de a folosi exact strategia descrisa

in propunere cu represorul mutant D173G a

represorului fagului lambdoid 434 nu au fost

intru totul productive caci aceasta proteina desi

se angaja la legare in trans o facea cu eficienta

scazuta. De aceea am abordat pentru

indeplinirea aceleiasi strategii in locul 434R,

represorul operatorului lactozei Lac I cu legarea sa

pe secventa sa element operator. Pentru evidentierea

acestei interactiuni am purificat Lac I din E. coli

transformata cu un vector de expresie lacZ, iar

secventa element operator ce urmeaza a fi clonata in

tandem multiplu(vezi pg 31-32, D3D propunerea de

proiect) a fost asamblata din oligonucleotide

sintetice unul dintre ele marcat la capatul 5’ cu

18

fluoroforul Alexa484. Experimentul descris in Fig. 21 este un experiment de EMSA(electrophoretic mobility

shift assay) ce evidentiaza legarea specifica a Lac I de operator intai in cis(DNA-R2-dimer Lac I legat de o

secventa operator-godeul 1, la un raport molar 1,25:1, LacI:opADN). Cand incubarea represorului cu ADN-

ul marcat se face prin adaugarea unui exces de ADN operator fie in totalitate marcat(godeul 2), fie

aproximativ jumatate marcat-godeul 3(1:1,6, lacI:opADN) complexul proteina ADN se formeaza prevalent

in trans astfel mediind reactia noastra de interes. Aceste rezultate preliminarii sunt incurajatoare, si pe baza

lor am ansamblat un polioperatorADN cu secvente multiple in tandem, construct folosit drept model de

ancorare in experimentele descrise mai jos.

D3D-2. Interactiunea LacI repressor-ADN Operator dirijeaza recombinarea VDJ in trans. Avand in

vedere faptul ca interactiunea de legare Lac I repressor

tetramer de cate un singur operator pe doua molecule ADN

poate media cu eficienta apropierea acestora in trans am

incercat sa amplificam acest efect generand doua constructe

de ADN plasmidial ce contin cate 8 secvente operator insiruite in tandem, adiacente, fiecare octamer 8xOp

flancand fie un 12 sau un 23 RSSr-reporteri (Fig. 22, sau Ob4 D3D Fig.8 pg 31 din propunerea de proiect)

de fiecare parte. Pentru a evidentia daca legarea de LacI represor poate in mod cooperativ reduce eficienta

clivajului RAG in cis, pe constructul cu 12RSS flancat de 8xOp am adaugat la distanta si un 23RSSc

constitutiv. Experimentele prin care testam efectul produs de tetramerii de Lac I repressor au fost descrise la

Ob4 D3D Fig.8 pg 31-32 din propunerea de proiect si aici vom aminti doar pe scurt rationamentul

desfasurarii lor. Primul set de experimente testeaza daca medierea prin complexele LacI represor tetramer

formate intre constructele cu 12 si 23RSSr reporter prin legarea de cele 4 multisituri repetate in tandem la

8xOp duce la o ghidare moleculara a complexului recombinazic RAG spre o cataliza preferentiala in

trans(versus cea naturala 12RSS reporter cu 23RSSc). Acest lucru presupune testarea efectului catalitic

RAG pe cele doua constructe din Fig. 22 in prezenta sau absenta unei concentratii corespunzatoare de LacI

19

Represor. In Fig. 23 avem imaginea marita (vezi gelul in ansamblu in coltul din dreapta jos al imaginii) a

separarii produsilor de clivaj ADN generati de RAG in urma a 13 reactii intreprinse distinct in conditiile

specificate de legenda de deasupra gelului. In diagrama din stanga imaginii gelului sunt reprezentati

schematic cei patru produsi rezultati in urma clivarii de catre RAG la nivelul 12-RSSr (cel mai redus in

mobilitate electroforetica), 23-RSSc (imediat sub cel descris anterior), 23-RSSr (cu mobilitate intermediara),

si cel de dublu clivaj cu sinapsa in cis 12-RSSr & 23-RSSc (banda mica de mobilitate maxima

electroforetica). In mod remarcabil clivarea de catre RAG a ADN-ului in trans necesita atat prezenta

ambelor tipuri de constructe plasmidiale unul cu 12-RSSr si celalalt cu 23-RSSr cat si cea a proteinei de

docare represorul LacI (compara rezultatele din godeurile 1,3, 4, 5, 7 cu cele din reactiile 2 si setul 8-13).

Pentru a pune in evidenta in ce masura concentratia de represor LacI influenteaza gradul de proximitate

mediata a 12-RSSr si 23-RSSr setul de reactii din reactiile 3-7 trebuie in mod corespunzator comparate cu

cele din setul 8-13. Deoarece efectul detectabil la nivelul clivajului unic 12-RSSr se datoreaza sumativ atat

sinapsei in trans (cu 23-RSSr) cat si a celei cu 23-RSSc de pe acelasi ADN, el poate fi urmarit numai

corelativ in sensul sincronizarii celor doua efecte. Produsul de clivaj unic mediat prin RAG la 23-RSSr este

cel ce indica electiv eficienta imperecherii sinaptice in trans si de aceea este indicatorul de maxima acurateta

a fenomenului urmarit si indus de noi si modulat prin concentratia de LacI represor. Pentru a urmari astfel de

efecte corelative produsii de reactie izolati electroforetic precum cei din reactiile din Fig. 23 au fost

cuantificati fluorescent pe imaginile gelurilor si intensitatea lor relativa reprezentata in functie de

concentratia de represor Lac I inclusa in reactie. Aceste curbe de eficienta a clivajului unic (in cazul sit-

urilor reporter)

sau dublu(12-

RSSr & 23-

RSSc) au fost

reprezentate

grafic in Fig. 24

Curbele

reprezentate in

albastru sunt

reactiile control

in care ADN-ul

partener reactiei

in trans este absent in timp ce cele in rosu contin ambele plasmide cu sit-urile in trans. Pe axa y este

reprezentata intensitatea relative fluorescent a produsului de reactie RAG urmarit in timp ce pe abscisa sunt

rprezentate concentratiile de represor Lac I din reactie. In Fig. 24C se vede efectul remarcabil al represorului

Lac I care intr-un ordin de 0.1-1µM creste eficienta reactiei de clivaj unic la 23-RSSr de aproape 5 ori,

20

numai in prezenta partenerului 12RSSr. Acest effect este observat si la sit-ul partener 12-RSSr(Fig. 24A),

confirmand corelativ faptul ca imperecherea trans 12RSSr/23-RSSr este substantial facilitata de legarea

cooperativa a tetramerilor represorilor LacI la cele doua set-uri de octameri 8xOct ce le flancheaza.

Interesant insa este si efectul de inhibitie al reactiei de clivaj RAG dublu 12RSSr/23-RSSc prin sinapsa in

cis pe acelasi ADN, efect independent insa de prezenta partenerului 23RSS reporter in trans (Fig. 24B

curbele in rosu si albastru arata acelasi efect stimulativ). Acest efect incercam sa-l atribuim posibil modularii

de proximitate a celor 2 sit-uri in cis prin faptul ca represorul Lac I probabil indoind ADN-ul inter-sit-uri

scade concentratia efectiva a celor doua RSS-uri de pe acelasi ADN unul fata de celalalt, astfel reducand

sansele sinapsarii in cis. Scopul primar al acestor experimente a fost atins si anume acela de a reproduce in

vitro(reactia chimica RAG+AND+LacI repressor) fenomenul ce se produce patologic in cazul translocatiilor

cromozomiale din limfoamele primare B sau T. Mentionam ca acest rezultat reprezinta prima tentativa de a

dirija artificial in vitro sinapsa RAG pe sit-uri RSS localizate in trans. Pasul urmator il reprezinta

caracterizarea cinetica a acestui fenomen si influenta transcrierii asupra modularii configuratiei RSS-urilor

in trans(vezi mai jos).

D3D-3. Efectul suprarasucirii trasncriptionale a unuia din situ-urile RSS implicate in recombinarea

VDJ in trans. Rezultatele pozitive ale experimentelor

prezentate la punctele D3D-1 si 2 ne permit reinvestigarea

reactiei de clivaj cu doua RSS-uri flancate de 8xOp localizate

in trans dar de aceasta data influentand configuratia 12RSSc

constitutiv prin transcrierea concomitenta cu clivajul cu T7RNA polimeraza (Fig. 25A). Acest experiment

este doar unul preliminar de tip pilot prin care am inceput sa investigam efectul transcrierii in afara

contextului de mediere a docarii ADN-ADN prin legarea represorului LacI. Asa cum este ilustrat in

diagrama din Fig. 25A unul din plasmide contine atat RSS-ul constitutiv 12RSSc, sub influenta promoterului

T7 in aval cat si pe cel reporter 23RSSr flancat in ambele parti de 8xOp. Celalalt plasmid contine doar

12RSS reporter flancat de octameri 8xOp. In Fig. 25B este ilustrat scan-ul obtinut prin fluorescenta din

gelul nedenaturat(nativ) folosit la separarea electroforetica a produsilor de reactie de clivaj indus prin RAG

in prezenta represorului LacI(godeurile 2,4,6 si 8) sau absenta sa (godeurile 1,3,5 si 7). In Fig. 25C sunt

prezentate rezultatele reactiilor de RT-PCR ce pun in evidenta un produs de aprox. 200bp. corespunzator

lungimii transcriptului nostru, in prezenta T7 polimerazei (3, 7 si8). In Fig 25C primele 9 godeuri din stanga

reprezinta reactiile in prezenta revers transcriptazei iar ultimele din dreapta reactiile control in absenta

acestei enzime. Numerele reactiilor corespund cu cele din Din pacate reactia pilot prezentata nu a fost

suficient de bine tratata cu RNAaza A si urmele de ARN prezente in fiecare reactie au influentat dramatic

mobilitatea electroforetica a produsilor de clivaj enzimatic detectati. In special trebuie sa mentionam

imposibilitatea detectiei clivajului unic la 12RSSc desenat in diagram intre paranteze. In ciuda acestor

inconveniente tehnice regretabile reactia de clivaj evidentiaza remarcabil cresterea substantiala a clivarii

21

duble 12RSSc/23RSSr (banda cu mobilitate maxima de jos) ori de cate ori reactia faciliteaza sinapsa prin

transcriere in cis (compara godeurile 1 cu 3, 3 cu 4, si 7 cu 8, atunci cand reactia nu contine represor LacI

/12RSSr LacI dar are transcriere. Aceasta observatie intareste si mai convingator concluziile privind efectul

stimulator al transcrierii pe RSS-uri orientate in cis deletional descrise la pg 16 si 17 ale acestui raport.

Urmeaza sa caracterizam efectul dinamic al transcrierii exercitat asupra unui RSS reporter pe reactia in trans

si ulterior sa construim plasmidele de transfectie pentru repetarea acestor experimente si evidentierea

efectului de docare al represorului LacI pe cataliza RAG in culture celulare. Experimentele de evidentiere a

recombinarii in trans la nivel celular definitiveaza cel de-al IVlea obiectiv propus in proiect.

CONCLUZII

In aceste 42 luni de activitate am reusit:

a) Sa exprimam si sa purificam in regim constant si de rutina proteine active RAG1, RAG2 and HMGB1/2

din diverse surse reactivi extrem de pretiosi pentru toate studiile recombinarii RAG in vitro.

b) Folosind un assay de ligare facilitata pe substratul IS264 am determinat ca RAG induce activ prin sinapsa

(<5min) acumularea substantiala de produs circular suprarasucit. Generarea acestor produsi de reactie initial

postula dar apoi am putut si demonstra prin studii de FRET ca RAG in timpul sinapsei impleteste

plectonemic activ 12si 23RSS-urile indoindu-le si suprarasucindu-le in sinaptozom. Acest efect faciliteaza

dramatic sinapsa in cis experimentele de ligare conducand la o acumulare rapida si eficienta de cercuri

monomerice suprarasucite in timp ce producerea prin sinapsa RAG in trans de multimeri este greu

detectabila.

c) Am investigat si mecanismul prin care clivajul RAG este activat de gradul de suprarasucire la care este

supus substratul sau ADN. Am dezvoltat o metoda noua de clivaj dublu RAG pe topoizomeri. Prin ea am

22

analizat cataliza RAG pe 10 topoizomeri cu lungime restransa ce constrange orientarea de faza elicoidala a

celor doua 12/23RSS-uri. Clivajul este in mod substantial crescut de catre topoizomerii suprarasuciti si

respecta orientarea optima de faza determinata si la sinapsa evidentiata prin ligari.Aceste rezultate

demonstreaza fara echivoc ca suprarasucirea RSS-urilor induce o reducere a barierei de energie de activare

pe care RAG ar trebui sa o invinga in timpul sinapsei prin indoirea RSS-urilor ADN relaxat.De aceea

aceasta stare induce activarea catalizei.

d) Pentru a investiga configuratia RSS-urilor in sinapsa am folosit metodologia FRET si din nevoia de a

depasi un design experimental neproductiv propus innitial. Prin aceasta am investigat configuratiile

12&23RSS in complexul sinaptic RAG si am construit pe baza datelor FRET un model detaliat atat al 12 cat

si al 23-RSS in PC si SC. Configuratia 23-RSS in sinaptozom a fost publicata in luna ianuarie 2013

(Ciubotaru et. al. in Nucleic Acids Research 2013, vol. 41, 2437-54) (3) intr-o revista prestigioasa in

domeniul biologiei moleculare cu factor de impact 8.4. Configuratia 12-RSS atat in sinaptozom cat si in

complexul unic RAG/HMGB1 a fost elucidata prin aceeiasi metodologie de FRET si rezultatele acestei

investigatii au fost publicate in luna ianuarie 2015 la aceeasi revista Nucleic Acids Research (Ciubotaru et.

al. in Nucleic Acids Research 2015, vol43, 917-931)(8). Rezultatele docarii si modelarii molecular-

structurale a configuratiilor 12/23RSS in interiorul sinaptozomului au fost publicate in review in 2014 in

revista Discoveries (7).

e) Am demonstrat atat prin experimente in vivo cat si in vitro faptul ca suprarasucirea indusa de transcriere

poate modula dramatic activitatea RAG atunci cand are loc la promoterii adiacenti RSS-urilor. Rezultatele

noastre subliniaza consistent stimularea clivajului prin RAG la orientarea deletionala in contextul

suprarasucirii negative, si presupune inhibitia severa a sinapsei in cis atunci cand situ-rile 12/23RSS sunt in

configuratia inversionala a aceleiasi suprarasuciri. Aceste rezultate au fost prezentate oral la a 9a Conferinta

de Biomolecular Dynamics Albany 2015 in SUA, iar abstractul acestei prezentari a fost publicat ca o

comunicare scurta in Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 2015, vol33, Sup1, p71(9).

f) Cu ajutorul interactiunii represor LacI-operator ADN, evidentiata in trans, am edificat un sistem de

modulare a ancorarii intermoleculare ADN-ADN pentru indeplinirea obiectivului 4.

g) Am testat modul cum sistemul proiectat de noi LacI represor –operator ADN, dirijeaza cu prevalenta

cataliza de clivare RAG in trans, astfel simuland fenomenologia ce produce in mod patologic translocatiile

cromozomiale in cursul recombinarii V(D)J.

h) Am optimizat conditiile de producere a reactiei de clivaj prin RAG in trans, si aceste conditii au fost

testate ulterior prin reactii de echilibru. Din cuantificarea produsilor de reactie obtinuti estimam o crestere

de cel putin 5 ordine de marime a reactiei in trans atunci cand ea este dirijata prin Lac I versus reactiile

control in absenta sa. Vom reface reactiile in conditii optime(concentratia fiecarui plasmid ADN continand

un RSSr reporter, si a represorului Lac I) in conditii cinetice pentru a caracteriza sistemul complex prin

constantele enzimatice.

23

g) In reactii pilot am testat efectul transcrierii de a competitiona activ la un RSS constitutiv(neflancat de

operatori) cu sistemul de docare in trans, si rezultatele preliminare sustin convingator faptul ca transcrierea

sustine orientarea recombinarii in cis.

References 1)Ciubotaru, M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of recombination signal sequence

configuration in the RAG1/2 synaptic complex. Mol Cell Biol 27, 4745-4758, (2007).

2) Yin, F. F. et al. Structure of the RAG1 nonamer binding domain with DNA reveals a dimer that mediates DNA

synapsis. Nat Struct Mol Biol 16, 499-508, (2009).

3) Ciubotaru, M. Trexler A. J., Spiridon L., Surleac M. D., Rhoades E, ., Petrescu A. J., Schatz D.G. “RAG and

HMGB1 create a large bend in the 23RSS in the V(D)J recombination synaptic complexes. Nucleic Acids Research,

2013,vol 41, 2437-2454

4) Swanson, P. C Fine structure and activity of discrete RAG-HMG complexes on V(D)J recombination signalsMol

Cell Biol 22, 1340-1351, (2002). 5)Zwilling, S. et al. High mobility group protein 2 functionally interacts with the POU domains of octamer transcription factors, EMBO J. 14, 1198-1208, (1995). 6) Dunn, J. J. et al. Targeting bacteriophage T7 RNA polymerase to the mammalian cell nucleus,Gene, vol68,259-266,(1988). 7)Ciubotaru M., Surleac M.D., Musat G. M., Rusu A. M., Ionita E., Albu C. C. Paul " DNA bending in the synaptic complex in V(D)J recombination: turning an ancestral transpososome upside down”, Discoveries, 2(1):e13:1-15, 2359–7232(2014).

8) Ciubotaru M. , Surleac M. D., Metskas L. A., Koo P., Rhoades E., Petrescu A. J., Schatz D.G.” The architecture of the 12RSS in V(D)J recombination signal and synaptic complexes “, Nucleic Acids Research, 2015, vol43, 917-931 9) Ciubotaru M.”V(D)J recombination targeted in cis by transcription induced DNA supercoiling”, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 2015, vol 33, Sup1, p71. DOI: 10.1080/07391102.2015.1032746.