1

Raport ştiinţific sintetic intermediar

privind implementarea proiectului: “Ion sensing and separation through modified cyclic

peptides, cyclodextrins and protein pores”/ “Detecţia şi separarea ionică prin intermediul

peptidelor ciclice, al ciclodextrinelor şi al porilor proteici”, pe toată perioada de execuţie până

în prezent (2012-2014)

În cadrul acestui proiect ne-am propus să proiectăm şi să realizăm unele

nanostructuri capabile să detecteze şi să separe molecule individuale şi ioni, activităţi ce

reprezintă un domeniu actual şi important de cercetare. În acest sens, o atenţie deosebită

este acordată complecşilor formaţi de nanopori proteici şi adaptori moleculari ciclici,

datorită capacităţii lor reglabile de recunoaştere moleculară şi a metodelor facile de

modificare chimică a acestor molecule, factori de importanţă majoră într-o multitudine de

aplicaţii. Obiectivele propuse în acest proiect sunt:

O1: Obiectivele includ managementul contractului (comunicare şi raportare), monitorizarea

calităţii şi sincronizarea rezultatelor proiectului, precum şi managementul cunoştinţelor

acumulate pe parcursul proiectului. Coordonatorul de proiect (CO) va lucra îndeaproape cu

Comitetul ştiinţific (CS) (echipa de coordonatori ştiinţifici), asistat de către Managerul de

Proiect (PM) şi directorul economic (AC):

O2: Proiectarea, sintetiza şi analiza structurală a diferitelor tipuri de compuşi organici

macrociclici (I) şi peptide ciclice (II) ca posibile sisteme gazdă pentru fixarea în porii proteici de

α-HL sau pentru depunerea pe diferite suprafeţe polimerice: de Au şi S i:

O3: Testarea sistemelor moleculare inovatoare bazate pe adaptori moleculari reprezentaţi de

peptide ciclice şi compuşi organici macrociclici care pot să detecteze, să separe şi să cuantifice

liganzi specifici, printr-o proiectare raţională a interacţiunilor care au loc în interiorul

lumenului porului proteic de α-HL inserat într-un bistrat lipidic.

O4: Dezvoltarea de noi metode pentru studierea proprietăţilor membranare şi a modificărilor

comportamentului celular.

O5: Proiectarea şi caracterizarea SAM-urilor moleculare funcţionalizate pe suprafeţe de Au, Si

şi polimer/sticlă pentru aplicaţii electronice (bio)moleculare.

O6: Testarea suprafeţelor funcţionalizate pentru ataşarea selectivă de celule.

O7: Inţelegerea mecanismelor care stau la baza proprietăţilor de transfer electronic între

biomolecule şi suprafaţă, distribuţia lor de sarcină sau influenţa linker-ului. Fabricarea de

micro-nano-reţele.

2

Consorţiul este format din următorii parteneri:

(CO): Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” din Iaşi, Facultatea de Fizică, Iaşi, România

(P1): Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice şi Moleculare, Cluj

Napoca, România

(P2): Universitatea „Babeş - Bolyai”, Facultatea de Chimie, Cluj-Napoca, România

(P3): Institutul Naţional de Cercetare - Dezvoltare pentru Fizică şi Inginerie Nucleară “Horia

Hulubei” - IFIN-HH, Bucureşti, România

(P4): Universitatea de Medicină şi Farmacie "Carol Davila", Bucureşti, România

Datorită complexităţii acestui proiect, coordonatorul împreună cu partenerii din consorţiu

au realizat, în perioada 11-12 iunie 2014, un workshop satelit în cadrul conferinţei internaţionale

IC-ANMBES 2014, Braşov, România, cu tema: “Current reports on synthetic peptides, metals

and molecular adaptors interaction with protein pores and reconstituted lipid membrane systems”

( http://icanmbes.unitbv.ro/html/satellite_workshop.html).

În cadrul acestei întâlniri fiecare partener şi-a prezentat rezultatele ob ţinute dar şi

provocările întâmpinate pe parcurs. A existat un schimb de opinii critic şi constructiv între toţi

cercetătorii implicaţi în proiect, cu scopul unei mai bune coordonări a activităţilor aferente

fiecărui partener şi a unei coroborări optime a rezultatelor. De asemenea, au existat discuţii

bilaterale continue (chat, mail-uri, telefon), care au asigurat comunicarea eficientă între parteneri

pe toată durata implementării proiectului.

În vederea identificării substanţelor ţintă s-au elaborat structurile macrociclice din

schemele 1-3. Design-ul compuşilor macrociclici a ţinut cont de dimensiunile porului -HL, de

cerinţele de rigiditate ale structurilor macrociclice, de prezenţa grupărilor care pot fixa

macrociclurile în por şi de facilităţile necesare unor funcţionalizări ulterioare ale acestor derivaţi

macrociclici.

Un prim set de structuri elaborate este prezentat în schemele 1-3.

Schema 1. Macrocicluri ţintă cu unităţi naftodiimidă.

3

Schema 2. Macrocicluri ţintă cu unităţi fenotiazinice.

Schema 3. Macrocicluri ţintă cu unităţi dibenzopirolice sau triazinice.

Compuşii din schema 1 sunt dimeri şi conţin unităţi naftodimidice. Retrosinteza este

prezentată în schema 4.

Schema 4. Compusul A poate fi obţinut din naftodimidă prin bromurare; naftodimida şi compuşii de

tipurile B şi C sunt comerciali.

4

Metoda de sinteză se bazează pe transformarea lui A în podand şi apoi o reacţie în 2 etape

care să conducă prioritar la obţinerea macrociclurilor dimere.

Pentru macrociclii din schema 2 s-a elaborat retrosinteza din schema 5.

Compuşi de tipul podanzilor D şi E au fost deja obţinuţi în colectivul nostru, iar metoda

de macrociclizare avută în vedere este în două etape ca şi în cazul macrociclurilor I şi II.

Retrosintezele şi strategiile de sinteză ale derivaţilor V şi VI sunt asemănătoare cu cele

prezentate în schemele 4 şi 5, doar că unităţile aromatice de pornire sunt bis(dibenzopirolice) şi

triazinice monosubstituite.

Derivaţii bitiofenici au fost deja investiga ţi, iar derivaţii monosubstituiţi ai triazinei (o

parte au fost deja sintetizaţi) se obţin din clorura de cianuril conform unor proceduri ce au fost

raportate deja.

Schema 5. Retrosinteza şi strategiile de sinteză ale macrociclurilor din schema 2

Datele de modelare moleculară arată că derivaţii cu fenotiazină şi cu triazină corespund

cerinţelor de fixare în porii -HL. Analiza procedurilor asociate reacţiilor care rezultă din

schemele retrosintetice arată că pentru a ajunge la produşii propuşi iniţial sunt necesare multiple

reacţii care decurg cu randamente moderate. Aceste considerente ne-au determinat să

reconsiderăm aceste structuri pe de o parte şi pe de altă parte să începem investigaţiile pe

compuşi care se pot sintetiza mai uşor şi apoi modelele obţinute să le extindem la structuri mai

mari. Structurile propuse conţin heterociclurile fenotiazină, tiofen şi triazină care au dat rezultate

bune în modelare.

Compuşi macrociclici candidaţi pentru includerea în porii -HL

O primă serie de compuşi macrociclici cu grupări bitiofen au fost sintetizaţi printr-o

metodă clasică pornind de la derivaţi ai bitiofenului decoraţi cu grupări hidroximetil şi

oligoetilenglicoli activaţi (Schema 6).

5

Schema 6. Derivaţi ai bitiofenului decoraţi cu grupări hidroximetil şi oligoetilenglicoli activaţi.

Aceşti compuşi prezintă interes deoarece partea bifenilică poate electropolimeriza

formând un polimer conductor. Această metodă ar fi una extrem de simplă şi de eficientă pentru

a depune macrocicluri pe diverse suprafeţe.

Macrociclurile 3 şi 4 nu au format polimeri stabili, dar compusul 2 (Poly(2)) a format un

astfel de polimer al cărui stabilitate este remarcabilă.

Poly(2) a fost testat pentru a vedea dacă complexează cationi din grupa I. Metoda de

investigare a fost una electrochimică bazată pe voltametria ciclică.

Astfel s-au înregistrat voltamogramele polimerului singur şi apoi pe rând în prezenţa a

câte un cation din grupa I. Cu excep ţia Li+, pentru ceilalţi cationi nu s-au înregistrat modificări

ale voltamogramelor. Pentru Li+ se observă o deplasare remarcabilă a potenţialului de oxidare de

70 mV (Figura 1), astfel încât poly(2) est un candidat important pentru construcţia de senzori

selectivi pentru cationii de litiu.

Figura 1. Votamogramele ciclice ale lui poly(2); linia neagră: în prezenţa soluţiei (0,1 M) de

Bu4NPF6; linia roşie: în prezenţa soluţiei (0,1 M) de LiClO4 (di ferenţa de potenţial de oxidare

70mV).

O a doua serie de compuşi macrociclici s-au obţinut pornind de la derivaţii disubstituiţi ai

fenotiazinei tot în reacţie cu oligoetilenglicoli ditosilaţi (Schema 7).

6

Randamentele reacţiilor sunt corecte 32-57 %, randamentul cel mai mare fiind obţinut

pentru compusul cu cinci unităţi etilenoxid, caz în care există cea mai bună potrivire între

lungimea lanţului şi deschiderea din substrat.

Pentru compusul 7 s-a obţinut şi structura moleculară în stare solidă prin difracţie de raze

X pe monocristal (Figura 2).

Cu aceasta serie de compuşi s-au făcut studii de complexare folosind spectrometrie de

masă în tehnica ESI-MS.

Schema 7. Compuşi macrociclici obţinuţi pornind de la derivaţi disubstituiţi ai fenotiazinei în reac ţie

cu oligoetilenglicoli ditosilaţi.

Figura 2. Structura molecular ă în stare solidă a compusului 7 obţinută prin difracţie de raze X pe

monocristal (reprezentare ORTEP)

S-a urmărit abilitatea acestor macrocicluri (6-8) de a complexa cationi din grupa I.

Probele au fost obţinute prin amestecarea de volume egale din soluţii echimolare (10-5 M) ale

macrociclului investigat şi al amestecului de săruri ale cationilor din grupa I (Li+, Na+, K+, Rb+ şi

Cs+). După injectarea probelor în spectrometru s-au urmărit intensităţile relative ale picurilor

macrociclu-cation. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.

7

Tabelul 1. Rezultatele investigaţiilor ES I-MS realizate cu macrociclurile 6-8.

6 (n=1) 7 (n=2) 8 (n=3)

[M+Li]+ 100% 37% 6%

[M+Na]+ 78% 100% 59%

[M+K]+ 78% 60% 100%

[M+Rb]+ - - -

[M+Cs]+ - - 2%

[2M+K]+ 11% 21% 4%

Se remarcă preferinţa celui mai mic macrociclu (6) pentru cationii de Li+, în timp ce

macrociclurile mai mari (7 şi 8) prezintă preferinţe pentru cationii de Na+ şi K+. Doar cel mai

mare macrociclu complexează slab Cs+, dar pentru toţi macrociclii se observă formarea de specii

sandwich cu cationul de K+.

Alţi compuşi macrociclici cu unităţi fenotiazinice au fost obţinuţi printr-o sinteză

originală bazată pe utilizarea reacţiei de cuplare Suzuki-Miyaura. Această reacţie a fost

utilizată pentru prima dată de noi pentru obţinerea de macrocicluri flexibile. S-au folosit

două strategii în care derivaţii diboronici şi dibromuraţi au fost inversaţi (Schema 8).

Schema 8. Sinteza originală bazată pe utilizarea reac ţiei de cuplare Suzuki-Miyaura.

Analiza structurală a compuşilor a fost efectuată cu ajutorul spectrelor RMN, a spectrelor

de masă şi cu ajutorul unei structuri moleculare în stare solidă obţinută prin difracţie de raze X

(Figura 3). Se observă formarea unui solvat, a unei combinaţii moleculare macrociclu-moleculă

de solvent, în acest caz CH2Cl2.

8

Figura 3. Rezultatele difrac ţiei de raze X pe monocristal în cazul compusului 11: diagrama ORTEP,

reprezentare spacefill şi imagine a reţelei.

Aceeaşi reacţie de tip cross-coupling Suzuki-Miyaura a fost aplicată şi pentru obţinerea

de derivaţi macrociclici ai bi- şi tertiofenului (Schema 9)

Schema 9. Reacţie de tip cross-coupling Suzuki-Miyaura pentru obţinerea de derivaţi macrociclici ai

bi - şi tertiofenului

9

Analiza structurală a compuşilor a fost efectuată cu ajutorul spectrelor RMN, a spectrelor

de masă şi cu ajutorul unei structuri moleculare în stare solidă obţinută prin difracţie de raze X

(Figura 4).

Figura 4. Rezultatele difracţiei de raze X pe monocristal în cazul compusului 13: diagrama ORTEP

şi imagine a reţelei.

În vederea realizării obiectivelor propuse au fost modificate strategiile de sinteză şi au

fost operate modificări ale moleculelor ţintă astfel încât probleme sintetice (randamente foarte

scăzute în etape iniţiale ale sintezelor multietap) sau cele legate de proprietăţile substanţelor

implicate (solubilitate redusă în marea majoritate a solvenţilor) să fie eliminate. În plus prin

aceste modificări s-au introdus grupări capabile să interacţioneze cu porii de -HL. Au fost

sintetizaţi macrociclii cu unităţi fenotiazinice decorate cu funcţiuni carboxil sau nitril la capătul

lanţurilor alchil ataşate la atomul de azot fenotiazinic (Schema 10). Au fost folosite proceduri

elaborate în cadrul acestui proiect şi aceşti macrociclii sunt mai bine adaptaţi pentru a

interacţiona cu porii.

10

Schema 10. Sintetiza macrociclurilor cu unităţi fenotiazinice decorate cu func ţiuni carboxil la capătul

lanţurilor alchil ataşate la atomul de azot fenotiazinic.

Schema 11. Sintetiza macrociclurilor cu unităţi fenotiazinice decorate cu funcţiuni nitril la capătul

lanţurilor alchil ataşate la atomul de azot fenotiazinic

11

Macrociclurile cu unităţi triazinice sunt deosebit de importante deoarece ele au

dimensiuni potrivite pentru a intra în pori şi au o structură aproape plană care convine

experimentelor de incluziune în por şi de selectivitate pentru diverşi cationi.

Reacţiile sunt prezentate în schemele 12 şi 13.

Schema 12

Schema 13

12

Reacţia cheie este desimetrizarea derivatului triazinic, obţinerea compusului 28.

Trimerizarea amestecului de nitrili în raport molar de 2,1/1 (exces de hidroxibenzonitril) conduce

la un amestec de compuşi în care compusul 28 este majoritar. Acesta se separă prin

cromatografie pe coloană. Macrociclizările au fost realizate în condiţii standard cu randamente

acceptabile.

Pentru unul dintre compuşi (31) s-a reuşit (urmează să efectuăm aceste reacţii pe toată

seria) introducerea de grupări fenilformil (33) care permit fixarea macrociclului în pori şi

depunerea pe diverse suprafeţe.

O altă categorie de compuşi care au fost testaţ i pentru porii de -HL au fost peptidele

ciclice.

În cazul peptidelor ciclice, dimensiunea exterioară a macrociclului precum şi

dimensiunea cavităţii interioare, pot fi modulate prin varierea numărului şi a configuraţiei D sau

L a aminoacizilor care intră în structura peptidei ciclice.

Se are în vedere obţinerea de peptide ciclice cu 8-12 aminoacizi, cu un pattern de

configuraţie a aminoacizilor (L,D)n şi respectiv (L,L,L,D)n (A şi B, Schema 14). Alternanţa D,L a

aminoacizilor din structura peptidei ciclice determină o orientare a catenelor laterale a

aminoacizilor înspre exteriorul macrociclului (A, Schema 14). În cazul peptidelor cu alternanţa

(L,L,L,D)n catena laterală a fiecărui al patrulea aminoacid este orientată înspre interiorul cavităţii

(B, Schema 14), asigurând astfel selectivitatea pentru diferiţi analiţi. De asemenea, în vederea

creşterii afinităţii peptidelor ciclice faţă de analiţii utilizaţi, s-a realizat design-ul şi s-a elaborat

strategia de sinteză pentru obţinerea de noi criptanzi care conţin în moleculă două macrocicluri

polipeptidice (C, Schema 14).

Fixarea peptidelor macrociclice în porul -HL este asigurată prin introducerea în

structura acestora a unor L-aminoacizi care conţin în catena laterală (orientată înspre exteriorul

macrociclului) grupări funcţionale complementare cu grupările funcţionale ale porului proteic

(ex. acid aspartic, acid glutamic, lisina, arginina, cisteina, triptofan). Selectivitatea pentru diferiţi

analiţi este determinată pe de o parte de dimensiunea macrociclului şi pe de altă parte de natura

grupărilor funcţionale grefate pe catenele laterale a aminoacizilor orientate înspre interiorul

cavităţii. S-au avut în vedere în aceste poziţii: serina, cisteina, histidina precum şi aminoacizi

decoraţi cu diferite grupări funcţionale (ex. NTA -acid nitrilotriacetic, piridina, etc).

Peptidele au fost obţinute prin strategia Fmoc de sinteză de peptide pe suport solid

(SPPS) (Schema 15). Aceste peptide conţin în secvenţă 8 sau 12 aminoacizi cu configuraţie L-

sau D-, dispuşi altenativ şi prezintă în poziţii simetrice aminoacizi cu grupări funcţionale pe

catena laterală care vor fi folosite în etapa de ciclizare a criptanzilor. Aminoacizii folosiţi au fost

aminoacizi α-N-Fmoc protejaţi. Aceştia au avut gruparea α-carboxilică liberă, iar grupările

funcţionale de pe catenele laterale care ar fi putut reac ţiona cu reactivii folosiţi pentru sinteză au

fost de asemenea protejate.

13

Schema 14. Design-ul peptidelor macrociclice A, B si C.

Sinteza s-a realizat pe suport polimeric solid (răşină Rink Amide), utilizându-se DMF ca

solvent. Cuplajele peptidice s-au realizat în prezenţă de DIPEA pentru a asigura bazicitatea

mediului de reacţie şi folosind următorii agenţi de cuplaj: HBTU şi HOBt pentru elongarea

peptidei şi HATU pentru etapa de ciclizare. Deprotecţia grupării Fmoc s-a realizat cu piperidină.

Primul aminoacid (Fmoc-Asp-ODmab) a fost legat pe răşină prin gruparea carboxil de pe catena

laterală în condiţii standard de SPPS. Acest aminoacid prezintă particularitatea de a fi protejat pe

gruparea α-carboxil cu o gruparea protectoare ortogonală (grupare care nu reacţionează cu

reactivii implicaţi în sinteză şi poate fi deprotejată selectiv). A urmat înlăturarea Fmoc de pe

primul aminoacid cu piperidină şi cuplarea celui de-al doilea.

Alungirea peptidei s-a realizat printr-un proces repetat de cuplare - deprotecţie a grupării

α-NH2 a aminoacizilor în secvenţa dorită. După obţinerea precursorilor peptidici liniari s-a

deprotejat selectiv gruparea α-carboxilică a primului aminoacid în prezenţă de hidrat de

hidrazină şi s-a realizat ciclizarea pe răşină prin formarea unei legături amidice între capătul C-

terminal (gruparea α-carboxil a primului aminoacid) şi capătul N-terminal (gruparea α-amino a

ultimului aminoacid) al peptidei. Peptida ciclică a fost tăiată de pe ră şină în prezenţă de TFA

95%, proces în cadrul căruia au fost îndepărtate toate celelalte grupări protectoare de pe catenele

laterale ale aminoacizilor din secvenţă.

Peptidele ciclice au fost analizate prin RP-HPLC-MS, purificate prin RP-HPLC

preparativ şi caracterizate prin ES(+)-HRMS.

14

- suport polimeric - grupare protectoare pentru -NH2

- grupare protectoare ortogonală pentru gruparea -COOH a primului aminoacid

- grupări protectoare pentru funcţiunile de pe catenele laterale

Schema 15. Sinteză de peptide ciclice pe suport solid prin strategia Fmoc

15

Sinteza unei dodecapeptide funcţionalizată cu grupări etinil

Schema 16. Structura peptidei ciclice I

Peptida ciclică I conţine 12 aminoacizi şi a fost sintetizată prin strategia Fmoc de sinteză

de peptide pe suport solid conform procedeului descris mai sus. Aminoacizii folosiţi sunt Fmoc-

Asp-ODmab (aminoacid protejat ortogonal folosit în poziţia 1 a secvenţei), Fmoc-D-Ala-OH

(poziţiile 2, 4, 6, 8, 10, 12), Fmoc-His(Trt)-OH (poziţiile 3, 7, 9) şi compusul cupoziţiile 5, 11. În

urma tăierii de pe răşină, gruparea funcţională de pe catena laterală a primului aminoacid este o

grupare amidică, acesta devenind un reziduu de asparagină. D-alanina a fost inclusă în secvenţa

peptidică pentru a asigura alternanţa D, L a aminoacizilor, element configuraţional ce determină

orientarea catenelor laterale înspre exteriorul ciclului.

Sinteza unei octapeptide funcţionalizată cu grupări amino

Peptida ciclică II conţine 8 aminoacizi şi a fost sintetizată prin strategia Fmoc de sinteză

de peptide pe suport solid (Schema 17). Aminoacizii folosiţi sunt Fmoc-Asp-ODmab (aminoacid

protejat ortogonal folosit în poziţia 1 a secvenţei), Fmoc-D-Ala-OH (poziţiile 2, 4, 6, 8) , Fmoc-

Lys(Boc)-OH (poziţiile 3, 7) şi Fmoc-Asn(Trt)-OH (poziţia 5). În urma tăierii de pe răşină,

gruparea funcţională de pe catena laterală a primului aminoacid este o grupare amidică, acesta

devenind un reziduu de asparagină. Secvenţa de aminoacizi este una simetrică, caracteristică care

scade numărului de izomeri ce se pot forma în urma ciclizării criptanzilor.

16

Schema 17. Structura peptidei ciclice II

Aminoacidul funcţionalizat pe catena laterală cu grupare etinil, 34, a fost sintetizat în 2

etape, pornind de la L-acid aspartic protejat N-Fmoc şi α-C-tBu (Fmoc-Asp-OtBu), aminoacid

disponibil comercial (Schema 18). Utilizarea acestui derivat a permis funcţionalizarea selectivă a

grupării carboxil de pe catena laterală. Deprotecţia grupării tBu duce la obţinerea unui compus ce

poate fi utilizat în SPPS (sinteză de peptide pe suport solid).

Schema 18. Ruta sintetică pentru obţinerea aminoacidului funcţionalizat cu grupare etinil.

Prima etapă a fost introducerea grupării etinil pe catena laterală printr-o reacţie de cuplare

amidică a aminoacidului (Fmoc-Asp-OtBu) cu propargilamină. Aminoacidul a reacţionat prin

gruparea carboxil de pe catena laterală. Reacţia s-a desfăşurat în mediu bazic asigurat prin

adăugare de DIPEA (diizopropilamină), în prezenţa agenţilor de cuplaj HBTU şi HOBt.

Cea de-a doua etapă a sintezei a fost deprotecţia esterului terţ-butilic din poziţia α a

aminoacidului. Reacţia s-a realizat cu acid triflouracetic. Sinteza criptandului va fi realizata în

viitorul apropiat.

17

Depunerea de compuşi cu abilităţi de a prinde specii invitate pe diverse suprafeţe

Suprafeţele luate în considerare (III) sunt decorate cu grupări amino. Se au în vedere

două funcţionalizări: una cu un macrociclu decorat cu un bra ţ pendant cu grupare carboxil (35) şi

obţinerea unei suprafeţe decorate cu azaoxamacrocicluri (IV, schema 19) şi alta prin care în

reacţie cu cicloctina 36 să se ajungă la o suprafaţă decorată cu legături triple reactive (V) care să

dea prin reacţie click cu o azidă terpiridinică (37) suprafeţe decorate cu unităţi terpiridinice (VI,

schema 20).

Aceste suprafeţe cu terpiridine pot fi decorate în continuare în prezenţă de terpiridine

funcţionalizate şi un cation care să complexeze terpiridinele.

Schema 19. Obţinerea unei suprafe ţe decorate cu azaoxamacrocicluri.

Schema 20. Suprafeţe decorate cu unităţi terpiridinice.

18

Macrociclul 35 decorat cu un braţ pendant cu grupare carboxi a fost ob ţinut prin

succesiunea de reacţii din schema 21 pornind de la azaoxamacrociclul nesubstituit care este

comercial.

Schema 21

Derivatul terpiridinic decorat cu grupare azidă (37) a fost obţinut prin succesiunea de

reacţii arătată în schema 22.

Schema 22

Pentru a decora diverse suprafe ţe se au în vedere şi derivaţi ai nucleobazelor care prezintă

grupări de tip azidă şi care astfel prin reacţie "click" pot interacţiona cu suprafeţe decorate cu

triple legături terminale.

Nucleobazele decorate cu grupări azido au fost obţinute conform schemelor 23 şi 24.

19

Schema 23

Schema 24

Reacţiile cu tripodanzi sunt prezentate în schemele 25 şi 26:

Schema 25

20

Schema 26

Abilităţile de complexare ale acestor tripodanzi au fost investigate prin tehnici complexe

ESI-MS.

Asamblarea controlată, bazată pe un design riguros, a moleculelor organice

funcţionalizate se constituie din ce în ce mai mult ca o tehnică de bază în dezvoltarea

materialelor moleculare nanostructurate. Aplicaţiile sunt deosebit de ample în domenii dintre

cele cu cel mai rapid progres tehnologic: nano- şi bio-tehnologiile, biomimetică, chimia

supramoleculară, nano-medicină, biologia moleculară etc. Structura şi proprietăţile acestor

sisteme autoasamblate se bazează pe diferite tipuri de interacţiuni intermoleculare cum ar fi:

legături de hidrogen, forţe slabe Van der Waals (VdW), interacţiuni electrostatice în sisteme cu

transfer de sarcină.

Un rol important îl are compatibilitatea substrat-sisteme moleculare. Două tipuri de

substraturi au fost alese, pe bază de aur (Au) şi pe bază de siliciu (Si). Filmele de aur obţinute au

fost testate în ceea ce priveşte posibilitatea fabricării de microstructuri de dimensiuni controlate,

dar şi de a depune molecule prin tehnica de nanolitografie de tipul DipPen (DPN – Dip Pen

Nanolithography). Rezultatele experimentale au fost comple tate de simularea teoretică a

interacţiunii aur-sisteme moleculare, dar şi de testarea a mai multe clase de macrociclii

compatibili cu proteina α-hemolizină privind inserţia membranară şi transportul ionic prin porul

proteinei.

Testarea afinităţii şi a selectivităţii interacţiunii receptor-ligand în mediu lichid

Calorimetria izotermă de titrare

Calorimetria izotermă de titrare (ITC – Isothermal Titration Calorimetry) este una dintre

modalităţile cele mai directe de a caracteriza energetica proceselor de asociere/autoasociere

induse prin intermediul forţelor intermoleculare şi are marele avantaj de a fi singura metodă de

măsurare directă a variatiei entalpiei într-un proces izoterm. Ne-am concentrat pe caracterizarea

proceselor de asociere/disociere a moleculelor mici ce interacţionează pe baza forţelor de tip

21

hidrofil/hidrofob, a mecanismelor de tip „π-stacking”, respectiv a interacţiunilor cation – orbital

π. In investigatiile noastre au fost utilizate diferite combinaţii moleculare de tip oaspete gazdă.

Drept molecule „gazdă” au fost utilizate macrociclii conţinând lanţuri de tip eter-coroană de

diferite lungimi. Spre exemplificare, prezentăm 2 structuri moleculare reprezentative având cea

mai mare, respectiv cea mai mică cavitate (Figura 5):

BDBTU40C6

Bis(3,9-dibenzo-2,4,8,10 tetraoxo

[5.5] undecan)-40-crown-6.

O

O

O

O

O

O O

O

BBDC32C6

Bis(2-benzo-1,3dioxane)cyclohexano-

32-crown-6

Figura 5. Structuri moleculare reprezentative pentru experimentele de ITC efectuate

Cavitatea internă accesibilă cationilor diferă de la un macrociclu la altul atât în ceea ce

priveşte constrângerile spaţiale cât şi din perspectiva densităţii de sarcină din zona cavităţii. În

acest sens există evidenţe solide că în cavităţile interioare se acumulează cu preponderenţă

sarcinile negative iar înspre exterior cele pozitive. Au fost injectate serii de 20, 40 respectiv 60

de injecţii de soluţie de triflat de K în reactorul calorimetrului ce conţine soluţia de macrociclu.

Soluţiile au fost preparate în amestec de acetonitril:cloroform (2:1). Am folosit acest

amestec de solvenţi pentru a asigura o bună solubilitate atât pentru triflatul de potasiu cât şi

pentru macrociclii organici. Fiecare injecţie este urmată de un peak de compensare a căldurii

produse (sau absorbite atunci când este cazul) care prin integrare oferă valoarea caldurii de

reacţie.Interacţia dintre ionii de potasiu şi cei doi macrociclii are caracter exoterm în ambele

cazuri. Macrociclul BDBTU40C6 prezintă afinitate scăzută faţă de ionul de potasiu şi metoda

ITC nu este capabilă de a obţine parametri termodinamici. Figura 6 prezintă curbele de titrare

reprezentative pentru macrociclul BDBDC32C6 cu triflat de K.

(a) (b)

Figura 6. Titrarea macrociclului BDBDC32C6 cu triflat de K.

O

O

O

O

O

O

O

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

O

0 2000 4000 6000 8000 10000

-40

-30

-20

-10

0

Pu

tere

ca

lorica

(W

)

Timp (s)

a)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

-2.2

-2.0

-1.8

-1.6

-1.4

-1.2

-1.0

-0.8

Q(k

Ca

l/mo

l)

Ratie molara

b)

22

Din termograma (a) se poate observa că amplitudinea peak-urilor este de aproximativ 10

ori mai mare decât în cazul macrociclului BDBTU40C6. Dependenţa căldurii eliberate per

injecţie de raportul molar al partenerilor de reacţie este prezentată în Figura 6 (b). Linia continuă

corespunde celei mai bune curbe de fitare. Din nefericire varia ţia lentă a căldurii cu fracţia

molară a celor doi parteneri de reacţie are drept consecinţă o importanta marjă de imprecizie

privitoare la valorile parametrilor de fit. Cel mai afectat parametru este cel referitor la

stoichiometrie. Există cel puţin trei situaţii cu stoichiometrii diferite care conduc la parametrii

termodinamici diferiţi. În astfel de cazuri procedura de fitare nu este suficientă pentru o selectare

exhaustivă a modelului de interacţie fiind necesare investigaăii prin metode complementare.

Experimentele de titrare calorimetrică au fost analizate în termeni de stochiometrie 1:1,

3:2 respectiv 2:1. În Tabelul 2 sunt prezentaţi parametrii termodinamici obţinuţi prin ITC în

urma complexării ionului de potasiu de către macrociclul BDBDC32C6.

Tabelul 2

În urma datelor obţinute am propus următoarele structuri potenţiale ale complecşilor

(Figura 7).

O

O

O

O

O

OO

O

O O

K+

n=1

OO

OO

OOOOOO

O

OO

O

O O O O O O

K+

K+

K+

n=1.5

O

O

O

O

O

OO

O

O O

K+

K+

n=2

Figura 7. Potenţiale structuri ale complecşilor

Cea mai stabilă structură (ΔG = -2.37 Kcal/mol) este cea corespunzătoare complexului

obţinut prin legarea a doi ioni de K la macrociclu. Pe de altă parte, în cazul stoichiometriei 2:1

variaţia de entalpie este relativ mică. În consecinţă, rezultatele obţinute sugerează o contribuţie

K (M-1) ΔH (Kcal) ΔG (Kcal) TΔS (Kcal) Adj. R-Square

n = 1 42.5 - 18.7 - 2.21 - 16.49 0.85027

n = 1.5 48 - 12 - 2.30 - 9.7 0.98969

n = 2 55.62 - 8.46 - 2.37 - 6.09 0.99012

23

importantă a entropiei care de asemenea prezintă o scădere uşoară în timpul procesului de

asociere.

O a doua structură propusă este cea de tip sandwich cu stoichiometrie de 3:2. Într-o astfel

de arhitectură supramoleculară trei ioni de potasiu sunt capturaţi între doi macrocicli într-un

complex macromolecular coordinat.

A treia structură propusă este cea obtinuţă în cazul stoichiometriei de 1:1. Procesul de

complexare este oarecum similar cu cazul 18-crown-6 coronand dar cu afinitate mult mai mică.

Această scădere semnificativă a randamentului de legare poate fi atribuită diferenţei dintre

dimensiunile geometrice ale cavităţii macrociclului şi raza cationului de potasiu. În plus,

flexibilitatea lanţului polietilenic este limitată de rigiditatea unităţilor spiro-dioxan.

Spectroscopia de rezonanţă a plasmonilor de suprafaţă

Monitorizarea în timp real a proceselor de recunoaştere moleculară

În vederea măsurării interacţiunilor rezultate între biomolecule precum şi urmărirea

întregului proces de interacţiune creat (detecţia în timp real) s-a utilizat metoda bazată pe

măsurarea fenomenelor de rezonanţă a plasmonilor de suprafaţă (surface plasmon resonance,

SPR). Scopul acestor experimente a fost de a pune în evidenţă interacţiunile dintre moleculele

implicate în procesul de funcţionalizare al senzorului de aur, precum şi abilitatea acestuia de a

detecta ioni din soluţie. Ca molecule test s-au utilizat: cisteamina, ciclooctina, terpiridina-azida si

perclorid de fier(III), cu scopul detecţiei de ioni de fier din soluţie, ca urmare a formării

complexului bi-terpiridină-Fe(III).

În timpul măsurătorilor, moleculele care interacţionează, corespunzător selectate, sunt

fixate pe o placuţă de aur în timp ce moleculele pereche, care interacţionează cu acestea, circulă

deasupra lor. Interacţiunile rezultate deasupra suprafe ţei de aur iluminate pe partea opusă cu

lumină monocromatică influenţează intensitatea fasciculelor de lumină reflectate la unghiuri

diferite. Suprafaţa de aur a fost funcţionalizată cu molecule de cisteamină (CIS), cu rol de ligand

pentru suprafaţa de aur datorită grupării tiol, care permite formarea legăturii covalente Au-S.

Experimentul se iniţiază prin injectarea a 100 μl de etanol : apă (50%) în fiecare canal al

sistemului SPR şi se înregistrează scanarea angulară a curbei de rezonanţă SPR, conform Figurii

8. Se determină astfel unghiul de rezonanţă al experimentului, şi anume 67.950.

În Figura 9 este prezentată senzograma experimentului total SPR, care constă din 8 etape

succesive A – H. Spălarea cu etanol se aplică dupa fiecare etapă de reacţie între compuşii

implicaţi, pentru îndepărtarea moleculelor nelegate.

24

Figura 8. Scanarea angulară a curbei de rezonanţă SPR. Figura 9. Senzograma experimentului total SPR.

Funcţionalizarea senzorului de aur cu moleculele selectate este reprezentată schematic în

Figura 10, observându-se interacţiunile care au loc între acestea (etapa A, C, E si G).

Aur

O ON

O

O

O

N

N

N

N3 Fe(ClO4)3 . xH2O

S

NH2

monostrat deCisteamina (CIS)

Ciclooctina (OCT)

S

NH

O

Terpiridina - Azida (T - A)

S

NH

O

N NN

S

NH

O

N NN

N

N N

Fe

S

NH

O

N NN

N

N NFe

N

NN

N3

Etapa C

Etapa A

Etapa E Etapa G

Figura 10. Funcţionalizarea substratului de aur cu moleculele selectate.

Etapa A constă în injectarea soluţiei de Ciclooctină (3 mM / DMSO : EtOH : H2O = 1 : 1

: 2). Astfel are loc legarea covalentă între grupările funcţionale terminale: amino libere (NH2) ale

CIS şi carboxilice protejate (prin gruparea succinimidil ester - NHS) ale OCT. Se continuă apoi

cu Etapa B de spălare cu etanol. Datorită legăturii covalente nou formate între CIS şi OCT, se

observă creşterea semnalului senzogramei SPR cu patru unităţi. În Etapa C se introduce soluţia

de compus Terpiridină - Azidă (T - A) (3 mM / DMSO : EtOH = 1 : 1), având loc reacţia click, în

25

absenţa de cupru, între OCT şi azida -N3 cu formare de ciclu triazolic (cicloadiţia Huisgen). După

Etapa D despălare cu etanol, semnalul senzogramei a crescut cu cinci unităţi. Etapa E presupune

injectarea unei soluţii de perclorid de fier (EtOH : H2O = 1 :1) cu formarea in situ a complexului

între Fe(III) şi gruparea terminală Terpiridinină din molecula T – A. În urma Etapei F de spălare

cu alcool, în senzograma SPR semnalul creşte doar cu două unităţi. În ultima Etapă de reacţie G,

se injectează din nou o soluţie de Terpiridină – Azidă, ducând la formarea complexului bi-

terpiridină cu ionii Fe(III) introduşi în etapa precedentă. În final, după Etapa H de spălare se

observă creşterea semnalului cu două unităţi.

Optimizarea şi caracterizarea structurală a compuşilor prin metode chimice şi/sau

teoretice

Un alt obiectiv a constat în testarea câtorva clase de compuşi pe bază de macrociclii

(MC) organici şi polipeptide ciclice (PPC), cu scopul găsirii structurilor energetice optime pentru

inserţia lor în interiorul proteinei α-hemolizină. Pentru a determina structura de echilibru a

sistemelor moleculare studiate s-a folosit programul DFTB+ bazată pe teoria „density functional-

based tight binding method” combinată cu tehnica „self-consistent charge technique” (SCC-

DFTB).

Macrocicli organici

Optimizarea energetică a structurii spaţiale

Macrociclii aleşi au dimensiuni comparabile cu diametrul porului şi conţin fragmente

moleculare speciale conferind o funcţionalitate specifică acestor macrocicluri. Pentru toate

structurile a fost optimizată energetic structura spaţială şi a fost estimată diferenţa de energie

dintre structura relaxată şi cea ipotetic plană. Structurile spaţiale ale macrociclilor sunt prezentate

în Figura 11.

O caracteristică a acestor macrociclii este că diferitele fragmente aromatice sunt închise

cu fragmente de etilenoxid de lungimi diferite (n=1,2). În cazul structurii MC1, fragmentele

aromatice de tip 1,4,5,8-naftalenetetracarboxdiimidă prezintă o puternică atracţie între ele cât şi

cu fragmentele de benzol. Situaţie asemănătoare observăm şi în cazul structurii MC2, cu excepţia

că în cazul când lanţul de etilenoxid conţine 2 unităţi, forma plan-paralelă nu se mai formează.

Dacă gruparea aromatică acoperă o porţiune relativă mare din lungimea ciclului, ciclul va avea o

rigiditate mare. Dacă unitatea etilenoxid este mai lungă, diferite fragmente aromatice au o

posibilitate mai mare de a sta rotit faţă de planul iniţia l a macrociclului. Energiile

conformaţionale sunt prezentate în Tabelul 3.

26

MC1n=0 MC1n=1

MC2n=0 MC2n=1

MC3n=0

MC3n=1

MC4n=0

MC4n=1 MC5

MC6

MC7

Figura 11. Structurile geometrice optimizate ale macrociclilor investigaţi.

Tabelul 3

Geom. Energie

(kcal/mol) Geom.

Energie

(kcal/mol)

MC1n=0 -58.7 MC1n=1 -55.5

MC2n=0 -40.3 MC2n=1 -45.8

MC3n=0 -19.4 MC3n=1 -47.9

MC4n=0 -24.7 MC4n=1 -35.8

MC5 -34.4 MC6 -44.5

MC7 -53.6

27

De asemenea, au fost testate şi macrocicluri formate din diferite fragmente aromatice

rigide închise cu fragmente flexibile de polietilen glicol (PEG) de diferite lungimi (n=1,2,3)

(Figura 12).

MC1a

MC1b

MC2a

MC2b

MC3a

MC3b

Figura 12. Structurile geometrice ale macrociclurilor studiate.

În cazul structurii MC1 s-au obţinut două structuri stabile energetic. Pentru prima

structură (MC1) părţile rigide stau plan-paralel dar diametral opuse (MC1a), iar pentru cealaltă

configuraţie obţinem o structură pliată unde structurile rigide ale inelelor aromatice stau aproape

unul de celalalt (MC1b). Diferenţa de energie este numai de 10.04 kcal/mol în favoarea structurii

MC1b. Această diferenţă nu este foarte semnificativă şi ca atare prezenţa solventului poate sa

distrugă această configuraţie împăturită. Situaţie asemănătoare observăm şi în cazul structurii

MC2, cu diferenţa că în prima configuraţie (MC2a) planurile inelelor aromatice sunt

perpendiculare. În cazul configuraţiei pliate structura seamănă foarte mult cu cazul MC1b.

Diferenţa energetică este de 8.75 kcal/mol tot în favoarea structurii pliate (MC2b). Pentru a treia

structură, structura centrală este un inel aromatic cu trei atom de N (triazină) de care se leagă alte

trei inele benzenice. Fragmentele aromatice sunt legate cu un lanţ flexibil de polietile n glicol

(PEG) cu trei unităţi repetitive. În acest caz pentru prima conformaţie (MC3a) macrociclul a

păstrat o parte din planaritatea iniţială, iar la cea a doua configuraţie (MC3b) s-a obţinut o

structură cu grupările aromatice apropiate, dar ele nu se suprapun aşa de bine ca în cazurile

28

precedente. Distanţa interplanară este de 3.3 – 3.4 Å, iar diferenţa energetică de 8.09 kcal/mol tot

în favoarea structurii pliate (MC3b).

A treia clasă de macrociclii testaţi au fost cei pe bază de ditiofenfenotiazină (Figura 13).

Figura 13. Structurile geometrice a macrocililor pe bază de di tiofenfenotiazină.

Primele două macrocicluri sunt construite pe baza fragmentelor ditiofenfenotiazină unde

în primul caz două module de ditiofenfenotiazină sunt legate între ele de două lanţuri mai scurte

de dimetileter, iar în al doilea caz ele sunt legate direct între ele. În primul caz, macrociclul tinde

să ia o formă semiplanară, iar în cazul al doilea observăm o formă de pâlnie cu atomi de S

orientaţi spre aceeaşi direcţie.

Pentru primul macrociclu distanţa cea mai scurtă între atomii de S este de 6.52 Å, iar cea

mai lungă este de 11.23 Å.

Pentru macrociclul numărul doi distanţele sunt de 8.52 Å, respectiv 9.93 Å. În cazul al

treilea s-a ales pentru construirea macrociclului numai componente aromatice, iar geometria

optimizată arată o formă de şa care în cazul absorbţiei pe o suprafaţă metalică poate să se

transforme în formă planară. Distanţa medie între atomii de sulf este de 9.80 Å.

Pentru a fi capabili să capturăm metale în interiorul macrociclurilor cavitatea interioară a

sa trebuie să aibă dimensiunea volumului van der Waals a atomului de metal. De aceea, au fost

construiţi noi structuri de macrociclii de dimensiune mai mică având ca componente trei sau

patru unităţi de etilmetiletertiofen (Figura 14).

Macrociclul cu trei unităţi arată o simetrie de rotaţie de tip C3 cu atomii de S orientaţi în

aceeaşi direcţie care în cazul absorbţiei pe suprafaţă se pot aşeza foarte uşor pe suprafaţă.

Distanţa medie Na-O este de 2.75 Å, iar cea de S-S este de 6.56 Å. Macrociclul cu patru unităţi

nu mai are o formă simetrică, iar complexarea cu metalul de Na generează o structură

distorsionată care greu se poate absorbi pe o suprafaţă de aur.

MC1

MC2

MC3

29

Din analizele teoretice se poate concluziona că macrociclii MC2, respectiv cel cu trei

unităţi de etilmetiletertiofen sunt cei mai potriviţi pentru absorbţia autoasamblată pe o suprafaţă

de aur netedă (de tipul 111).

Figura 14. Structurile geometrice ale macrocililor pe bază etilmetiletertiofen.

Polipeptide ciclice

Optimizarea energetică a structurii spaţiale

O altă clasă de molecule studiate este clasa polipeptidelor ciclice (PPC) unde aminoacizi

cu chiralitate stânga şi dreapta apar alternativ în secvenţă. S-au ales diferite forme de aminoacizi

unde atomii din lanţul primar au chiralitatea deja menţionată, dar lanţul secundar conţine diferite

structuri moleculare specifice diferitelor tipuri de aminoacizi: aminoacizi încărcaţi cu sarcină –

lisină (PPC3) şi acidul aspartic (PPC4); aminoacizi polari – asparagină (PPC5); aminoacizi

aromatici – triptofan (PPC6). Geometria structurii spaţiale a polipeptidelor ciclice optimizate în

condiţii de vid sunt prezentate în Figura 15.

30

După cum rezultă din imaginile de mai jos, structura ciclică a polipetidelor nu se

distorsionează semnificativ, iar structura grupărilor funcţionale ale aminoacizilor sunt orientate

spre partea exterioară a ciclului peptidic. Se pot întâmpla cazuri când o grupare funcţională se

leagă prin legătură internă de H sau forţe slabe de tip van der Waals cu alte grupări de pe ciclul

peptidic.

PPC1 PPC2

PPC3 PPC4

PPC5 PPC6

Figura 15. Polipeptidele ciclice optimizate.

31

Pe suprafaţa exterioară a porului proteic de α-HL se găsesc un număr de aminoacizi

(Trp187, Prol190, Val191, Arg200, Met204, Trp260) care au ca rol stabilizarea porului inserat

în membrana lipidică. Pentru a testa şi investiga importanţa interacţiunilor manifestate între

aminoacizii triptofan şi bistratul fosfolipidic ce “acomodează” proteina, am considerat un model

simplificat al unor peptide cationice cu structură secundară de α-helix, active la nivelul

membranei, special proiectate pentru studiul rolului aminoacizilor triptofan în ancorarea unor

molecule la interfaţa membranei lipidice. Rezultatele obţinute au evidenţiat faptul că poziţia

aminoacizilor triptofan prezenţi în structura primară a peptidelor şi proteinelor, împreună cu

orientarea lor spaţială, deţin un rol esenţial în procesul de asociere şi de acomodare membranară

a acestor molecule, triptofanii putând acţiona ca puncte de ancorare ce favorizează interacţiunea

cu bistratul lipidic şi măresc stabilitatea acestei interacţiuni (I. Schiopu, L. Mereuta, A. Apetrei,

Y. Park, K.-S. Hahm, T. Luchian, 2012, Molecular BioSystems 8, 2860-2863). Astfel, numărul

de triptofani din structura primară, poziţia acestora în succesiunea de aminoacizi şi orientarea lor

spaţială influenţează numărul de puncte de ancorare, şi prin aceasta energia liberă de interacţiune

dintre moleculele de interes şi miezul hidrofob al membranei lipidice, modulând astfel

capacitatea de adsorbţie, inserţie şi formare a porilor de către peptide şi proteine membranar

active.

Au fost propuse şi sintetizate trei peptide scurte foarte asemănătoare, cu acelaşi număr de

aminoacizi în structura primară, aceeaşi sarcină electrică netă (+6), aproximativ aceeaşi

hidrofobicitate (-0.27 pe scala Eisenberg), dar cu număr diferit de aminoacizi aromatici,

respectiv cu poziţii şi orientări diferite ale acestora: Pep1 (LKRLQKLLSKIWNKW-NH2), Pep2

(FKRWQKLLSKIWWKN-NH2), respectiv Pep3 (LKRLQKLLSKIWWKN-NH2).

Experimentele de deplasare a maximului de emisie a triptofanului au permis calculul

energiei libere de adsorbţie a peptidelor la interfaţa membrană lipidică-mediu apos (atât cel

experimental cât şi cel teoretic), care indică un cost energetic mai scăzut în cazul peptidei Pep2,

tocmai datorită prezenţei a cel puţin două puncte de ‘ancorare’ în membrana lipidică, la ambele

capete ale peptidei (F1, W4 şi W12 sau W13). Experimentele de eliberare a calceinei din

lipozomi au revelat un procentaj mai ridicat de eliberare a fluoroforului în cazul peptidei Pep1 ce

prezintă două punct de ancorare (W12 şi W15) doar la un capăt al peptidei, celălalt capăt fiind

liber să traverseze miezul hidrofob al membranei şi să adopte o orientare perpendiculară pe

planul membranei în urma inserţiei. În urma experimentelor de electrofiziologie, s-a constatat că

pentru inserţia peptidei Pep2 este necesar un cost energetic adiţional de 0.2 kcal/mol

corespunzător inserţiei celor doi aminoacizi aromatici existenţi suplimentar în structura acesteia

(F1 şi W4) care trebuie să traverseze mediul hidrofob al bistratului pentru a forma pori

transmembranari.

Astfel, aceste rezultate au demonstrat importanţa aminoacizilor triptofan în interacţiunea

peptidelor şi proteinelor cu bistratul lipidic, care acţionează ca o ancoră la interfaţa membranei,

cu rol major în stabilitatea porului proteic de α-HL în membrană: timp de rezidenţă mare, de

ordinul orelor, conductanţă invariabilă în timp, rezistenţă la condiţii extreme ale mediului

32

electrofiziologic (pH, tărie ionică, temperatură), proprietăţi esenţiale utilizării acestor nanopori în

experimentele de detecţie şi separare ionică.

Figura 16. a) Curbe de saturaţie obţinute pentru o concentraţie de peptide de 0.5 µM, în urma

variaţiei concentraţiei de lipide, în cadrul experimentelor bazate pe deplasarea maximului de emisie

fluorescentă a triptofanului la trecerea din mediul polar al soluţiei electrofiziologice în mediul mai

hidrofob de la interfaţa membranei lipidice, ca urmare a ads orbţiei peptidelor. Interacţiunea care

favorizează adsorbţia peptidelor la interfaţă este cea dintre inelul indol al aminoacidului triptofan

(modelat cu verde) şi gruparea colină din capatele pol are ale lipidelor, aşa cum este ilustrat în

panelul (b). Energiile libere de interacţiune corespunzătoare adsorbţiei celor 3 peptide la interfaţa

membranei (obţinute experimental şi teoretic) se regăsesc în tabelul e). c) Rezultate ale studiului

efluxului de calceină înglobată în vezicule unilamelare mici în urma inserţiei peptidelor în membrană

şi a agregării lor sub formă de pori trans membranari, care arată evoluţia în timp real a intensităţii

de emisie a fluoroforului eliberat. d) Rezultate ale experimentelor de electrofiziologie care ilustrază

dependenţa deviaţiei standard a fluctuaţiilor de curent ionic prin porii formaţi de peptide de

di ferenţa de potenţial aplicată.

Metodele de detecţie experimentale care utilizează nanopori proteici se bazează pe

interacţiunea reversibilă dintre ionii sau moleculele de interes şi interiorul porului de α-HL,

modificat cu ajutorul unor adaptori moleculari de tipul peptidelor ciclice modificate sau

ciclodextrine. Pentru a asigura cuplarea optimă dintre aceşti adaptori moleculari şi interiorul

porului proteic, a fost necesară investigarea proprietăţilor structurale şi fizico-chimice ale

suprafeţei interne a canalului ionic format de α-HL, care modulează aceste interacţiuni în funcţie

de condiţiile mediului de reacţie: pH, tărie ionică, temperatură, etc. În acest sens, un obiectiv de

importanţă majoră a fost identificarea acelor aminoacizi care căptuşesc interiorul porului cu rol

esenţial în stabilirea interacţiunilor cu moleculele rezidente în por şi, de asemenea, a grupăr ilor

funcţionale prezente în structura moleculelor de interes care mediază aceste interacţiuni.

Astfel, am funcţionalizat nanoparticule de aur cu grupări 3-mercapto-1-propansulfonat

(MPSA-NP) şi am investigat interacţiunea dintre acestea şi interiorul porului de α-HL.

Dimensiunea MPSA-NP a fost determinată ca fiind 3.0 ± 0.6 nm, accesibilă vestibulului α-HL,

cu diametrul maxim de aproximativ 4.6 nm. Înregistrările de curent ionic la nivel de singură

moleculă au evidenţiat efectul interacţiunilor electrostatice directe dintre grupările sulfonat

33

prezente pe suprafaţa MPSA-NP şi resturile de Lys 147 din zona de constricţie a α-HL asupra

amplitudinii curentului ionic prin por (E. Campos, A. Asandei, C.E. McVey, J.C. Dias, A.S.F.

Oliveira, C.M. Soares, T. Luchian, Y. Astier, 2012, Langmuir 28(44), 15643–15650). În

absenţa unui partener de interacţiune rezident în por, Lys 147 interacţionează electrostatic cu Glu

111. Valoarea pKa pentru Lys 147 din structura proteinei în stare nativă (WT - α-HL) este de

11.7 ± 0.1, iar pentru Glu 111, pKa = 3.2 ± 0.5. Pentru grupările sulfonat de pe suprafaţa MPSA -

NP, pKa = 2.9 ± 0.1. Astfel, la un pH ușor bazic (pH = 8.0), sechestrarea unei MPSA - NP în

vestibulul α-HL a condus la un blocaj parţial al curentului ionic prin por (14-31%), în timp ce la

pH acid (pH = 2.8), blocajul curentului ionic este total (100%), datorită protonării Glu 111 şi a

destabilizării legăturii acestuia cu Lys 147 care, ca urmare, va interacţiona electrostatic cu

grupările sulfonat prezente pe suprafaţa MPSA - NP pătrunsă în vecinătatea zonei de constricţie

a α-HL, acestea fiind încă încărcate negativ la această valoare a pH-ului. Pentru a valida această

ipoteză, a fost introdusă o mutaţie în structura primară a proteinei, înlocuind Glu 111 cu Ala

(E111A), în scopul eliminării interacţiunilor Glu 111 - Lys 147 şi a facilitării interacţiunilor

electrostatice dintre Lys 147 şi grupările sulfonat. Această mutaţie a condus la un blocaj de 100%

al curentului ionic prin nanopor la pH = 2.8 şi de 92% la pH = 8.0, confirmând interacţiunile

electrostatice manifestate între interiorul porului şi suprafaţa MPSA - NP.

Figura 17. a) Model molecular care ilustrează interacţiunea dintre o singură MPSA-NP şi interiorul

porului proteic WT-αHL (secţiune longitudinală, c od PDB 7AHL). Resturile de Glu 111 şi Lys 147

din zona de constricţie sunt evidenţiate în roşu, res pectiv albastru, iar MPSA-NP a fost evidenţiată

printr-un contur de suprafaţă bleu deschis. Înregistrări reprezentative ale curentului ionic mediat de

WT-αHL (b), res pectiv de mutantul E111A (c), în prezenţa a 10 μg/mL MPSA-NP adăugate de partea cis (potenţial zero) a bistratului lipidic, la pH = 2.8, respectiv pH = 8.0. Fluctuaţiile de curent

sunt datorate interacţiunilor reversibile dintre MPSA -NP şi zona de constricţie a α-HL. O, L1, L2,

L3, şi L4 denotă starea “deschis”, respectiv primul, al doilea, al treilea şi al patrulea nivel de blocaj al

curentului ionic prin por atunci când NP interacţionează cu proteina. Diferenţa de potenţial aplicată

membranei a fost ΔV = +80 mV, iar mediul electrofiziologic de o parte şi de cealaltă a membranei

lipidice a fost 2M KCl, menţinut la o valoare a pH-ului de 2.8 cu 5 mM MES, res pectiv pH = 8.0 cu

10 mM HEPES .

Aceste rezultate au condus la înţelegerea importanţei aminoac izilor încărcaţi electric

prezenţi în zona de constricţie a α-HL (Lys 147, Glu 111) în interacţiunea cu grupări sulfonat

prezente pe suprafaţa externă a unor molecule/particule rezidente în por.

34

De asemenea, au conturat o nouă abordare de control al stărilor „închis”/„deschis” ale

porului proteic de α-HL, în funcţie de condiţiile de mediu.

În scopul proiectării sistemelor de detecţie şi separare propuse în cadrul acestui proiect,

este necesară o cunoaştere detaliată a factorilor care guvernează interacţiunea microscopică

dintre macromolecule şi interiorul nanoporului de α-HL, factori ce determină translocarea

acestora de partea cealaltă a porului proteic într-o manieră caracterizată de parametri specifici

(intervalul de timp dintre două evenimente de translocare succesive, timpul de rezidenţă în por al

moleculei de interes, amplitudinea blocajului curentului ionic prin por, fluctuaţii de curent

caracteristice în timpul unui singur eveniment de blocaj, etc.), esenţiali în procesul de detecţie.

Posibilitatea de a modula aceşti parametri într-o manieră controlată reprezintă un element

important pentru îndeplinirea obiectivelor acestui proiect.

Detaliile microscopice ale translocării peptidelor prin nanopori reprezintă factori esenţiali

în înţelegerea transportului prin pori proteici transmembranari şi au importanţă deosebită în

dezvoltarea de noi nano-tehnologii. Până la ora actuală, rezoluţia tehnicilor de investigaţie la

nivel de singură moleculă nu a permis detecţia şi înregistrarea unor etape distincte care să

caracterizeze procesele foarte rapide de translocare.

Utilizând experimente de electrofiziologie în condiţii specifice de pH şi simulări de

dinamică moleculară, am reuşit să încetinim trecerea unor peptide prin porul proteic de α-HL

suficient de mult încât să punem în evidenţă etape intermediare în procesul de translocare

corelate cu zone structurale distincte ale porului, şi am reuşit să controlăm timpul de rezidenţă,

direcţia, succesiunea şi dinamica tranziţiilor spaţio-temporale ale unei singure molecule peptidice

în interacţiune cu porul. Simulările de dinamică moleculară au relevat succesiunea temporală, la

rezoluţie atomică, a conformaţiilor intermediare ale peptidei în procesul de translocare, iar

amplitudinile calculate ale diferitelor microstări de blocaj ale porului şi succesiunea lor

temporală au fost în acord cu semnalul de curent ionic înregistrat experimental (L. Mereuta, M.

Roy, A. Asandei, J.K. Lee, Y. Park, I. Andricioaiei, T. Luchian, 2014, Scientific Reports

(Nature Publishing Group) 4: 3885).

Peptida utilizată în cadrul acestor experimente a fost CAMA P6

(KWKLFKKIGIGKFLQSAKKF-NH2), adăugată în concentraţie de 30 µM de partea trans a

membranei lipidice în care a fost inserat un singur por proteic de α-HL. Sub acţiunea unui câmp

electric generat de diferenţa de potenţial aplicată de o parte şi de alta a membranei lipidice, sunt

înregistrate blocaje reversibile ale curentului ionic prin porul de α-HL generate de pătrunderea

unui singur monomer CAMA P6 în interiorul lumenului proteinei şi care se succed într-o

manieră stocastică.

Aşa cum poate fi observat în figura de mai jos, la pH neutru, interacţiunea dintre peptide

şi interiorul lumenului proteinei (β-barrel) conduce la evenimente de blocaj omogene, pentru

care reducerea în amplitudinea curentului ionic (ΔI B1 = IB1 - IO) este asociată substării de blocaj

35

B1. O vedere detaliată a evenimentelor de blocaj a pus în evidenţă faptul că, pe măsură ce

valoarea pH-ului scade, se poate observa o a doua sub-stare de blocaj, B2, de amplitudine relativă

mai mică (ΔI B2 = IB2 - IO). Zona de β-barrel a proteinei (diametru interior de 2 nm) şi vestibulul

acesteia (diametru interior maxim de 4.6 nm) prezintă dimensiuni şi proprietăţi fizico-chimice şi

topologice distincte. Acest lucru determină înregistrarea unor blocaje de curent ionic distincte în

funcţie de compartimentul în care se găseşte peptida în interiorul porului proteic, în timpul

translocării. Nivelul de blocaj superior (B1) a fost atribuit prezenţei peptidei în lumenul α-HL, cu

structură de β-barrel, pe când nivelul de blocaj inferior (B2, amplitudine relativă mai mică a

blocajului), a fost atribuit prezenţei peptidei în vestibulul proteinei. În urma translocării peptidei

de partea cis a membranei, amplitudinea curentului ionic revine la nivelul iniţial corespunzător

potului liber (O). Această cale de translocare secvenţială a peptidei prin nanopor este confirmată

de simulările de dinamică moleculară realizate la pH neutru.

Figura 18. Secvenţe tipice ale înregistrărilor de curent ionic prin porul de α-HL care arată

interacţiunea reversibilă, la nivel de singură moleculă, dintre peptida CAMA P6 şi porul proteic

imobilizat într-o membrană lipidică planară. Înregistrările au fost efectuate la o diferenţă de

potenţial ΔV = 150 mV, într-o soluţie simetrică de 2M KCl, la o valoare a pH-ului de: pH = 7.1 (a),

pH = 5.1 (b), pH = 4.5 (c), res pectiv pH = 3.3 (d), sub acţiunea a 30 µM peptidă introdusă de partea trans a membranei (potenţialul de comandă). Linia punctată în secţiunea de sus a panelului (a-d)

reprezintă nivelul de curent ionic prin porul liber (O); în secţiunea de jos a panelului (a -d) se pot

observa fluctuaţiile de curent evidenţiate de tranziţia pe nivelurile inferioare B 1 şi B2 care reflectă

blocajele stocastice ale curentului ionic în urma interacţiunii reversibile dintre peptidă şi porul liber

de α-HL. Substările distincte B1 şi B2 sunt evidenţiate în reprezentările „scatter plot” din panelul (e-

h), care arată distribuţia timpilor de rezidenţă ai peptidei în por în funcţie de amplitudinea relativă a

blocajului. Substarea B1 este evidenţiată la pH = 7.1 (e), iar substarea B2 este evidenţiată la o valoare

acidă ale pH-ului, pH = 4.5 (g).

36

Simulările de dinamică moleculară au pus în evidenţă trei conformaţii diferite ale

peptidei. Prima este cea corespunzătoare peptidei libere în soluţie, reprezentată de o conformaţie

aleatoare, eterogenă, răsucită la nivelul celor două glicine succesive (Gly 9 şi Gly 11), separate

de o izoleucină (Ile 10). În por, datorită constrângerilor impuse de zona cu structură de β-barrel,

peptida adoptă o a doua conformaţie răsucită, cu împachetare de tip “hairpin”, stabilizată de

legături de hidrogen intramoleculare, care determină blocajul complet al curentului ionic (nivelul

B1). Cea de a treia conformaţie este una liniară, corespunzătoare trecerii peptidei prin zona de

constricţie a α-HL. După trecerea în vestibul, blocajul parţial al porului proteic dă naştere

nivelului intermediar al curentului ionic (B2).

Aşa cum poate fi observat în figura de mai jos, am constata t că rata de asociere a

procesului de interacţiune dintre peptidă şi porul de α-HL (rateon = 1/ton), scade semnificativ

odată cu scăderea valorii pH-ului. Acest lucru se datorează aminoacizilor încărcaţi de la gura

porului proteic (14 resturi de acid aspartic, Asp 127 şi Asp 128, şi 7 lizine, Lys 131) care, la

valori acide ale pH-ului, determină o încărcare electrică netă pozitivă a zonei prin protonarea

aminoacizilor încărcaţi negativ, şi constituie astfel o barieră electrostatică pentru peptidele

cationice din soluţie.

De asemenea, pentru a elucida mecanismul care determină dependenţa de pH a dinamicii

peptidelor prin porul proteic de α-HL, am determinat timpul de rezidenţă al peptidei în por,

corespunzător celor două substări distincte. Durata evenimente lor de blocaj (toffB2),

corespunzătoare nivelului intermediar B2, creşte odată cu scăderea valorii pH-ului.

Figura 19. a) Dependenţa de pH a ratei de asociere dintre peptidă şi lumenul porului de α-HL

(rataon) determinată cu ajutorul intervalelor de timp dintre două evenimente de blocaj succesive (ton),

distribuite exponenţial. b) dependenţa de pH a ratei de disociere a peptidei din vestibulul proteinei

(rateoffB2), determinată din valoarea medie a timpilor de rezidenţă ai peptidei în vestibul, în

substarea B2 (toffB2). c) fragment dintr-o înregistrare originală de curent ionic, la pH = 5.1, care

evidenţiază intervalele de timp care caracterizează asocierea dintre peptidă şi por (ton), res pectiv

translocarea peptidei de-a lungul vestibulului (toff B2). Peptida a fost adăugată în concentraţie de 30

µM de partea trans a membranei lipidice, iar diferenţa de potenţial aplicată a fost de 150 mV.

37

Analiza statistică a ratelor de translocare a peptidei prin vestibul (rateoffB2 = 1/toffB2) în

funcţie de pH şi de diferenţa de potenţial aplicată de o parte şi de alta a membranei, a revelat

scăderea dramatică a ratei de traversare a zonei vestibulului odată cu scăderea pH-ului, sugerând

faptul că dinamica şi mecanismul de translocare al moleculelor prin porul proteic de α-HL

depind într-o manieră critică de aciditatea mediului fiziologic. Acest lucru se datorează abilităţii

pH-ului de a modula sarcina netă a vestibulului α-HL care devine încărcat pozitiv la valori acide,

datorită protonării resturilor de acid aspartic (Asp 13, Asp 2, Asp 4 şi Asp 227) pe fiecare dintre

cei şapte monomeri ai α-HL care lasă necompensate sarcinile pozitive ale resturilor de lizină şi

arginină (Lys 8, Arg 56, Arg 104 şi Lys 154).

Astfel, efectul modulator al pH-ului asupra translocării peptidelor poate fi explicat prin

două posibile mecanisme: (i) interacţiuni nespecifice, de rază lungă, de repulsie electrostatică

dintre peptidă şi suprafaţa internă a porului proteic şi (ii) contribuţia fluxului electroosmotic prin

canalul proteic anionic selectiv care se opune mişcării electroforetice a peptidei prin por în

câmpul electric generat de diferenţa de potenţial aplicată.

Aşa cum a fost menţionat mai sus, un alt aspect foarte important care poate fi pus în

evidenţă în urma interacţiunilor cu porul proteic de α-HL este reprezentat de stările

conformaţionale adoptate de peptide în condiţii diferite ale mediului de reacţie.

Interacţiunile electrostatice manifestate între perechi specifice de resturi de aminoacizi

prezenţi în structura primară a peptidelor şi a proteinelor aduc o contribuţie majoră în stabilitatea

conformaţională a acestora, influenţând modul lor de împachetare şi interacţiunea cu alte

macromolecule. Variind pH-ul sau tăria ionică a mediului în care se desfăşoară aceste

interacţiuni, am studiat modul în care împachetarea unor peptide cu conformaţii de “β-hairpin”,

care conţin histidină în structura lor primară, depinde de interacţiunile electrostatice manifestate

între resturi de aminoacizi (L. Mereuta, A. Asandei, C.H. Seo, Y. Park, T. Luchian, 2014, ACS

Appl. Mater. Interfaces 6(15), 13242-13256). Peptidele utilizate în cadrul acestor studii au fost

CAMA 1 (KWKLFKKIGIGKHFLSAKKF-NH2), de hidrofobicitate 45%, sarcină +8 la pH = 8,

respectiv +9 la pH = 4.5, şi CAMA 3 (KWKLKKHIGIGKHFLSAKKF-NH2), de hidrofobicitate

40%, sarcină +8 la pH = 8, respectiv +10 la pH = 4.5.

Am cuantificat, la nivel unimolecular, frecvenţa de translocare a acestor peptide prin

porul proteic de α-HL, timpul de rezidenţă al peptidelor în interiorul porului, respectiv

amplitudinea blocajelor de curent ionic asociate cu interacţiunea dintre monomerii de peptidă şi

por.

Am arătat că rata de captură a peptidelor în lumenul proteinei scade semnificativ la pH

acid, datorită contribuţiilor entalpice şi entropice aduse barierei de energie liberă care

controlează viteza de asociere dintre peptidele aflate în soluţie şi porul de α-HL (Fig. 20).

38

Figura 20. Înregistrări originale de curent ionic care arată interacţiunea dintre peptidele CAMA 3

(A, roşu), res pectiv CAMA 1 (B, albastru), şi porul proteic de α-HL, la pH = 7 (panel a), respectiv pH

= 4.5 (panel b). Diferenţa de potenţial aplicată a fost de ΔV = +70 mV, iar experimentele au fost

realizate într-o soluţie simetrică de 2 M KCl, cu 30 µM peptidă adăugată de partea trans a

membranei. Nivelul „O” indică curentul ionic prin porul liber de α -HL, nivelul „C1” este

corespunzător curentului ionic în timpul unui eveniment de blocaj, atunci când peptida se află în

lumenul porului, respectiv „C2” cores punde prezenţei peptidei în vestibulul proteinei, vizibilă la pH

acid. Vederile detaliate de mai jos evidenţiază substările distincte de blocaj B1 şi B2, caracterizate de

amplitudinile relative ΔIB1 şi ΔIB2 şi timpii caracteristici τon (intervalul de timp dintre două

evenimente de blocaj succesive), res pectiv τoff (durata unui eveniment de blocaj). Panelurile c) şi d)

prezintă diagrame „scatterplot” ale substărilor de blocaj B1 şi B2, la pH = 7, res pectiv pH = 4.5.

Am arătat că rata de captură a peptidelor în lumenul proteinei scade semnificativ la pH

acid, datorită contribuţiilor entalpice şi entropice aduse barierei de energie liberă care

controlează viteza de asociere dintre peptidele aflate în soluţie şi porul de α-HL (Fig. 20). Din

punct de vedere entalpic, interacţiunea de atracţie electrostatică dintre sarcina netă pozitivă a

peptidelor cationice şi inelul de sarcina netă negativă de la gura porului (7x Asp 127; 7x Asp

128; 7x Lys 131) este diminuată la pH acid, când intrarea în lumen devine mai puţin negativă şi

se comportă ca o barieră de potenţial care reduce concentraţia locală de monomeri de peptidă. În

acelaşi timp, la pH = 4.5, protonarea histidinelor conduce la o creştere a interacţiunilor

electrostatice inter-aminoacizi şi conferă peptidelor aflate la intrarea trans a porului o structură

mai dezordonată. Astfel, la pH acid, peptida petrece un timp mai îndelungat în căutarea unei

conformaţii favorabile din punct de vedere entropic care să asigure pătrunderea şi translocarea ei

prin lumenul proteinei.

Timpul de rezidenţă al peptidelor în por scade odată cu scăderea pH-ului de la valoarea 7

la 4.5. Acest lucru se datorează creşterii forţei electroforetice care acţionează asupra peptidelor

ca urmare a creşterii sarcinii nete pozitive a acestora prin protonarea histidinelor. Valorile

ratelor de asociere şi disociere ale reacţiilor reversibile, investigate la cele două valori ale pH-

ului, pentru cele două peptide analizate, sunt sintetizate în tabelul 4.

39

Tabel 4. Valori ale ratelor de asociere (rateon), respectiv disociere (rateoff) pentru cele două peptide

adăugate de partea trans a membranei într-o concentraţie de 30µM, determinate la o di ferenţă de

potenţial aplicată ΔV = +70 mV, la pH = 7, res pectiv pH = 4.5.

CAMA 1 CAMA 3

pH = 7 pH = 4.5 pH = 7 pH = 4.5

rateon (s-1) 7.5 ± 24.3 1.43 ± 0.13 13.23 ± 0.92 1.17 ± 0.08

rateoff (s-1) 296.45 ± 24.3 471.36 ± 40.36 520.40 ±36.62 966.85 ± 68.27

De asemenea, la pH acid, amplitudinea blocajelor de curent ionic este mai mare decât la

valori neutre ale pH-ului, datorită modificărilor conformaţionale induse peptidelor. Acestea

prezintă la pH acid o stabilitate mai redusă a structurii de “β-hairpin” care conduce la o

obstrucţionare redusă a porului în timpul translocării. În acest context, rata de disociere dintre

monomerii de peptidă şi por este mai mare la pH acid.

Am realizat de asemenea experimente în soluţii electrofiziologice de tărie ionică diferită:

2M, 1M, respectiv 0.5M KCl. Rezultatele au arătat că rata de captură a peptidelor scade odată cu

scăderea tăriei ionice a mediului datorită creşter ii razei norului de contra- ioni asociaţi

monomerilor de peptidă care împiedică partiţia acestora în lumenul proteinei (Fig. 21 a) şi c)).

Protonarea histidinelor la pH acid accentuează acest efect. Mobilitatea peptidelor în interiorul

porului este mai mare la tărie ionică mică şi valori neutre ale pH-ului, datorită diminuării ariei

transversale efective a acestora în aceste condiţii şi a creşterii extensiei lanţului peptidic ca

urmare a intensificării interacţiunilor electrostatice dintre aminoacizi.

Figura 21. Dependenţa de tăria ionică a soluţiei electrofiziologice a ratelor de asociere (rate on),

respectiv disociere (rateoff) ale interacţiunilor reversibile dintre peptidele CAMA 3 (roşu), res pectiv

CAMA 1 (albastru) şi porul proteic de α-HL. Liniile punctate reprezintă intervalele de confidenţă de

95% pentru valorile estimate.

Astfel, prin analiza parametrilor care caracterizează evenimentele de blocaj determinate

de trecerea peptidelor prin porul proteic de α-HL, am descoperit că dinamica unor

macromolecule prin canalul proteic este determinată în mare măsură de sarcina electrică netă a

porului de-a lungul căii de permeaţie şi că fluxul electroosmotic poate avea o contribuţie

importantă la translocarea macromoleculelor prin por, mai ales la valori acide ale pH-ului, când

40

selectivitatea pentru anioni a porului creşte semnificativ. De asemenea, cinetica acestor procese

de interacţiune depinde de proprietăţile moleculelor care interacţionează cu interiorul porului,

sarcină electrică, secţiune transversală efectivă, interacţiuni electrostatice inter-aminoacizi,

gradul şi stabilitatea împachetării monomerilor, proprietăţi ce pot fi modificate controlat prin

intermediul mediului de reacţie. Rezultatele noastre subliniază potenţialul imens al tehnicii la

nivel de singură moleculă bazate pe nanopori în identificarea unor etape consecutive distincte

care compun interacţiunea de asociere a moleculelor cu porul proteic şi translocarea lor prin

regiuni distincte ale acestuia, caracterizate de viteze de reacţie de ordine de mărime diferite,

imposibil de detectat în măsurători obişnuite. Aceste rezultate demonstrează posibilitatea de a

creşte într-o manieră controlată timpul de rezidenţă al macromoleculelor gazdă în por şi de a

discretiza astfel calea de permeaţie a acestora corespunzător trecerii lor prin compartimentele

distincte ale porului, conducând la o înţelegere detaliată a acestor procese complexe de

interacţiune.

Un obiectiv important al proiectului îl constituie detecţia ionilor cu ajutorul nanoporilor

proteici hibrizi. Pentru aceasta, este foarte importantă identificarea unor interacţiuni specifice

dintre anumite tipuri de ioni şi alte macromolecule care să facă posibilă detecţia acestora prin

astfel de tehnici de detecţie stocastică. În acest sens, ne-am oprit atenţia asupra ionilor metalici

(Cu2+, Zn2+, Al3+, Fe3+) şi a interacţiunii lor specifice, prin legături coordinative, cu aminoacidul

histidină (His), ce poate fi uşor integrat în structura unor peptide model sau ce se găseşte în mod

natural în structura acestora (ex. peptidele beta amiloidice), proiectate şi utilizate ca partener de

interacţiune în procesul de detecţie stocastică prin nanoporul de α-HL. În studiile noastre, am

arătat că procesul de complexare cu ioni metalici al peptidelor ce conţin aminoacizi histidină în

structura lor primară induce modificări conformaţionale ale acestora. Ţinând cont de experienţa

dobândită în studiul proceselor de interacţiune dintre peptide şi nanopori proteici, aceste

modificări conformaţionale pot fi detectate în urma analizei cinetice a acestor procese şi conduc

în mod indirect la detecţia respectivilor ioni metalici.

Aşa cum este prezentat în figura de mai jos, ionii metalelor tranziţionale (ex.: Cu2+)

formează legături coordinative cu aminoacidul histidină în forma sa neprotonată, mai exact cu

azotul din gruparea imină. Utilizând peptida chimerică CAMA (KWKL FKKI GIGK FLHS

AKKF-NH2), am pus în evidenţă interacţiunea dintre ionii metalici de Cu2+ şi aminoacidul

histidină din structura primară a acesteia prin experimente de spectroscopie de fluorescenţă.

În urma acestor investigaţii bazate pe deplasarea maximului de emisie al aminoacidului

triptofan (Fig.22, panel b), am determinat constanta de disociere dintre peptida CAMA şi ionii de

Cu2+, Kd = 6.3 µM. Datorită legăturilor coordinative formate între ionii metalici şi aminoacidul

histidină, peptidele suferă modificări conformaţionale (panel c) care au putut fi detectate prin

tehnici bazate pe interacţiunea stocastică dintre peptide şi porul proteic de α-HL în prezenţa,

respectiv în absenţa ionilor metalici (L. Mereuta, I. Schiopu, A. Asandei, Y. Park, K.-S. Hahm,

T. Luchian, 2012, Langmuir 28, 17079-17091).

41

Figura 22. a) Structura chimică a aminoacidul Histidină în forma protonată, la pH acid, şi forma

neprotonată, la pH neutru/bazic şi reacţia sa reversibilă cu ionii metalici.b) Structuri moleculare care

prezintă modificările induse de ionii de Cu2+

(verde) în conformaţia peptidei CAMA în urma

interacţiunii lor cu aminoacidul His 15 (roşu). c) Variaţia deplasării maximului de emisie al

triptofanului (Δλ) în funcţie de concentraţia de ioni de cupru, într -o soluţie salinăcu pH = 7. Graficul

încadrat reprezintă s pectrele de emisie fluorescentă normalizate a 1.5 mM peptidă CAMA în absenţa

ionilor de cupru (negru), res pectiv în prezenţa concentraţiei maxime de 22 mM Cu2+

(roşu).

Figura 23. Înregistrări tipice de electrofizologie care arată efectul creşterii concentraţiei de ioni de Cu

2+

asupra interacţiunii dintre un singur por proteic de α -HL şi 30 µM peptidă CAMA, într -o soluţie

simetrică de 2M KCl, la pH = 7, în absenţa (a), respectiv în prezenţa ionilor de Cu2+

în concentraţii de 10 µM (b) şi 100 µM (c), adăugate de partea trans a membranei. Fluctuaţiile de la nivelul ini ţial al

curentului ionic, corespunzător porului liber, indică fenomenele de blocaj induse de interacţiunea

reversibilă dintre o singură peptidă liberă sau complexată cu Cu2+

şi un singur por de α-HL. Panelurile

de jos prezintă reprezentări schematice care ilustrează efectul ionilor deCu2+

asupra interacţiunii

dintre peptidă şi por, din punctul de vedere al reducerii volumului de electrolit exclus de peptida

complexată în interiorul porului (ΔI >ΔICu2+). Peptida liberă pătrunde integral în lumenul α -HL (d), pe

când peptida complexată poate să acceseze doar parţial interiorul porului datorită modificărilor

conformaţionale induse de Cu2+

(e). Diagramele dreapta-sus din panelurile d) şi e) redau o

reprezentare simplificată a profilului de energie liberă simţi t de peptida liberă (d), res pectiv peptida

complexată cu Cu2+

(e), în interacţiune reversibilă cu porul. Reprezentările grafice dreapta -jos din

panelurile d) şi e) arată dependenţa de diferenţa de potenţial aplicată a valorilor medii ale timpilor de

rezidenţă ai peptidei în por (τOFF) în absenţa (d), respectiv prezenţa a 100 µM Cu2+

(e).

42

Rezultatele arată că atât intervalul de timp dintre două evenimente succesive, cât şi durata

unui eveniment de blocaj, cresc în urma adiţiei în sistem a ionilor de Cu2+. Conform teoriei lui

Eyring cu privire la stările de tranziţie, şi ţinând cont de faptul că efectul potenţialului

transmembranar poate fi privit ca o alterare a energiilor libere de activare a proceselor de

asociere/disociere, dependenţele de diferenţa de potenţial aplicată a timpilor τOFF şi τON au putut

fi fitate cu funcţii exponenţiale simple de forma ±((x(ΔV))/t)

OFF ONy(τ ,τ )=Ae .

Dependenţa de diferenţa de potenţial aplicată a timpului de rezidenţă al peptidei în por

(τOFF) poate fi fitată cu o scădere exponenţială, în cazul peptidei libere (linia punctată din panelul

d) dreapta-jos), respectiv cu o creştere exponenţială în cazul peptidei complexate cu Cu2+ (linia

punctată din panelul e) dreapta-jos).

Atunci când cuprul lipseşte din soluţia electrofiziologică, peptida liberă poate fi

acomodată în întregime în lumenul porului de α-HL. În interiorul porului, o singură peptidă

CAMA este reţinută temporar de zona de constricţie formată de Met 113, Lys 147 şi Glu 111.

Dacă forţa electrică care acţionează asupra peptidei este suficient de mare, peptida poate depăşi

această barieră şi trece de partea cis a porului proteic. Acest comportament este în acord cu

dependenţa nemonotonă de diferenţa de potenţial aplicată a timpului de rezidenţă al peptidei în

por (τOFF). Când peptida este complexată cu ioni de Cu2+ prin intermediul His 15, ea suferă o

modificare conformaţională care împiedică pătrunderea totală a monomerului în interiorul

porului. Astfel, frecvenţa evenimentelor de translocare scade semnificativ. Pentru translocarea

unei peptide împachetate, este necesară atât despachetarea ei parţială de partea trans a

membranei, cât şi reîmpachetarea de partea cis, fenomene ce adaugă un cost energetic

suplimentar în procesul de translocare, fapt ce explică creşterea timpilor τOFF şi dependenţa lor

crescătoare de diferenţa de potenţial aplicată.

În cazul prezenţei cuprului în soluţie, adăugarea de EDTA în exces de partea trans a

membranei lipidice a condus la anularea aproape completă a efectului ionilor de Cu2+. De

asemenea, la valori acide ale pH-ului, când histidina este protonată, aceste modificări nu au mai

fost observate. Aceste rezultate demonstrează că efectele observate se datorează întradevăr

complexării peptidă-Cu2+.

În acest context, pornind de la afinitatea aminoacidului histidină pentru ionii metalici şi

rolul pe care l-ar putea juca această interacţiune reversibilă în detecţia acestor ioni sau a unor

molecule ce conţin aminoacidul, am studiat şi o serie de alte peptide ce conţin în structura lor

primară histidină, cum ar fi fragmentul Aβ1-16 din peptida amiloid de origine umană (Asp-Ala-

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys), respectiv fragmentul Aβ1-16 din

peptida amiloid de la şoareci. (Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Asp-Ser-Gly-Phe-Glu-Val-Arg-His-

Gln-Lys).Peptida de origine murină conţine doar doi aminoacizi histidină faţă de cei trei prezenţi

în structura peptidei umane.

43

Peptidele au fost adăugate într-o concentraţie de 50 μM de partea trans a membranei

lipidice în care a fost în prealabil inserat un singur por proteic de α-HL. În urma experimentelor,

am pus în evidenţă proprietăţile de detecţie ale nanoporului proteic în compararea la nivel de

singură moleculă a celor două peptide prin intermediul analizei interacţiunilor reversibile dintre

acestea şi diverse metale. Rezultatele noastre ne-au permis să calculăm afinităţile dintre Cu2+ şi

cele două fragmente Aβ1-16 (A. Asandei, I. Schiopu, S. Iftemi, L. Mereuta, T. Luchian, 2013,

Langmuir 29(50), 15634-15642), iar analiza statistică a blocajelor induse în curentul ionic prin

porul liber în urma pătrunderii monomerilor de peptidă în lumenul α-HL, a arătat că

propensitatea de interacţiune dintre diverse metale şi peptidele analizate, având ca urmare

modificări conformaţionale ale acestora, se supune ordinii: Cu2+> Zn2+> Fe3+> Al3+ (A. Asandei,

S. Iftemi, L. Mereuta, I. Schiopu, T. Luchian, 2014, J. Membrane Biol 247(6), 523-530).

Figura 24. Înregistrări tipice de curent ionic la nivel de singură moleculă care arată interacţiunea

reversibilă dintre fragmentul Aβ1-16 şi porul de α-HL la o diferenţă de potenţial aplicată ΔV = -100

mV, în absenţa (a), respectiv prezenţa a 200 µM Cu2+

(b), Zn2+

(c), Fe3+

(d), Al3+

(e). Fluctuaţiile de

curent de la nivelul de bază corespunzător porului liber (~ -150 pA), reflectă procesele reversibile de

asociere dintre un singur monomer de peptidă şi lumenul porului proteic.

Cercetările au arătat că peptidele amiloid interacţionează cu ionii metalelor tranziţionle;

pentru mutanţii amiloid cărora li s-au substituit aminoacizii histidină, s-a observat diminuarea

procesului de agregare a monomerilor de peptidă în prezenţa unor metale (Pagel et al., 2008).

Interacţiunea dintre peptidele amiloid şi ionii de Cu2+ a fost pusă pe seama a patru legături

coordinative coplanare între un ion metalic şi atomii de azot ai inelelor imidazol de la trei

aminoacizi intramoleculari de histidină (His 6, His 13 şi His 14), respectiv un al patrulea partener

care ar putea fi: gruparea amino din capătul N-terminal, un oxigen de la Tyr 10, un oxigen de la

Glu 3, gruparea carboxil de la Asp 1, sau gruparea carbonil de la Ala 2 (Karr et al. 2005; Stellato

et al. 2006; Hong et al. 2010).

44

Complecşii formaţi de peptide amiloid cu ioni de Zn2+ par să fie structuri mai complicate,

deşi, un mecanism similar de coordinare a fost propus atât în cazul Zn2+ (Danielsson et al. 2007),

cât şi în cazul Fe3+ (Nair et al. 2010).

În ciuda eforturilor experimentale susţinute, estimările cantitative ale constantelor de

disociere care caracterizează afinitatea ionilor metalici pentru peptidele ami loid au generat

rezultate disparate, cu valori raportate în domeniul atomolar - 11 µM pentru Cu2+, respectiv 2-

300 µM pentru Zn2+ (Atwood et al. 2000; Tougu et al. 2008).

În cadrul studiilor noastre, am implementat tehnica de investigaţie la nivel unimolec ular

bazată pe inserţia unui singur nanopor proteic de α-HL în membrana lipidică, pentru a cuantifica

detaliile microscopice care guvernează interacţiunea dintre diferite metale Cu2+, Zn2+, Fe3+, Al3+,

şi fragmentul amiloidic Aβ1-16 de origine umană. Rezultatele noastre au confirmat posibilitatea

utilizării acestui sistem pentru a dezvolta o nouă tehnică de analiză cinetică a interacţiunilor

dintre diverse metale şi peptide Aβ, şi ne-au permis estimarea cantitativă a constantelor de

echilibru care caracterizează aceste interacţiuni reversibile.

Figura 25. Diagrame “scatter-plot” care arată distribuţia ampli tudinii relative de blocaj, ΔIblock, a

timpilor de rezidenţă a fragmentelor peptidice Aβ1 -16 în interiorul porului de α-HL, care evidenţiază amprenta distinctă a blocajelor i nduse de aceste peptide adăugate de partea trans a membranei într-

o concentraţie de 50 µM, în absenţa (a), respectiv prezenţa di feritelor metale (b-e) în concentraţie de

200 µM. Blocajele distincte asociate cu peptidele libere (ΔIpeptide), respectiv peptidele complexate cu

diferiţi ioni metalici (ΔIpeptide-M), au fost evidenţiate prin încadrare în contururi eliptice. Evenimentele

de ciocnire a peptidelor la gura porului, caracterizate de amplitudini relative reduse ale blocajelor,

au fost excluse din analiza statistică.

45

Figura 26. Dependenţa timpului mediu de disociere a peptidei din por, τOFF (a), res pectiv a timpului

mediu de asociere a peptidei cu porul , τON (b), ce caracterizează reacţia reversibilă dintre monomerii

de peptidă şi lumenul α-HL, de concentraţia de metal adăugată de partea trans a membranei: Cu2+

(triunghiuri cu vf. în sus), Zn2+

(cercuri), Fe3+

(triunghiuri cu vf. în jos), Al3+

(pătrate). Concentraţia

de fragmente amiloidice Aβ1-16 a fost de 50 µM.

Tehnica dezvoltată de noi se bazează pe amprenta unică a fluctuaţiilor curentului ionic

mediat de un singur por de α-HL imobilizat în membrana lipidică, ca urmare a pătrunderii

fragmentelor libere de peptidă, respectiv a fragmentelor complexate cu metale în lumenul

porului. Analiza cinetică a frecvenţei fenomenelor de blocaj induse de interacţiunea dintre

peptidele amiloid şi porul proteic, în prezenţa unor metale cu afinitate crescută faţă de aceste

peptide (ex. Cu2+, Zn2+), ne-a permis cuantificarea constantelor de disociere ale proceselor de

complexare a acestor metale cu monomerii de peptide (Kd, Cu2+ = 4.5 9 10-7 M, si Kd,Zn2+ = 9.2

9 10-5 M).

Rezultatele noastre arată că această tehnică generază rezultate ce pot complementa cu

succes abordările analitice de descriere a interacţiunilor metal - peptide amiloid şi întăresc

posibilitatea generării unor senzori bazaţi pe peptide pentru detecţia diferitelor metale, bazaţi pe

funcţionalizarea raţională a nanoporilor proteici cu secvenţe peptidice capabile să recruteze

selectiv şi cu afinitate crescută diferite metale de interes.

În cadrul investigaţiilor realizate pe cele două fragmente amiloidice similare Aβ1-16,

unul de origine umană, respectiv unul de origine murină, a fost pusă în evidenţă afinitatea

crescută a acestor peptide pentru porul proteic de α-HL în prezenţa ionilor de Cu2+. Analiza

cinetică a frecvenţei şi duratei fenomenelor de blocaj, în contextul interacţiunilor dintre două

populaţii diferite de peptide (libere, respectiv complexate cu metal) cu porul proteic, a generat

următoarele valori pentru constantele de disociere ale interacţiunilor: Kd (α-HL; Cu2+) = 26.8 µM

(Aβ de la şoareci) and Kd (α-HL; Cu2+) = 32.6 µM (Aβ de la om).

Afinitatea crescută a celor două peptide complexate cu metale faţă de porul proteic a fost

pusă pe seama unei creşteri a hidrofilicităţii complecşilor formaţi care conduce la creşterea

contribuţiei entalpice la diferenţa de energie liberă asociată reacţiei la echilibru dintre fragmente

Aβ1-16 complexate cu Cu2+ şi α-HL. Datorită faptului că legarea Cu2+ conduce la constrângerea

46

conformaţională a fragmentelor Aβ1-16, probabilitatea contribuţiilor entropice de a avea un rol

în creşterea afinităţii complecşilor metal-peptidă pentru porul α-HL este neglijabilă. Aceste

concluzii întăresc rezultatele unor studii recente care arată că chelarea ionilor de Cu2+ de către

aminoacizii His 6, His 13 şi His 14, din structura primară a peptidelor Aβ de la om, inhibă

formarea fibrilelor amiloidice prin stabilizarea peptidelor amiloyd în stare solubilă şi reducerea

interacţiunilor hidrofobe care conduc la agregarea peptidelor.

Analizând în detaliu procesele de asociere, respectiv disociere, ale interacţiunilor

reversibile studiate, rezultatele noastre arată că asocierea peptidelor Aβ1-16-Cu2+ de la şoareci cu

porul α-HL este mai favorabilă faţă de cazul peptidei libere, pe când în cazul peptidelor Aβ1-16-

Cu2+ de la om, asocierea este redusă faţă de interacţiunile cu peptida liberă. Aceste observaţii ar

putea fi puse pe seama unor modificări conformaţionale ale peptidei peptidelor Aβ1-16-Cu2+ de

la şoareci care rezultă într-o interacţiune mai favorabilă la gura porului de α-HL.

A) B)

Figura 27. A) Înregistrări tipice de curent ionic printr -un singur canal de α-HL care arată

interacţiunea reversibilă dintre fragmentul Aβ1-16 de origine umană (stânga, roşu), res pectiv

fragmentul Aβ1-16 de origine murină (dreapta, albastru), adăugate de partea trans a membranei în

concentraţie de 50 µM, şi lumenul porului proteic. Diferenţa de potenţial aplicată a fost ΔV = -100

mV. Datorită duratei foarte mici a evenimentelor de blocaj cauzate de peptida de origine murină,

frecvenţa de tăiere a filtrului “trece-jos” a fost 20 kHz în cadrul acestor înregistrări, spre deosebire

de 10 kHz în cazul experimentelor cu peptida de origine umană, fapt ce se reflectă în zgomotul

crescut al înregistrărilor corespunzătoare peptidei de la şoareci. B) Dependenţa de concentraţia de

Cu2+

adăugată de partea trans a membranei a timpului mediu de asociere a peptidei cu porul, τON

(paneluri a,c), respectiv a timpului mediu de disociere a peptidei din por, τOFF (paneluri b,d), ce

caracterizează reacţia reversibilă dintre monomerii de peptidă Aβ1 -16 de origine umană(panelurile

de sus), respectiv Aβ1-16 de origine murină (panelurile de jos), şi lumenul porului de α -HL.

Nivelurile curentului ionic cores punzătoare porului liber şi porului blocat de peptidă sunt indicate

prin săgeţi “open”, res pectiv “closed”.

47

Figura 28. Dependenţa de diferenţa de potenţial aplicată a timpului mediu de disociere a peptidei din

por, τOFF, ce caracterizează reacţia reversibilă dintre fragmentele de peptidă Aβ1-16 de la om (roşu),

respectiv de la şoareci (albastru), şi lumenul porului de α-HL, în absenţa (panelurile a şi c), res pectiv

prezenţa ionilor de Cu2+

de partea trans a membranei (panelurile b şi d). Concentraţia de fragmente

amiloidice adăugate a fost de 50 μM. Cu2+

a fost adăugat în concentraţie de 200 μM în cazul

experimentelor pe peptide de origine umană (b), res pectiv 600 μM în cazul experimentelor pe peptide

de origine murină (d). În cazul absenţei metalului din soluţia electrofiziologică pentru ambele peptide

şi a prezenţei Cu2+

în interacţiune cu peptidele de la şoarece, dependenţele de ΔV ale timpului mediu

de disociere τOFF au fost fitate cu scăderi exponenţiale odată cu creşterea în modul a di ferenţei de

potenţial (a,c,d). În cazul prezenţei Cu2+

în interacţiune cu peptidele de origine umană, dependenţa de

ΔV a timpului mediu de disociere τOFF a fost fitată cu o scădere exponenţială odată cu scăderea în

modul a diferenţei de potenţial (b).

De asemenea, rezultatele au arătat că modificările conformaţionale ale peptidei Aβ1-16

de la şoareci, rezultate în urma complexării cu metale, păstrează o topologie spaţială favorabilă

translocării peptidei complexate de partea cealaltă a porului de α-HL. Contrar acestei situaţii,

peptida Aβ1-16 de la om îşi pierde abilitatea de translocare prin por în urma complexării cu

Cu2+. (Fig. 28, panelurile b, d). Aceste rezultate întăresc observaţia că legarea metalelor produce

efecte diferite asupra celor două fragmente amiloidice prin alterarea distinctă a împachetării

acestora în urma complexării. Ca urmare, modificările conformaţionale induse asupra celor două

fragmente amiloid depind în mare măsură de prezenţa în plus a aminoacidului His 13 la peptida

de origine umană faţă de cea de la şoareci, care conţine doar doi aminoacizi histidină (His 6, His

14) în structura primară.

Din datele experimentale obţinute până în acest moment se poate concluziona că:

a) tăria ionică a soluţiei fiziologice influenţează timpul de rezidenţă a peptidei în por şi timpul

dintre evenimete.

48

b) pH-ul soluţiei este unul dintre factorii care modulează interacţiunea dintre molecule şi

interiorul porului proteic. Valoarea pH-ului soluţiei influenţează afinitatea moleculelor pentru

interiorul porului în condiţii specifice ale semnului şi valorii diferenţei de potenţial aplicate

de o parte şi de alta a membranei, alterând astfel timpul de rezidenţă al moleculei în por.

Astfel, dacă se consideră moleculele de ciclodextrină, s-a putut observa că la pH acid acestea

interacţionează cu lumenul α-HL mai ales la aplicarea unui potenţial negativ. Mai mult,

timpul de rezidenţă creşte foarte mult în aceste condiţii. La un pH neutru, moleculele de

ciclodextrină pot pătrunde în porul proteic atât la potenţiale negative cât şi la potenţiale

pozitive, dar timpul de rezidenţă scade foarte mult. Dacă se lucrează la pH bazic, se observă

că moleculele se inseră mai ales la aplicarea unui potenţial pozitiv şi, de asemenea, timpul de

rezidenţă creşte odată cu creşterea pH-ului (Fig. 29).

c) prezenţa ionilor metalici produce complexarea peptidelor înainte de a interacţiona cu porul

proteic ducând la o modificare a conformaţiei acestora, crescând atât timpul de rezidenţă a

complexului în por cât şi timpul dintre evenimentele de blocare.

d) un alt element foarte important care influenţează „dramatic” timpul de rezidenţă, dar şi

timpul dintre blocaje al unui compus ciclic sau nu, este dimensiunea acestuia. Astfel, cu cât

molecula are diametru mai mic cu atât timpul de rezidenţă este mai mic (Fig. 29).

Figura 29. Înregistrarea fluctuaţiilor de

curent produse de interacţiunea dintre γ -

CD (diametrul interior 7.5–8.3Å şi

exterior 16.9Å) şi β-CD (diametrul

interior 6.0–6.6 Å şi exterior 15.3 Å) şi

porul proteic de α-HL. Aceste

înregistrări s-au realizat în condiţii

diferite de pH. Panelurile a) şi b)

reprezintă blocajele produse de γ -CD la

pH=4.4 şi ΔV = -50 mV şi ΔV = +50mV

iar panel e şi f reprezintă blocajele

produse de β-CD la pH=4.4 şi ΔV = -50

mV şi ΔV = +50mV. Fluctuaţiile de

curent înregistrate la pH = 7 şi ΔV = -50

mV şi ΔV = +50mV sunt reprezentate în

panelurile c) şi d) pentru γ-CD şi g şi h

pentru β-CD.

Moleculele ciclice sunt utilizate din ce în ce mai mult în procesul de detecţie şi

cuantificare a diferiţilor analiţi. Ciclodextrinele au fost utilizate pe scară largă în procesul de

incluziune a diferitelor substanţe cu importanţă fiziologică dar şi în secvenţierea genomului

49

uman cu costuri mici (Nature doi:10.1038/ nature. 2012.10051). O problemă majoră cu aceste

molecule este faptul că interiorul macrociclului este hidrofob şi nu poate fi funcţionalizat cu

uşurinţă şi cu costuri mici cu grupări specifice pentru diferiţi compuşi hidrofili, impundu-se

utilizarea acestora într-un domeniu restrâns. Din acest motiv s-au sintetizat alţi compuşi ciclici

care să poată fi utilizaţi într-un domeniu mult mai larg. Astfel, studiul experimental a fost

continuat folosind alţi compuşi ciclici sintetizaţi în cadrul acestui proiect, BEC-COOH (Figura

30 panel a), calix[3]arena, octapeptida ciclica MCP2 (Figura 30 panel b).

a) b)

Figura 30. a) Structura macrociclului sintetizat BEC-COOH. b) Structura chimică a peptidei ciclice

formate din 8 aminoacizi, MCP2.

S-a utilizat acelaşi protocol experimental ca în cazul ciclodextrinelor şi din datele

experimentale preliminare s-a observat că aceste molecule ciclice nu interacţionează cu

membranele lipidice utilizate, dar interacţionează cu lumenul porului de α-HL. Analizând

înregistrările realizate la nivel de singură moleculă s-a observat că blocajele produse de aceste

molecule ciclice sunt de trei tipuri: blocaje de amplitudine mare (blochează canalul în proporţie

de 85%), blocaje de amplitudine mai mică (blochează aproximativ ½ din diametrul porului) şi

blocaje combinate.

O primă concluzie este aceea că această peptidă ciclică poate să pătrundă în lumenul

porului proteic în două poziţii: una favorabilă (b1) caracterizată de un curent rezidual Ib1 care

formează un complex asemănător celui descris mai sus care se formează între α-HL şi

ciclodextrine, şi un alt tip de interacţiune în care molecula ciclică pătrunde transversal sau într-o

altă conformaţie în lumenul porului blocând 85% din diametrul porului (b2) caracterizată de

curentul rezidual Ib2. Cel de-al treilea tip de blocaj am presupus că este dat de pătrunderea unei

molecule ciclice în poziţia b1 după care există posibilitatea fie să pătrundă o moleculă în poziţie

transversală (starea b2) fie din b1 molecula îşi schimbă conformaţia blocând porul (b2) revenind

apoi din nou în poziţia b1 (Figura 31). Cele 3 tipuri de blocaje apar atât la potenţiale pozitive cât

şi la potenţiale negative, interacţiunile fiind totuşi favorizate de potenţialele negative.

50

Figura 31. Înregistrarea fluctuaţiilor de curent induse de interacţiunea dintre lumenul porului de α-

HL şi moleculele ciclice noi sintetizate. Înregistrările s -au realizat la un potenţial ΔV=-50 mV (a) şi ΔV=+50 mV (b). S-au utilizat următoarele notatii: „O” – α-HL în starea deschis, „b1” şi „b2”

reprezintă cele două tipuri de blocaje produse de pătrunderea unei molecule de peptidă în interiorul

porului. Soluţia fiziologică 2 M KCl, 10 mM HEPES , are pH=7.2.

Din înregistrările fluctuaţiilor de curent la diferite potenţiale (ΔV= + 50 mV, +70 mV,

+80 mV, +100 mV, -50 mV, -70 mV, -80 mV, -90 mV şi -100 mV) s-a observat că dependenţa

Ib1-V este o dependenţă liniară, în timp ce dependenţa Ib2-V nu este liniară confirmând într-o

primă fază presupunerea că molecula aflată în poziţia b2 prezintă o altă conformaţie care se

modifică o dată cu modificarea potenţialului aplicat (Figura 32).

Figura 32. Diagramele curent-tensiune ale celor două stări b) (a) şi b2 (b) ale complexului format din

α-HL inserată într-un bistrat lipidic şi molecula nou sintetizată. Ib1 şi Ib2 reprezintă curentul rezidual

prin complexul format (inset). Soluţia fiziologică 2 M KCl, 10 mM HEPES, are pH=7.2, iar

înregistrarea din inset s-a realizat la un potenţial ΔV=-50 mV.

O altă moleculă sintetizată în cadrul acestui proiect a fost oxicalix[3]arena. Acestă

moleculă are structură asemănătoare cu a ciclodextrinelor dar poate fi uşor funcţionalizată în

interiorul ciclului putând fi apoi utilizată ca senzor pentru diferiţi compuşi. Din datele

experimentale obţinute (Figura 33) s-a observat că aceste molecule se „acomodează” bine în

interiorul porului având un timp de rezidenţă suficient de mare. Plecând de la structura acestui

51

compus s-a propus ca în cel mai scurt timp să se sintetizeze un nou compus care în interiorul

ciclului să fie ataşată o grupare amino care va putea fi protonată la diferite valori de pH.

Figura 33. Reprezentarea fluctuaţiilor de curent produse de interacţiunea dintre un canal de α -HL şi

o moleculă de calix[3]arena. Molecula ciclică blocheaza lumenul porului aproape în totalitate,

amplitudinea blocajului tinzând s pre zero. Potenţialul aplicat (a) ΔV = +50 mV şi (b) ΔV = -50 mV.

Soluţie: 2 M KCl, 10 mM HEPES, pH=7.3

Un alt compus care s-a luat în considerare pe parcusul acestui proiect a fost o peptidă

ciclică MCP2 (Figura 30 panel b). Aceste molecule ciclice au grupări de tip amidă în interiorul

lor, grupări care pot participa la reacţii de complexare cu diferite metale tranziţionale.

Figura 34. Înregistrări selectate care arată fluctuaţiile de curent printr-un por proteic de α-HL

datorită blocării reversible a porului de peptida ciclică MCP2 care a fost adăugată în partea trans a

membranei lipidice artificiale la o concentraţie de 20 µM la un potenţial aplicat ΔV = + 50 mV (panel

a) şi ΔV = - 50 mV (panel b). În partea de jos a figurii este reprezentă o imagine mărită a unei părţi

din ănregistrarea selectată pentru a pune în evidenţă timpii de rezidenţă foarte mici ai aceste peptide

în porul proteic.

Aceste molecule au caracteristicile cele mai bune pentru a fi utilizate ca biosenzor dar

datorită timpului de rezidenţă foarte mic de ordinul 10-4 nu pot utilizate cu succes în cadrul

acestui proiect.

52

Pentru dezvoltarea de noi metode pentru studierea proprie tăţilor membranare şi a

modificărilor comportamentului celular s-a explorat modificarea proprietăţilor membranei

lipozomale în prezenţa antibioticelor formatoare de canal tip valinomicină (Figura 35), a

antibioticelor aminoglicosidice (gentamicina, Figura 41) precum şi a membranei celulelor umane

(plachete) modificate prin inserţia (superexprimarea) polipeptidului P selectina (CD62P, Figura

45) la pacienţii cu Leucemie Cronică Mieloproliferativă (LCM). S-au urmărit de asemenea

modificările de fluiditate şi hidratare ale membranelor celulelor în cultură (endoteliu cardiac

uman-linia şi epiteliul tubului renal de Opossum -OK). Aceste studii au avut ca scop obţinerea de

informaţii privind modificările de organizare ale bistratului lipidic artificial (lipozomi SUV) şi

naturali (membrane plachetara şi celule epiteliale în cultură) în urma inserţiei unui compus de

interes biologic/medical.

1. Modificarea polarizării generale GP a membranei lipozomului DMPC tip SUV (Small

Unilamellar Vesicle) prin inserţia antibioticului formator de por: Valinomicina

Figura 35. Structura chimică a valinomicinei (C54H90N6O18) şi structura s paţială a complexului

valinomicina/K+

Interiorul complexului Valinomicină -K+ este polar, în timp ce suprafaţa complexului este

hidrofobică, permiţând valinomicinei să dizolve K+ în miezul lipidic al membrane.

Experimentele noastre au urmărit în ce măsură împachetarea lipidelor în peretele lipozomilor

SUV precum şi în al membranelor celulare umane este afectată de prezenţa unor polipeptide cu

un grad ridicat de selectivitate a recunoaşterii ionice (raportul de stabilitate al asocierii

valinomicina-K+ versus valinomicina-Na+ este 106).

S-au efectuat măsurători de polarizare generalizată GP a bistratului lipidic alcătuit din

DMPC în care s-a încorporat valinomicina în diferite concentra ţii.

Măsurători de GP pe suspensii lipozomale (DMPC) având încorporată valinomicina, au

arătat că GP scade sistematic în prezenţa valinomicinei, pe domeniul de concentra ţii investigat (0

- 82 µM). Acest lucru indică o deplasare a împachetării lipidice spre faza ‘lichidă”, mai hidratată.

53

Figura 36. Înregistrarea la diferite concentraţii de valinomicină dizolvată în DMS O a variaţiei

polarizării generale a suspensiei de lipozomi S UV cu temperatura

Figura 37. Variaţia polarizării generale cu concentraţia de valinomicină încorporată, a suspensiei de

lipozomi S UV termostatată la di ferite temperaturi (10-45oC).Solvent valinomicina: DMS O

Figura 38. Variaţia polarizării generale a sus pensiei de lipozomi S UV cu temperatura la diferite

concentraţii de valinomicină în metanol

-3.00E-01

-2.00E-01

-1.00E-01

0.00E+00

1.00E-01

2.00E-01

3.00E-01

4.00E-01

15 20 25 30 35 40 45

Series1

Series2

Series3

Series4

Series5

Series6

-3.00E-01

-2.00E-01

-1.00E-01

0.00E+00

1.00E-01

2.00E-01

3.00E-01

4.00E-01

0 16.4 32.8 49.2 65.6 82

GP

C valinomycin ( M)

15

20

25

30

35

40

45

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

10 15 20 25 30 35 40 45

0

16.4

32.8

49.2

65.6

82

54

Figura 39. Variaţia polarizării generale cu concentraţia de valinomicină încorporată, a suspensiei de

lipozomi S UV termostatată la di ferite temperaturi (10-45oC). Solvent valinomicina: metanol

0 30 60 9020

30

40 Metanol

DMSO

Tc (

0C

)

[Valino] M

Figura 40. Reprezentarea variaţiei temperaturii critice de tranziţie Tc în func ţie de concentraţia de

valinomicină în solvenţi di feriţi: Metanol (negru) şi DMSO (roşu). Se poate observa că prezenţa

valinomicinei nu modifică Tc a bistratului DMPC.

Înregistrările de mai sus arată că inserţia dodecapepsidului ciclic Valinomicină în

bistratul lipidic DMPC facilitează hidratarea bistratului, reflectată în creşterea sistematică a GP

cu concentraţia antibioticului

Valinomicina nu afectează organizarea lipidică a bistratului, după cum reiese din

păstrarea constantă a temperaturii de tranziţie de fază Tc la toate concentraţiile de

Valinomicină folosite, atât în solvent Methanol cât şi în DMSO.

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

1 2 3 4 5 6 G

P

Cvalinomycin ( M)

10

15

20

25

30

35

40

45

55

2. Modificarea fluidităţii membranare a lipozomilor DMPC tip SUV în prezenţa

antibioticului aminoglicozidic Gentamicină

Figura 41. Structura chimică a gentamicinei

Gentamicina este cel mai important antibiotic dintre aminoglicozidele care se folosesc

încă în mod current pentru tratarea infecţiilor bacteriene, în particular a celor cauzate de

organismele gram-negative. Modul de acţiune al acestui antibiotic constă în întreruperea sintezei

proteinelor prin legarea de subunitatea ribosomala 30S. Deşi există o literatură consistentă

privind acţiunea gentamicinei în interiorul celulei ce gazduieşte bacteria, nu se cunoaşte modul în

care gentamicina (şi aminoglicosidele, în general) penetrează membrana celulară, respectiv

aspectele moleculare ale interacţiei gentamicinei cu bistratiul lipidic.

În studiul nostru, am investigat modificările de fluiditate ale bistratului lipidic din

membranele model (lipozomi DMPC tip SUV) şi celulare (celule endoteliale cardiace în cultură)

în prezenţa gentamicinei.

S-a explorat rolul prezenţei lipidelor încărcate negativ, respectiv cardiolipina (CL) în

interacţiunea cu gentamicina, care este un polication.

Pentru evaluarea fluidităţii membranare s-a monitorizat anizotropia fluorescenţei (r) a

suspensiei lipozomale/celulare marcate cu markerul de fluorescenţă TMA-DPH. S-a observat că

r creşte atunci când fluiditatea scade, adică atunci când bistratul lipidic se rigidizează.

Prezentăm mai jos curbele de variaţie cu temperatura ale anizotropiei fluorescenţei

lipozomilor DMPC marcaţi, precum şi modificarea parametrului r în prezenţa gentamicinei.

Acelaşi tip de experiment se reia pe suspensii lipozomale, în care, pe lângă lipidul neutru DMPC,

este prezentă cardiolipina (CL), încarcată negativ.

56

10 20 30 40

0.14

0.21

0.28 DMPC

DMPC+Gentamicin

r

t (0C)

Figura 42. Variaţia anizotropiei fluorescenţei lipozomilor DMPC în absenţa (negru) şi prezenţa

gentamicinei (roşu).

10 20 30 40

0.14

0.21

0.28 DMPC+CL

DMPC+CL+Gentamicin

r

t (0C)

Figura 43. Variaţia anizotropiei fluorescenţei cu temperatura în prezenţa şi absenţa

gentamicinei în cazul lipozomilor DMPC+CL.

10 20 30 40

0.14

0.21

0.28 celule endoteliale

celule endoteliale+Gentamicin

r

t (0C)

Figura 44. Variaţia anizotropei fluorescenţei cu temperatura în prezenţa şi absenţa

gentamicinei în cazul celulelor endoteliale în culturi marcate cu TMA-DPH

57

În toate situaţiile explorate (lipozomi DMPC cu şi fără cardiolipină, celule în cultură) se

observă o rigidizare a membranei în prezenţa gentamicinei. În prezenţa CL şi în cazul celulelor,

se pierde aspectul sigmoidal al dependenţei anizotropiei cu temperatura, aspect caracteristic

membranelor monolipidice.

Figura 45. Efectul antibioticelor gentamicină (GEN), amikacină (AMI) şi kanamicină (KAN)

asupra membranelor celulelor endoteliale (EA) determinat prin măsurarea polarizării

generalizate la di ferite temperaturi (15 -370C)

3. Modificarea fluidităţii membranei celulelor plachetare în conjunc ţie cu exprimarea

suplimentară de receptori CD62P pentru selectina P

Modificarea fluidităţii membranare a celulelor plachetare testată prin măsurarea

anizotropiei fluorescenţei în cazuri diferite de leucemie cronică mieloidă s-a corelat cu expresia

modificată a receptorilor exprimaţi/inseraţi în membrana plachetară.

Figura 46. Modificarea fluidităţii membranei celulelor plachetare provenite de la pacien ţii cu

LCM în fază avansată.

-0.1

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 Po

lari

zare

ge

ne

raliz

ată

t0C

EA

EA GEN

EA AMI

EA KAN

58

În cazurile de leucemie cronică mieloproliferativă – faza avansată, fluiditatea

membranară a celulei plachetare a fost în medie substanţial scăzută (anizotropia fluorescenţei

crescută – Figura 45) faţă de fluiditatea membranei la trombocitele martor (p=0.032). În studiul

nostru s-a văzut că exprimarea receptorului CD62P (Selectin P – proteină membranară granulară

140kDa, antigen CD62) are o expresie (inserţie membranară) semnificativ crescută în membrana

celulei plachetare provenită de la pacienţii cu LCM în raport cu plachetele provenite de la grupul

martorilor sănătoşi (26.03 vs.4.36, p=0.001).

Figura 47. Selectina P - proteina membranară cu stocare în granulele plachetare, 140kDa,

antigen CD62.

Rezultatele acestui studiu au făcut obiectul articolului: “Assessment of changes in

membrane properties of platelets from CML patients in different stages of the disease” Viola

Maria Popov, Ana Maria Vladareanu, Horia Bumbea, Eugenia Kovacs, Mihaela G. Moisescu,

Minodora Onisai, Maria-Minodora Iordache, Tudor Savopol, Blood Coagulation &

fibrinolysis, 2013, 25:142-150

În cadrul acestui proiect s-au efectuat experimente pe diferite membrane artificiale,

pentru a înţelege mecanismul fizico-chimic prin care antibioticele cu un înalt grad de

selectivitate ionică (valinomicina) şi alte antibiotice curent folosite în clinică interacţionează cu

bistratul lipidic. S-au folosit metodele de măsurare a fluorescenţei emise de markerul Laurdan şi

de TMA-DPH, ce oferă informaţii despre dezorganizarea membranei şi pătrunderea speciilor

polare (apa) în aceasta şi, respectiv, despre libertatea de mişcare a moleculei-sondă TMA-DPH

în monostratul superior al bistratului lipidic (fluiditatea acestuia crescând când r scade). GP şi r

s-au măsurat pe un interval larg de temperatură, pentru a căpăta o imagine globală a

modificărilor de organizare ale membranei, ştiut fiind faptul că membranele artificiale se

comportă diferit în faza de gel şi faza de lichid cristalin. La membranele naturale găsim un

interval întreg de temperaturi de tranziţie de fază, acesta având un rol crucial în activităţile

fiziologice de la nivelul membranei.

59

O constatare importantă este aceea că interacţiunea aminoglicozid - membrană prezintă o

componentă electrostatică pronunţată. În timp ce marcarea membranelor DMPC simple (neutre

din punct de vedere electric) cu Laurdan nu indică o dezorganizare şi pătrundere a apei în

prezenţa aminoglicozidelor testate (gentamicină, kanamicină, amikacină), experimentele pe

lipozomi DMPC ce conţin lipidul încărcat negativ cardiolipina, indică o creştere a GP sub

acţiunea celor 3 antibiotice policationice, efectul gentamicinei fiind cel mai pronunţat. Acest

efect de stabilizare/rigidizare a bistratului lipidic în prezenţa aminoglicozidelor se confirmă şi în

cazul marcării cu TMA-DPH –marker de fluorescenţă ce permite evaluarea rigidităţii membranei

prin măsurarea anizotropiei fluorescenţei. Efectul de “rigidizare” indus de aminoglicozide

descreşte în ordinea: genta-kana-amika şi se poate explica prin interac ţia electrostatică a

policationilor aminoglicozidici cu sarcinile negative ale cardiolipinei. Natura fină a acestor

interacţiuni ar putea fi identificată cu ajutorul experimentelor de Titrare Calorimetrică Izotermă

(ICT) şi prin simulări de dinamică moleculară.

In faza următoare s-a trecut la experimente pe celule de mamifer, respectiv celule

endoteliale umane în cultură (EAhy926) şi celule epiteliale din tubul renal de Opossum (linia

celulara OK). Măsurătorile de Polarizare Generalizată efectuate pe suspensii celulare marcate cu

Laurdan, au arătat că, în mod asemănător efectului pe lipozomii conţinând cardiolipina,

aminoglicozidele folosite induc o rigidizare/stabilizare a membranei celulare, la toate

temperaturile testate.

Măsurătorile de anizotropie a fluorescenţei pe celulele OK conduc la observarea unei

tendinţe similare. Toate aminoglicozidele testate induc o rigidizare statistic semnificativă pe tot

domeniul de temperaturi testate.

Aceste date, deşi obţinute in vitro, constituie o indicaţie a modului în care

aminolicozidele interacţionează cu membrana celulelor de mamifer, aratând, în mod

surprinzător, că prezenţa antibioticului exercită, aparent, un efect de rigidizare “protector‘‘.

Un alt obiectiv important al acestui proiect a fost să realizăm un biomaterial compus

dintr-un material plastic a cărui suprafaţă să fie construită astfel încât să permită legarea

covalentă a lamininei care constituie un important component glicoproteic al membranelor.

Lamininele joacă un rol important în ataşarea, creşterea, diferenţierea celulară [Sasaki et al.,

2004].

Realizarea acestui obiectiv presupune parcurgerea următoarelor etape:

1. Selectarea unor materiale de tip polimeri organici: nylon 6.6, PMMA-polimetilmetacrilat,

PET-polietilentereftalat – Testarea materialelor sub aspectul biocompatibilităţii

2. Obţinerea suprafeţelor funcţionalizate: cuplarea spacerilor moleculari de diferite lungimi

pe suprafeţe de plastic/sticlă activate; Cuplarea covalentă a lamininei la suprafeţe activate

(PET).

3. Caracterizarea densităţii de suprafaţă a lamininei cuplate pe suprafaţa PET-ului -Metoda

enzimatică

60

4. Caracterizarea suprafeţelor prin Atomic Force Microscopy (AFM)

5. Carcterizarea suprafeţelor prin spectroscopie de infraroşu (IR)

6. Testarea suprafeţelor funcţionalizate pentru ataşarea de celule (fibroblaste şi limfocite

izolate) şi studiul ataşării şi diferenţierii OLN-93

Condiţii de cultură – Linii celulare

În studiu au fost folosite următoarele linii celulare:

- fibroblaste de şoarece L929 (pentru testarea biocompatibilităţii materialelor plastice şi a

aderenţei celulare la materialul PET funcţionalizat)

- limfocite din sânge integral uman (utilizate pentru testarea aderenţei celulare şi pentru testarea

ataşării selective a celulelor pe suprafeţele funcţionalizate cu anticorpi

- OLN-93 –linie celulară,model pentru oligodendrocite OLG (utilizate pentru testarea ataşării şi

diferenţierii pe materialul plastic PET funcţionalizat)

Pentru linia L929 s-a utilizat mediul de cultură MEM suplimentat cu 2 mM Glutamină şi

10 % ser fetal bovin (FBS). S-a lucrat pe pasaje celulare aflate în intervalul 15-30. Pentru

limfocitele izolate s-a utilizat mediul de cultură RPMI suplimentat cu 10 % ser fetal bovin.

Pentru OLN-93 s-a utilizat mediul DMEM cu 10 % FBS sau 1% FBS în vederea inducerii

diferenţierii (s-a lucrat pe celule aflate până la pasajul 10). În toate mediile de cultură folosite s-a

adăugat streptomicină 100µg/ml şi penicilină 100 unităţi/ml. Culturile celulare au fost menţinute

în incubator (REVCO) într-o atmosferă de 5% CO2 şi o temperatură de 37ºC.

Teste în vitro de determinare a citotoxicităţii materialelor

a. Testul de difuzie prin agar

Pentru a putea fi supuse testului de difuzie prin agar, materialele plastice luate în studiu

(nylon 6.6, PMMA-polimetilmetacrilat, PET-polietilentereftalat) au fost sterilizate prin iradiere

gama cu o doza de 25 kGy şi apoi supuse procedurii de extracţie. Extractele probelor au fost

obţinute în condiţii standardizate. Probele au fost imersionate în mediul de cultură complet

pentru o perioadă de 24 h, la o temperatură de 37ºC, cu agitaţie, cu un raport de extracţie

greutate-volum de 0.2 g/ml. Culturilor de celule li s-au aplicat extractele pure. Ca probă de

control negativ a fost utilizat MEM fară ser, iar ca şi control pozitiv am utilizat o soluţie apoasă

de 0,45 % fenol.

Testul de difuzie în agar a fost utilizat pentru evaluarea citotoxicităţii materialelor

plastice PET, PMMA şi nylon 6,6 . Metoda a fost aplicată în conformitate cu standardul SN ISO

10993.

Testarea s-a făcut în vase petri de 35 mm în diametru. S-a adăugat fiecărui vas de cultură

o suspensie celulară de L929 pentru a se asigura o concentraţie de celule de 1,5 x 105cells/vas de

61

cultură. Celulele se incubează timp de 24 h pentru a obţine un monostrat celular subconfluent.

După incubare, monostratul celular se acoperă cu un strat de agar nutritiv de 0,5 % (Sigma) (1,

3). După gelificarea agarozei, s-au plasat în contact cu agarul, discuri millipore imbibate cu

probele şi controalele de testat şi s-au incubat timp de 24 h. Apoi, s-au îndepărtat mostrele şi s-a

adăugat fiecarui vas soluţie 0,01% de roşu neutru şi s-a incubat 30 min la 37ºC. După

indepărtarea colorantului, fiecare cultură s-a analizat microscopic. Observarea celulelor s-a făcut

în 15 zone delilmitate de caroiajul de pe fundul vaselor de cultură. Procentul de celule necolorate

(lizate) s-a calculat prin împărţirea numărului de celule necolorate la numărul total de celule

observate (colorate şi necolorate).

b. Determinarea viabilităţii celulare - Test MTS

Testul MTS s-a aplicat atât pentru materialele plastice PET, PMMA şi nylon 6,6. Celulele

au fost folosite pentru însămânţare în plăci cu 96 godeuri (200 microlitri mediu de

cultură/godeu): 5000 celule L929 per godeu. Celulele au fost incubate apoi 24 de ore (37ºC, 5%

CO2), înainte de a fi expuse extractelor materialelor ceramice pe perioade de 24 de ore. După

incubarea acestora timp de 24 de ore, mediul de cultură a fost îndepărtat şi înlocuit cu 200 µl de

soluţie reprezentând diferite concentraţii de extracte ale materialelor folosite (cinci replici pentru

fiecare concentraţie). Drept control pozitiv s-au folosit celule incubate cu mediul de cultură. Ca

şi control pozitiv s-a utilizat o soluţie de 0.45% fenol. Determinarea viabilităţii celulare s-a făcut

prin utilizarea kitului “Cell Titer 96 Aqueous One Soluţion Cell Proliferation Assay” (Promega)

ce are la bază reducerea de către celulele viabile a reac tivului MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-

yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) şi apoi detectarea

spectrofotometrică a acestuia. Măsurarea absorbţiei la 490 nm s-a făcut cu un cititor de plăci de

Tecan. S-au calculat medii ale absorbţiilor măsurate pe replicile culturilor aflate în aceleaşi

condiţii de tratament.

Viabilitatea s-a calculat prin normarea valorilor obţinute la celulele tratate în raport cu

acelaşi număr de celule netratate. Viabilitatea (%) = [Abs 490nm(corectat)]proba tratata *100/ [Abs

490nm (corectat)]proba netratata

Obţinerea suprafeţelor funcţionalizate (PET) cu laminina

În prima etapă benzile de polietilentereftalat (PET) de dimensiuni de (1x5) cm şi grosime

0,165 mm au fost tratate cu HCl 10 % la 40° C timp de o oră şi apoi spălate cu apă deionizată şi

alcool etilic şi uscate. În cea de-a doua etapă grupările carboxi formate în urma atacului chimic

acid au fost activate cu o soluţie de 10 mg N-hidroxisuccinimidă (NHS) şi 40 mg N-ciclohexil-

N’-(2-morfolinoetil)-carbodiimida-metil-p-toluolsulfonat (CDI) la un volum total de 20 ml

dimetilformamidă (DMF) aceasta reacţie de activare a fazei solide desfăşurându-se timp de 3 ore.

62

Figura 48. Schema cuplarii covalente a lamininei la suprafaţă PET .

În etapa a treia benzile de PET activate au fost puse în reacţie cu o soluţie de laminină în

concentraţie de 1 µg/ml în tampon carbonat 50 mM, pH 9,5 şi lăsate să reacţioneze 24 ore pentru

cuplajul covalent la suprafaţă PET (conform schemei din figura 48). Benzile au fost ulterior

spălate cu tampon fosfat 10 mM pH 7,24 şi conservate în vederea testării cu diferite tipuri de

celule. Soluţii de laminina cu concentraţia de 2 ng/ml au fost folosite pentru AFM iar pentru IR

au fost folosite concentraţii de 1 µg/m şi 10, 100, 1000 µg/ml. Pentru adsorbţia lamininei la

suprafaţă PET, se pune PET-ul neactivat în contact cu o soluţie de laminina de 1 µg/ml în

tampon carbonat 50 mM pH 9,5 şi se lasă să reacţioneze.

O

O

o

O

C

O CH2

CH2

Polietilentereftalat (PET, poliester)

+ HCl

n

O C COOH

O

O-CH2-CH2-OH

Faza solida

R-N=C=N-R'

1-etil-3(3'-diaminopropil)-carbodiimida (CDI)

N-OH

O

O

N-hidroxisuccinimida (NHS)

++

O-CO- COO-N

O

OO-CH2-CH2-OH

Faza solida activa

H2N-LAMININA+

O-CO- CO-NH-LAMININA

O-CH2-CH2-OH

Laminina cuplata la faza solida (produs final)

Etapa 1: Reactia de scindare la suprafata a polietilentereftalatului

Etapa 2: Reactia de activare a gruparii carboxi cu carbodiimida si N-hidroxisuccinimida

Etapa 3: Reactia de cuplare covalenta a lamininei la faza solida

63

Caracterizarea densităţii de suprafaţă a lamininei cuplate pe suprafaţa PET-ului: Metoda

enzimatică

Obţinerea markerului enzymatic LAM-PRH

În vederea determinării densităţii masice de suprafaţă a proteinei, a fost folosită pentru

cuplajul covalent peroxidază - o glicoproteină cu conţinut de carbohidraţi legaţi structural.

La 0.4 ml de 2% glutaraldehidă în 50 mM fosfat de sodiu (pH 7.2) s-au adăugat 10 mg de

peroxidază din hrean. După agitare timp de 8 h la temperatura camerei excesul de glutaraldehidă

a fost îndepărtat prin filtrarea prin gel prin utilizarea coloanelor cu Sephadex G25 cu 1mM fosfat

de sodiu ca eluent. Au fost colectate fracţiile ce conţin activitate peroxidazică şi amestecate, iar

concentraţia de proteină determinată. Tamponul soluţiei enzimatice a fost schimbat prin adăugare

de 100 mM de tampon de bicarbonat de sodiu (pH 9.5). 100 µl de soluţie de laminina (1 mg/ml)

a fost amestecată cu 100 µl de enzimă (0.5 mg/ml). Amestecul de reactive a fost incubat la 4◦C

pentru 24 h iar conjugatul laminin-peroxidază a fost purificat prin filtrare pe coloane cu

Sephadex G200. Concentraţia markerului sintetizat LAM-PRH=0,625 mg/ml.

Cuplarea covalentă sau prin adsorbţie a markerului enzymatic la suprafaţa PET-ului

activat şi măsurarea activităţii enzimatice

Stripurile activate sau neactivate au fost introduse într-o soluţie de conjugat laminin-

peroxidaza (5µl) -10 ng/ml (în tampon de carbonat de sodium pH9,5) şi agitate pentru 6 ore la

temperatura camerei. Stripurile care conţin conjugatul au fost spălate cu 10 mM/l citrat de sodiu.

Activitatea peroxidazică a fost măsurată prin utilizarea soluţiei de substrat (1 mg/ml

tetramethylbenzidină, 0.1 % apă oxigenată în 10 nM/l tampon citrat de sodiu pH 5.4).

Măsurătorile spectrofotometrice s-au realizat la 450 nm, iar activitatea enzimatică s-a calculat cu

ajutorul unei curbe etalon şi a fost raportată la suprafaţa activată (suprafaţă de PET acoperită cu

marker enzymatic exprimată în cm2.

Caracterizarea suprafeţelor prin Atomic Force Microscopy

Analiza AFM a fost realizata cu un AFM comercial (XE-100, Park Systems, South

Korea). Suprafeţe de 1 um x 1um au fost analizate pentru toate probele pr in metoda non–contact

utilizând cantiliveri de silicon (PPP NCHR, Nanosensors, Switzerland).

Caracterizarea suprafeţelor prin IR

Spectrele de absorbţie IR au fost înregistrate cu un spectrometru IR TENSOR II (Bruker,

Billerica, MA, USA) echipat cu un modul ATR (attentuated total reflectance). Probele au fost

scanate de 16 ori şi mediate pentru a obţine spectrul final.

64

Testarea suprafeţelor funcţionalizate prin urmărirea ataşării celulelor

Limfocite izolate din sângele periferic uman precum şi fibroblaste de şoarece din linia

L929 suspendate în mediu de cultură au fost depuse pe PET netratat şi tratat cu laminină pentru a

testa aderenţa acestora la suprafeţele biofuncţionalizate. Aderenţa celulelor la suprafeţe a fost

examinată după diferite intervale de timp de incubare a celulelor şi anume: 2 h şi 24 h pentru

limfocite şi, respectiv 1 min, 5 min, 15 min şi 24 h pentru fibroblaste. Celulele au fost colorate cu

doi markeri fluorescenţi acridine orange şi ethidium homodimer şi s-a efectuat numărarea

acestora la microscopul de fluorescenţă. Numărul celulelor s-a raportat la o suprafaţă de 1 cm2.

Testarea suprafeţelor funcţionalizate prin investigarea aderării şi diferenţierii celulelor

Pentru a induce diferenţierea, celulele OLN-93 au fost însămânţate pe rondele din

materialul plastic PET netratate şi tratate fie cu laminina (10 ug/mL), poli-D-lizină (40ug/mL),

fie cu matrice extracelulară ECM gel-100ug/ml, Sigma-Aldrich, Germania), folosind ca mediu

DMEM cu 10% FBS, respectiv DMEM cu 1% FBS, timp de 7 zile. Rondelele cu diamentrul de

10 mm au fost aşezate în plăci cu 6 godeuri. Au fost însămânţate 500 celule/rondea în 60 µL de

DMEM 10% FBS. După circa o oră de incubare la 37°C, 5% CO2, timp în care celulele au

aderat la substrat, în vasele de cultură s-a adăugat mediu până la un volum de 1 mL/godeu.

Culturile au fost lăsate peste noapte în incubator, iar a doua zi mediul a fost fie schimbat cu unul

conţinând 1% FBS, fie înlocuit cu unul nou (cu 10% FBS), ulterior fiind reînnoit odată la 2-3

zile.

Marcarea cu faloidină

La 7 zile de la iniţierea culturilor în vederea diferenţierii, celulele au fost marcate cu o

soluţie de faloidină-FITC (Sigma-Aldrich, SUA), printr-un protocol specific. Faloidina este o

toxină fungică ce se leaga la fibrele de F-actină ale citoscheletului. Astfel, folosind faloidina

conjugată cu FITC, pot fi uşor observate chiar şi prelungirile foarte fine ale celulelor. Protocolul

de marcare constă în: spălare de 3 ori, 5 minute, cu PBS; fixare: paraformaldehida 3% (Sigma) în

PBS, 5 minute; spălare: de 3 ori, 5 minute, cu PBS; permeabilizare: Triton X 100 (Sigma) 0.1%

în PBS, 10 minute; spălare: de 3 ori, 5 minute, cu PBS. Lamelele au fost apoi mutate pe o folie

de parafilm. Marcarea s-a realizat prin aplicarea a 40 µL de soluţie faloidina-FITC 40 µg/mL, pe

fiecare lamelă, urmată de incubarea la temperatura camerei, la întuneric, timp de o oră; spălate de

3 ori, 5 minute, cu PBS. Lamelele au fost montate pe lame de sticlă folosind mediu de montare

antifade ProLong Gold Antifade Reagent (Invitrogen, SUA), lăsate la uscat şi sigilate cu lac de

unghii.

Analiza morfologică

Celulele marcate cu faloidina-FITC au fost vizualizate folosind un microscop de

fluorescenţă (Olympus IX 71, Germania) dotat cu un set de filtre adecvat şi cu o camera CCD

65

(iXON EM+ DU-897 E-CSO-UVB, Andor Technology, Irlanda) necesară pentru captura

imaginilor. Analiza morfologică s-a realizat folosind ImageJ (http://www.rsbweb.nih.gov/ij/) şi a

constat în măsurarea ariei corpului celular, cu ajutorul uneltei ”Poligonal selection” şi a lungimii

proceselor, utilizând ”Segmented line”. Utilizând comanda ”Measure”, programul a cuantificat

aceste date ca număr de pixeli. Informaţiile obţinute au fost apoi copiate într-un tabel în Origin.

Ulterior, folosind un factor de transformare calculat pe baza analizei imaginii unui micrometru

obiectiv prin intermediul unei scale de măsură, s-a aflat dimensiunea în microni a celulelor.

Pe lângă datele oferite din analiza în ImageJ, celulele au fost analizate din punct de

vedere morfologic prin încadrarea în 3 categorii, în funcţie de forma, numărul de prelungiri şi

prezenţa proceselor secundare.

Pentru fiecare dintre condiţiile de creştere am analizat minim 200 de celule, măsurand

aria corpului celular, lungimea proceselor şi încadrându- le într-una din cele 3 categorii descrise.

Analiza biochimică

Pentru caracterizarea biochimică, expresia genica a unor markeri de diferenţiere ai OLN -

93 a fost analizată cantitativ prin utilizarea tehnicii RT-PCR. ARN-ul din celulele însămânţate a

fost extras utilizând ARN Minikit. ADNc a fost sintetizat din ARN prin utilizarea unui kit de

revers transcriere. Pentru PCR s-a utilizat sistemul Quantitec Sybr Green RT-PCR. Primeri

specifici pentru genele markerilor: NG2, CNP, MOG şi MAG au fost utilizaţi. Nivelele

transcripturilor au fost normalizate la actina prin utilizarea metodei Ct şi apoi la cele obţinute

pentru PET.

Selectarea/Testarea materialelor sub aspectul biocompatibilităţii

Materialele plastice selectate (nylon 6.6, PMMA-polimetilmetacrilat, PET-

polietilentereftalat) au fost mai întâi testate sub aspectul biocompatibilităţii lor prin utilizarea

liniei celulare de fibroblaste de şoarece, L929. Două tehnici au fost utilizate pentru evidenţierea

biocompatibilităţii: testul standardizat de difuzie prin agar şi testul MTS de analiză a viabilităţii

celulare. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 5 şi figura 49.

CN CP Nylon 6,6 PET PMMA

Figura 49. Morfologia celulelor L929 (observată la microscop) supuse contactului cu extractele

materialelor studiate şi controlul negativ şi pozitiv (CN -control negativ - mediu de cultură fară ser;

CP-control pozitiv - sol fenol 0.45% ); Se observa celulele lizate în cazul controlului pozitiv în timp ce

în prezenţa CN şi a extractelor obţinute din material celulele au o morfologie normală.

66

Tabel 5. Testarea biocompatibilităţii materialelor plastic: testul de di fuzie prin agar şi testul MTS de

determinare a viabilităţii.

Material testat Tehnica Caracteristici

determinate

Rezultate

Obţinute

Verdict

PET MTS Viabilitate

celulară %

101.6 Non citotoxic

Difuzie prin agar Index de liză /

Index de zonă

0/1 Non citotoxic

Nylon 6,6 MTS Viabilitate

celulară %

94.4 Non citotoxic

Difuzie prin agar Index de liză /

Index de zonă

0/1 Non citotoxic

PMMA MTS Viabilitate

celulară %

100.7 Non citotoxic

Difuzie prin agar Index de liză /

Index de zonă

0/1 Non citotoxic

Experimentele au evidenţiat lipsa citotoxicităţii materialelor: nylon 6.6, PET, PMMA.

Într-o primă fază se vor utiliza în studiu benzile de polietilentereftalat (PET) cu

dimensiuni de (1*5) cm şi grosime 0,165 mm. Studii anterioare au demonstrat de asemenea

biocompatibilitatea unei structuri tridimensionale a PET-ului (care mimează mai bine matricea

extracelulară) fară a fi nevoie de o depunere ulterioară a unor proteine de adeziune (Gustafsson

Y et al., 2012).

Caracterizarea densităţii de suprafaţă a lamininei la suprafaţa PET.

Cinetica markerului enzimatic LAM –PRH la diferite concentraţii ale acestuia este

prezentată în figura 50. Se observă că începând cu concentraţia de 10 ng/ml se obţine o cinetică

optimă, acesta fiind motivul pentru care s-a ales această concentraţie pentru caracterizarea

densităţii de suprafaţă a lamininei.

0 5 10 15 20 25 30 350.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Cinetica LAM-PRH la diferite concentratii

De

nsita

tea

op

tica

la

=

45

0 n

m

Timp (min)

1 ng/ml

10 ng/ml

5 ng/ml

Figura 50. Cinetica markerului enzimatic LAM-PRH la di ferite concentraţii.

67

Utilizând procedura enzimatică descrisă anterior s-a putut calcula densitatea de suprafaţă

a lamininei legate covalent sau prin adsorbţie la suprafaţa PET prin folosirea curbei etalon aşa

cum se observă în figura 51.

0 20 40 60 80 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

PET cuplat prin adsorbtie cu LAM-PRH

OD450nm

=1,15

densitatea de suprafata calculata =82 ng/cm2

PET cuplat covalent cu LAM-PRH

OD450nm

=1,3

densitatea de suprafata calculata =93 ng/cm2

De

nsita

tea

op

tica

la

=

45

0 n

m

Concentratia laminina-PRH (ng/ml)

Curba etalon -activitatea enzimatica a markerului enzimatic laminina-PRH

la 15 min, substrat enzimatic tetrametilbenzidina (TMB) si H2O

2

Figura 51. Evaluarea densităţii de suprafaţă a markerului LAM-PRH cuplat la PET

(polietilentereftalat) cupl at covalent sau ads orbţie fizică

Densitatea de suprafaţă calculată în cazul foliilor PET activate covalent a fost de 93

ng/cm2 iar în cazul celor cuplate prin adsorbţie fizică a fost de 82 ng/cm2. Se pare că datorită

capacităţii mari de adeziune a lamininei, cuplarea covalentă în condiţiile experimentale date este

aproximativ egala cu cuplarea prin adsorbţie fizică în cazul formării unui strat monomolecular.

Caracterizarea suprafeţelor prin AFM

Pentru o caracterizare calitativă a depunerilor de laminină pe PET s-au efectuat

investigaţii de imagistică utilizând tehnica microscopiei de forţă atomică (Atomic Force

Microscopy, AFM). Probe de PET şi PET depuse cu laminină 2ng/mL au fost examinate prin

AFM. Imaginile au fost obţinute cu un instrument tip XE-100 (Park Systems, South Korea). S-a

scanat o arie de 1 µm2, în modul non-contact utilizând un cantilever din silicon (PPP NCHR,

Nanosensors, Switzerland).

Rezultatele sunt prezentate în figurile 52 şi 54.

În figura 52 se pot vedea două imagini ale suprafeţei probei de PET.

68

Figura 52. Imagini ale suprafeţei de PET

Se observă atât din imaginile tridimensionale (mijloc) cât şi din cele plane (dreapta) ca

suprafaţa probei de PET nu este cu adevărat plană (într-un domeniu de dimensiuni ale înălţimii

neregularităţilor de ordinul nanometrului). Înălţimea neregularităţilor observate este de ordinul 6-

10 nm. De altfel, acest lucru este observabil (într-o manieră calitativă) şi în imaginea optică

(stânga). Prezenţa acestor neregulatăţi reprezintă un impediment pentru o bună evaluare

cantitativă a depunerii de laminină luând în considerare dimensiunile moleculei de laminină

(aprox 100 nm lungime şi 8 nm grosime). În figura 53 este prezentată structura moleculei de

laminină însoţită de imagini de microscopie electronică.

Figura 53. Structura moleculei de laminină. Imagini de microscopie electronică.

69

În figura 54 sunt prezentate imagini ale unor suprafeţe de probe de PET cu depunere de laminină.

Figura 54. Imagini ale unor suprafeţe PET cu depuneri de laminină.

70

Din punct de vedere calitativ se observă că peste neregularităţile suprafeţei de PET apare

o granulaţie de dimensiuni mici. O încercare de analiză cantitativă a profilului pe înălţime

sugerează o înălţime de ordinul 3-4 nm pentru această granulaţie ceea ce nu se potriveşte cu

grosimea moleculelor de laminină (8 nm). Pe de altă parte, prezenţa neregularităţilor suprafeţei

suportului (PET) îngreunează analiza cantitativă, posibilitatea apariţiei de rezultate artefactuale

fiind mult crescută.

În scopul diminuării contribuţiei “negative” a acestor neregularităţi, am realizat o analiză

bazată pe spectrul Fourier (FFT) al profilului pe înălţime de-a lungul unui segment selectat pe

suprafaţa scanată. Analizele s-au efectuat folosind pachetele software ImageJ

(http://imagej.nih.gov/ij/) şi Origin Pro 8.0.

Spectrele FFT ale profilului de-a lungul unui segment pe proba de PET şi pe proba de

PET depus cu laminina sunt prezentate comparativ în figura 55, stângă. Se observă că cele două

spectre sunt relativ similare la frecvenţe foarte mici (sub 0.04 1/pixel), în schimb la frecvenţe

ceva mai mari sprectrul PET scade în continuare pe când în spectrul PET cu laminină apare un

maxim la aprox. 0.05 1/ pixel. Acest maxim reprezintă contribuţia lamininei.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0

20

40

60

80

100

120

Am

plit

ud

e

Frequency / 1/pixels

FTT Laminin

FTT PET

peak laminin

0.4, cutoff frequency

0 100 200 300 400 5000

50

100

150

200

250

High pass filtered (0.04 cutoff frequency)

non-filtered

Pix

els

in

ten

sity

pixels Figura 55. S pectrele FFT ale profilului de-a lungul uni segment pe proba PET şi PET depus cu laminina .

O filtrare a graficului profilului de înălţime de-a lungul unui segment pe proba de PET cu

laminină conduce practic la eliminarea contribuţiilor neregularităţilor de dimensiuni mari (peste

100 nm, frecvenţele mici în spectrul FFT) şi la evidenţierea granulaţiei introduse de prezenţa

lamininei (fig. 55, dreapta). Considerând fiecare maxim din profilul filtrat ca fiind produs de o

moleculă de laminină se obţine pentru dimensiunea medie a petei pe imaginea asociată unei

molecule de laminină valoarea de aprox. 30-40 nm, ceea ce reprezintă o bună aproximare a

dimensiunii moleculei de laminină. Densitatea superficială a lamininei rezultată în acest fel este

de ordinul 1000 molecule/µm2 .

La concentraţia de 2 ng/mL utilizată în aceste experimente se observă o aglomeraţie

destul de mare a moleculelor de laminină pe suprafaţa PET ceea ce ne face să considerăm că

moleculele nu sunt întinse aşa cum se poate vedea în imaginea de microscopie electronică, ci mai

degrabă lanţul proteic este încolăcit ceea ce face ca dimensiunea aparentă a unei moleculei să

71

scadă. Pentru validarea acestei supoziţii este însă necesară evaluarea unor imagini de AFM

pentru probe cu concentraţii mai mici de laminină (200 pg/mL sau chiar 20 pg/mL). În etapa

următoare ne propunem să obţinem aceste imagini şi de asemenea (folosind procedura de analiză

FFT) să evaluam dependenţa densităţii superficiale a lamininei legate pe suprafeţa de PET de

concentraţia de laminină din soluţia folosită la depunere.

Un rezultat important obţinut în această etapă este densitatea superficială mare obţinută

prin legarea covalentă a lamininei. Pentru comparaţie, în figura 56 este prezentată imaginea

AFM obţinuta de Hernandez şi colaboratorii (Hernandez JCR et al, 2007) care au folosit pentru

depunere o soluţie de laminină de 2 µg/mL (de 1000 de ori mai mare decât cea folosită de noi)

însă legarea lamininei de substrat (copolimer de etilacrilat şi hidroxietilacrilat) s-a realizat prin

adsorbţie simplă. Se observă că metoda legării covalente propusă de noi în acest studiu asigură o

capacitate mult mai bună de acoperire a suprafeţei suportului polimeric.

Figura 56. Imagine AFM obţinută de Hernandez et al . (2007).

Acest rezultat (densitatea superficială de aprox. 1000 molecule/µm2) este comparabil cu

cel obţinut din analiza făcută pe baza markerului enzimatic. Într-adevăr, 92 ng/cm2 (valoarea

determinată prin marcarea enzimatică a lamininei), considerând masa molară a complexului

proteic de laminină (aprox 800000 d) reprezintă aprox. 700 molecule/µm2. Ţinând cont de erorile

introduse de prelucrarea de imagine putem spune că avem o concordanţă rezonabilă a celo r două

metode total independente.

Caracterizarea suprafeţelor prin spectroscopie de IR

Aşa cum am specificat şi la materiale şi metode, spectrele de absorbţie IR au fost

înregistrate cu un spectrometru IR TENSOR II (Bruker, Billerica, MA, USA) echipat cu un

modul ATR (attentuated total reflectance). Probele au fost scanate de 16 ori şi mediate pentru a

obţine spectrul final. Volumul de probă luat în lucru (cu concentraţiile lamininei de 1000, 100,

72

10 şi 1 µg/mL) a fost de 5 µL. Probele au fost dispuse pe banda de PET şi au fost uscate în etuvă

la temperatura de 40 oC.

În Figura 57 sunt prezentate spectrele celor 5 probe înregistrate. Benzile vibraţionale cele

mai importante pentru laminina au fost indicate prin săgeţi. Sunt prezentate şi poziţiile fiecărei

benzi de absorbţie. Astfel, picul de la 1627 cm-1 este datorat grupării amidice I care rezultă în

urma întinderilor vibraţionale ale C=O din legatura peptidică. Acest pic se observă foarte clar

pentru cele mai mari concentraţii de Laminina (1000, 100 şi 10 µg/mL), dar mai puţin pentru cea

mai mică concentraţie (1 µg/mL), unde doar o mică contribuţie este observată în zona de 1700-

1500 cm-1, comparativ cu semnalul dat martor (PET).

Picul de la 1550 cm-1 este datorat grupării amidice II care apare în urma îndoirilor

legăturilor N-H. Similar cu picul de la 1627 cm-1 acesta se observă mai bine pentru cele mai mari

concentraţii de Laminina.

Al treilea pic observat este la 1459 cm-1 care este datorat grupării COO-. În această

regiune semnalul PET-ului este mai intens şi picul Lamininei se poate observa bine pentru

primele 2 concentraţii (1000 şi 100 µg/mL).

Datele prezentate sprijină studiile anterioare în sensul că se respectă o proporţionalitate a

modificării absorbţiei la lungimea de undă cu concentraţia de laminina la valori ale concentraţiei

mai mari de 10 µg/ml.

1600 1400 1200 1000 800

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

14

59

.98

cm

-1

15

50

.64

cm

-1

Ab

so

rba

nta

/ cm-1

1 mg/mL Laminina

100 g/mL Laminina

10 g/mL Laminina

1 g/mL Laminina

PET

16

27

.78

cm

-1

Figura 57. S pectrele IR ale PET-ului la di ferite concentraţii de laminină (1, 10, 100, 1000 µg/mL)

depuse pe PET

Testarea primară a suprafeţelor funcţionalizate pentru ataşarea de celule (PET cu

laminina)

Limfocite izolate din sângele periferic uman precum şi fibroblaste de şoarece din linia

L929 suspendate în mediu de cultură au fost depuse pe PET netratat şi tratat cu laminină pentru a

testa aderenţa acestora la suprafeţele biofuncţionalizate. Aderenţa celulelor la suprafeţe a fost

examinată după diferite intervale de timp de incubare a celulelor şi anume: 2 h şi 24 h pentru

73

limfocite şi, respectiv 1 min, 5 min, 15 min şi 24 h pentru fibroblaste. Am utilizat limfocitele

datorită importanţei pe care o prezintă în cazul în care biomaterialul confecţionat se

intenţionează a fi utilizat ca implant, ele fiind primele care interacţionează cu acesta (Chang D.,

2009). Aşadar, comportamentul lor este vital pentru dezvoltarea de biomateriale noi sau alte

tehnologii terapeutice care utilizează materiale sintetice. Rezultatele obţinute sunt prezentate în

tabelul 6 şi Figurile 58 şi 59.

Tabel 6. Testarea aderenţei celulelor la suprafaţa biofuncţionalizată din PET cu laminină: Densitatea

celulară (celule/cm2 )

PBMC L929

2 h 24 h 1 min 5 min 15 min 15 min + 24 h

PET 11700 11730 850 2839 2839 6120

PET cu laminina 44.200 40400 2040 8500 11339 16320

Densitatea limfocitelor aderente este de aproximativ 3 ori mai mare pe suprafaţa

funcţionalizată faţă de cea ne- funcţionalizată (Tabelul 6 şi Figura 58). În cazul fibroblastelor,

densitatea celulelor aderente este semnificativ mai mare încă din primele minute de incubare: de

2.5 ori mai mare după 1 min şi 5 min şi de 3 ori mai mare după 15 min şi 24 de h (Tabelul 6 şi

Figura 59).

Figura 58. Limfocite aderente pe PET şi PET cu laminină.

24 h – pe PET-laminina (stânga) şi pe PET (dreapta) (marcate cu AO şi Eth-1)

Figura 59. Aderenţa fibroblastelor L929 pe PET şi PET cu laminină L929.

24 h- pe PET (stânga) şi pe PET-laminina (dreapta)

74

Testarea suprafeţelor activate şi cuplate cu laminină pentru ataşarea de celule: studiul

ataşării şi diferenţierii OLG

OLN-93 reprezintă o linie celulară folosită în numeroase studii ca model al

oligodendrocitelor, celule ce formează teaca de mielină în sistemul nervos central. Procesul de

mielinizare este unul complex, ce implică trecerea oligodendrocitelor prin stadii succesive de

diferenţiere pornind de la celule precursoare, cu o morfologie simplă, bipolară, până la cel de

celule mature, puternic ramificate, ce pot mieliniza până la 50 de axoni diferiţi (Miller, 2002).

Bazându-ne pe studii anterioare privind rolul componentelor serului în reglarea

proliferării, respectiv diferenţierii celulare, am testat capacitatea de diferenţiere a celulelor OLN-

93 cultivându- le timp de 7 zile în mediu cu o concentraţie redusă de ser (DMEM, 1% FBS) pe

suprafeţe de PET funcţionalizate prin cuplare cu laminină prin comparaţie cu suprafeţe de PET

netratate sau acoperite cu şi poli-D-lizina (PLL) şi mediu extracelular (ECM).

Pentru a caracteriza stadiul de diferenţiere al celulelor pe substraturile funcţionalizate am

efectuat o analiză morfologică şi una biochimică a acestora. În cadrul analizei morfologice am

folosit criterii precum gradul de ramificare, aria corpului celular respectiv lungimea prelungirilor

emise. Studiile biochimice au constat în evidenţierea expresiei unor markeri specifici stadiilor

succesive de diferenţiere a oligodendrocitelor (NG2, CNP, MAG şi MOG).

Analiza morfologica

Într-o primă etapă în cadrul analizei morfologice, au fost descrise trei categorii celulare

(figura 60), pornind de la celule bipolare, alungite asemănătoare precursorilor oligodendrocitelor

(categoria 1), până la unele arborizate formând o reţea în jurul corpului celular asemănătoare, fie

pre-oligodendrocitelor fie OLG imature sau chiar mature (multipolare), precum şi o categorie

distinctă ce constă în celule de tip amoeboid care au corpul foarte extins cu prelungiri scurte sau

chiar absente (intinse, plate).

Figura 60. Imagini reprezentative pentru categoriile de celule descrise, conform morfologiei: 1.

Bipolară; 2. Multipolară; 3. Plată, fară procese. Imagini de microscopie de fluorescenţă obţinute în

urma marcării cu faloidin-FITC. Coloraţie verde: fibre F-actina.

75

Distribuţia celulelor pe categorii

O analiză a distribuţiei celulelor în categoriile descrise anterior, specifică fiecarei variante

de creştere oferă informaţii asupra capacităţii suprafeţelor utilizate de a permite diferenţierea

morfologică a celulelor OLN-93. În figura 61 este prezentată distribuţia celulelor în categoriile

descrise mai sus în urma cultivării celulelor din linia OLN-93 timp de 7 zile în mediu cu 1% FBS

pe PET, PET cuplat cu laminină, PET cu PLL şi cu ECM. Pentru fiecare condiţie au fost

analizate 200 celule.

Figura 61. Distribuţia celulelor în categoriile descrise mai sus în urma cultivării celulelor timp de 7

zile în mediu cu 1% FBS pe PET, PET cuplat cu laminină, PET cu PLL şi cu ECM.

În urma analizei culturilor după 7 zile de creştere pe diferitele suprafeţe utilizate,

influenţa substratului asupra diferenţierii este vizibilă. Se observă că proporţia cea mai mare de

celule multipolare se află pe PET tratat cu laminină, suprafaţă care va fi utilizată în studiile

viitoare pentru culturile primare de neuroni în vederea ghidării creşterii neuronale.

Modificări ale ariei corpului celular şi a lungimii proceselor

În figurile 62 şi 63 sunt prezentate lungimea medie a prelungirilor şi respectiv aria medie

a corpului celular în condiţiile de creştere analizate.

Măsurătorile s-au realizat pe imagini de microscopie de fluorescenţă obţinute în urma

marcării cu faloidin-FITC, fiind astfel evidenţiate fibrele de actină. În ceea ce priveşte lungimea

medie a proceselor nu se observă modificări semnificative induse de suprafeţele utilizate pentru

diferenţierea celulelor cu excepţia PET-ului tratat cu ECM care pare să inducă o creştere vizibilă

a lungimii prelungirilor faţă de restul materialelor de creştere utilizate.

Fre

cven

ta tip

ulu

i celu

lar

(pro

cen

te)

Tip suprafata de crestere

intinse

multipolare

76

Figura 62. Lungimea medie a prelungirilor funcţie de tipul de suprafaţă de creştere .

Figura 63. Aria medie a corpului celular în condiţiile de creştere analizate.

În figura 63 se pot observa modificări semnificative ale ariei medii celulare pe cele 4

tipuri de suprafeţe de creştere: pe PET-urile pe care s-au depus PLL şi ECM s-au obţinut celel

mai mari valori ale ariei probabil şi datorită faptului că pe aceste suprafeţe au fost regăsite cele

mai multe celule plate; pe PET-ul pe care s-a cuplat laminina s-a obţinut cea mai mică arie medie

a celulelor în ciuda faptului că în acest caz regăsim cele mai multe celule multipolare însă este

adevărat că în acelaşi timp numărul celulelor plate este cel mai mic.

Analiza biochimică

Caracterizarea biochimică a celulelor OLN-93 a constat în analiza expresiei unor

markeri specifici anumitor stadii de diferenţiere ale oligodendrocitelor (NG2, CNP, MAG,

MOG) prin analiza expresiei genice a acestora prin metoda RT-PCR. În aceste experimente

77

celulele au fost cultivate în mediu cu 1% FBS, pe PET, PET tratat cu 40 ug/ml PLL, PET cuplat

cu laminină în concentraţie de 10 ug/ml şi PET tratat cu 100 ug/ml ECM . Rezultatele sunt

prezentate în Figura 64.

Markerii moleculari urmăriţi sunt corelaţi cu stadiile evolutive ale oligodendrocitelor,

după cum urmează: NG2 este un condroitin-sulfat proteoglican transmembranar prezent din

stadiul de celule precursoare ale oligodendrocitelor până la cel de preoligodendrocite când

expresia sa este oprită; CNP este primul marker al mielinei, fiind o peptidă exprimată de la

începutul stadiului de oligodendrocite imature, până la finalul diferenţierii; MAG reprezintă o

glicoproteină ce apare odată cu stadiul de oligodendrocite mature; MOG este glicoproteină ce

defineşte atingerea stadiului final al diferenţierii.

O primă observaţie este că gena MOG nu se exprimă pe niciuna dintre suprafeţele de

creştere testate. Se remarcă o expresie crescută a genelor NG2 (prezentă înainte ca celulele să

atingă stadiul de oligodendrocite) şi CNP (primul marker al mielinei), la celulele crescute pe

PET funcţionalizate prin cuplare cu laminină. Expresia acestor gene e mult scăzută pe PET-ul

tratat cu PLL şi ECM prin raportare la expresia acestora pe PET.

Figura 64. Analiza expresiei genice a markerilor de diferenţiere ai OLN-93.

În privinţa expresiei genei MAG (exprimată în OLG mature), se observă o creştere

semnificativă a acesteia pe PET-ul tratat cu PLL. Gena apare exprimată şi în celulele crescute pe

PET-ul cuplat cu laminina dar mai puţin prin comparaţie cu PET-ul netratat, în cazul suprafeţei

PET tratat cu ECM fiind absentă.

Rezultatele obţinute sugerează că suprafaţa PET funcţionalizată prin cuplarea covalentă a

lamininei permite ataşarea şi diferenţierea celulelor ceea ce sugerează citocompatibilitatea

78

acestui biomaterial. În urma studiului efectuat am realizat un biomaterial compus din PET care a

fost activat într-o maniera care să permită cuplarea covalentă a lamininei la suprafaţă acestuia.

Biomaterialul obţinut s-a dovedit a fi citocompatibil permiţând aderarea celulelor de tipul

fibroblastelor şi limfocitelor umane precum şi diferenţierea celulelor OLN-93. În viitor,

următoarea etapa va fi extinderea utilităţii acestui biomaterial în ghidarea creşterii neuronale.

Fabricarea de filme subţiri de Au prin epitaxie moleculară în vid ultra-înalt.

Caracterizarea la scară nanometrică a topografiei suprafeţelor prin măsurători AFM şi

STM

Optimizarea parametrilor de depunere a filmelor subţiri de Au şi caracterizarea acestora

prin microscopie de scanare

Substraturile care vor deservi construirii de senzori miniaturizaţi de înaltă senzitivitate şi

specificitate pentru detecţia de ioni se bazează pe filme subţiri de aur şi siliciu pe substrat de

siliciu reconstruit 7×7. Cele două seturi de filme subţiri au fost obţinute utilizând tehnica

modernă de depunere epitaxială cu fascicul molecular (MBE-Molecular Beam Epitaxy). Doi

parametrii experimentali au fost optimiza ţi (temperatura substratului şi rata de depunere) cu

scopul obţinerii unor filme de aur de înaltă calitate şi rezoluţie, cu terase atomice întinse pe

suprafeţe mari, potrivite pentru autoasamblarea de molecule.

Reconstrucţia Si (111) 7 × 7 a fost obţinută cu ajutorul unui tratament termic bine stabilit

şi cunoscut. Confirmarea reconstrucţiei s-a făcut pe baza imaginilor de difracţie de electroni de

energie înaltă (RHEED) (Figura 65) şi de microscopie de scanare prin efect tunel (STM) (Figura

66). Imaginea STM reflectă distribuţia spaţială a stărilor electronice ocupate de la suprafaţă.

Celula elementară (7 × 7) este arătată în Figura 66 (a) iar dimensiunea ei s-a găsit ca fiind de 2.7

× 2.7 nm, aşa cum se regăseşte şi în literatura de specialitate.

Profilul de linie din Figura 66 (c) arată poziţiile şi diferenţa de înălţime a şase tipuri

distincte de atomi (numerotaţi de la 1 la 6) evidenţiaţi în Figurile 66 (a) şi (b).

Figura 65. Imaginea RHEED pentru reconstrucţia 7x7 a substratului de Si(111).

79

Figura 66. a) Imaginea STM a reconstrucţiei Si(111) 7×7inregistrată cu un potenţial negativ aplicat

probei de -2V şi un curent de tunelare de 0.3 nA; b) Celula elementară 7×7 şi evidenţierea tipurilor

de atomi; c) Profilul de linie extras de-a lungul liniei reprezentată în b).

Tabelele 7 şi 8 cuprind parametrii experimentali folosiţi pentru filmele de aur depuse.

Figura 67. Difractogramele filmelor subţiri de Au/Si(111) obţinute la (a) temperaturi diferite ale

substratului ş i la (b) rate di ferite de depunere.

Orientarea filmelor sub ţiri a fost studiată cu ajutorul difracţiei de raze X, în geometria

Bragg-Brentano ( - 2 şi sunt prezentate în Figura 67. Se poate observa din difractogramele

XRD că filmele depuse la temperaturi mai scăzute decât 580 oC şi cu rate de depunere diferite de

1.6 nm/min conţin maxime corespunzătoare indicilor Miller (111), (200), (220) şi (311), indicând

faptul că aceste filme nu sunt depuse numai după direcţia (111) a substratului de Si. Filmele 3 şi

Tabel 7

Parametrii de depunere pentru filmele de Au

obţinute la temperaturi diferite ale substratului

Film

depus

Temperatura

substratului (ºC)

Rata de depunere

(nm/min)

1 480

1.6 2 530

3 580

4 630

Tabel 8

Parametrii de depunere pentru filmele de Au

obţinute la rate diferite de depunere

Film

depus

Temperatura

substratului (ºC)

Rata de

depunere

(nm/min)

5

580

0.15

6 0.8

7 1.6

8 4.3

80

7 depuse la o temperatură a substratului de 580 oC şi cu o rată de depunere de 1.6 nm/min

prezintă un singur maxim de difracţie corespunzător planului cu indicii Miller (111). Toate

celelalte maxime de difracţie ale aurului nu sunt prezente în difractograma filmului sub ţire. Lipsa

lor sugerează în mod clar orientarea preferenţială a cristalitelor filmului după planele (111) pe

substrat [8]. Pe baza imaginilor STM s-a determinat modul de creştere a filmelor, morfologia

suprafeţelor, dar şi rugozitatea lor, aceasta din urmă rezultând prin calculul RMS (root mean

square).

Pentru ca topografia suprafeţelor filmelor obţinute să fie sub formă de terase atomice

[10], o condiţie absolut necesară este ca RMS-ul să aibă valoarea de sub 1 nm.

Filmele depuse de către noi prezintă o creştere 2D, arătată în Figurile 68 şi 69. Filmul 1

prezintă numeroase terase incomplete şi discontinuităţi. Înălţimea maximă este de ∼150 nm.

Granulele de Au par să se unească, în încercarea de a forma o suprafaţă continuă, dar energia

furnizată de substrat pe durata depunerii şi a procesului de tratament termic de după depunere,

este insuficientă. În cazul filmului 2, înălţimea maximă este de ∼4 nm, iar suprafaţa sa este

formată din terase întinse, separate de paşi monoatomici. O observaţie interesantă în cazul

topografiei acestui film este prezenţa unei insule de Au, fapt care ne duce cu gândul la existenţa

centrilor de nucleaţie.

Film 5 Film 6 Film 7 Film 8

Figura 69. Imagini 3D reprezentative de S TM pentru filmele de Au/Si(111) la rate de depunere de (a)

0.15 nm/min; (b) 0.8 nm/min; (c) 1.6 nm/min; (d) 4.3 nm/min.

Film 1 Film 2 Film 3 Film 4

Figura 68. Imagini 3D STM (1.2 μm × 1.2 μm) a filmelor de Au depuse la di ferite temperaturi ale

substratului. Imaginile STM au fostobţinute la o diferenţă de potenţial de 1.6V şi un curent de tunelare

de 0.3 nA.

81

De fapt, în general, creşterea filmelor metalice pe suprafe ţe nemetalice are loc în modul

Volmer–Weber în prima etapă, sub forma de insule 3D.

Acest mod de creştere este urmat de unirea insulelor şi formarea de entităţi de dimensiuni

mari. După ce se realizează acoperirea completă a suprafeţei substratului, creşterea filmului este

una pe direcţie verticală (2D).

Temperatura de depunere de 580 oC pare destul de potrivită pentru formarea de terase

atomice de mică rugozitate cu paşi atomici de 3 Å. Creşterea strat cu strat a acestui film este

aratată în figura 68. În cele din urmă, înalţimea maximă a suprafeţei în cazul filmului 4 ajunge la

∼10 nm, cu o suprafaţă formată din terase plane separate de găuri mari, cu o adâncime de câteva

zeci de monostraturi atomice. Calitativ, filmul 3 este cel mai uniform dintre filmele depuse de

noi, cu o suprafaţă formată din straturi monoatomice şi rugozitate de 0.32 nm. Toate filmele

depuse cu rate de depunere diferite au o orientare 2D, independent de rata de depunere folosită

(Figura 69). Grosimea filmelor este direct proporţională cu rata de depunere. Filmul 5 obţinut cu

cea mai mică rată de depunere are terase atomice incomplete şi doar câteva monostraturi de Au,

pe când filmul 8, depus cu cea mai mare rată de depunere prezintă multiple terase incomplete şi

tinde să formeze pe suprafeţe mari mari site-uri de nucleaţie. Filmul depus la 0.8 nm/min are cea

mai mare rugozitate,de 1.41 nm. Filmul obţinut la rata de depunere de 1.6 nm/min are terase

atomice line, o înălţime maximă de 0.05 nm şi un RMS de 0.02 nm.

În concluzie, filme de Au depuse prin tehnica MBE, de înaltă calitate, optime pentru

utilizarea lor drept substrat în fabricarea de senzori, se obţin la o temperatură a substratului de

580 ºC şi o rată optimă de depunere de 1.6 nm/min.

Microelectrozi interdigitizaţi

Obţinerea de microelectrozi interdigitizaţi prin tehnici de fotolitografie

Bazându-ne pe experienţa dobândită în

depunerea de filme subţiri de aur, am obţinut cu

succes suprafeţe microstructurate de aur pe

substrat de sticlă, folosind tehnica de

fotolitografie. Aceste suprafeţe, sub forma de

microelectrozi interdigitizaţi (μIDE) cu o

înălţime de 100 nm şi o lăţime de 300 μm vor

deservi ataşării selective a unor compuşi nou

sintetizaţi pe bază de macrocicluri şi peptide

ciclice, cu scopul final de a fabrica biosenzori

ionici, de înaltă calitate şi senzitivitate.

(a) (b)

Figura 68. (a) Proiectarea măştii;

(b) Imaginea măştii realizată cu ajutorul

microscopului optic.

82

Etapele procesului fotolitografic pentru realizarea unor modele pe suprafaţa unei probe

constau în: curăţarea şi degresarea substratului; depunerea materialului care urmează să fie

folosit pentru realizarea structurilor; depunerea stratului de fotorezist pe întreaga suprafaţă a

plachetei; poziţionarea fotomăştii şi expunerea la radiaţia UV; developarea fotorezistului;

tratarea termică a stratului de fotorezist rămas precum şi corodarea chimică a stratului de metal

prin ferestrele făcute în fotorezist; îndepărtarea stratului de fotorezist prin spălarea cu solvenţi

organici.

Stratul metalic a fost acoperit

cu un fotorezist pozitiv comercial

(Positiv 20), iar sandwich-ul

sticlă/Au/Pozitiv 20, împreună cu

masca, a fost supus iradierii UV, cu

lumină la lungimea de undă de 395

nm, compatibilă cu intervalul de

expunere al fotorezistului folosit.

Desenul schematic al măştii folosite pentru fabricarea μIDE este prezentat in Figura 70

(a), iar rezoluţia laterală a măştii se poate observa în Figura 70 (b). Sistemul sandwich-mască a

fost supus iradierii UV timp de 10 minute, la o distanţă de iradiere de ≈ 4 cm, pentru a obţine o

rezoluţie laterală a microelectrozilor comparabilă cu cea a măştii.Polimerul iradiat a fost

developat în soluţie de NaOH 0.7% până când acesta a fost îndepărtat complet (Figura 71).

Stratul de Au neacoperit de fotorezist a fost îndepărtat chimic prin scufundarea sandwich-

ului în soluţie de apă regală. Rezultatul este prezentat in Figura 72. Ultimul pas a reprezentat

îndepărtarea fotorezistului rămas în soluţie de acetonă.

Caracterizarea structurală şi morfologică a electrozilor s-a făcut pe baza măsurătorilor de

raze X şi a imaginilor de microscopie de forţă atomică (AFM). Difractograma obţinută prezintă

un singur maxim de difracţie corespunzător planului cu indicii Miller (111). Toate celelalte

maxime de difracţie ale Au nu sunt prezente în difractograma filmului subţire (Figura 73). Lipsa

lor sugerează în mod clar orientarea preferenţială a cristalitelor filmului cu planele (111) pe

substrat.

Figura 73. Difractograma filmului de Au utilizat pentru fabricarea μIDE.

Figura 71. Developarea

polimerului folosit în

procesul de fotolitografie.

Figura 72. Corodarea

chimică a metalului.

83

Măsurătorile AFM de topografie au permis obţinerea unor informaţii asupra „reliefului”

probei în ansamblu, a suprafeţei substratului pe care s-a efectuat depunerea şi a stratului de Au

depus. Figura 74 prezintă măsurătorile AFM realizate pe sistemul Au/sticlă, unde grosimea

filmului metalic a fost setată la valoarea de 100 nm. Dupa cum se poate observa din Figura 75 (a)

si (b), grosimea filmului depus se situeaza in jurul valorii de 110 nm.

Analiza rugozităţii stratului de Au efectuată pentru aria specificată în Figura 75 (a)

(16450 puncte de scan incluse) indică grosimi cuprinse în intervalul 102.2-161.5 nm, media

înălţimilor 120.3 nm, rugozitatea medie Sa 7.3 nm, abaterea pătratică medie (RMS) Sq 9.4 nm.

Asimetria distribuţiei (skewness) Ssk 0.95 şi aplatizarea (kurtosis) curbei de distribuţie Ska 0.88

descriu distribuţia datelor de înălţime aferente ariei decupate (Figura 75).

Fabricarea de filme subţiri de Si prin epitaxie moleculară în vid ultra-înalt. Caracterizarea

la scară nanometrică a topografiei suprafeţelor prin măsurători STM

Optimizarea temperaturii substratului de depunere a filmelor subţiri de Si şi

caracterizarea acestora prin microscopie de tunelare

Următorul obiectiv a constat în optimizarea metodei de obţinere a nanostructurilor de

siliciu utilizând tehnica de MBE, cu aplica ţii în nanodetecţie. Parametrul experimental găsit a fi

optim este temperatura substratului. Prin această activitate am urmărit obţinerea de suprafete

nanostructurate de Si/Si(111) 7×7, în vederea posibilită ţii de detecţie a semnalelor de intensitate

scăzută, pentru realizarea de biosenzori sau dispozitive de tip lab-on-a-chip precum şi în

tehnologia microarray-urilor. Structurile realizate experimental au fost caracterizate prin tehnici

de STM şi AFM, pentru studierea proprietăţilor morfologice ale acestora.

Temperatura substratului a fost variată în intervalul -100 – 450 ºC, parametrii de

depunere a filmelor nanostructurate obţinute fiind în Tabelul 9.

Figura 74. Histograma cores punzătoare

ariei decupate din imaginea topografică a

suprafeţei de aur.

Figura 75. (a) Topografia AFM a unei limite a stratului de

aur depus sub formă de electrod pe substrat de sticlă. (b)

Profilul de-a lungul secţiunii S2 indicată în imaginea

topografică.

b a

84

Tabelul 9. Valorile parametrilor relevanţi pentru filme de Si depuse la diverse temperaturi ale

substratului.

Filmul

depus

Temperatura celulei

de efuzie

(oC)

Presiunea fluxu lui

de atomi

(10-8

mbar)

Temperatura

substratului (ºC)

1

1350 1.2

-100

2 24

3 450

Din imaginile STM (Figurile 76, 77) obţinute pe filmul 1 depus la temperatura de -100 ºC

a substratului se observă o tendinţă de creştere unidimensională a filmului din cauza fasciculului

molecular omogen şi a temperaturii scăzute a substratului, atomii neavând energia suplimentară

necesară migrării pe suprafaţă. Din imaginea STM de 1 μm × 1 μm (Figura 77) se observă că

filmul este crescut omogen cu o înălţime maximă de ≈ 2 nm.

Figura 76. Imaginea 2D obţinută prin STM de 8 μm ×

8 μm pentru filmul depus la temperatura de -100 0C.

Figura 77. Imaginea 3D obţinută prin STM de 1 μm

× 1 μm pentru filmul depus la temperatura de -100 0C.

Filmul depus la temperatura camerei prezintă un mod de creştere 2D cu coloane

discontinue şi înălţimi neregulate (Figura 80), înălţimea maximă a acestora fiind de 10 nm.

Figura 78. Imaginea 2D obţinută prin STM de 8 μm × 8

μm pentru filmul depus la temperatura camerei.

Figura 79. Imaginea 3D obţinută prin STM de

500 nm × 500 nm pentru filmul depus la

temperatura camerei.

85

Figura 80. Distribuţia înălţimii maxime a

nanostructurilor de Si observate experimental.

Figura 81. Distribuţia perimetrului

nanostructurilor de Si observate experimental.

Din imaginile STM pe o suprafaţă de 500 nm × 500 nm se poate observa modul de

creştere colonar, imposibilitatea coalescenţei acestora datorându-se energiei insuficiente primită

în timpul depunerii filmului. Dintr-un studiu statistic efectuat pe imaginea STM de 8 μm × 8 μm

(Figura 78) rezultă faptul că înalţimea medie a suprafeţei este in jur de 2-3 nm iar perimetrul

grăunţilor ce o alcătuiesc este de aproximativ 100 nm (Figura 81).

Filmul depus la temperatura substratului de 450 ºC prezintă nanostructuri de Si bine

definite şi crescute în mare majoritate urmând terasele atomice ale substratului de Si(111) pe care

s-a făcut depunerea (Figura 82). Acest lucru se datorează energiei furnizate de substrat atomilor

de Si pe durata depunerii, crescându- le astfel mobilitatea pe suprafaţă.

Figura 82. Imaginea 2D obţinută prin STM de 8 μm

× 8 μm pentru filmul depus la temperatura de 450 ºC.

Figura 83. Imaginea 3D obţinută prin STM de 500

nm × 500 nm pentru filmul depus la temperatura de

450 ºC.

1086420

30

25

20

15

10

5

Maximum Height [nm]

Nu

mb

er o

f H

ills

0.40.350.30.250.20.150.10.050

250

200

150

100

50

Perimeter [µm]

Num

ber

of

Hil

ls

86

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

18

27

36

he

igh

t (

m)

width ( m)

Figura 84. Profilul topografic extras de-a lungul

liniei reprezentată în imaginea STM de 8 μm × 8 μm

Figura 85. Distribuţia înălţimii maxime a

nanostructurilor de Si observate experimental.

Figura 86. Distribuţia perimetrului nanostructurilor

de Si observate experimental.

Înălţimea medie a nanostructurilor obţinute este de 15-20 nm (Figurile 84, 85) cu

perimetrul cuprins în intervalul 100-150 nm (Figura 86). Aceste date au fost obţinute în urma

măsurătorilor STM pe o suprafaţă de 8 × 8 µm (Figura 82). Imaginile au fost înregistrate cu un

potenţial al probei de 2V şi un curent de tunelare de 0.3 nA. Imaginea STM pe o suprafa ţă de

500 × 500 nm (Figura 83) colectată cu un curent de tunelare de 0.33 nA şi un potenţial de 2 V

arată procesul de creştere a nanostructurilor de Si/Si (111). Procesul de nucleaţie are loc la

graniţa dintre domenile substratului de Si(111) 7×7 urmat de coalescenţa insulelor proaspăt

formate urmărind fidel terasele atomice ale substratului.

Calcule de structuri de suprafaţă (Solid State Physics DFT Theory) şi caracterizare

Caracterizarea energetică şi structurală a unor molecule ciclice depuse pe suprafeţe de Au

şi SiO2

Au fost determinate energetica unor molecule ciclice adsorbite pe suprafe ţe de Au(111)

respectiv SiO2 precum şi proprietăţile lor electronice şi structurale prin Teoria Funcţionalei de

Densitate (DFT) folosind codul SIESTA. S-au calculat în detaliu energiile de interacţiune şi

geometriile de adsorpţie pentru terminaţiile macrociclurilor care acţionează ca linkeri pentru

2520151050

6

5

4

3

2

1

Maximum Height [nm]

Nu

mb

er o

f H

ills

350300250200150100500

10

8

6

4

2

Perimeter [nm]

Nu

mb

er o

f H

ills

87

suprafeţe (amintim aici benzenul, tiofenul şi cisteina care pot interacţiona prin sulf şi piridina

care poate interacţiona prin atomul de azot) (Figura 87).

Figura 87. Macrociclurile adsorb pe suprafeţe prin linkeri specifici.

În imagine este reprezentat schematic un macrociclu ads orbit prin tiofen.

Se oferă o perspectivă teoretică a efectului interac ţiunii van der Waals asupra

mecanismului de adsorbţie a unei molecule test (tiofen) pe suprafaţa de Au (111), dar şi o

comparaţie între rezultatele obţinute prin mai multe funcţionale însoţită de o analiză a

proprietăţilor geometrice, a energiilor de legare şi a transferului energetic între moleculă şi

suprafaţă.

Experimentele au arătat că benzenul interacţionează slab cu suprafeţe de metal nobil. Pe

suprafeţe de tip (111) se adsoarbe într-un mod ordonat în formă de straturi de 3x3 unită ţi.

Moleculele heteroaromatice, cum ar fi tiofenul sau piridina se adsorb diferenţiat. În regim de

acoperire redus, moleculele heteroaromate adoptă o conformaţie plată, în timp ce la creşterea

ariei de acoperire, a fost observată o orientare înclinată sau verticală.

Tabel 10 .Valorile parametrului de bulk (în Å) pentru aur, calculaţi cu 3 funcţionale di ferite.

S-au testat trei functionale dedicate calculului interacţiunii van der Waals: VDW-DF2 a

lui Lee et al. (LMKLL); VDW-DF a lui Dion et al. (DRSLL) şi KBM a lui Klimes et al.

Electronii din seturile de baze au fost înlocuiţi cu pseudopotenţiale. Pentru fiecare tip de

funcţională, un set specific de pseudopotenţiale a fost generat şi testat pornind de la parametrii

pentru funcţionala GGA-PBE.

88

Pentru început s-au calculat parametrii relevanţi de bulk pentru suprafaţa de aur goală,

utilizând cele 3 funcţionale (Tabelul 10), în intervalul de energie 300-400 meV. Valori mai mari

ale energiei decât cele prezentate în tabel conduc la restrângerea orbitalilor atomici gama, care

nu ar mai putea descrie în mod optim interac ţiunea de tip van der Waals. Pentru atomii organici

am testat valori ale energiei între 10 şi 150 meV (Tabelele 11 şi 12).

Tabel 11. Momente de dipol (în Debye) pentru

tiofen pentru cele trei func ţionale ca funcţie de shift

de energie utilizat pentru a defini orbitalii DZP în

SIES TA.

Tabel 12. Momente de dipol (în Debye) pentru

tiofen pentru cele trei func ţionale ca funcţie de shift

de energie utilizat pentru a defini orbitalii TZP în

SIES TA.

În Tabelul 13 am rezumat testele pentru moleculele libere şi pentru aur în bulk.

Prin compararea momentelor de dipol obţinute cu fiecare dintre cele trei funcţionale

observăm că toate rezultatele sunt apropiate ca precizie de calcul. Pentru a optimiza procedura de

calcul, am folosit 3 modele a căror rezultate sunt sumarizate în Tabelul 12. În urma acestor teste,

s-a impus crearea celui de-al patrulea model schematizat în Figura 88.

Figura 88. Reprezentarea schematică a modelului final. Zona roşie indică regiunile în care se petrece

relaxarea geometrică cu scanarea mai multor seturi de bază . Zona albastră indică regiunile în care

parametrii geometrici şi setul de baze sunt fixe.

Tabel 13. Rezultatele testelor pentru cele 3 funcţionale: momente de dipol P pentru tiofen, parametrul de

bulk şi momentul de dipol al suprafeţei de aur relaxată. Momentele de dipol sunt prezentate în De bye,

distanţele sunt date în Å ş i energiile de legare în eV.

89

În concluzie, prin fixarea atomilor de aur în poziţiile ideale într-o suprafaţă de Au(111)

cu parametrul de reţea de 4.08 Å obţinem rezultate realiste. Se mai poate argumenta că prin

utilizarea de pseudo-orbitali atomici largi (PAO) cu raza scurtă de acţiune, se obţin valori

nerealiste ale energiilor de legare; cauza lor este efectul de BSSE mare, care face ca rezultatele

finale de fie discutabile.

În continuare, am studiat adsorbţia tiofenului (T) pe Au (111), la o valoare a modificării

energiei de 15 meV. Am construit mai multe structuri prin translatarea moleculei paralel cu

suprafaţa, pentru a investiga efectul localizării pe suprafaţă asupra geometriei de adsorbţie

(Figura 89). Au rezultat 25 locaţii pe suprafaţă pentru care am calculat energia totală. Doar cele

cu energia cea mai mică sunt caracterizate în continuare. Diferenţele sunt de până la 0.22 Å

(pentru DRSLL) indicând o orientare uşor înclinată a moleculei în raport cu suprafaţa. Pentru

orientarea perpendiculară a tiofenului, funcţionala KBM favorizează o geometrie cu distanţe mici

faţă de suprafaţă (Tabel 14).

A fost calculată şi energia de adsorbţie (sau de legare) a complexului aur-moleculă

precum şi energia de deformare elastică a moleculei adsorbite. S-a constatat că valorile energiei

de deformare elastică sunt mai mici de 0.01 eV pentru toate configura ţiile investigate, valoare

care este aproape de precizia numerică a metodei DFT. Într-o primă aproximare, putem

considera că molecula nu este deformată prin adsorbţia pe suprafaţă, în acord cu modelul

fizisorbţiei slabe (Tabelul 15).

Energia de legatură a tiofenului în configuraţie plană este cu aproximativ 0.1 eV mai

joasă decât cea în configuraţie perpendiculară, ceea ce indică faptul că la o rată mică de acoperire

este preferată configuraţia plană în vreme ce la o rată ridicată de acoperire este preferată

configuraţia perpendiculară. Cele mai bune rezultate au fost obţinute prin utilizarea funcţionalei

LMKLL.

Pentru a calcula transferul de sarcină am folosit două metode. În primul model, am

eliminat o parte a sistemului (de exemplu, metalul sau atomii organici) şi am calculat densităţile

Tabel 14. Parametrii geometrici ai adsorbatelor (distanţele

minime şi maxime faţă de suprafaţă (Dmin şi Dmax), variaţia

maximă a unghiului asimetric. De sus în jos, rezultatele

LMKLL, DRSLL si KBM.

Figura 89. Reprezentarea grafică a

structurilor relaxate împreună cu

conturul transferului de energie între

moleculă şi suprafată calculat la 0,0005

e/Bohr3.

90

de sarcină pe atomii ramaşi. În a doua metodă, am păstrat întregul sistem rezultat în urma

relaxării structurale, dar am setat ca atomi- fantomă atomii componenţi pentru fiecare dintre cele

două părţi ale sistemului (substratul de aur şi moleculele). S-a estimat transferul de sarcină între

moleculă şi suprafaţă prin integrarea densităţii electronice pe domeniile spaţiale selectate, iar

valorile transferului de sarcină sunt prezentate în Tabelul 15 şi sunt comparate cu valorile

populaţiilor Hirschfeld pentru toţi atomii din molecule. Se poate observa că rezultatele sunt

negative şi apropiate de zero. Integrala densităţilor de sarcină este în acord calitativ cu

populaţiile Hirschfel. Dacă folosim atomi- fantomă pentru a calcula densitatea de sarcină, există o

tendinţă clară de a obţine valori mai mari. O investigaţie detaliată a transferului de sarcină pentru

regiunile selectate (Figura 90) este prezentată în Figura 91. Variaţiile sunt relativ mari, indicând

faptul că pentru acest sistem suprapunerea seturilor de bază are cel mai important efect asupra

densităţii de sarcină.

Tabel 15. Energia de adsorpţie pentru tiofen fară/cu corecţia BSSE şi suma populaţiilor Hirschfeld.

Sunt raportate valorile pentru toate cele trei funcţionale.

Figura 90. Reprezentarea schematică a traseului pentru

calcularea transferului de sarcină între moleculă şi

suprafaţă.

Figura 91. Reprezentarea schematică a

densităţilor de sarcină calculate cu LMKLL

pentru toate configuraţiile investigate.Liniile

roşii - BSSE inclus. Linii negre punctate fără

BSSE.

91

Se observă o fluctuaţie relativ importantă în segmentul DE (molecula-suprafaţă) dar

valorile sunt neglijabile. Acest lucru este în concordanţă cu concluzia anterioară, principalul

efect al suprapunerii setului de bază este de a produce variaţii ale densităţii electronice pe regiuni

largi în spaţiu, mai degrabă decât de a produce schimbări importante în regiuni bine localizate.

În continuare s-au simulat doi macrociclii (Figura 92) pe suprafeţe de Au şi SiO2. Două

forme izomerice (molecula 1 – curbată şi molecula 1* - planară) au fost testate. În urma

comparării stabilităţii energetice a moleculei în cele două stări în urma relaxării structurale (în

vid) s-a stabilit că nu există diferente energetice semnificative între cele două structur i.

Figura 92. Molecula 1 (stânga). Structura moleculară optimizată până la 0.04 eV/Ang; Molecula 1* (centru)

relaxată în vid până la un gradient de 0.4 eV/Ang; Molecula 2 (dreapta). Structura planară a moleculei

relaxată în vid până la un gradient de 0.4 eV/Ang.

Construcţia suprafeţei de Au (Figura 93 (a)) s-a făcut ţinându-se cont de dimensiunea

celei mai mari molecule astfel încât să nu existe interacţiune între mai multe molecule adsorbite

pe suprafaţă. În consecinţă suprafaţa include 12x12 atomi pe strat şi două straturi (în total 288

atomi). Suprafaţa de SiO2 (Figura 93 (b)) a fost construită cu o dimensiune suficientă pentru a

evita interacţiunea între mai multe molecule adsorbite pe suprafa ţă. Moleculele simulate pe

suprafeţe sunt prezentate în Figura 54.

(a) (b)

Figura 93. (a) Suprafaţa de Au(111) cu dimensiunea de 12x12x2 atomi. (b) Suprafa ţa de SiO2 cu

dimensiunea de 4x4x1 unităţi de bază.

92

(a) (b) (c)

Figura 94. (a) Molecula 1 pe Au(111); (b) Molecula 1* pe Au(111); (c) Molecula 2* pe Au(111).

Tabelul 16 sumarizează valorile energiei de adsorbţie moleculă-suprafaţă pentru toate

sistemele investigate, iar Tabelul 17 prezintă distanţele minime atom – suprafaţă pentru fiecare

tip de atom din moleculă în cazul fiecărui sistem.

Structura electronică a moleculelor relaxate în vid este reprezentată în Figura 95. Sunt

reprezentate densităţile de stări proiectate pe fiecare tip de atom din moleculă.

Molecula 1: Se remarcă

posibilitatea de interacţiune dintre

aceşti atomi şi suprafaţa de aur.

Molecula 1*: principala modificare

faţă de molecula 1 este aplatizarea

picului azotului, pierzând

capacitatea de a interacţiona cu

suprafaţa.

Molecula 2: nu mai există stări

suficient de apropiate de

nivelul Fermi.

Figura 95

Tabelul 16

Molecula C O N S

1_Au 2.99 4.84 3.66 3.37

1*_Au 3.08 3.33 3.27 3.23

2_Au 3.11 3.38 3.5 3.03

1_SiO2 1.02 3.66 2.66 2.53

2_SiO2 0.93 1.23 1.97 0.53

Tabelul 17

Molecula Eleg (eV)

1_Au -4.22

1*_Au -5.30

2_Au -3.28

1_SiO2 -14.90

2_SiO2 -16.50

93

Structura electronică a moleculelor adsorbite pe Au(111) este reprezentată în Figura 96.

Sunt reprezentate densităţile de stări proiectate pe fiecare tip de atom din moleculă.

Molecula 1: sulful

interacţionează cu metalul.

Molecula 1*: atomii de oxigen

interactionează puternic cu

suprafaţa.

Molecula 2: oxigenul este cel care

interacţionează cu suprafaţa.

Figura 96

Structura electronică a moleculelor adsorbite pe SiO2 este reprezentată în Figura 97.

Molecula 1: reprezentare geometrică a sistemului

moleculă-suprafaţă.

Molecula 2: structura adsorbită pe SiO2.

Molecula 1: se remarcă anularea densităţilor de stări

la nivelul Fermi – consecintă a interacţiunii cu

suprafaţa.

Molecula 2: similar cu datele pentru molecula 1, dar

fără densitate de stări la nivelul Fermi pentru oxigen.

94

Densitatea de stări a atomilor din suprafaţa de SiO2

în interacţiune cu molecula 1: se remarcă existenţa

stărilor de nivelul Fermi atât pentru siliciu cât şi

pentru oxigen.

Densitatea de stări a atomilor din suprafaţa de SiO2

în interacţiune cu molecula 2: structura electronică

este foarte similară celei din cazul primei molecule.

Figura 97

Depunerea bioconjugatelor pe suprafeţe în paternuri geometrice prin nanolitografie

DipPen

Monostraturi moleculare şi biomoleculare depuse prin nanolitografie DipPen

Funcţionalizarea suprafeţelor utilizând cerneluri moleculare

Pentru testarea electrozilor interdigitizaţi obţinuţi în vederea posibilităţii de funcţionalizare cu

molecule cu afinitate pentru Au şi cu proprietăţi de autoasamblare, s-a folosit tehnica de

nanolitografie DPN, iar cerneala moleculară testată a fost MHA (acid mercaptohexadecanoic).

Imaginea AFM a noului sistemului poate fi vizualizată în Figura 98.

Figura 98. Imagine AFM a unui electrod de Au cu

molecule de MHA.

Tehnica de nanolitografie DPN a fost aplicată şi în vederea scrierii cu cerneluri

moleculare pe bază de L-Glutation (GSH) pe suprafaţă de Au şi albumină serică umană (HSA)

Pătrat de 1 × 1 µm

obţinut prin depunerea

de MHA pe electrodul

de Au prin tehnica DPN

95

pe suprafaţă de sticlă funcţionalizată cu gruparea amino. Pentru procesul de nanolitografie Dip-

Pen, un vârf de AFM se imersează în soluţia conţinând compusul de lucru, timp de 10 minute.

Au fost efectuate experimente de scriere pe suprafeţe de aur utilizând soluţii de GSH (2

mgmL-1) în apă dublu distilată în care s-a adăugat un surfactant netoxic, şi anume Tween 20

(TW 20) (Figura 99), în diferite concentraţii, de 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 şi 0.1% (v/v).

O

HO NH

O

NH2

SH

HN

O

OH

O

L-Gutation (GSH) =

glicisglu

HOO

O

OOH

OOH

OO

O

y

x

w

z

w+x+y+z=20

Tween 20 (TW 20)

Y

Figura 99. Nanolitografia Dip-Pen cu cerneală moleculară de L-Glutation şi Tween 20.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 100. (a) Topografia AFM a suprafeţei solide de Glutation; (b) Secţiunea medie a profilului de

înălţime a glutationului pe suprafaţă; (c) Scrierea liniilor de calibrare de diferite grosimi; (d)

Secţiunea medie a profilului de înălţime a glutationului pe fiecare linie scrisă.

Suprafata de Au

Varf AFM

Directia de Scriere

Menisculde Apa

TransportMolecular

YYYYYYYYY

Y YY

YY

Y

YYY

Y

YY

Y

1 µm

3D

Line 1 Line 2 Line 3 Line 4 Line 5

2D

292 nm

263 nm 241 nm 215 nm

185 nm

1.25 µm

2D

2.9 µm

3.5 µm

96

Adăugarea de Tween a favorizat atingerea unui optim de umectare ducând la un optimum

al forţelor de distribuţie pentru transferul cernelii pe suprafaţa de aur. Îmbunătăţirea rezoluţiei

spaţiale pe măsura creşterii concentraţiei de surfactant TW 20 adăugat în soluţia de GSH a fost

observat. Procedeul de scriere a constat în: (i) iniţierea procedeului standard de scriere a unei

suprafeţe mari de 1 μm (Figura 100 (a)) pentru a fi siguri că cerneala este pe vârf şi aderă la

suprafaţă. În Figura 100 (b) se poate observa o secţiune medie care arată înălţimea stratului de

glutation pe suprafaţă; (ii) 5 linii de calibrare de diferite grosimi au fost trasate cu acul DPN pe

suprafaţa de Au (Figura 100 (c)) pentru setarea finală premergătoare scrierii dorite pe suprafaţă.

Figura 98 (d) arată secţiunea medie a înălţimii stratului molecular pe suprafaţă.

În procesul final de scriere am ales să scriem pe suprafa ţa de Au într-un domeniu de 5.33

μm atât cu linii de diferite grosimi, dar şi cu puncte care au o rază diferită. Figura 101 arată

rezultatul scrierii atât în format 2 D cât şi 3D.

(a) (b)

Figura 101. (a) Imaginea LFM de linii si puncte de GS H a procesului de depunere prin DPN; (b)

Imaginea 3D a liniilor si punctelor trasate.

Se demonstrează astfel capabilitatea DPN de a crea modele complexe de scriere la scară

nanometrică cu posibile aplicaţii în electronică moleculară sau biosenzoristică. În cazul

experimentelor DPN pe bază de albumină serică umană (HSA) (Figurile 102 şi 103), s-a preparat

o soluţie de HSA (1.9 mg mL -1) în tampon fosfat salin (pH = 7.4).

Figura 102. Imagini AFM ale suprafeţei de sticlă Figura 103. Scriere DPN cu HSA

funcţionalizată cu aldehidă. pe sticlă funcţionalizată cu aldehide

3D 2D

Sticla functionalizata

cu aldehide

HSA

Linia

1

Linia

2

Linia

3

100nm

nmn

80 nm 60 nm 0.30 0.22

X Range: 5.33

µm

97

Caracterizarea prin spectroscopie Raman a unui linker molecular model

Identificarea unei metode robuste de testare a monostraturilor moleculare

Spectroscopia Raman şi în particular, spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă

(SERS – Surface enhanced Raman scattering) este un instrument foarte util în determinarea

proprietăţilor fizico-chimice şi a structurii moleculare a probelor, pe baza poziţiei şi intensităţii

benzilor spectrului Raman. Cantităţile de substanţă folosite sunt de ordinul mg, mai ales în cazul

spectroscopiei SERS, unde detecţia este posibilă chiar la nivel de single-molecule detection.

Scopul utilizării celor 2 tipuri de spectroscopii vibraţionale a fost pentru a oferi informaţii

complementare celor furnizate de imaginile AFM ob ţinute pe molecula de GSH, folosită în

procesul de scriere DPN.

Înregistrarea spectrelor Raman ale compusului GSH (Figura 104) s-a realizat pe o

platformă NTEGRA Spectra, care îmbină un spectrometru Raman confocal SOLAR TII cuplat

cu microscoape AFM în două configuraţii diferite. Spectrele Raman şi SERS au fost obţinute

utilizând laserul 532 nm (verde) la o putere de 4.5 mW, atât pe probe în stare solidă (Raman,

SERS), cât şi în stare lichidă (experimentele SERS). Ca şi substrat SERS s-a utilizat coloid de

argint (Figura 105). Probele lichide pentru spectrele SERS au fost preparate prin adăugarea a 100

sau 200 µl de soluţie GSH (concentraţie de 10 mM) la 400 µl coloid de argint (50 - 60 nm).

Figura 104. Formula chimică a GS H. Figura 105. Coloid de argint folosit în

experimentele S ERS.

Spectrul Raman a fost înregistrat cu un număr de 500 de acumulări, un timp de

expunere de 2 secunde fiecare, cu re ţeaua de difractie 600/600 şi este prezentat în Figura 106.

Spectrele SERS au fost înregistrate cu un număr de 100 de acumulări cu timpul de

expunere de 2 secunde fiecare şi cu reţeaua de difractie 600/600. Figura 107 prezintă spectrul

SERS al moleculei de GSH în stare lichidă, iar Figura 108 este spectrul SERS al probei uscate pe

lamelă.

98

Figura 106. Spectrul Raman al moleculei de GS H în stare solidă.

Figura 107. Spectrul S ERS al moleculei de GS H în

stare lichidă.

Figura 108. Spectrul S ERS al moleculei de GS H în

stare solidă.

Următorul spectru SERS a obţinut folosind o cantitate de trei ori mai mare a coloidului de

Ag (Figura 109).

Comparând spectrele Raman şi SERS ale glutationului pot fi observate modificări

semnificative ale poziţiilor şi intensităţilor benzilor, ca urmare a interacţiunilor moleculei cu

suprafaţa nanoparticulelor de argint.

99

Figura 109. Spectrul S ERS al moleculei de GS H în stare lichidă, obţinut cu o cantitate de

coloid de Ag de 3 ori mai mare.

Informaţiile structurale care pot fi extrase din aceste spectre sunt foarte importante pentru

a observa modul în care se realizează interacţiunea între compuşii biologici şi suprafeţele

metalice. Acesta este un stadiu important în caracterizarea senzorilor moleculari fabrica ţi pe

substraturi de aur. Aceste tehnici spectroscopice vor fi folosite şi pentru compuşii sintetizaţi de

către partenerii noştri de la Facultatea de Chimie a Universităţii Babes-Bolyai.

Director proiect,

Prof. univ. dr. Tudor LUCHIAN