1  

Analiza structurala si modularea functionala a drenajului fluidului perivascular si al amiloidului Abeta in creier

Director proiect: Prof. Univ. dr. Pirici Nicolae-Daniel, U.M.F Craiova, Disciplina Metodologia Cercetarii Stiintifice, Departamentul I Stiinte Morfologie

Raport Stiintific I (09.01.2017- 31.12.2017)

Obiectivele fazei de executie

In etapa I a proiectului, s-au organizat si efectuat o serie de intalniri intre membrii echipei, s-au optimizat procedurile si tehnicile de lucru, si s-au obtinut rezultatele propuse, unele fiind valorificate deja prin publicatii/prezentari.

1. Initierea managementului proiectului.

1.1. Intalnire de lucru intre parteneri; stabilirea protocoalelor finale de lucru.

S-au discutat in cadrul acestor intalniri obiectivele proiectului, si daca acestea constituie inca elemente de maxima actualitate, avand in vedere timpul scurs de la data propunerii initiale in competitie. Pe baza studiului de documentare bibliografica, echipa si-a updatat baza de referinte bibliografice, iar publicatiile arata ca nu exista inca rapoarte ale utilizarii unui inhibitor selectiv de aquaporina 4 (AQP4) (produs denumit commercial TGN-020) in modularea curgerii perivasculare a lichidului interstitial in creier, si implicit al drenajului peptidului precursor al amiloidului (Aβ). Este cunoscut faptul ca modele animale murine purtatoare de mutatii la nivelul proteinelor APP (proteina precursoare a amiloidului) si PS1 (Presenilina 1), ce reproduc patologia amiloida din maladia Alzheimer, vor depozita predominant amiloid perivascular in momentul in care nu mai exprima AQP4 (AQP4 -/-) (Xu, Xiao et al. 2015). Acest lucru sugereaza implicarea AQP4 in modularea curgerii si clearance-ului perivascular al Aβ, insa ideea nu a fost abordata inca pana in prezent. Pe de alta parte, nici descrierea anatomo-histologica complexa a vaselor cu fenotip limfatic de la nivelul SNC nu a fost extinsa peste o analiza a leptomeningelui (Louveau, Smirnov et al. 2015). In concluzie, obiectivele generale ale proiectului de fata si-au pastrat inca prioritatea si actualitatea stiintifica.

Intrucat biobaza UMF Craiova a primit foarte recent familii de soareci transgenici pe fond C57BL/6 ce exprima proteine fluorescente legate de astrocite, oligodendroglii sau microglii, s-a hotarat intre membrii echipei ca toate experimentele de injectare intracerebrala a amiloidului sa se desfasoare pe aceste animale, pentru a examina in vivo in mod ideal reactiile celulare si vasculare in dinamica lor (de exemplu modelul CX3CR1 ce exprima microglii fluoresente verzi) (Jung, Aliberti et al. 2000). S-a decis astfel mentinerea numarului de animale de experienta, conform planului propus in proiectul depus, pentru toate loturile studiului de injectere intracerebrala, dar cu utilizarea acestui nou model disponibil.

1.2. Semnarea unui acord cu Comisia de Etica a UMF Craiova si respectiv UMF Crol Davila; crearea unei pagini web dedicate a proiectului. Ulterior primei intalniri intre membrii echipei, si consecutiv deciziei de a mentine numarul de animale si metodologia de lucru propusa in forma depusa a proiectului, s-a formulat o cerere de avizare a proiectului de catre Comisiile de Etica ale celor doua UMF partenere. Aprobarile cu numarul 199/24.10.2017 (pentru UMF Craiova) si respectiv 125/16.06.2017 (pentru UMF Carol Davila) sunt anexate in copie acestui raport. Pe site-ul UMF Craiova a fost creata o pagina dedicata proiectului ce va fi updatata periodic, pe masura evolutiei acestuia (http://www.umfcv.ro/143ped).

2  

2. Injectia intracerebrala a Aβ40 cu /fara inhibitorul de AQP4. Evaluarea in vivo in microscopie cu doi fotoni

In scopul perfectionarii tehnicilor necesare injectiei sub microscop a unor volume mici, in coordinate stereotaxice bine definite, s-a realizat intai un prototip de sistem de atasare a unui micromanipulator pe platanul microscopului cu stimulre doi fotoni (2P) din cadrul biobazei UMF Craiova, prin design si printare tridimensionala cu ajutorul imprimantei 3D UP BOX plus (Tiertime Corp.) ce face parte din dotarea UMF Craiova. Designul a fost realizat cu ajutorul interfetei online Tinkercad (Autodesk Tinkercad, https://www.tinkercad.com), prin colaborarea intre membrii proiectului din UMF Craiova si UMF Carol Davila (Figura 1).

Figura 1. Design-ul suportului pentru micromanipulator, in platforma de desen Tinkercad si instrumental montat pe platanul microscopului, dupa printare 3D.

In scopul injectarii unor volume mici in timp de cateva minute, vom utiliza o microseringa Hamilton cu volum de 1µl, care insa nu pote fi actionata manual constant la o viteza de descarcare de cateva minute. In acest scop am pus la punct un prototip de minipompa controlata electronic ce actioneaza constant si controlabil pistonul seringii (Figura 2).

Figura 2. Sistemul de actionare si control al microseringii Hamilton in cadrul aparatului de pozitionare stereotaxica.

Toate loturile de animale transgenice necesare pentru acest studiu sunt in prezent in curs de injectare sub microscop, dupa optimizarea instrumentarului descris si a solutiei de Aβ40 HiLyte FluorTM 555 (AnaSpec, USA; 3µl in 1% NH4OH), in scopul vizualizarii simultane a difuziei Aβ40 impreuna cu reactia celulara fluoresecnta endogen in aceste animale (Figura 3).

3  

Figura 3. Urmarirea reactiei celulare corticale la nivelul zonei de injectare intracerebrala, secventa temporala surprinsa in microscopie 2P. Astrocitele sunt verzi, oligodendrogliile rosii, iar resturile de

dura albastre.

Pentru animalele ce vor fi tratate cu inhibitorul de AQP4, se va utiliza compusul TGN-020 [N-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)pyridine-3-carboxamide], in doza de 200 mg/kg dizolvat in ser fiziologic (Huber, Tsujita et al. 2009, Igarashi, Huber et al. 2011, Nakamura, Suzuki et al. 2011). Directorul de proiect contactase deja un producator capabil sa sintetizeze inhibitorul (http://www.uorsy.com), intrucat produsul disponibil de exemplu la Sigma-Aldrich avea un pret prohibitiv la cantitatea necesara in proiectul de fata, si in plus, aceasta forma neutra ar putea prezenta probleme de solubilitate in ser fiziologic. S-a contactat producatorul de mai sus si s-a initiat comanda de sinteza a unei sari de de Cl care sa prezinte o solubilitate crescuta in ser fiziologic [N-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)pyridine-3-carboxamide dihydrochloride]. In urma discutiei dintre membrii din UMF Craiova si UMF Carol Davila s-a hotarat ca sarea de Cl este de preferat fata de sarea de Na utilizata in alte studii.

Rezultatele preliminarii ale acestui studiu arata pentru prima data in literatura ca inhibarea AQP4 (se presupunea teoretic pana in prezent ca AQP4 ar avea rolul de facilitare a difuziei apei din interstitiu in spatiul perivascular si invers) duce la blocarea eliminarii Aß solubil din parenchimul cerebral. Se preconizeaza deci aparitia a cel putin unei publicatii intr-un jurnal cu factor de impact important in domeniu.

3. Procesarea si arhivarea tesutului in vederea investigatiilor histo- si imunohistochimice.

Toate animalele de testari prealabile a metodei de injectie si cele destinate studiului vascularizatiei limfatice meningo-cerebrale au fost deja sacrificate si procesate pentru includerea la parafina, fiind deja analizate histopatologic si imunohistochimic.

4. Prelucrarea si examinarea histopatologica si imunohistochimica a tesutului arhivat.

Toate tesuturile incluse la parafina au fost deja analizate in ceea ce priveste reactia gliala in jurul situsului de injectare, rezultatul fiind o reducere a gliozei reactive la animalele tratate cu TGN-020 (rezultat prezentat in cadrul unui conferinte). Colateral, suntem interesati daca pe un model animal de traumatism cerebral, inhibarea AQP4 poate avea efecte benefice si poate imbunatati recuperarea clinica.

4  

Observatia ca TGN-020 reduce transferal apei in parenchim, reducand deci edemul cerebral, ne-a facut sa evaluam efectul sau si dupa un accident vascular cerebral ischemic, acolo unde etapa initiala de edem citotixic nu poate fi contracarata prin mijloace terapeutice curente. Rezultatele analizei histopatologice si imunohistochimice detaliate arata ca inhibarea AQP4 duce la reducerea gliozei si apoptozei la animalele tratate (Figura 4), si ca tratamentul potenteaza si efectul unor neuroprotectoare precum Crebrolysin (Figura 5). Ambele rezultate sunt deja in curs de evaluare in jurnalele “International Journal of Molecular Sciences” si respectiv “CNS & Neurological Disorders - Drug Targets”.

Figura 4. Pe un model murin tratat cu TGN-020 dupa un accident vascular cerebral ischemic se arata reducerea densitatii de celule apoptotice comparativ cu animalele netratate.

Figura 5. Mentinerea densitatii neuronale la animale tratate cu Cerebrolysisn si TGN-020 dupa un AVC ischemic comparativ cu animalele tratate numai cu Cerebrolysin.

5  

5. Microscopie electronica de transmisie-analiza datelor obtinute

O parte din blocurile incluse au fost postfixate in glutaraldehida si sunt deja examinate si in curs de evaluare integrativa prin Microscopie Electronica (EM) in cadrul UMF Carol Davila (EM de transmisie), dr si in cadrul universitatii din Southampton, UK, in laboratorul de histologie condus de dna Prof Roxana Carare (examinare EM pe sectiuni seriate printr-o tehnica existenta in acest laborator). Se preconizeaza aparitia a cel putin unei publicatii in urma colaborarii dintre cee doua centre din Romania si laboratorul din Southampton pe durata derularii acestui proiect.

6. Screening anatomo-histologic al vaselor limfatice durale

Proiectul depus a propus analiza vaselor limfatice durale de la nivelul encefalului, in lumina descoperirii prezentei reactivitatii pentru markeri limfatici la acest nivel. In acest scop s-a inceput evaluarea unor tehnici de decalcificare si procesare pentru includere la parafina in vederea evaluarii parenchimului cerebral impreuna cu oasele craniului.

Intrucat procesarea pentru includerea la parafina duce la o reducere volumetrica de aproximativ 25% a piesei histologice, in functie de continutul in apa al tesutului, ne-a interesat ce tehnica de decalcificare reduce suficient duritatea oaselor neurocraniului pentru ca acestea sa nu se desprinda de parenchimul cerebral in timpul procesarii. In al doilea rand, tehnica de decalcificare nu trebuie sa afecteze antigenicitatea tesutului pentru a putea efectua apoi si teste imunohistochimice pentru vizualizarea simultana a vaselor de sange si limfatice.

Rezultatele optimizarilor noastre au aratat ca:

1. Dintre cele mai utilizate doua metode de decalcificare (incubarea cu acid formic 5-10% si respectiv 5-10% EDTA, cea din urma mentine cel mai bine antigenicitatea tesutului) (Figura 6).

Figura 6. Decalcificrea in solutie tamponata de EDTA mentine antigenicitatea tesutului mai bine comparativ cu FA.

2. Indiferent de metoda de decalcificare, procesarea tesutului pentru includere la parafina contine o serie de pasi de deshidratare obligatorii, si incepand cu deshidratarea in etanol 90% incepe un proces de contractare selectiva a tesutului ce duce la distrugerea continuitatii os-parenchim (Figura 7).

6  

Figura 7. Procesarea pentru includere la parafina induce retractia encefalului de pe calota craniana incepand cu solutia de alcool 90%.

3. Incubarea in parafina topita peste noapte (parafina clasica cu punct de topire de 56˚) duce la o contractare suplimentara a parenchimului cerebral si o desfacere a sa de pe calota craniana (Figura 8). Aceste date au aratat ca nu putem folosi tehnica calsica de includere la parafina si ca este nevoie de o metoda alternativa.

Figura 8. Rezultatul decalcificarii cu EDTA 5-10% si al procesarii prin includere la parafina. Se observa desprinderea masiva a parenchimului cerebral de oasele neurocraniului si viscerocraniului.

4. In aceasta situatie, am revizuit literatura tehnica legata de procesarea si includerea tesutului intr-un mediu de sectionare (respingand ideea sectionarii la gheata datorita morfologiei de calitate inferioara a acestor preparate). O solutie putin utilizata astazi datorita unor costuri mai ridicate pentru analize de rutina s-a dovedit a fi inlocuirea parafinei clasice cu un amestec de polietilenglicoli (PEG), un produs care exista pe piata si care poarta denumirea de Parafina poliesterica (PEG) (VWR cod 360704E) (Steedman 1957). Avantajele utilizarii PEG sunt ca este miscibila cu alcoolul 90% si ca are temperatura de topire de 38˚C, deci parea un produs ideal pentru necesitatile noastre. Am achizitionat si testat acest produs, iar rezultatele au aratat in final o pastrare a integritatii interfetei parenchim –calvaria, cu retinerea antigenicitatii in cazul procesarii pentru imunohistochimie (Figura 9).

7  

Figura 9. Procesarea si includerea tesutului decalcificat in parafina PEG arata o retinere a integritatii interfetei os- parenchim cerebral.

In concluzie, desi datorita obstacolelor tehnice aceasta a fost de departe cea mai lunga perioada a primei etape a proiectului de fata, am obtinut in final un protocol care sa permita evaluarea unitara a craniului si a encefalului in scopul evaluarii vaselor de sange si limfatice de la nivelul meningelui.

Apoi, conform planului propus, am urmarit din punct de vedere imunohistochimic identificarea simultana pe aceste tesuturi a endoteliului vascular in general, impreuna cu un marker specific endoteliului limfatic. Am efectuat tehnici de imunohistochimie dubla secventiala pentru vizualizarea CD31 (sobolan anti-mouse Abcam ab56299 sau Santa Cruz sc-101454) si a Lyve-1 (iepure anti-mouse Abcam ab36993 sau ab33682). Au fost alesi cate doi anticorpi pentru fiecare tinta pentru a nu considera observatiile incidentale. Anticorpii au fost detectati separat cu cate un sistem polimeric conjugat cu HRP si dezvoltat fie pentru IgG de iepure, fie pentru IgG de sobolan (Nikirei Histofine). Intre cele doua detectii s-a utilizat o metoda de elutie si blocare a HRP introduse in literatura de grupul nostru (Pirici, Mogoanta et al. 2009), iar detectia chimica s-a realizat fie cu DAB (Vector Labs) fie cu Permanent HRP Green (Zytomed, cod ZUC070-100).

In scopul separarii celor doua culori, chiar si in cazul suprapunerii lor), utilizam o camera de achizitie microscopica multispectrala unica in tara (Nuance FX, Perkin Elmer), care permite selectarea si separarea semnalelor in functie de lungimea de unda emisa in spectrul vizibil, fiind la ora actuala o metoda avizata si pentru diagnosticul histopatologic (Figura 10). Prin optimizarea acestei camere multispectrale grupul nostru a participat si la elaborarea unor lucrari legate de evaluarea imunohistochimica a plexurilor nervoase mienterice in diferite tipuri de tumori ale tubului digestiv, dintre care una este deja publicata (Tartea, Florescu et al. 2017).

8  

Figura 10. Imunohistochimie dubla enzimatica (Lyve 1 – maro, CD31 – verde) in care separarea spectrala a celor doua semnale ilustreaza ca pe masura ce vasele de sange leptomeningeale mari

(verde) se ramifica, isi pierd treptat fenotipul limfatic (maro)

Au fost realizate si preparate fluorescente in care cei doi anticorpi primari au fost detectati cu ajutorul unor secundari anti-iepure si respectiv anti-sobolan marcati cu AlexaFluor555 si Alexa Fluor 596, sectiunile fiind apoi procesate prin deconvolutie (Figura 11). Analiza imagistica se desfasoara in prezent pe statiile grafice aflate in dotarea ambilor parteneri ai proiectului.

Figura 11. Imunohistochimie dubla fluorescenta in care se observa din nou faptul ca vasele de sange leptomeningeale mari se ramifica, isi pierd treptat fenotipul limfatic (centrifuge fata de vasele mari

leptomeningeale, majoritatea vaselor devin Lyve-1 negative).

7. Diseminarea rezultatelor

In aceasta etapa a proiectului s-a initiat o pagina web dedicata proiectului (http://www.umfcv.ro/143ped), s-au stabilit si confirmat protocoalele finale de lucru, si s-au obtinut acordurile comisiilor de Etica ale UMF Craiova si UMF Carol Davila.

In cadrul etapei de documentare asupra proceselor neurodegenerative din dementa de tip Alzheimer, ne-a interesat si updatarea bazei de publicatii asupra rolului proteinei tau asociate microtubulilor (MAP-tau), ocazie cu care a fost redactat un review in acest sens, acceptat spre publicare:

9  

Denisa Floriana Vasilica Pîrșcoveanu, Ionica Pirici, Valerica Tudorica, Tudor Adrian Balseanu, Carmen Valeria Albu, Simona Bondari, Ana Maria Bumbea, Mircea Pîrșcoveanu. Tau Protein In Neurodegenerative Diseases – A Review. Acceptat in Romanian Journal of Morphology and Embriology.

Optimizarea sistemului de analiza imagistica multispectrala a dus la publicarea unui articol si la acceptarea spre publicare a altuia:

Tartea, E. A., C. Florescu, I. Donoiu, D. Pirici, A. R. Mihailovici, V. C. Albu, T. A. Balseanu, M. Iancau, C. D. Badea, C. C. Vere and V. Sfredel (2017). Implications of inflammation and remodeling of the enteric glial cells in colorectal adenocarcinoma. Rom J Morphol Embryol 58(2): 473-480.

Diana Rodica Tudorașcu, Daniel Pirici, Elena-Anca Târtea, Edme Roxana Mustafa, Cristina Florescu, Cristin Constantin Vere, Alina Maria Balea, Ileana Puiu, Georgică-Costinel Târtea, Carmen Valeria Albu. Synaptic expression as prognostic factor for survival in colorectal carcinomas. Acceptat in Romanian Journal of Morphology and Embriology.

Sunt in prezent in curs de evaluare doua articole:

Ionica Pirici, Tudor Adrian Balsanu, Catalin Bogdan, Claudiu Margaritescu, Tamir Divan, Vacaras Vitalie, Laurentiu Mogoanta, Daniel Pirici, Roxana O Carare, Dafin Fior Muresanu. Inhibition of aquaporin-4 improves the outcome of ischaemic stroke and modulates brain paravascular drainage pathways. In curs de evaluare la “International Journal of Molecular Sciences”.

Bogdan Catalin, Ionica Pirici, Tudor Adrian Balseanu, Adina Stan, Valerica Tudorica, Maria Balea, Ion Mindrila, Carmen Valeria Albu, Guleed Mohamed, Daniel Pirici, Dafin Fior Muresanu. Cerebrolysin and aquaporin 4 inhibition improve pathological and motor recovery after ischemic stroke. In curs de evaluare la “CNS & Neurological Disorders - Drug Targets”

Initierea procedeelor de injectare intracerebrala a dus la aparitia de prezentari in cadrul unor conferinte, dupa cum urmeaza:

Ionica Pirici, Bogdan Catalin, Adrian Balseanu, Laurentiu Mogoanta, Claudiu Margaritescu, Gabriela-Camelia Nicola, Nicolae-Daniel Pirici. Evaluarea efectului inhibarii aquaporinei 4 asupra difuziei fluidelor in parenchimul cerebrl si asupra curgerii parvasculare a lichidului interstitial. Al XV-lea Simpozion Nationl de Morfologie Microscopica cu participare internationala, 24-27 mai 2017, Baile Felix, Oradea.

Ionica Pirici, Bogdan Catalin, Adrian Balseanu, Laurentiu Mogoanta, Claudiu Margaritescu, Elena Silvia Popescu, Daniel Pirici. Optimization of whoile mouse head processing for paraffin embedding with minimal volumetric changes for morphology studies. The 8th Conference of the National Neuroscience Society of Romania (Neurodegeneration and regeneration From cells to mind), 19-21 octombrie 2017, Craiova

Adrian-Tudor Balseanu, Ionica Pirici, Bogdan Catalin, Claudiu Margaritescu, Laurentiu Mogoanta, Dafin Fior Muresanu, Daniel Pirici. New targeting patways in ischemic stroke – aquaporin. The 8th Conference of the National Neuroscience Society of Romania (Neurodegeneration and regeneration From cells to mind), 19-21 octombrie 2017, Craiova

Alexandru Cojocaru, Sanziana Godeanu, Diana Barbulescu, Nicolae Vladulescu, Maria Brosteanu, Mona-Irina Dragan, Mircea Sebastian Serbanescu, Tudor-Adrian Balseanu, Bogdan Catalin. Cranial window implantation alters superficial vascular network. The 8th Conference of the National

10  

Neuroscience Society of Romania (Neurodegeneration and regeneration From cells to mind), 19-21 octombrie 2017, Craiova

07.12.2017 Director proiect, Prof. Univ. dr. Pirici Nicolae-Daniel

11  

Referinte Bibliografice 

 

Huber, V. J., M. Tsujita and T. Nakada (2009). "Identification of aquaporin 4 inhibitors using in

vitro and in silico methods." Bioorg.Med.Chem. 17(1): 411-417.

Igarashi, H., V. J. Huber, M. Tsujita and T. Nakada (2011). "Pretreatment with a novel aquaporin

4 inhibitor, TGN-020, significantly reduces ischemic cerebral edema." Neurol.Sci. 32(1): 113-116.

Jung, S., J. Aliberti, P. Graemmel, M. J. Sunshine, G. W. Kreutzberg, A. Sher and D. R. Littman

(2000). "Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent

protein reporter gene insertion." Mol Cell Biol 20(11): 4106-4114.

Louveau, A., I. Smirnov, T. J. Keyes, J. D. Eccles, S. J. Rouhani, J. D. Peske, N. C. Derecki, D.

Castle, J. W. Mandell, K. S. Lee, T. H. Harris and J. Kipnis (2015). "Structural and functional features of

central nervous system lymphatic vessels." Nature 523(7560): 337-341.

Nakamura, Y., Y. Suzuki, M. Tsujita, V. J. Huber, K. Yamada and T. Nakada (2011). "Development

of a Novel Ligand, [C]TGN-020, for Aquaporin 4 Positron Emission Tomography Imaging." ACS

Chem.Neurosci. 2(10): 568-571.

Pirici, D., L. Mogoanta, S. Kumar-Singh, I. Pirici, C. Margaritescu, C. Simionescu and R. Stanescu

(2009). "Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the

same species and of the same subtype." J.Histochem.Cytochem. 57(6): 567-575.

Steedman, H. F. (1957). "Polyester wax; a new ribboning embedding medium for histology."

Nature 179(4574): 1345.

Tartea, E. A., C. Florescu, I. Donoiu, D. Pirici, A. R. Mihailovici, V. C. Albu, T. A. Balseanu, M.

Iancau, C. D. Badea, C. C. Vere and V. Sfredel (2017). "Implications of inflammation and remodeling of

the enteric glial cells in colorectal adenocarcinoma." Rom J Morphol Embryol 58(2): 473-480.

Xu, Z., N. Xiao, Y. Chen, H. Huang, C. Marshall, J. Gao, Z. Cai, T. Wu, G. Hu and M. Xiao (2015).

"Deletion of aquaporin-4 in APP/PS1 mice exacerbates brain Abeta accumulation and memory deficits."

Mol Neurodegener 10: 58.