metode biochimice

8/3/2019 Metode biochimice

1/20

Metode biochimice utilizate in aprecierea efectuluipoluantilor din mediu asupra organismului

Determinarea sulfiilor din snge


2/20

Generaliti: prezena sulfiilor n snge a fost considerat ca indicator deexpunere la bioxidul de sulf. Incostanta cu care au fost pui n eviden, semnificaiaacestui indicator bichimic la expunerile la concentraii ridicate.Principiul metodei: bioxidul de sulf din snge formeaz cu reactivul fuxin formolic uncomplex colorat a crui intensitate este proporional cu concentraia.

Reactivi:-formaldehid, soluie 40%;-pararozanilin 3% n soluie alcoolic;-reactiv fuxin-formolic;-hidroxid de potasiu, soluie alcoolic 1%;-soluie saturat de clorur mercuric(HgCl2);-soluie etalon stoc pentru bioxid de sulf;-soluie etalon de lucru.

Recoltarea probelor de snge: sngele care se recolteaz din deget e unanticoagulant.

Mod de lucru: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 0,5 ml soluie alcoolic

de KOH 1%, 2,2 ml ap bidistilat i 0,2 ml snge. Eprubeta se agit timp de 2-3minute apoi se adaug 1 ml soluie saturat de clorur mercuric, agitnd din nou. Secentrifugheaz la 4000 turaii, timp de 5 minute i apoi se iau cu atenie dinsupernatant 2 ml i se introduc ntr-o eprubeta peste care se adauga 4 ml reactiv foxin-formolic. Dupa 5 se citete extincia la spectrofotometru la lungimea de und de 570nm n cuva de 1 cm. Valoarea extinciei se raporteaz la curba de etalonare care sentocmete dup schema de mai jos:

Dup fiecare adugare de reactiv se agit eprubetele. Se las apoi 5 nrepaus i se citete extincia n aceleai condiii ca i proba. Se traseaz curba deetalonare.

Calcul: mg SO2% =c/v 10C =concentraia ng SO2 din proba de snge;V =cantitatea de snge luat n lucru, n ml.

Determinarea fluorului din urin

Generalit: calea principal de eliminare a fluorului din organism este cea renal. Lao ingestie normal de fluor, concentraia fluorului urinar este proporional cu ingestia. Dac

Concentraia SO2/proba g 0 1 3 5 7 9 10Soluia etalon de lucru ml 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0Ap bidistilat ml 1,5 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,5Soluia de clorur mercuric ml Cte 0,5 mlReactiv fuxin-formolic Ml Cte 4 ml


3/20

organismul este expus la concetraie crescut de fluor, nivelul fluorului din urin crete, darfr a se menine proporionalitatea cu gradul de expunere.

Principiul metodei: fluorul este separat din urin prin microdifuzie sub forma de HF,care este prins pe o pelicul de hidroxid de sodiu ca fluorura de sodiu. Dozarea se facecolormetric, prin decolorarea lacului SPANDS- azotat de thoriu, proporional cu concentraia

fluorului.Reactivi i material necesar:-hidroxid de sodiu: soluie alcoolic 0,05 N;-acid percloric 70%;-azotat de thoriu 0,004M;-soluie etalon stoc pentru fluor;-SPANDS, 0,004 M;-soluie etalon stoc entru fluor;-soluia etalon de lucru;-sulfat de argint, pulbere;-acid clorhidric 0,05;

-2,5 ml soluie de azotat de thoriu 0,004 M;-5,0 ml soluie SPANDS 0,004 M;-0,04 soluie de HCl 0,05 N;-ap bidistilat;-cutii din polistiren folosite la ambalajul medicamentelor (faringosept sau B

complex);-capace din plastic cu care se astup flacoanele de vitamina C.Recoltarea se face din urina din 24 de ore, ntr-un recipient de polistiren.Mod de lucru: 2 ml urin se introduc ntr-un capacel de plastic care se amplaseaz n

capacul unei cutii de polistiren. n corpul aceleiai cutii se introduce 1 ml soluie alcoolic dehidroxid de sodiu i se las la etuv la 60C pentru evaporarea alcoolului i formarea peliculeide hidroxid de sodiu.

n cpcelul cu urin se introduc 0,1g sulfat de argint i 2 mg acid percloric, senchide imediat cutia i se lipeste o fie de leucoplast n jurul cutiei pentru a evita pierderilede fluor.Paralel cu proba, n condiiile identice se procedeaz pentru proba martor (apa bidistilat) i 5etaloane care conin cantiti succesive de fluor (1; 3; 5; 7; 10 g F) introducndu-se nfiecare cpcel cte 0,1; 0,3; 0,7; i 1,0 ml soluie etalon de lucru de fluorur de sodiu. Secompleteaza apoi volumul cu ap bidistilat pn la 2 ml. n continuare se procedeaz ca i

pentru proba de urin. Cutiile bine nchise se introduc n etuv la 58-60C, timp de 20 orepentru realizarea difuziei.

Se scot cutiile de la etuv i n corpul cutiei unde s-a realizat pelicula de hiroxid ifixarea fluorului se introduc 2 ml ap bidistilat, 4 ml acid clorhidric 0,05 N i 4 ml lacSPANDS-azotat de thoriu.Dup 10 se citete extincia de la spectrofotometru la lungimea deund de 580 nm n cuva de 1 cm. Cu valorile extinciilor obinute pentru proba martor ietaloane se traseaz o curb.

Calcul: mg F/dm3 = c/vC =concentraia n g fluor din proba de urin luat n lucru;V =cantitatea de urin luat n lucru, n ml;Obs.: concentraia fluorului n urin la o expunere normal de fluor este ntre 0,5-1,5 mg/dm3.

Determinarea mercurului din urin

Generaliti: creterea concentraiei mercurului n urin poate indica depozitarea demercur sau intoxicaie cu acest metal. Totui rezultatele sunt neconstatate, dup ptrunderea


4/20

n organism mercurul disprnd repede din snge n urin. Mai constant i cu valoare mairidicat pentru diagnosticul de expunere este determinarea Hg n pr i unghii.

Principiul metodei: mercurul formeaz cu difeniltiocarbazona un complex colorat lapH =1,5-2,0.

Reactivi:

-E.D.T.A-Na2, soluie 0,1 N;-acid sulfuric conconentrat d= 1,84;-acid sulfuric diluat;-permanganat de potasiu, soluie saturat;-galben de metanil, soluie 0,1%;-rou de fenol, soluie 0,1%;-ditizon, soluie stoc 0,1% n cloroform;-ditizon soluie de lucru;-soluie de hidroxilamin 10%;-soluia e splare;-toluen pur;

-soluia etalon stoc pentru mercur;-amoniac concentrat.

Recoltarea probelor: urina se recolteaz din prima emisiune de diminea sau urinacolectat n 24 ore (vasele n care se face recoltarea trebuie bine cltite) cu soluie de acidazotic (1:25) i apoi cu apa bidistilat.

Mod de lucru: ntr-o capsul de porelan se introduc 50 ml urin, 5 ml H2SO4concentrat (d =1,840) i 15 ml soluie saturat de permanganat de potasiu. Se nclzetemoderat pe baia de nisip fr a ajunge la fierbere, acoperind vasul cu o sticl de ceas, pn celichidul supernatant devine limpede i incolor prezentnd pe fundul vasului un precipitat

brun. Dac precipitatul lipsete nseamn c trebuie s se mai adauge soluie de permanganatde potasiu i se continu nclzirea pn ce lichidul supernatant se decoloreaz complet. Duprcire excesul de permanganat se ndeprteaz cu hidroxilamina adugnd pictur cu

pictur pn la disparia precipitatului brun i apoi un exces de 5 ml hidroxilamin. Se treceproba cantitativ ntr-o plnie de separare, se ajusteaz pH-ul la 1,2-2,0 aa cum s-a artat ladeterminare mercurului din aer i se procedeaz n continuare la fel ca i la aer.

Calcul: g mercur/dm3 urin = C x 20C = concentraia n g mercur din proba de urin luat n lucru g mercur/urina din 24 ore =C x 20 x V24.V24 = cantitatea de urin colectat n 24 ore, n litri.Obs.: valoarea normal a mercurului n urin este de 30 g/urina din 24 ore.

Determinarea mercurului din pr

Principiul metodei: ionii de mercur n mediul acid formeaz cu difenilcarbazona uncomplex colorat n portocaliu, ditizonatul de mercur, care se extrage cu toluen i se poatecolorimetra.

Reactivi i material necesar:


5/20

-acid azotic d= 1.41 i soluii apoase de 2% i 10% n volume;-acid sulfuric d= 1,84 i soluie apoas de 50% n volume;-hidroxid de amoniu soluie 25%;-parmangant de potasiu soluie saturat;-clorur stanoas10% n HCl concentrat;

-galben de metalin soluie apoas 0,1%;-rou de fenol 0,1;-ditizon soluie stoc 0,1% i 0,5%;-ditizon, soluia de lucru;-clorhidrat cu hidroxilamin, soluie 10%;-E.D.T.A.- sarea de sodiu;-clorur stanoas soluie 10%;-soluia de splare;-soluie etalon stoc;-ap bidistilat n prezent permanganatului de potasiu i hidroxidului de sodiu.Mod de lucru : n balonul cu fundul rotund de la aparatul de distilat mercur se

introduc 2 g pr, civa ml de ap bidistilat, 10 ml acid azotic, 10 ml ap oxigenat i 2 mlclorur stanoas 10% n acid clorhidric. Se fixeaz balonul la parat i se da drumul la focfoarte ncet. Se distileaz aproximativ 1/2 or i se continu determinarea la fel ca ladeterminarea mercurului din ap.

Determinarea plumbului n snge

Generaliti: plumbul se gsete n snge att sub forma anorganic ct i legat deunele substane organice. Cea mai mare parte a plumbului din snge, se gsete n eritrocite.Concentraia plumbului n snge ne d indicaii cu privire la indigestia i eliminarea lui norganism, mai precis la cantitatea de plumb pe care organismul o fixeaz.

Principiul metodei: plumbul are proprietatea de a reaciona cu difenilcarbazona, nmediul alcalin cu care formeaz un complex colorat n rou, ditizonatul de plumb,colorimetrabil.

Reactivi:


6/20

-acid azotic (d= 1,40);-acid azotic 1% i 0,05% n clorofrom;-cloroform;-ditizon 0,01% i 0,05% n cloroform;-soluia tampon de citrat;

-soluia de splare;-soluia etalon stoc pentru plumb;-soluia etalon de lucru;-acid tricloracetic 10% i 5%;-acid percloric 70%.

Recoltarea: sngele se recolteaz prin puncie venoas cu un ac sterilizat prin fierberen ap distilat, pe fluorura de sodiu (0,1) ca anticoagulant.

Modul de lucru: 10 ml de snge bine omogenizat se introduc ntr-o eprubeta decentrifug de 50 ml n care se afl 10 ml ap bidistilat. Se amestec bine cu o baghet desticl pentru a se realiza hemoliza i apoi se adaug 10 ml acid tricloracetic 10%, pictur cu

pictur sub agitare continu. Se las apoi o or n repaus i se centrifugheaz la 3000 turaii,

timp de 5. Supernatantul se trece ntr-o capsula de porelan. n eprubeta de centrifug se maiadaug 10 ml acid tricloraceti. Se adaug 5 ml acid azotic 5% i se amestec binecentrifugdu-se din nou. Supernatantul se separ n aceeai capsul. Peste fraciunile extrasen tricloracetic se adaug 5 ml acid azotic concentrat (d = 1,42) i se nclzete pe baia denisip pn rmn aproximativ 5 ml lichid. Dup ce s-a rcit se adaug 0,5 ml pn la uscare.Dac reziduul nu este alb se mai adaug 1 ml acid azotic i 2-3 picturi de acid percloric i seevapor din nou la sec. Se repet operaia pn ce reziduul este perfect alb. Se adaug apoi 2ml ap bidistilat i se evapor iari pn la sec. Peste reziduul uscat se adaug 10 ml acidazotic (1 :25) i apoi coninutul se trece cantitativ ntr-o plnie de separare cu poriuni mici deap bidistilat (s nu depaeasc volumul final 40 ml). Se adaug 15 ml soluie tampon idac proba se tulbur se mai adaug soluie tampon pn la limpezirea complet.

Paralel se face o prob martor folosind 15 ml acid tricloracetic care se trateaz la felca i proba. n continuare se procedeaz la fel pentru determinarea plumbului n ap i aer.

Calcul : g Pb/100 ml snge = C x 10C = concentraia n g Pb din proba de snge luat n lucru;Obs.: valoarea normal a plumbemiei este de 30 g/100 ml snge.

Determinarea plumbului n urin

Generaliti: plumbul n urin se gsete sub form de combinaii organice ianorganice. Concentraia plumbului din urin ne poate da unele indicaii cu privire laimpregnarea organismului cu plumb.

Principiul metodei: plumbul are proprietatea de a reaciona cu ditizona, n mediualcalin cu care formeaz un complex colorat n rou, ditizonatul de plumb, colorimetrabil.

Reactivi:

-acid azotic (d= 1,40) ;-acid azotic 1% i 0,05%;-cloroform;-ditizon 0,01% i 0,05%;


7/20

-soluia tampon de citrat ;-soluia de splare;-soluia etalon stoc;-soluia etalon de lucru;-permanganat de potasiu, soluie saturat;

-soluie de hidroxilamin 10%.Recoltarea: urina se recolteaz n vase bine splate cu detergent i cltite cu o soluie

de acid azotic 1:10 i cu ap bidisitlat. Recoltarea urinei se face din prima emisiune dediminea sau din urina colectat n 24 de ore.

Mod de lucru: ntr-o capsul de porelan se introduc 25 ml urin i se adaug 2,5 mlacid azotic (d = 1,42) i 8,5 ml soluie saturat de parmanganat de potasiu. Se nclzete pe

baia de nisip, moderat, pn ce lichidul supernatant devine limpede i incolor. Pe fundulvasului trebuie s persiste un rest de precipitat brun. n caz contrar se mai adaug civa ml de

permanganat continudu-se nclzirea. Dup rcirea parial a soluiei, se trateaz excesul depermanganat cu hidroxilamin, adugndu-se pictur cu pictur pn la dispariia completa precipitatului brun i apoi un exces de 2 ml. Paralel cu proba de urina se face un martor cu

ap bidistilat i care se lucreaz n aceleai condiii ca i proba.Se trece continutul din capsul cantitativ ntr-o plnie de separare cu poriuni mici de ap

bidistilat s nu depeasc 40 ml. Se adaug 15 ml soluie tampon pn la limpezireacomplet.

Calcul: g Pb/dm3 urina= c/v V24C= concentraia n g Pb din proba de urin luat n lucruV= cantitatea de urin luat n lucru, n mlV24= cantitatea total de urina eliminat n 24 de ore n mlObs.: Valoarea normal a plumbului n urin este de 50 g/urina/24 ore.

Determinarea enzimei amino-levulinicDehidraza (ALA-dehidraza)

Generaliti: enzima ALA-dehidraza intervine n biosinteza hemului la etapa decuplare a celor dou molecule de acid molecule de acid amino-levulinic pentru a forma

porfobilinogenul, precursorul nucleului porfirinic. Activitatea acestei enzime este inhibat ncazul expunerii organismului la plumb.

Principiul metodei: activitatea ALA-dehidrazei se determin prin dozareacolormetric a porfobilinogenului din snge nainte i dup incubarea sngelui total cu acid amino-levulinic ca substrat.

Reactivi:-acid amino-levulinic 0,01 M;-reactiv;-deproteinizant: acid tricloracetic 10%;


8/20

Recoltarea probelor: sngele se recolteaz prin puncie venoas pe heparin.Mod de lucru: n 2 eprubete de centrifug care se noteaz cu P i M se introduc n

fiecare cte 0,2 ml snge heparinizat i 1,3 ml ap bidistilat, se amestec uor i apoi seintroduc ntr-o baie termostat la 37C timp de 10 pentru realizarea hemolizei. n eprubeta Pse introduce 1 ml acid amino-levulinic (substrat) iar n eprubeta M 1 ml acid tricloracetic,

se agit i apoi 1 ml acid amino-levulinic. Ambele eprubete se in la incubat timp de 60 la37C. Dup incubare se adaug i n eprubeta P 1 ml acid tricloracetic. Se centrifugheazambele eprubete la 3000 rotaii timp de 10. Se ia din supernatant cte 1 ml i se introduce nalte 2 eprubete peste care se adaug 1 ml reactiv Ehrlich.

Calcul: uniti ALA-dehidraza/ml eritrocite = 12,5 x E60 E0/ % hematocrit x1000E60= valoarea extinciei probei din eprubeta P.E0= valoarea extinciei din eprubeta M.Obs.: se consider ca valori normale pentru activitatea ALA-dehidrazei 25 uniti/l deeritrocite.

Determinarea hematocritului(volumul eritrocitelor)

Principiul metodei: sngele se centrifugheaz i se separ eritrocitele de plasm iarprin evaluarea raportului cantitativ ntre ele se obine volumul eritrocitelor.

Reactivi i material necesar:-centrifuga;-anticoagulant-heparina;-material pentru recoltarea sngelui prin puncia venoas;-hematocrit.

Recoltarea probei de snge: sngele se recolteaz prin puncie venoas heparina (opictur de heparin este suficient pentru 5 ml snge).

Mod de lucru: sngele se introduce n hematocrit i se centrifugheaz la 4000 rotatii

timp de 20. Dup centrifugare se msoar nlimea h a coloanei de eritrocite i nlimeaH a coloanei totale de snge. Dac tubul este gradat n mm se face citirea direct, dac nueste gradat, nlimea se msoar cu ajutorul unei rigle.

Calcul: hematocrit% =100 x h/H.


9/20

h= nlimea coloanei de eritrocite, n mm;H= nlimea coloanei totale de snge, n mm;Obs.: valori normale ale hematocritului: brbai 44,9%; femei 40,7%.

Determinarea acidului amino-levulinic n urin

Generaliti: ca i coproporfirinele, concentraia acidului delta-amino-levulinic crete

n urin n expunerea organismului la concentraii crescute de plumb n urma perturbriibiosintezei hemului produs de prezena plumbului.Principiul metodei: acidul amino-levulinic se separ din urin prin reinerea lui pe o

coloan cu rini schimbtoare de ioni, cationic i determinarea colorimetric cu reacticulEhrlich.

Reactivi i material necesar:-hidroxid de sodiu 1 N;-acid clorhidric 1 N i 2 N;-tampon acetat, pH = 4,6;-acetat de sodiu 2 M;-acid acetic glacial;

-acid acetic soluie 1 M i 0,2 M;-acetilaceton;-acid percloric 70%;-rin cationic DOWEX 50 - x 8, granulaie 200-400 mesh forma H+;


10/20

-rin anionic (pentru ndeprtarea porfobilinogenului) rin DOWEX 2- x8 sauDOWEX 1- x8 cu granulaia de 200-400 mesh sub form de acetat;

-reactiv Erlich.Recoltarea probelor: urina se recolteaz din prima emisiune de diminea sau din

urina colectat n 24 ore i se lucreaz ct se poate de repede.

Mod de lucru: cele 3 coloane se aeaz una deasupra celeilalte avnd grij ca deasupras fie coloana anionic. Se introduc n coloane 8 ml ap bidistilat i se ateapt s treaccomplet prin cele dou coloane [n coloana anionic s-a reinut porfobilinogenul iar n ceacationic acidul amino-levulinic (ALA)].

n coloana cationic se introduc 7 ml acetat de sodiu 1 M care este prins ntr-oeprubet gradat de 10 ml. Se completeaz volumul la 10 ml cu soluie tampon de acetat i seadaug apoi 0,2 ml acetilaceton, se agit bine eprubeta se adaug 2 ml reactiv Ehrlich i seamestec bine. Se las n repaus 15 apoi se citete extincia la spectrofotometru la lungimeade und de 553 nm n cuva de 1 cm. Citirile se fac fa de un martor preparat din 2 ml ap

bidistilat i 2 ml reactiv Ehrlich.Calcul: mg ALA/dm3 urina =E553 x 47,6.

Valoarea normal a acidului amino-levulinic n urin este de 5,2 mg/urina din 24ore.

Determinare porfirinelor urinare

Generaliti: perturbarea biosintezei hemului este unul din efectele toxicitii plumbului evideniat prin creterea excreiei urinare de coproporfirine i acid amino-levulinic.

Principiul metodei: porfirinele urinare sunt extrase i aduse n soluie cu acidclorhidric apoi se msoar extincia la lungimea de und maxim a bandei de absorbiecaracteristic porfirinelor. Concentraia porfirinelor se calculeaz pe faza coeficientului deextincie molar.

Reactivi:-acid acetic glacial;-eter etilic;-acetat de etil;-acid clorhidric soluie 0,1 N i 0,5 N;-soluie de iod 0,1 N;-tiosulfat de sodiu, soluie 0,1 N.

Recoltarea: urina se recolteaz din prima emisiune de diminea i se pstreaz celmult 3 ore ferit de lumin, sau urina colectat n 24 ore n care se adaug 2 ml toluen pentruconservare.

Mod de lucru: ntr-o plnie de separare se introduc 5 ml urin i 1 ml acid acetic.


11/20

Dac proba de urina este proaspt, se oxideaz prin adugarea a 5 picturi de soluiede iod iar excesul se ndeprteaz prin adugarea a 5 picturi de tiosulfat. Probele colectate n24 ore nu se mai oxideaz. Se adaug 30 ml eter etilic i se agit bine proba timp de 3. Sesepar stratul de urin n alt plnie. n prima plnie se adaug de 2 ori cte 5 ml de ap

bidistilat i stratul apos se separ tot n cea de-a doua plnie.

Peste stratul eteric (plnia 1) se adaug poriuni succesive de cte 1 ml de HCl 0,1 Nagitnd de fiecare dat plnia cte 1 iar extraciile acide sunt unite ntr-o eprubet gradat de10 ml. Sunt suficiente 4 extracii cu acid i se completeaz volumul pn la 5 ml cu acid.Dac concentraia porfirinelor este prea mare, culoarea extrasului are o nuan roz. Secontinu extracia cu acid pn ce ultima fraciune extras nu mai prezint fluorescen roiela lumina ultraviolet i n acest caz volumul final se completeaz pn la 10 ml cu acid. nextrasul acid sunt coninute coproporfirinele.

n plnia a doua n care se afl urina i apa de splare se adaug 30 ml acetat de etil ise agit plnia 3. Se ndeprteaz faza apoas iar stratul de acetat de etil se spal de 3 ori cucte 5 ml ap bidistilat. Fraciunile apoase se elimin. Peste acetatul de etil se introduc

poriuni de cte 1 ml HCl, 0,5 N i n stratul acid sunt extrase uroporfirinele. Fraciunile acide

sunt unite ntr-o eprubet gradat de 10 ml i se completeaz volumul pn la 5 ml acidclorhidric 0,5.

Extincia extraselor acide se msoar la spectofotometru la mai multe lungimi de undi anume: 380 nm, 401 nm, 405 nm.

Calcul: g coproporfin/dm3 urina =[2Emax (E380+E430)]V/V1817.Emax= valoarea exticiei la 401 nm;E380= valoarea exticiei la 380 nm pentru interferene;E430= valoarea exticiei la 430 nm pentru interferene;V= cantitatea final a extraselor acide (n ml);V1= cantitatea de urin luat n lucru, n ml;

g uroporfirine/dm3 urina=[2Emax (E380+E430)]V/V1831.Emax= valoarea extinciei la 405 nm.Obs.: -pentru exprimarea rezultatelor la urina din 24 ore concentraia aflat la litru seraporteaz la volumul de urin din 24 ore.

-pentru obinerea extinciei maxime se fac citiri n zona ntre 396-410 nm, din 2 n 2nm;

-valorile normale ale coproporfirinelor urinare sunt de 120 g/urina din 24 ore;-valorile normale de uroporfirine urinare sunt de 20 g/urina din 24 ore.


12/20

Determinarea carboxihemoglobinei

Generaliti: oxigenul i oxidul de carbon concureaz pentru aceeai parte ahemoglobinei, dar afinitatea pentru oxidul de carbon a hemoglobinei este de 210 ori mai maredect pentru oxigen. De aceea ntr-o atmosfer poluat cu oxid de carbon, oxigenareaesuturilor este deficitar din cauza creterii procentului de carboxihemoglobin. Dac nivelulcarboxihemoglobinei este sub 10% din hemoglobina total, presiunea parial a oxigenuluiarterial este normal, totui la concentraia de 4-10% s-au semnalat modificri fiziologice.Cnd carboxihemoglobina reprezint 66% din hemoglobina total, survine moartea.

Principiul metodei: oxidul de carbon eliberat din caroxihemoglobin reduce soluia declorur paladoas proporional cu concentraia oxidului de carbon. Excesul de clorur

paladoas se determin colorimetric cu iodura de potasiu:PdCl2 + CO + H2O Pd + CO2 + 2HClPdCl2 + 4IK[PdI4]K2 + 2KCL

Reactivi i material necesar:-clorur paladoas;-hemolizant de fericianur;-iodur de potasiu, soluie 20%;-celula de microdifuzie;

celula se nchide ermetic cu un dop rodat.Recoltarea probelor: sngele se recolteaz prin puncie venoas ntr-un tub mic n

care s-a introdus n prealabil cca. 10 mg oxalat de sodiu i o bil de sticl, umplndu-secomplet. Se astup cu un dop de cauciuc fr a lsa bule de aer n interior i se omogenizeaz

prin rsturnare de 10-15 ori. n felul acesta proba se poate pstra 24 ore la rece.Mod de lucru: exact 1 ml din clorura paladoas se introduce n compartimentul central

al celulei iar n cel periferic se introduc 5 ml hemolizant de fericianur.Se msoar exact 1 ml snge i se introduce n compartimentul periferic apoi senchide imediat celula. Se amestec lichidele din compartimentul periferic prin rotire cu


13/20

mult atenie. Se las celula la temperatura camerei i la ntuneric pn a doua zi (minimum 6ore).

Se pipeteaz cu grij, lichidul din compartimentul central ntr-un balon cotat de 50 ml,filtrndu-l. Se spal apoi cu poriuni mici de ap bidistilat pn ne-am asigurat c am trecuttot coninutul. Se adaug apoi n balon 10 ml de IK 20% i se completeaz la semn cu ap

bidistilat.Paralel cu proba se face un martor n care se pun numai reactivii fr snge. Se

msoar extincia probei i a martorului la spectofotometru, la lungimea de und de 50 nm ncuva de 1 cm.

Calcul: mg PdCl2 redus= Es Ep/Es.Es= valoarea extinciei martorului;Ep= valoarea extinciei excesului de clorur paladoas rmas n prob;g COHb % din Hb total = g COHb/100 ml snge/ g Hb total/100 ml snge x 100.

Obs.: valoarea normal a COHb este de 1,5% din Hb total pentru nefumtori i de10% din Hb total pentru fumtori.

Determinarea oxidului de carbon din aerul expirat

Principiul metodei: aerul expirat se trece printr-un tub Drger care are o umplutur deI2O5. Oxidul de carbon reduce pentoxidul de iod la iod elementar care coloreaz n brunsuportul alb.

Material necesar:

-o pung de PVC prevzut cu un tub de cauciuc la care este ataat o clema i setermin cu un tub de sticl;

-aparatul Drger;-tub Drger pentru oxid de carbon.

Recoltarea probelor: subiectul este scos din atmosfera poluat cu oxid de carbon ieste pus sa fac 2-3 inspiraii i expiraii. Inspir apoi profund, se menine n apnee 20 dupcare sufl forat aerul ntr-o punga de PVC care se astupa bine i se transport n laborator. Seataeaz la punga de PVC, pompa Drger la care aste fixat un tub Drger pentru a determina

oxidul de carbon. Se aspir aerul din pung cu ajutorul pompei pn cnd stratul alb din tubulDrger ncepe s se mbruneze, oprind pomparea cnd mbrunarea stratului a ajuns la odiviziune exact. Se ine cont de numrul de pompri care s-au efectuat. Se citesc diviziunilede pe tub pn unde s-a mbrunat suportul i se calculeaz oxidul de carbon dup indicaiiledate n prospectul aparatului. Cunoscnd cantitatea de oxid de carbon din aerul expirat n

ppm, se poate determina carboxihemoglobina, procentual din hemoglobina total dupformula: COHb% din Hb totala= ppm CO/ 5


14/20

Determinarea hemoglobinei totale

Principiul metodei: hemoglobina este oxidat de fericianur la methemoglobina carecu cianura de potasiu trece n cianmethemoglobina i este derivatul cel mai stabil alhemoglobinei al crei coeficient molar de extincie este stabilit.

Reactivi: soluia Drabkin: 0,14 g fosfat monopotasic, 0,05 g cianur de potasiu, 0,2 gfericianur de potasiu K3 [Fe (CN)6] se dizolv n civa ml ap bidistilat. Se filtreaz printr-o hrtie de filtru cantitativ, se adaug n filtrat 0,5 g saponin, se agit i se pstreaz la recei n sticl brun.

Recoltarea sngelui: sngele se recolteaz prin puncie venoas sau din capilare pe unanticoagulant.

Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 5 ml reactivi Drabkin i 0,02 ml sngebine omogenizat i msurat cu micropipeta care se descarc introducnd pipeta n lichid fra barbota. Se mai spal de 2-3 ori pipeta cu reactiv fr a produce barbotare. Seomogenizeaz proba prin scuturare i dup 10 se msoar extincia la spectrofotometru la

lungimea de und de 542 nm fa de reactivul Drabkin ca martor, n cuva de 1 cm.Calcul: g Hb total/ 100 ml snge= E542 x 36,8Obs.: coeficientul molar de extincie se poate determina dac avem soluii de

hemoglobin standardizat dupa formul: K= conc. Standard a Hb/ extincie.-concentraia standard a Hb este nscris pe fiol. n lipsa standardului de Hb se

folosete coeficientul molar de extincie 36,8;-valori normale pentru Hb sunt: la brbai 1416,5/ 100 ml snge; la femei

13-/100 ml snge.


15/20

Determinarea methemoglobinei

Generaliti: nitraii i nitriii din mediu n concentraie crescut pot damethemoglobinemii la copii pn la vrsta de 1 an hrnii artificial. Implicaii n oxidareafierului din hemoglobin pentru formarea methemoglobinei sunt nitriii. n ap ns nitriii segsesc n concentraie mic din cauza labilitii lor care n prezenta oxigenului trec uor nnitrai iar absena acestuia face ca ei s se reduc la amoniac. Nitraii n ap pot atingeconcentraii crescute i foarte crescute iar la nivelul tubului digestiv al copiilor mici au

posibilitatea s se reduc la nitrii, datorit florei reductoare abundente ce exist la acestnivel.

Alte cauze care determin susceptibilitatea copiilor la methemoglobinemii sunt:labilitatea hemoglobinei de a trece mai uor n methemoglobin, volum mic de snge,echipamentul enzimatic oxido-reductor, de la nivelul eritrocitelor slab dezvoltat,concentrarea nitrailor din ap prin procesul fierberii i prezena de lapte praf a unei cantiticrescute de flora reductoare.

Principiul metodei: methemoglobina se transform n cianmethemoglobin care e maistabil i are un coeficient molar de extincie bine stabilit la lungimea de und de 630 nm.

Prin diferena dintre valoarea extinciei nainte i dup adugarea cianurii se obine cantitateade methemoglobin.Reactivi:-soluii tampon de fosfai cu pH=6,6;-soluia de cianur de sodiu sau potasiu neutralizat;-acid acetic 12%;-fericianur de potasiu 20%;-soluie de amoniac 25%;-oxalat de sodiu, cristale;-saponin, substan.Mod de lucru: sngele se recolteaz din deget ntr-un tub mic de sticl pe oxalat de

sodiu. ntr-o eprubet se introduc 10 ml soluie tampon i se adaug 0,1 ml sngedescrcndu-se bine pipeta prin refulare de 2-3 ori n soluia tampon. Se amestec bine


16/20

coninutul eprubetei apoi se adaug aproximativ 0,1 g saponin i se agit eprubeta timp de 5pentru realizarea hemolizei.

Se citete extincia la spectrofotometru, la lungimea de und de 630 nm n cuva de 1cm drum optic. Dup citirea extinciei se adaug direct n cuv o pictur de cianurneutralizat, se amestec bine cu o baghet de sticl i dupa 2 se citete din nou extincia la

aceeai lungime de und.Calcul: (A-B) 65= g% methemoglobin

A= valoarea extinciei nainte de adugarea cianurii;B= valoarea extinciei dup adugarea cianurii;65= coeficient extracie molar.

Determinarea colinesterazei din snge

Generaliti: activitatea colinesterazei din snge este sensibil influenat de unelesubstane toxice cum ar fi pesticidele organofosforice. Este indicat s se determine aceeai

prob de snge att activitatea colinesterazei din eritrocitate ct i cea din plasm.Principiul metodei: prin msurarea aceticolinei hidrolizat dup incubare cu snge

total se poate aprecia activitatea colinesterazei. Acetilcolina rmas dup incubare sedetermin colorimetric prin reacia cu hidroxilamina cu care formeaz acetilhidroxilaminacare cu clorura feric d un complex rou, foarte stabil. Pentru a diferenia activitatea celordou colinesteraze se folosete un inhibitor specific pentru pseudocolinesteraz, numitdiparcol.

Reactivi:-tampon barburic pH = 7,4;-clorhidrat de dietilamino-etil-fenotiazin;-acid tricloracetic 10%;-soluia stoc de clorur de acetilon;-soluia de lucru de acetilcolin;-NaOH soluie 3,5 N;-HCl soluie 4 N;

-hidroxilamin hidrocloric;-soluie alcalin de hidroxilamin;-clorur feric.

Recoltarea probei de snge: sngele se recolteaz pe heparin sau pe altanticoagulant.

Mod de lucru: se msoar 0,2 ml snge i se dilueaz cu 1,8 ml ap bidistilat,realizndu-se o diluie de 1/10, se agit bine pentru a se face hemoliza. Se citesc extinciile laspectrofotomentru la lungimea de und de 520 nnm n cuva de 1 cm fa de martorul dereactivi.

Calcul: activitatea colinesterazei se exprim n g acetilon hidrolizat ntr-o or la38C de 1 ml snge total.

Colinesteraza total= E-E1/ E 100.Colinesteraza globular =E-E2/E 100.Colinesteraza plasmatic: colinesteraza total colinesteraza globular.E= valoara extinciei etalonului E.


17/20

E1= valoarea extinciei colinesterazei totale.E2= valoarea extinciei colinesterazei globulare.Obs.: valori normale: -colinesteraza globular= 34,5;

-colinesteraza plasmatic= 16,8.Raportul colinesteraza globular/ colinesteraza plasmatic = 0,66.

Colinesteraza globular se poate raporta i la numrul de eritrocite/mm3.Colinesteraza globular/mm3 snge total / coliesteraza (n milioane).

Determinarea cromului din snge

Generaliti: cromul hexavalent are o toxicitate crescut comparativ cu cel trivalent,absorbindu-se uor pe cale digestiv, respiratorie i prin piele. Este responsabil de frecvenacrescut a cancerului pulmonar.

Principiul metodei: dup mineralizarea sngelui cromul hexavalent formeaz cudifenilcarbazina un complex colorat n roz-violaceu a crui intensitate este proporional cuconcentraia cromului.

Reactivi:-H2SO4 d = 1,84;-acid percloric 60%;-acid azotic d= 1,40-NaOH 10 N;-permanganat de potasiu 0,1 N;-azid de sodiu 5%;-fosfat monosodic (NaH2PO4 2H2O) 60%;-difenilcarbazin 0,1% n alcool etilic;-albastru de timol 0,4%;-bicromat de potasiu soluie standard.Mod de lucru: 5 ml de snge total se introduc ntr-un flacon Erlenmayer peste care se

adaug 1 ml acid sulfuric, 2 ml acid percloric, 1,5 ml acid azotic i 2-3 perle de sticl. Se

acoper cu o sticl de ceas i se nclzete pe baia de nisip pn se obine culoarea maronie.Se mai introduc cteva picturi de acid azotic cnd are loc o reacie energic. Se repetadugarea de acid azotic pn cnd nu mai are loc reacia. Se pune proba direct pe flacr

pentru ndepartarea vaporilor albi de acid percloric. Se adaug 10 ml ap bidistilat i secontinu fierberea pe sit. Se rcete i apoi se adaug o pictur de indicator albastru detimol i hidroxid de sodiu pn la culoarea roz. Se adaug 0,5 ml permanganat de potasiu ise introduce proba n baia de ap la 80C. Dac culoarea roz a permanganatului a disprut n10 se mai adaug 0,3 ml permanganat i se continu fierberea 20. Se scoate proba din baiei se adaug azid de sodiu pictur cu pictur pn la decolorarea complet. Se introduc 2ml fosfat monosodic, pentru ndeprtarea interferenei fierului i 1 ml difenilcarbazin. Dup5 se citete extincia la un spectrofometru la lungimea de und de 540 nm n cuva de 1 cm.

Calcul: g Cr/100 ml snge= C/V 100.C= concentraia n g Cr din proba de snge luat n lucru.V= cantitatea de snge luat n lucru n ml.Observaii: valoarea normal a cromului n sngele total este de 10 g/100 ml snge.


18/20

Determinarea arsenului din pr

Generaliti: arsenul este un toxic cumulativ. O expunere a organismului la un mediupoluat cu arsen face s creasc concentraia acestui element att n snge ct i n urin. Untest mai fidel al expunerii la arsen l constituie determinarea lui n firele de pr.

Principiul metodei: proba de pr se mineralizeaz i arsenul se determin colorimetriccu dietildicarbamatul de argint.

Reactivi:-alcool etilic;-eter etilic;-acid azotic d=1,40;-acid percloric 70%;-acid clorhidric 20%;Mod de lucru: aproximativ 3 g pr tiat ct mai aproape de rdcin se in 3-4 ore n

eter etilic pentru degresare. Se filtreaz i se spal bine cu ap i detergent, apoi se cltete cuap bidistilat i n final cu alcool etilic. Se usuc la temperatura camerei ntre dou hrtii defiltru. Dup uscare se cntresc exact 2 g pr, se introduc ntr-un flacon Erlenmayer, pestecare se adaug 10 ml acid azotic concentrat. Se acoper vasul cu o sticl de ceas, se nclzete

pe baia de nisip pn scade volumul la 2-3 ml. Dup rcire se introduc 5 ml ap bidistilat i10 ml acid azotic concentrat. Se continu nclzirea pe baia de nisip pn ce lichidul devinelimpede, galben pai i nu mai emite vapori bruni. Dac nu s-a ajuns la acest stadiu se maiadaug civa ml ap bidistilat i 2-3 ml acid azotic i se continu fierberea cu grij ca s nu

se carbonateze. Se rcete proba i apoi se adaug 1 ml acid percloric i 2-3 ml ap bidistilat. Se continu nclzirea vasului acoperit cu sticla de ceas pn la decolorareacomplet. Se ia sticla de ceas i proba se nclzete pn la evaporare la sec. Pentrundeprtarea urmelor de acid percloric se reia reziduul de 2-3 ori cu cte 5 ml ap bidistilati se evapor. Reziduul trebuie s fie cristalin i perfect alb. Se trece reziduul, cantitativ, cu10 ml acid clorhidric 20% n generatorul aparatului de determinat arsenul i se continudeterminarea.

Calcul: g As/100 g pr = C/g 100C= concentraia n g As din proba de pr luat n lucru;G= cantitatea de pr luat n lucru, n g.


19/20

Determinarea arsenului n snge


Reactivi:-alcool etilic;-eter etilic;-acid azotic d=1,40;-acid percloric 70%;-acid clorhidric 20%.Mod de lucru: se recolteaz sngele venos pe fluorura de sodiu. Se msoar exact 10

ml snge i se introduc ntr-un flacon Erlenmayer peste care se adaug 10 ml acid azoticconcentrat. Se fierbe pe baia de nisip i se procedeaz n continuare ca la determinareaarsenului din pr.

Calcul: g As/100 ml pr = C/g 100.C= concentraia n g As din proba de snge;G= cantitatea de snge luat n lucru, n ml.Obs.: cancentraia normal a arsenului din snge este de maximum 10 g/100 ml.


20/20

Determinarea arsenului n urin


Reactivi:-alcool etilic;-eter etilic;-acid azotic d=1,40;-acid percloric 70%;

-acid clorhidric 20%.Mod de lucru: se recolteaz urina din 24 ore. Se iau 200 ml urin i se introduc ntr-un

flacon Erlenmayer peste care se adaug 10 ml acid azotic concentrat. Se fierbe pe baia denisip i se procedeaz n continuare ca la determinarea arsenului n pr.

Calcul: g As/dm3 = C/V 1000.C= concentraia n g As din proba de urin luat n lucru;V= cantitatea de urin luat n lucru, n ml.Obs.: concentraia normal a arsenului n urin se considera a fi de 15-60 g As/dm3

sau 100 g As/urina din 24 ore.

Powered by http://www.referat.ro/

cel mai tare site cu referate
http://www.referat.ro/http://www.referat.ro/

metode biochimice

Documents