Aspecte Biochimice Privind Fermentatia Lactica a unor Produse Vegetale

Aspecte biochimice privind fermentaia lactic a unor produse vegetale

CAPITOLUL ICONSERVAREA PRIN ACIDIFIERE 1.1. Scurt istoric despre murturi

Murturile fac parte din toate tradiiile i din toate culturile. Istoria castravetelui murat ncepe cu vreo 3000 de ani .e.n. cnd locuitorii Indiei de Nord au adus semine de castravete pe Valea Tibrului. Crceiide castravei s-au rspndit rapid n ntreaga Europ, oamenii nvnd s conserve legumele crescute de ei n saramur.

Din India castravetele a migrat n Grecia i Italia, fiind apreciat n special n Imperiul Roman. Mai trziu a devenit mncare tradiional n China i Rusia.

n Danemarca procedeul de murare este atestat ncepand cu secolul al XV-lea.

Murturile au jucat un rol important i n descoperirea Americii, pe vremea aceea multe din cltoriile transoceanice fiind deturnate pentru c echipajele vaselor se mbolnveau de scorbut din cauza lipsei de vitamina C. Amerigo Vespucci a fost cel care a depozitat pe navele ce se nscriau n cltoria istoric peste Atlantic cantiti uriae de murturi, pentru a prentmpina epidemia de scorbut. n 1820 apare n America prima fabric de castravei murai.

Castravetele murat a fcut impresie n rndul monarhilor i oamenilor de rzboi. Cleopatra, regina egiptenilor, l-a apreciat pentru calitile sale cosmetice i nutritive. Iulius Cezar i Napoleon cereau neaprat castraveciori la prnz, iar n timpul celui de-al II-lea rzboi mondial guvernul americanavea 40% din producia de castravei murai rezervat pentru trupele armate. mpratul roman Tiberiu avea pe mas, indiferent de anotimp, castravei. Romanii, la rndul lor, erau mari iubitori de castravei, i cultivau n sere i i murau. n zilele noastre, castraveii sunt cele mai cultivate legume dup roii sau ceap.

China este cel mai mare productor, urmat de Japonia i Turcia. n acest top mondial al cultivatorilor de castravei, Romnia ocup locul al aselea, fiind urmat de Olanda.

Murturile se numr printre cele mai gustoase aperitive. Murturile fabricate industrial sunt lipsite de savoarea celor n saramur, fcute n gospodrii, dup metode vechi de mii deani. Castraveii sau gogonelele fermentate industrial, pe care le cumprm de la magazin, nu au nici pe departe calitile tmduitoare ale celor murate acas, la borcan.

n procesul natural de fermentaie se formeaz acidul lactic ce ofer murturilor arom unic i caliti nutriionale excepionale.[ www.wikipedia.org]

1.2. Noiuni introductiveProcedeul de conservare a alimentelor, cunoscut i aplicat din cele mai vechi timpuri, i

pstreaz i astzi nsemntatea. Se bazeaz pe aciunea antiseptic a unor acizi organici asupra microflorei care provoac alterarea alimentelor, n special de origine vegetal, prin fermentare sau putrefacie. Conservarea legumelor i fructelor a fost realizat la nceput prin acidifiere natural, cu acid lactic rezultat al unui proces de fermentare prilejuit de microflora epifit a legumelor. [Marinescu, 1976] Acidifierea este o noiune colectiv, folosit pentru procedeele de conservare, caracterizate prin formarea acizilor care influeneaz dezvoltarea microorganismelor, activitile enzimatice i nsuirile fizico-chimice ale alimentelor prelucrate. Aciunea microbian a acizilor se bazeaz att pe micorarea pH-lui n substrat, ct i pe toxicitatea unor acizi nedisociai care sunt utilizai drept conservani chimici.

Conservarea prin acidifiere este o variant a conservrii biochimice, care const n favorizarea dezvoltrii bacteriilor productoare de acid, n special acid lactic. Acidifierea alimentelor constituie un mijloc de prevenire a alterrii lor deoarece creeaz un mediu neprielnic dezvoltrii microorganismelor, n special a bacteriilor de putrefacie. [Segal, 1964] Avnd n vedere caracterul produciei de legume, iar nevoile de consum n gospodriile oamenilor, fiind constant liniare pe parcursul anului, n timpul sezonului de recoltare acestea consumndu-se proaspete, a fost nevoie de conservarea surplusului, una din metode cu consum minim de manoper i materiale fiind murarea. Procedeul de conservare a legumelor prin crearea unor condiii care favorizeaz dezvoltarea bacteriilor lactice n detrimentul celorlalte microorganisme existente, se cunoate n limbajul curent sub denumirea de murare. Produsele astfel conservate poart denumirea de murturi. Aceast metod de conservare se cunoate i se aplic din timpuri ancestrale, produsele obinute avnd pe lng valoarea alimentar i nutritiv, i o valoare de reabilitare i tratare a unor afeciuni medicale. Murturile sunt foarte sntoase i se folosesc ca aperitive pe parcursul ntregii ierni, fiind nelipsite din casele romnilor. 1.3. Tipurile de conservare prin acidifiere Acidifierea poate fi realizat pe urmtoarele ci: acidifiere natural acidifiere artificial acidifiere mixt

1.3.1. Consevarea prin acidifiere natural (murare) Conservarea prin acidifiere natural este o metod de conservare biochimic, bazat pe principiul acidocenoanabiozei, adic formarea n mediul de conservare a acidului lactic prin fermentarea zaharurilor fermentescibile sub aciunea bacteriilor lactice. Aceast metod se aplic la obinerea produselor lactate acide (iaurt, lapte btut, smntn fermentat, brnz de vac etc.) i la murarea legumelor i fructelor. [Bologa, 2008] Aceast conservare are la baz aciunea antiseptic a acidului lactic produs prin fermentaie lactic, conservare ajutat i de producerea de bacteriocine n mediul de fermentare, de producerea de HO i prin competiia pentru nutrieni ntre bacteriile lactice i cele de alterare. [Banu, 1999]

Se conserv prin fermentaie lactic varza cpni i tocat, castraveii, gogonelele, mslinele, ardei grai umplui cu varz i morcovi, conopida, pepeni verzi, sfecl roie, fasole verde etc., dar i unele fructe sau sucuri de legume i fructe, pentru obinerea de produse cu valoare terapeutic. Acidifierea natural are urmtoarele avantaje:

obinerea unui produs stabilizat la un cost de transformare redus

obinerea de produse cu caliti senzoriale dorite, datorit n principal aromei deosebite obinute prin fermentare ameliorarea valorii nutritive prin producerea de vitamine din grupul B i de aminoacizi

prelungirea sezonului de prelucrare a produselor vegetale i oferirea ctre consumatori de produse n sezonul de iarn - costuri energetice reduse n comparaie cu alte metode de conservare [Banu, 2004] Acidul lactic format prin fermentarea glucozei, fructozei (n cazul murrii) i lactozei (n cazul produselor lactate acide) are aciune antiseptic n concentraii mai mari de 0,5%.

Bacteriile lactice care intervin n fermentaia natural a produselor vegetale sunt: Leuconostoc mezenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus brevis i Lactobacillus plantarum. Prima specie este implicat n stadiile iniiale de fermentare a verzei ( cpni i tocat) cu adaos de 2,5%NaCl, iar ultimele trei sunt asociate cu fermentarea castraveilor i a celorlalte produse vegetale, inclusiv a mslinelor , cu adaos de 5-7%NaCl. [Banu, 2008] Procesul de fermentare se produce sub influena microflorei epifite de pe produsele supuse fermentrii i reprezint un fenomen complex ce cuprinde n afar de fermentaia lactic i unele fermentaii secundare cum sunt: fermentaia acetic, alcoolic, propionic, butiric, etc

n cazuri nedorite poate avea loc alterarea prin fenomenul de putrefacie, cnd coninutul de zahr al produselor vegetale supuse conservrii a fost mic i repede consumat prin fermentaiile secundare, iar acidul lactic se gsete n cantitate foarte mic.

Prin fenomenul de fermentaie lactic, acetic, propionic etc., are loc transformarea glucidelor n acizii respectivi, iar n fenomenul de putrefacie se transform proteinele care n faza final de descompunere duc la formarea de aminoacizi. Aceast descompunere se poate petrece att n stare de anaerobioz ct i n stare de aerobioz. [Segal, 1964] Fenomenul de putrefacie este produs de ctre bacteriile de putrefacie, care se dezvolt ntr-un mediu al crui pH este mai mare de 4. Aceasta explic de ce produsele conservate prin acidifiere pot fi ferite de putrefacie. Prin putrefacia unor produse vegetale, n special varza murat, iau natere produse de descompunere urt mirositoare: indol, scatol, mercaptani, hidrogen sulfurat, amoniac, etc.

n vederea conservrii produsului fermentat trebuie ca acidul lactic s fie format n concentraie ct mai mare, ct mai aproape de limita dat prin coninutul de zaharuri din legume. Pentru aceasta, procesul de fermentare ar trebui s fie efectuat numai de bacterii homofermentative. Materia prim conine ns o microflor spontan, foarte variat, i posibilitatea apariiei unor fenomene microbiologice nedorite este destul de mare.

Pentru a crea condiii prefereniale bacteriilor lactice, se iau urmtoarele msuri:

- se adaug clorur de sodiu n proporie de 2-6%, care are aciune distructiv selectiv asupra microorganismelor, favoriznd activitatea bacteriilor lactice. Sarea are un rol selectiv pentru microorganisme deoarece nu toate pot suporta concentraii de 2-6%. Pe de alt parte, sarea extrage, prin difuzie, sucul celular cu substane solubile fermentescibile, realiznd un mediu nutritiv prielnic bacteriilor lactice.- se caut s se menin o temperatur apropiat intervalului optim de dezvoltare a bacteriilor lactice, care este n jur de 25C. Dup ce s-a acumulat o cantitate suficient de acid lactic, temperatura trebuie cobort pentru a evita apariia altor fermentaii.- se creeaz un mediu anaerob, util fermentaiei lactice, i pentru a evita fermentaia acetic sau alte fermentaii aerobe. Pentru c mediul anaerob poate favoriza fermentaia butiric la unele produse (varz murat) se recurge la aerarea (vnturarea) saramurii. Deoarece mediul creat n produs este acid (pH4 sau mai mic), fenomenele de putrefacie frecvente n medii anaerobe nu apar.[Guulescu, 1973] 1.3.2. Conservarea prin acidifiere artificial (marinarea)

Marinarea este o metod de conservare prin acidifiere artificial, care se face cu ajutorul oetului adugat n mediu i se bazeaz pe principiul acidoanabiozei. [Bologa, 2008] Aciunea conservant a acidului acetic depinde de: - concentraia mediului de conservat n acid acetic: n concentraii reduse (cca 0,3%) , acidul acetic stimuleaz creterea microorganismelor i n special a mucegaiurilor, servind ca surs de nutriie hidrocarbonat. n concentraii mai mari (0,4-4%), acidul acetic are o aciune bacteriostatic, iar peste 4% aciunea poate fi bactericid.

- specia microorganismelor: bacteriile sunt puin rezistente n mediu acid. Aceast rezisten depinde de stadiul lor de dezvoltare. n concentraii de pn la 4% acidul acetic inhib dezvoltarea majoritii bacteriilor saprofite, ntre 4-5% sunt distruse rapid formele nesporogene, sporii bacteriilor rezistnd mult timp chiar la concentraii de 6%. Mucegaiurile i drojdiile au o acidorezisten mai mare.- pH-ul produsului alimentar la care s-a adugat acid acetic. Acidul acetic avnd un grad de disociere mai mare dect al acidului lactic, rezult c nivelul concentraiei de hidrogen va fi mai mare i, deci, pH-ul mai sczut. Aciunea antiseptic a acizilor organici nu poate fi explicat n toate cazurile numai prin pH. La acelai pH aciunea conservant a acidului acetic difer n funcie de radicalul acid. - concentraia de NaCl i zahr. Aceste dou substane poteneaz efectul conservant al acidului acetic. [Banu, 2008] Aciunea antiseptic a oetului, n concentraie de peste 2%, este intensificat i prin adaos de sare 2-3%, iar pentru mbuntirea gustului se adaug i zahr 2-5%. Aceste adaosuri nu reduc apreciabil cantitatea de acid acetic necesar pentru a preveni creterea microorganismelor, dar sporii unor bacterii sunt mult mai uor distrui dac n soluie se adaug i NaCl. [Panaitescu, 1973] Conservarea cu ajutorul acidului acetic se aplic la:

- fabricarea semiconservelor de pete denumite ,,marinate, concentraia de acid acetic n acest scop fiind de 4%- obinerea unor produse vegetale cum ar fi: castravei n oet, gogoari n oet, varz roie n oet, ardei capia n oet, ardei iui n oet, conopid n oet, hrean n oet, varz alb tiat n oet etc. Pentru c oetul la aceste produse nu asigur protecie i fa de drojdii i mucegaiuri, conservarea prin marinare se dubleaz cu conservarea prin pasteurizare/sterilizare termic.

- conservarea maionezelor (la aceasta contribuie i mutarul i faptul c maionezele au un coninut redus de ap i unul ridicat de ulei). [Banu, 1999] Murturile n oet trebuie s aib, dup stabilirea echilibrului ntre concentraia oetului adugat i apa din legume o concentraie final de 2-3% acid acetic pentru a asigura conservarea lor. Dac concentraia oetului este mai mic de 2%, legumele trebuie supuse procesului de pasteurizare pentru a putea rezista n timp. Procesul tehnologic de conservare prin acidifiere artificial se consider terminat dup circa dou sptmni. Dup acest interval concentraia n acid acetic atinge o valoare de echilibru (maxim 3 %). Uzual se folosesc concentraii ceva mai mici. La aceste valori ale pH-ului se mpiedic dezvoltarea bacteriilor dar i a drojdiilor i mucegaiurilor. [DArthey, 1991] Legumele conservate n oet se numesc legume marinate.

n general, exceptnd unele mici deosebiri, operaiile preliminare de pregtire a legumelor n vederea marinrii sunt la fel ca i cele aplicate n cazul conservrii prin sterilizare sau prin acidifiere natural. n cazul marinatelor asortate, legumele se pregtesc fiecare separate i se amestec n procentele stabilite sau eventual convenite ntre productor i consumator.

Indiferent de metoda de conservare utilizat, trebuie realizat o ct mai bun ermeticitate a borcanelor i recipientelor n care vor fi pstrate aceste produse. [Gherghi, 1994] 1.3.3. Conservarea prin acidifiere mixt

Acest prcedeu const n supunerea produselor vegetale unei fermentaii lactice naturale incomplete, adic oprit la o concentraie de circa 0,8% acid lactic, urmat de o acidifiere artificial cu acid acetic, pn la atingerea unei concentraii totale de 3% acid acetic. Produsele obinute prin acest sistem de conservare au un gust mai plcut n comparaie cu celelalte metode. [DArthey, 1991]CAPITOLUL II

PRINCIPIILE CONSERVRII

PRIN FERMENTAIE LACTIC 2.1. Consideraii generale despre mecanismul fermentaiei lactice Conservarea prin acidifiere natural se bazeaz pe aciunea conservant a acidului lactic ce se formeaz ntr-un aliment, printr-o fermentaie lactic condus. Din aceast cauz, ea este denumit i conservare biochimic. n clasificarea metodelor de conservare, conservarea prin acidifiere natural i are locul printre metodele acidocenoanabiozei, deoarece se caracterizeaz prin aceea c bacteriile lactice, datorit activitii lor, nu permit dezvoltarea altor bacterii care s altereze produsul.

Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate sub aciunea echipamentului enzimatic al microorganismelor n acid lactic ca produs principal i produse secundare cum ar fi: diacetil, acetoin, alcool etilic i .

Calea metabolic de producere a acidului lactic este frecvent ntlnit n lumea microbian, n schimb randamente superioare de convertire a glucidelor n acid lactic sunt ntlnite la bacterii i mucegaiuri. Acestea prin activitatea lor, produc acidul lactic necesar, conform reaciei, ce poate fi reprezentat global astfel:

Glucoz Acid lactic Din punct de vedere biochimic, procesul nu decurge att de simplu, avnd un numr mare de faze intermediare. Prin formarea acidului lactic se schimb reacia mediului, care devine acid, mpiedicnd dezvoltarea bacteriilor de putrefacie. S-a constatat c minimul de dezvoltare a bacteriilor de putrefacie este la: pH = 5, pe cnd bacteriile lactice se pot dezvolta la un pH cuprins ntre 3-3,5. n afar de faptul c reduce pH-ul, acidul lactic are i o aciune conservant caracteristic. [Segal, 1964] Mucegaiurile selecionate ale genurilor Aspergillus, Penicillium i Mucor pot fi cultivate submers, cu aerare dirijat, pentru obinerea industrial a acidului lactic. [DArthey, 1991] n condiii naturale, acidul lactic se poate forma i n esutul muscular prin procesul de glicoliz, prin secvene biochimice catalizate de enzime similare cu cele ale celulei microbiene. 2.2. Bacterii lactice Bacteriile lactice sunt foarte rspndite n natur n diferite biotopuri: aparatul foliar al plantelor, n microbiota intestinal (n primii ani de via sau cnd n alimentaie predomin laptele), n cavitatea bucal, n microbiota pielii.

Dintre sursele alimentare permanent asociate cu bacteriile lactice amintim laptele (n care bacteriile lactice prezente pe canalele galactofore sunt antrenate la mulgere) i legumele (varz, castravei etc.). [Banu, 2008] Bacteriile productoare de acid lactic au fost utilizate la prepararea i prelucrarea alimentelor, din timpuri istorice. Bacteriile lactice sunt implicate n obinerea alimentelor fermentate din materii prime agricole, cum sunt: laptele, carnea, i produsele vegetale , care dein o pondere important n industria alimentar. Tulpinile de bacterii lactice folosite pentru obinerea produselor alimentare sunt izolate i selectate numai dup numeroase testri.

Bacteriile lactice sunt un grup de bacterii gram pozitive, fr respiraie, fr formare de spori, producnd acid lactic ca principal produs n fermentaia carbohidrailor, alturi de dioxid de carbon i ali compui organici. Bacteriile lactice sunt microaerofile i nu produc transformri drastice n compoziia alimentelor. n ultimii ani bacteriile lactice au fost folosite i ca produse de tip probiotic. Probioticele sunt microorganisme care, dup o administrare oral, sunt capabile s colonizeze tractul digestiv i s pstreze sau s determine o cretere a florei naturale digestive, prevenind aderarea microorganismelor patogene la peretele intestinului i asigurnd securitatea utilizrii optime a hranei. Probioticele stimuleaz activarea sistemului imunologic acionnd ca barier de protecie a tubului digestiv. [Dan, 2001] 2.2.1. Caracterele morfo-fiziologice ale bacteriilor lactice 2.2.1.1. Caractere morfologice Bacteriile lactice prezint eterogenitate morfologic: principalele forme sunt derivate de la forma coccus, i se pot prezenta sub form de streptococi (genul Lactococcus i genul Streptococcus), de diplococi (genul Leuconostoc), de tetrade (genul Pediococcus).

Numeroase alte bacterii lactice se prezint sub form cilindric, de bastonae cu dimensiuni variabile, izolate sau n lanuri lungi, incluse n genul Lactobacillus. [Banu, 2008] 2.2.1.2. Caractere fiziologice

Bacteriile lactice sunt pretenioase din punct de vedere nutritiv i nmulirea lor are loc n medii cu compoziie chimic complex. Ca surse de carbon i energie, bacteriile lactice pot s produc asimilarea sau fermentarea pentozelor: riboz, xiloz, arabinoz, a hexozelor: glucoz, galactoz, a diglucidelor: lactoz, maltoz, zaharoz.

Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat n acid lactic, iar acidul citric n acetoin i diacetil. Acidul lactic nu poate fi folosit de ctre bacteriile productoare i acumularea sa prin fermentare conduce la inhibarea nmulirii i ncetinirea vitezei de fermentaie.

Ca surse de azot, bacteriile lactice prefer aminoacizi, peptide i amide, fr s poat folosi sruri amoniacale. Bacteriile lactice au enzime proteolitice intracelulare care pot avea un rol pozitiv la maturarea brnzeturilor, dup eliberarea lor din celulele autolizate. O excepie este specia Lactobacillus casei care poate produce o hidroliz enzimatic a cazeinei.

Bacteriile lactice n general, dintre care cele termofile n special, necesit prezena n mediu a unor factori de cretere, vitaminele: B,B, biotina, acidul para-aminobenzoic, acidul folic, acidul pantotenic.

Bacteriile lactice sunt acidotolerante: valori minime de pH la care are loc creterea sunt de 4,3-4,8 pentru lactococi i 3,8-4,4 pentru lactobacili cu valori optime n domeniul de pH 4-6.

n raport cu oxigenul din aer, bacteriile lactice sunt anaerobe sau facultativ anaerobe. Prin cretere n medii lichide (bere, vin, sucuri) dau o tulburare persistent i acrire, iar prin dezvoltarea n lapte produc coagularea acid a cazeinei, cnd pH-ul se reduce la 4,6 ca rezultat al formrii de acid lactic.

Bacteriile lactice sunt adaptate s creasc ntr-un domeniu larg de temperaturi (0-55C) cu valori optime n domeniul mezofil (20-25C-streptobacterii, 30-35C-lactococci Gram pozitivi sau 35-45C-lactobacterii termofile). Sunt bacterii nesporulate i pot fi inactivate pe cale termic la temperaturi mai mari de 65C n 30 minute sau la 72-74C n 15-20 secunde (regimul de pasteurizare a laptelui). [Banu, 2008] O caracteristic important a bacteriilor lactice este aceea c suport uor concentraii de sare de 6% sau chiar mai mult, fr a-i opri activitatea fermentativ. Avnd n vedere c multe alte bacterii, n special cele care provoac putrefacia, nu suport asemenea concentraii de sare, aceast caracteristic este pus n valoare n industrie prin srarea corespunztoare a legumelor nainte de fermentare. [Dan, 2001] 2.2.2. Caracterele taxonomice i clasificarea bacteriilor lactice Dup punerea n eviden a bacteriilor lactice ca ageni de acrire a berii de ctre Louis Pasteur n 1875, muli cercettori au studiat aceste bacterii att de rspndite n natur.

O clasificare de referin aparine lui Orla Jensen (1919), care mparte bacteriile lactice n dou mari grupe:

a) Bacterii lactice adevrate-care produc numai acid lactic cu un randament de 90-100% din zahrul consumat, bacterii Gram-pozitive, facultativ anaerobe.

Genurile cele mai importante sunt: genul Thermobacterium i genul Streptobacterium n care erau inclui lactobacilii, genul Streptococcus (streptococi lactici) precum i genuri ca -coccus (actual genul Leuconostoc) i genul Tetracoccus (genul Pediococcus). [Dan, 2001]b) Pseudofermeni lactici (bacterii lactice atipice) care produc prin fermentaie cantiti mici de acid lactic i n cantiti superioare gaze: CO, H, acid acetic .a., bacterii Gram negative, aerobe. n aceast grup erau incluse bacteriile coliforme cu genul Escherichiae i genul Aerogenes (actual genul Enterobacter). [Dan, 2001] O nou clasificare, a lui Bergey, separ bacteriile lactice adevrate n familia Lactobacteriaceae n timp ce bacteriile coliforme se regsesc n familia Enterobacteriaceae.

Cea mai recent clasificare aparine lui Kandler i Weiss (1986) care n afar de proprietile fiziologice i tinctoriale ale bacteriilor lactice are la baz cunoaterea procentual a coninutului n baze azotate: guanin i citozin din structura acizilor nucleici, criteriu taxonomic stabil pe baza cruia s-au putut stabili similitudini sau deferenieri ntre speciile cunoscute.

Conforn acestei clasificri bacteriile lactice sunt incluse n familia Lactobacillaceae cu urmtoarele genuri: 2.2.2.1. Genul Streptococcus

2.2.2.1.1. Grupul streptococilor lactici inclui n genul Lactococcus cu speciile: Lactococcus lactis, Lactococcus lactis biovar diacetilactis, Lactococcus lactis biovar acetoinicus i Lactococcus lactis subspecia cremoris. [Banu, 2008] Membrii genului Lactococcus sunt bacterii lactice Gram-pozitive, de forma coccus sau forme derivate de la aceasta, putnd prezenta celule ovoidale, n funcie de condiiile de cultivare. Celulele, care de obicei sunt asociate n perechi sau lanuri scurte, au diametre de 0,5-1,5 m i nu prezint mobilitate.

Caracterizai prin auxotrofie sever fa de unii aminoacizi i vitamine, lactococii au capacitatea de a se dezvolta n domeniul de temperatur 10-45C, cu optim la temperaturi de 25-30C. Nu au capacitatea s creasc n prezen de 0,5% NaCl. Aceste proprieti sunt utile n diferenierea speciilor genului Lactococcus de cele ale genului Streptococcus, i n special de Streptococcus thermophillus. [Salvadori, 1996] Dintre factorii de cretere pentru dezvoltarea i activitatea fiziologic a lactococilor, cei mai importani sunt: aminoacizii izoleucin, valin, histidin, metionin, arginin, prolin, glutamat, serin i treonin i vitaminele biotina, acidul folic, riboflavina, niacina, tiamina i acidul pantotenic. n plus unele microelemente sunt eseniale, alturi de glucoz, pentru dezvoltarea optim n medii definite.

Alte caracteristici prin care lactococii se difereniaz de alte bacterii lactice sunt pH-ul optim de aciune i tipul de acid lactic format, avnd n vedere capacitatea lor de a forma cantiti importante de acid lactic. Astfel, comparativ cu alte bacterii lactice, majoritatea lactococilor formeaz numai izomerul L(+) al acidului lactic, cu excepia tulpinilor de Lactococcus lactis subspecia lactis biovar diacetilactis, care formeaz pe lng acid lactic i aldehid acetic, diacetil i acetoin, avnd capaciatatea de a fermenta i citratul..

Lactococii prezint importan pentru producerea de acid lactic, substane de arom, capacitatea proteolitic i lipolitic, precum i formarea de compui cu potenial bioconservant. [Salvadori, 1996] 2.2.2.1.2. Grupul viridans, bacterii ce aparin genului Streptococcus cu urmtoarele specii importante: Streptococcus salivarius subspecia thermophillus (Streptococcus thermophillus)-cultur folosit la fabricarea iaurtului i Streptococcus bovis. [Banu, 2008] Genul Streptococcus include bacterii lactice cu form sferic (coccus), Gram pozitive, cu multe proprieti metabolice similare, dar care populeaz habitaturi diverse, unele prezentnd proprieti fiziologice distincte.

La fel ca i alte bacterii lactice, Streptococcus thermophilus este bine adaptat la medii asociate cu laptele, fiind frecvent izolat din lapte i produse lactate tratate termic. Ca i ali streptococci, tulpinile de Streptococccus thermophilus sunt heterotrofe, i n general, pretenioase din punct de vedere nutritive, prefernd glucidele simple, ca surse de carbon i energie, i aminoacizi n calitate de surse de azot.

Se difereniaz de speciile genurilor Enterococcus i Lactococcus prin sensibilitatea fa de NaCl (crete greu n medii cu 2% NaCl i este inhibat n prezen de 4% sare), incapacitatea de a forma NHdin arginin, precum i incapacitatea de a crete la temperature de 10C, pH 9,6 sau n prezen de 0,1% albastru de metilen.

Utilizate n special pentru proprietatea lor acidifiant, cu efecte benefice asupra calitii produselor lactate fermentate, tulpinile de Streptococcus thermophilus sunt compatibile n culturi starter cu specii de Lactobacillus i Bifidobacterium. [Rehm, 1996] 2.2.2.1.3. Grupul streptococilor fecali, denumii eterococi, cu specia reprezentativ Streptococcus faecalis Bacteriile din genul Enterococcus sunt de obicei asociate cu microbiota intestinal a omului i animalelor, microbiota epifit a plantelor i microbiota specific a alimentelor, n special cele de origine animal.

Studii efectuate n SUA, n perioada 1960-1970, au demostrat eficiena utilizrii tulpinilor selecionate de Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium, n culturi starter multiple alturi de bacterii lactice, pentru mbuntirea aromei i gustului produselor lactate, sau n calitate de probiotice.

Practica a dovedit importana enterococilor n culturi starter, ca urmare a proprietilor lor fiziologice i anume: larga adaptabilitate la condiiile impuse de mediu, toleran la pH acid i NaCl. n plus, la unele tulpini de Enterococcus faecium i Enterococcus faecalis s-a evideniat potenial antimicrobian, dat fiind capacitatea lor de a sintetiza bacteriocine cu spectru larg de activitate. [Rehm, 1996] 2.2.2.1.4. Grupul streptococilor patogeni, cu speciile Streptococcus pyogenes (agentul scarlatinei) i Streptococcus agalactiae (agentul mastitei, transmisibil prin lapte colectat de la vaci bolnave). [Banu, 2008] 2.2.2.2. Genul Lactobacillus Include aproximativ 50 de specii clasificate n funcie de temperatura optim de activitate i modul de fermentare a glucidelor n homofermentativi-lactobacili care produc numai acid lactic i cantiti minore de substane de arom i heterofermentativi-lactobacili productori de acid lactic, acid acetic, diacetil, CO.

Din punct de vedere morfologic lactobacilii se prezint sub form de bastonae drepte sau curbate, care n anumite condiii de mediu i pot modifica morfologia cptnd forme derivate de la coci, ceea ce poate mpiedica uneori identificarea i diferenierea speciilor Domeniul optim al temperaturilor de dezvoltarea este de 30-40 C, dar pot s creasc la temperaturi de 5-53 C. se dezvolt n medii cu pH85% acid lactic), capabile s se dezvolte i s acioneze la temperaturi de 45 C. Ca glucide fermentescibile, hexozele sunt fermentate pe calea Embden-Mayerhof-Parnas, ca urmare a potenialului de a produce aldolaz i fosfocetolaz, apoi sunt fermentate pentozele i gluconatul.

Bacteriile speciei Lactobacillus acidophilus se disting prin proprietile lor antimicrobiene, prin formarea de metabolii cu efect bioconservant precum: acid lactic (>85%), peroxid de hidrogen i bacteriocine. [Salvadori, 1996] 2.2.2.2.2. Lactobacili facultativ heterofermentativi mezofili

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus sake

Lactobacillus casei

Bacteriile aparinnd speciei Lactobacillus casei sunt tulpini cu proprieti fiziologice i genetice eterogene asociate cu microbiota ecosistemelor alimentare. Ele sunt evideniate ca factori cu aciune fiziologic, funcional, din categoria promotorilor sntii umane i animale. Aceste bacterii mai pot fi asociate cu microbiota furajelor, a legumelor proaspete i fermentate, a crnailor proaspei, a aluaturilor congelate cu microbiota intestinal sau microbiota cavitii bucale.

Morfologic, Lactobacillus casei se difereniaz prin forma celulelor prezente ca bastonae cu capetele drepte, care tind s se asocieze n lanuri. Aceste bacterii sunt facultativ heterofermentative, ce posed importante proprieti biotehnologice generate i de capacitatea proteolitic, lipolitic sau de producere de exopoliglucide. [Banu, 2008] 2.2.2.2.3. Lactobacili heterofermentativi, mezofili

Lactobacillus viridiscens, lactobacillus fermenti

Lactobacillus iulinus

Lactobacillus bifidum

Lactobacillus brevis

Tulpinile de Lactobacillus brevis pot fi frecvent izolate din lapte, brnzeturi, microbiota epifit a plantelor i boabelor de cereale, ape reziduale, produse din carne i vegetale fermentate, furaje, materii fecale sau microbiota bucal i intestinal a oamenilor i a oarecilor.

n culturi pure formeaz colonii cu aspect rugos, plate, adesea translucide. Dei majoritatea tulpinilor formeaz colonii nepigmentate, la unele tulpini s-au evideniat colonii cu biomas de culoare portocalie sau roie. n preparat microscopic pot fi evideniate bastonae drepte sau curbate, cu capetele rotunjite, uneori putnd fi evideniate i bastonae mai lungi, singulare sau sub form de lanuri scurte.

Din punct de vedere fiziologic, tulpinile de Lactobacillus brevis sunt caracterizate ca bacterii lactice microaerofile, cu metabolism lactic strict heterofermentativ, prin care hexozele sunt convertite pe calea fosfocetolazei n acid lactic, etanol, acid acetic i CO, n condiiile absenei sistemului enzimatic fosfotransferazic specific pentru fermentarea glucozei, fructozei i lactozei. Studii recente au demonstrat c, prin cultivare n condiii anaerobe, n prezena fructozei se produce inducia biosintezei enzimelor din complexul transferazic i a enzimelor glicolitice care permit metabolizarea fructozei pe calea EMP.

Creterea i activitatea fiziologic a bacteriilor Lactobacillus brevis este condiionat de prezena factorilor de cretere: pantotenat de calciu, niacin, tiamin i acid folic, n timp ce riboflavina, piridoxalul i vitamina B nu constituie factori de stimulare.[Butriss, 1993] Orla-Jensen a mprit genul Lactobacillus n urmtoarele grupe:

- gupa Thermobacterium, care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L.lactis, L.helveticus, L.bulgaricus, L.acidophilus, L.leichmanii, L.delbruekii- grupa Sreptobacterium, care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L.casei, L.plantarum

- grupa Betabacterium, care cuprinde lactobacilii heterofermentativi ce contamineaz frecvent brnzeturile i salamurile crude: L.fermenti, L.brevis, L.viridiscens

Unii autori au clasificat streptobacteriile n acidorezistente i neacidorezistente. Lactobacilii neacidorezisteni produc compui aromatici (diacetil, aceton), ceea ce nseamn metabolizarea divers a acidului piruvic. Produc de dou ori mai mult diacetil i acetoin dect cei acidorezisteni.

Dei Lactobacilii nu sunt considerai proteolitici, ei i pot obine azotul necesar dezvoltrii din proteinele laptelui, fiind utilizai la fabricarea iaurtului, chefirului, cumsului, brnza Emmenthal, etc. Lactobacilii intereseaz i n fermentaia mslinelor, verzei, castraveilor, n industria crnii, n producia spirtului i a drojdiei presate n vederea acidifierii plmezilor, la fabricarea acidului lactic prin fermentare, etc. [Banu, 2008] 2.2.2.3. Genul Leuconostoc Descoperite de mult vreme, speciile genului Leuconostoc erau cunoscute ca bacterii lactice cu proprieti fiziologice i biochimice aproape similare cu cele ale lactobacililor heterofermentativi, difereniindu-se de acetia prin morfologie i proprietatea particular de a produce D-lactat din glucoz.

Genul Leuconostoc include bacterii sub form de coci, diplococi, heterofermentativi-produc prin fermentaie acid lactic, alcool etilic, CO, iar prin biosintez, poliglucide de tip dextran. Specia cu importan practic este Leuconostoc mesenteroides subspecia cremoris-bacterii care pot folosi ca surs de carbon citraii pentru a forma diacetil.

Aceste bacterii sunt asociate cu microbiota epifit a fructelor i legumelor i microbiota specific produselor lactate i a preparatelor din carne fermentate.

Morfologic se difereniaz prin forma sferic a celulelor, care uneori deriv n forme lenticulare asemntoare unor bacili cu dimensiuni reduse i cu capetele drepte.

Prin cultivare pe medii de cultur specifice, n condiii optime, celulele au dimensiuni de (0,5-0,7)(0,7-1,2)m i sunt aranjate n perechi sau lanuri scurte, spre deosebire de condiiile naturale, cnd stresul la care sunt supuse celulele genereaz modificri morfologice, evideniate n principal prin apariia de lanuri lungi.

Asemenea altor bacterii lactice, i tulpinile de Leuconostoc impun pentru dezvoltare medii complexe bogate n glucide, peptide, aminoacizi, vitamine i microelemente. Acionnd optim n domeniul de temperaturi de 20-30 C i pH de 6,5, speciile de Leuconostoc au abilitatea exclusiv de a fermenta glucoza pe calea pentozofosfatului producnd D-lactat, etanol i CO. n plus, se poate forma i acetat, atunci cnd coenzima NADH trece n form oxidat, n prezena frucozei sau a oxigenului, pe calea NADH oxidazei.

Genul Leuconostoc cuprinde urmtoarele specii importante: L.lactis, L.mesenteroides (specie tipic), L. Paramesenteroides, L.gelidum, L.carnosum etc. Specia Leuconostoc lactis este caracterizat prin termoretizisten superioar, comparativ cu alte specii ale genului. [Rehm, 1996] 2.2.2.4. Genul Pediococcus Bacteriile lactice clasificate n genul Pediococccus sunt homofermentative, mezofile, cu temperatura optim la 30 C. Ele sunt repartizate n apte specii reprezentative: P. acedilactici, P. damnosus, P. parvulus, P. inopinatus, P. dextrinicus, P. pentosaceus i P. urinaeequi, caracterizate prin proprieti morfologice, fiziologice, nutriionale i genetice distincte. Microscopic, se disting ca celule de form sferic, cu diametru de 0,4-1,4m, asociate n perechi sau tetrade, ca urmare a diviziunii, dup dou planuri perpendiculare. Coloniile formate pe medii cu agar sunt mici (1,0-2,5 mm diametru), cu aspect neted, perimetrul circular i pigmentaie alb-gri.

n timp ce majoritatea pediococilor sunt bacterii facultative anaerobe i microaerofile, tulpinile de Pediococcus acidilactici i Pediococcus pentosaceus pot s se dezvolte bine, att n condiii aerobe, ct i microaerofile. n condiii aerobe, pediococci produc acid acetic prin consumul acidului lactic din mediul fermentativ. Dei sunt caracterizate ca bacterii lactice catalazo i benzidin negative, n unele culturi dezvoltate pe medii cu concentraii reduse sau ridicate de glucide, s-a detectat potenialul acestora de a produce pseudo-catalaz.

Pediococii necesit pentru cretere glucide i vitamine ( vitamina B, biotina, acidul folic, etc.), aminoacizi (metionin i lizin), i microelemente (K, Mg, Ca, Zn, Fe, i Mn).

Au capacitatea de a crete optim n domeniul de temperature 25-40C, i la pH6,0-6,5.

Majoritatea tulpinilor tolereaz concentraii de NaCl de 4-6,5%. [Rehm, 1996] O bun dezvoltare a pediococilor a fost observat n medii de D-xiloz i glucoz n condiii aerobe. Tulpiniile de P.acidilactici posed capacitatea de a sintetiza -galactozidaz, sub control pozitiv, generat prin inducie prin efectul lactozei, galactozei, maltozei, melibiozei i acidului lactobionic.

Pediococii nu au abilitatea s reduc nitraii i nu pot s se dezvolte n medii cu sruri de amoniu ca unic surs de azot.

Prin fermentaia homolactic a glucozei, produc concentraii de peste 90% acid lactic. Cnd fructoza, riboza, arabinoza i xiloza constituie substraturi fermentescibile, acidul lactic este compusul major al fermentaiei, alturi de etanol i acid acetic n concentraii reduse. [Salvadori, 1996] 2.2.2.5. Genul Bifidobacterium

Dei cunoscute de mai mult vreme, interesul specialitilor pentru bifidobacterii a nceput s ia amploare abia dup anii '80, odat cu extinderea utilizrii acestora ca aditivi alimentari, n scopul obinerii de alimente funcionale sau n compoziia unor suplimente nutritive. Aceste bacterii se apropie din punct de vedere fermentative de bacteriile lactice heterofermentative, producnd acid acetic i lactic n raport 3:1 precum i cantiti mici de acid formic, etanol, acid succinic. Nu produc CO. Prezint forme diverse: celule scurte cocoidale, alungite, bifurcate, cu extremiti spatulate. [Banu, 2004] Prin cultivare pe medii cu agar, bifidobacteriile formeaz colonii cu caractere similare bacteriilor lactice, i n special cu cele de lactobacili. Spre deosebire de lactobacili, bifidobacteriile nu sunt acidotolerante i nu se pot dezvolta n facultativ-anaerobioz. Ediia a IX-a a Bergey's Manual of Systematic Bacteriology descrie 24 de specii de bifidobacterii, dintre care speciile: bifidum, longum, infantis, breve, adolescentins, angulatum, catenulatum, pseudocatenulatum i dentium, considerate de origine uman, sunt predominate n microbiota colonului i implicit n materii fecale i ape reziduale. Toate aceste specii pot fermenta lactoza, o caracteristic important pentru rolul lor de culturi starter probiotice n industria laptelui.

Principalele proprieti ale bifidobacteriilor sunt: [Butriss, 1993]- controlul i reglarea componentei microbiotei intestinale, n paralel cu creterea rezistenei fa de afeciunile enterice

- prevenirea i tratamentul bolilor diareice

- transformarea metaboliilor toxici

- deconjugarea srurilor biliare- prevenirea constipaiei- protecia funciei ficatului- reducerea colesterolului seric- reducerea presiunii sanguine

- potenial anticancerigen

- proprieti imunomodulatoare i imunostimulative

- producerea de factori de cretere ( micronutrieni i vitamine)

- mbuntirea toleranei fa de lactoz - mbuntirea absorbiei calciului

- degradarea nitrozaminelor i metabolismul ionilor de amoniu- refacerea microbiotei intestinale utile dup tratamente cu antibiotice

Toate bifidobacteriile sunt favorizate n implementarea i colonizarea colonului de ctre substanele prebiotice (substane bifidogene), care prin metabolizare servesc ca surs de energie. n prezent exist o adevrat industrie de producere de substane prebiotice, principalele ri productoare fiind Japonia, Germania, Canada, Austria, Italia, Berlgia i Frana. [Banu, 2004] 2.3. Ci de formare a produilor principali i secundari n fermentaia lactic n funcie de echipamentul enzimatic al bacteriilor lactice i sursele de carbon fermentescibile difer biochimismul formrii produilor de fermentaie. 2.3.1. Bacterii lactice homofermentative

Bacteriile lactice homofermentative produc fermentarea anaerob a hexozelor pe calea Embden-Mazerhof-Parnas (EMP) pn la formarea acidului piruvic, apoi fiind lipsite de enzima piruvat decarboxilaz, acidul piruvic devine acceptor de hidrogen. [Banu, 1999] n fermentaia homolactic, forma predominant a acidului lactic este dependent de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei (lactococci formeaz L(+) lactat i lacobacilii D(-) lactat, dar i de prezena lactat racemazei, care atunci cnd este activ n celula microbian, rezult prin fermentaie amestecul racemic (D,L-lactat): L- lactatdehidrogenaz

L(+) lactat + NAD Piruvat + NADH + H

D- lactatdehidrogenaz

D(-) lactat + NAD Piruvat + NADH + H

Lactat racemaz

L(+) lactat D(-) lactat

Ecuaia global a fermentaiei homolactice este:

Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza i lactoza pot fi trasportate ca atare n celul printr-un sistem activ de permeaze prezent la Streptococcus salivarium subspecia thermophillus (SST) i lactobacilii termofili, sau prin transport activ catalizat de sistemul fosfotransferaz-fosfoenolpiruvat (PT-PEP) prezent la bacterii ale genului Lactococcus i Lactobacillus, cu formarea esterilor fosforici. [Banu, 1999] Lactoza sau lactozo-P n celula bacterian sub aciunea -galactozidazei (lactazei) este transformat n glucidele componente.

Lactoz -galactozidaz Glucoz + Galactoz

n timp ce glucoza este metabolizat direct pe calea EMP, galactoza este trasnformat pe urmtoarele ci metabolice:

a) calea D-tagatozei 6 P care este prezentat n figura 2.1

b) calea Leloir prezentat n figura 2.3

c) calea glicolitic ( Embden Mayerhof Parnas) de fermentaie a glucozei- figura 2.4

Fig.2.1. Fermentarea galactozei 6P pe calea tagatozei [Banu, 2004] Din analiza figurii 1 rezult c streptococii lactici, pentru a metaboliza lactoza, aceasta trebuie s permeeze membrana celular, ceea ce este posibil datorit faptului c streptococii posed un sistem fosfotransferaz ( PTS ) care este dependent de fosfoenolpiruvat ( PEP ).

Odat ajuns n celul, lactoza este fosforilat la glucozil--1,4-galactozid-6-fosfat.

Schema de transformare a lactozei n lactoz 6-fosfat este urmtorea:

PEPHPr HPr-P Piruvat

Enzima I

F III

EMBED Equation.3 HPr-P F III-PHPr

F III-PLactoz Lactoz 6-P F III

Enzima II

n care: PEP este fosfoenolpiruvatul

proteina HPr i enzima I sunt proteine comune diferitelor sisteme PTS F III sau enzima specific III este enzima care transport lactoza

enzima IIeste enzima specific de fosforilare a lactozei. O dat fosforilat, lactoza este trecut n galactoz-6-P cu ajutorul fosfo--galactozidazei, galactoza-6P mergnd mai departe pe calea tagatozei. [Banu, 2004]

Fig.2.2. Transformrile lactozei de ctre -galactozidaz

i -D-fosfogalactozid-galactohidrolaz. [Banu, 2004] Pentru a se dezvolta n lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizeaz lactoza n glucoz i galactoz cu ajutorul-galactozidazei sau dup transformarea acesteia n lactoz-fosfat, care la rndul ei este hidrolizat n glucoz i galactoz-6P cu ajutorul -D-fosfogalactozid-galactohidrolaz.

-D-fosfogalactozid-galactohidrolaza este utilizat de Lactobacillus casei (facultativ heterofermentativ) iar -galactozidaza este utilizat de majoritatea lactobacililor din grupa homofermentativilor. [Banu, 2004] Hexozele (glucoza) sunt transformate de lactobacilii homofermentativi pe calea EMP.

Galactoza rezultat din lactoz prin intermediul -galactozidazei trebuie s fie mai nti transformat n glucoz-6P care intr pe calea Embden-Mayerhof-Parnas ( fig.2.3 ).

Fig.2.3. Calea Leloir de metabolizare a galactozei [Banu, 2008]

Fig. 2.4. Fermentarea lactic a glucozei pe calea hexozodifosfatului [Banu, 2004]

( produs de bacterii lactice homofermentative)

Fermentarea lactozei de ctre streptococii lactici, dup ce aceasta a ptruns n celulele respective, se face prin transformarea iniial a acesteia n lactoz 6-P, care apoi este hidrolizat n glucoz i galactoz-6P prin intermediul fosfat -galactozidazei ( fig.2.4 ) iar galactoza 6P este utilizat pe calea tagatozei n vederea formrii unei cantiti suplimentare de acid lactic.

n fermentaia homolactic se pot forma, n cantiti mici, substane de arom, diacetil i acetoin, fie prin metabolizarea glucidelor, fie a citrailor care asigur o surs suplimentar de acid piruvic, dup urmtorul biochimism (fig.2.5 i fig.2.6) :

Fig. 2.5. Formarea diacetilului din glucide [Banu, 2008]

Lactococii aromatizai ( L.lactis-diacetilactis, L.cremoris) produc n lapte cantiti de 0,1-1,3 mg% diacetil, care pot fi mrite prin adaos de citrat, controlul aciditii i al gradului de aerare.

Fig. 2.6. Formarea diacetilului din citrai [Banu, 2008]

Fig. 2.7. Formarea de diacetil de ctre Str. lactis subsp. diacetilactis i leuconostoci [Banu, 2004] Lactobacillus delbrueckii subspecia bulgaricus poate forma aldehid acetic din surse similare, cu rol n formarea aromei specifice iaurtului, optim atunci cnd raportul ntre aldehida acetic i diacetil este de 2,8 (fig.2.6). [Banu, 2008] Din analiza figurii 2.7. n care este prezentat schema de formare a diacetilului, respectiv a acetoinei i 2,3 butilenglicolului n cazul lui Streptococus lactis subspecia diacetilis este de remarcat faptul c citratul ptrunde n celula bacteriei lactice cu ajutorul citrat-permeazei care este indus chiar de prezena citratului n lapte. Permeaza respectiv este activ numai la pH