U.M.F ,,GR.T.POPA” IASIFACULTATEA DE BIOINGINERIE MEDICALA

Metode Cromatografice de

Analiză

Manole Georgiana – LarisaGrupa 4, Bim 1

1

I.INTRODUCERE

Metoda cromatografica Cromatografia este o metoda de separare avand la baza distribuirea

componentilor probei intre doua faze: una stationara (avand suprafata mare,solida sau lichida) si una mobile (lichida sau gazoasa) .

Tehnica cromatografica moderna este mai complexa si folosita frecvent pentru diverse separari ,dar termenul initial dat de Tvet (1903) de cromatografie(khroma=culoare,grafein=a scrie ) se pastreaza si in present.

Cei care au impus metoda cromatografica in stiinta au fost insa R.Kuhn si E.Lederer,independent unul de altul , in 1931.

Tehnicile cromatografice au la baza viteza diferita cu care componentele amestecului migreaza de-a lungul fazei stationare fiind purtate de faza mobila.

Doi solutii vor fi antrenati cu viteze diferite datorita afinitatii diferite pentru faza stationara . Ei vor fi analizati fie la iesirea din coloana(cromatografia pe coloana inchisa),fie adsorbiti pe faza stationara –cromatografie pe strat subtire si pe hartie (coloana deschisa).

2

II.CROMATOGRAFIA PE HARTIE SI IN STRAT SUBTIRE

In cromatografia pe hartie (CH) , pentru fixarea fazei stationaare poate fi folosita hartia de filtru . O fasie umectata de hartie de filtru poate inlocui coloana cromatografica. Deci,insasi hartia actioneaza ca support solid si apa ca faza stationara .

In cromatografia pe strat subtire (CSS) faza stationara este in mod curent o substanta solida polara ca silicagelul sau alumina , care acopera intr-un strat subtire placi de sticla , plastic sau aluminiu . Straturile subtiri sunt realizate si din schimbatori de ioni .Si hartia poate fi modificata chimic pentru a avea proprietati de schimbator de ioni .

In ambele tehnici (CH si CSS), probele sunt aplicate ca spoturi sau fasii la una din marginile hartiei sau ale stratului subtire: faza mobila este lasata sa strabata hartia sau placa de la aceasta margine spre marginea opusa .In acest proces componentele probei migreaza de-a lungul suprafetei cu viteze diferite si prin urmare se vor separa in spoturi sau benzi individuale . Acest proces se numeste developare

3

Dupa developare , substantele colorate sunt imediat vizibile : componentele incolore pot fi vizualizate prin stropire cu un reactiv de culoare sau in lumina ultraviolet prin fluorescenta produsa.

O cromatograma tipica pe hartie sau pe strat subtire:

Spoturile initiale , circulare , devin progresiv eliptice pe directia curgerii din cauza difuziei si efectelor de transfer de masa .Din acest motiv eficienta separarii (capacitatea de a separa cat mai multe component din proba) si rezolutiei (caracterizeaza separabilitatea a doua component din proba)sunt diminuate .

Elutia trebuie oprita inainte ca frontal de solvent sa ajunga la marginea opusa hartiei sau placii.

Pentru identificarea componentelor din amestec se poate determina factorul de retinere-Rf-care este characteristic unei anumite componente in conditiile date . Rf reprezinta raportul dintre viteza de migrare a

4

componentei si viteza de migrare a developantului(fazei mobile ), sau raportul dintre distanta de la linia de la start pana in centrul spotului -OS-si distanta de la start pana la frontal de solvent -OF-

Rf variaza invers proportional cu D (raportul de distributie)si este mai mare ca zero , dar mai mic decat unitatea cu (cu rare exceptii in cazul amestecului de solventi ce formeaza doua fronturi ; in acest caz calculul se va face in raport cu frontal cel mai apropiat de linia de start).

Valorile lui Rf sunt constant pentru un anumit compus daca se mentin conditii identice de lucru . Pentru identificari precise se recomanda utilizarea substantelor etalon care se aplica fie parallel cu proba de analizat , fie impreuna cu proba de analizat .

III.FACTORII CARE DETERMINA VALOAREA LUI Rf SI A REZOLUTIEI

Valoarea lui Rf-ului este determinata de rata de distributie care depinde de solubilitatea relative a componentelor separate sau polaritatea relative a componentelor adsorbite . De exemplu,daca cromatografia in strat subtire este folosita pentru separarea amestecului format dintr-o hidrocarbura ,oleat de metal , cholesterol si vitamina E atunci , hidrocarbura mai putin polara , va migra cel mai mult , iar colesterolul fiind cel mai polar va ramane in apropierea liniei de start ; oleatul de metal este mai putin polar ca vitamina E si se va gasi intre aceasta si hidrocarbura.

Cu toate ca procesul de separare are loc cu viteza mai mare la temperatura mai ridicata , rezolutia scade din cauza difuziei . In timp ce in cromatografia pe hartie valorile lui Rf cresc semnificativ cu temperature , in cazul cromatografiei pe strat subtire aceste cresteri sunt

5

mult mai reduse . Controlul strict al temperaturii nu este necesar daca probele si etaloanele sunt aplicate in aceleasi conditi

Calitatea hartiei sau al materialului stratului subtire , precum si prezenta impuritatilor influenteaza valoarea Rf . Hartia sau stratul subtire trebuie sa aiba o grosime uniforma , conditie mai usor de realizat in cazul hartiei (din fabricatie)dar mai dificil de realizat in cazul straturilor subtiri . Grosimea stratului subtire trebuie sa fie cuprinsa intre 0,2 si 0,3 mm .

O atmosfera stabila, saturata cu vaporii fazei mobile este de asemenea necesara pentru a asigura o reproductibilitate a valorilor Rf . Daca nu este o atmosfera saturate in vaporii solventiilor acestia se pot evapora de la suprafata hartiei sau stratului subtire , cauzand o incetinire a deplasarii frontului de solvent si in consecinta o modificare a Rf-ului .In practica , cromatograma este cel mai bine developata in tancuri (camere)de sticla in care atmosfera saturate a fost realizata prin captusirea peretilor cu hartie de filtru imbibata cu amestecul de solventii. Tancul se pregateste cu aproximativ 15 minute inainte de developarea cromatogramei .

Cantitatea de proba necesara a fi aplicata pentru obtinerea de spoturi detectabile cu un minimum de intindere este intr 0,01 si 5,0 mg . Pentru valori mai mari , se modifica semnificativ Rf-ul ,iar rezolutia este mult redusa din cauza intinderii spoturilor .

IV. APLICAREA PROBEI

Procesul aplicarii probei pe hartie sau strat subtire este numit spotare .Proba poate fi dizolvata in mai putin de 10 uL solvent , care se allege cat mai volatile pentru a preveni intinderea exagerata a spotului. Volumul de solutie aplicat , in cazul determinarilor cantitative, poate fi

6

masurat cu precizie folosind micropipeta sau microseringa ; in cazul determinarilor calitative , spoturile pot fi aplicate folosind tuburi capilare. Spotul initial se aplica aproximativ 2 cm de una din marginile hartiei sau cromatoplacii

V.PROCEDEE DE DEVELOPARE

Developarea cromatogramelor reprezinta procesul cel mai important in cromatografie .

Dupa directia de migrare a developantului in cazul cromatografiei pe hartie deosebim :

Developare descendenta , in care developantul strabate hartia de sus in jos;

Developare ascendenta , in care faza mobile se deplaseaza de jos in sus

Developare orizontala sau radiala , in care developantul se deplaseaza de la centru spre margine circular.

Tehnica descendenta este mai rapida deoarece migrarea fazei mobile este grabita de gravitatie . In acest caz hartia este atarnata vertical in tancul de developare cu capatul superior introdus intr-un rezervor continand faza mobile ; in cazul tehnicii ascendente , viteza de migrare este mai mica fata de cazul tehnicii descendete; hartia este tot in pozitie vertical cu capatul inferior introdus in rezervorul cu faza mobila

7

Developarea radial sau circular consta in migrarea fazei mobile pe orizontala de la centrul hartiei spre exterior . Faza mobile migreaza fazei mobile pe orizontala de la centrul hartiei spre exterior . Faza mobile migreaza din rezervor , prin intermediul unui fitil fixat in centrul hartiei si cu capatul opus introdus in rezervor . Frontul solventului va strabate hartia circular , iar componetele amestecului , aplicate circular , vor separa in arcuri de cerc concentric . In aceste caz rezolutia este mai buna si pot fi aplicate cantitati mai mari de substanta .

In cazul cromatografiei pe strat subtire ,cel mai mult este folosita metoda ascendenta cu toate ca nu exista motive de a nu folosi si celelalte doua tehnici .

In unele cazuri , pentru separarea mai eficienta a amestecurilor complexe, in care mai multe component prezinta aproximativ acelasi Rf pentru acelasi developant, deci rezolutia este practice nula, se apeleaza la developarea bidimensionala . Acesta consta in developarea cromatogramei intr-un system de solventi, dup ace s-au aplicat spoturile

8

initiale la una din margini si dupa complete uscare , hartia sau placa se roteste cu 90 de grade apoi se developeaza intr-un al doilea sistem de solventi.

VI.IDENTIFICAREA SI SEPARAREA COMPONENTELOR

Substantele colorate pot fi observate visual dupa developarea cromatogramei .Componentele incolore sunt vizualizate in lumina UV , in special pentru componentele necunoscute . Astfel , numerosi compusi organic prezinta fluorescent la iradiere cu radiatii UV cu  λ = 360 nm sau 254 nm .

In cazul substantelor nefluorescente se inglobeaza in hartie sau stratul subtire o substanta fluorescent in care caz spoturile apar ca o pata intunecata pe un fond fluorescent. Cel mai des se foloseste vizualizarea chimica prin stropire cu reactivi de culoare . Solventul in care s-a dizolvat reactivul trebuie sa fie usor volatil pentru a favoriza o uscare rapida ; se foloseste in mod curent acetone ,etanolul, cloroformul .

Reactivii pot fi selective (reactioneaza numai cu anumite grupe functionale)sau comuni (reactioneaza cu mai multi compusi avand strcturi diferite).Pentru ionii metalici se folosesc in acest scop reactivii cu care acestia formeaza compusi greu solubili si colorati .

Reactivii de culoare folositi pentru vizualizare.

Reactivul Compusii cu care reactioneazaVaporii de iod Substantele organice in general;

compusii nesaturatiAcidul fosfomolibdenic Substante organice in generalFluoresceina\brom Substante organiceAcid sulfuric Compusi organici (numai in CS)Ninhidrina sau isatina Aminoacizi

9

2,4-Dinitrofenilhidrazina Cetone si aldehideSolutie apoasa de H2S Cationi metaliciDifenil carbazida Cationic metaliciFtalat de aniline ZaharuriTriclorura de stibiu SteroiziAcid cloroplatinic Alcaloizi

In cromatografia pe strat subtire pentru identificarea substantelor organice stropirea cu acid sulfuric concentrate si incalzirea placii la aproximativ 200 grade C cateva minute, duce la carbonizarea substantei organice cu aparitia spoturilor brune sau negre.

VII.FAZA STATIONARA

Natura si functiile hartiei in CH

Hartia cromatografica este asemanatoare hartiei de filtru avand o mai buna aranjare a fibrelor de celuloza formate din lanturi ale anhidrocelulozei cu proprietati hidrofile.Hartia cromatografica mai contine pe langa fibrele de celuloza (in proportie de 95-99%) si mici cantitati de grupe carboxil , aminoacizi legati . Cantitatea de apa absorbita poate varia intre 5 si 20% si constituie faza stationara . Faza mobile se deplaseaza prin hartie datorita capilarelor create prin asezarea fibrelor de celuloza .

Hartia cromatografica se prepara din fibre de celuloza pura-linters-in urma unui tratament special .

10

Caracteristicile unor hartii cromatografice mai folosite .

Hartia Nr . Greutatea medie g\m2

Viteza de absortie a apei in mm\30min

Alte caracteristici

whatman 1 87 140-220 Hartie etalonwhatman 2 97 200-300 Migrare lentawhatman 3 185 150-250 Separari de

substante organice

whatman 4 93 70-100 Migrare rapidaSchleicher-schull

2040a 85-95 100-110 Corespunde cu Whatman 4

Schleicher-schull

2040b 120-125 140-160 Corespunde cu Whatman 4

Schleicher-schull

2043a 90-95 90-95 Corespunde cu Whatman 1

Schleicher-schull

2043b 110-120 100-110 Corespunde cu Whatman 1

Archer 302 Separari de substante organice

VII. FAZA MOBILA

Alegerea fazei mobile este destul de empirica , dar poti fi formulate unele reguli generale.

Pentru cromatografia pe hartie , faza mobile este adesea un amestec de solvent organic si apa cu adios de acizi , baze sau agenti de complexare pentru optimizare solubilizari componentelor amestecului de analizat . De exemplu , o separare buna a componentelor polare sau ionice se poate realiza cu un amestec de apa si n-butanol. Adaugarea de acid acetic permite incorporarea a unei cantitati mai mari de apa in amestecul apa cu n-butanol si solubilizarea componentelor bazice; adaugarea de amoniac face sa creasca solubilitatea componentelor acide .

11

In cazul fazelor stationare hidrofobe se folosesc amestecuri de solvent nepolari sau slab polari (benzen,ciclohexan,cloroform.)

In cazul CSS , cand silicagelul este faza stationara , pot fi folositi solventii cu polaritate mica . Solventii polari pot ei insisi fi adsorbiti conducand la un sistem de repartitie , lucru nedorit. In acest caz , solventii cei mai folositi in ordine descrescatoare ca importanta sunt : n-hexan , eter de petrol, ciclohexan , tetraclorura de carbon,toluene , benzene , dietil eter , chloroform , clorura de metilen , acetone , etilacetona, piridina , etanol .

VIII.APLICATIILE ANALITICE ALE CH SI CSS.

Atat in cromatografia pe strat subtire cat si cea pe hartie sunt folosite cel mai mult in scop calitativ . Aproape orice amestec de substante organice sau anorganice poate fi partial separate prin una dintre aceste tehnici .

In analiza calitativa componentii sunt idetificati prin compararea valorii Rf-urilor cu acelea ale etaloanelor, cromatogramele fiind executate in conditii identice; se mai face si prin indepartarea spoturilor de pe cromatograma si identificarea componentelor prin reactii chimice sau metode fizice .

Analiza cantitativa folosind CH si CSS nu se poate face cu precizie si acuratete ridicata . In conditi strict controlate se poate gasi o relatie cantitativa linear cantitativ al unui spot poate fi apreciat si prin masurarea densitatii optice direct pe cromatograma folosind un densitometru sau dupa taierea fasiei de hartie sau razuirea spotului de pe cromatoplaca , dizolvarea componentei intr-un solvent convenabil si masurarea absorbantei spectrofotometric.

12

Eroarea determinarilor cantitative este de regula intre 5% si 10% ,dar in unele cazuri deosebite , poate merge pana la 1-2% .

Cateva aplicatii in analiza a CH si CSS

Separarea Tehnica Faza mobilaAminoacizi si peptide CH sau CSS pe celuloza Bidimensionala

1.n-bunatol\acid acetic\apa2.n-fenol\apa

Zaharuri simple CH n-propanol\acetat de etil \apa

Steroizi CSS pe silicagel Cloroform\acetonaIonii de Cu,Co,Fe,Mn CH Acetona HCl concentrateAlcaloizi CSS pe silicagel Cloroform\etanolInsecticide CSS pe silicagel HexanVitamine:A,D,E,B,C

CSS pe silicagel Hexan\acetona\apa

BIBLIOGRAFIE

Vasile Dorneanu,Maria Stan,Marcel Florin Musteata , ,, CHIMIE ANALITICA” , IASI, “GR . T. POPA “ ,U.M.F , 2003

13