Lp. 10: Testarea sensibilităţii la antibiotice. Metoda difuzimetrică.

Obiective:1. Cunoaşterea şi înţelegerea relaţiei bacterie – antibiotic in vitro şi in vivo; importanţa

practică a acestor noţiuni2. Însuşirea criteriilor utilizate în iniţierea şi conducerea antibioterapiei.3. Cunoaşterea şi utilitatea practică a antibiogramei difuzimetrice – principiu, indicaţii,

necesar, procedură, citirea şi interpretarea, control de calitate, avantaje şi dezavantaje.

1. Discutarea relaţiei bacterie – antibiotic in vivo şi in vitro

In vitro: - CMI (cantitatea minimă de antibiotic care inhibă cultivarea unei tulpini bacteriene); - CMB (cantitatea cea mai mică de antibiotic care omoară 99,9% din bacteriile unei tulpini testate).

In vivo: – bacterie sensibilă la un anumit antibiotic (folosit în doze uzuale asigură cu mare probabilitate vindecarea infecţiei); - bacterie rezistentă la un anumit antibiotic (există o probabilitate puternică de eşec terapeutic); - bacterie intermediară (efectul terapeutic se poate obţine prin supradoze de antibiotic, administrare locală, doze uzuale în cazul antibioticelor care realizează concentraţii urinare mai mari decât cele serice).

Relaţia CMI cu încadrarea tulpinilor bacteriene în una din cele 3 categorii (S, R, I): tulpinile sensibile (S) sunt cele care au valoarea CMI < decât nivelul mediu al

antibioticului din focarul de infecţie; tulpinile rezistente (R) au CMI > decât nivelul mediu al antibioticului în focarul de

infecţie; tulpini intermediare (I) au CMI apropiată de nivelul mediu al antibioticului din focarul

de infecţie.

2. Criterii în iniţierea şi conducerea antibioterapiei. - oportunitatea tratamentului antibacterian;

- criterii în alegerea antibioticului adecvat: sensibilitatea agentului etiologic:

o terapie empirică bazată pe evaluarea probabilă a agentului etiologic în funcţie de tabloul clinic (agenţi etiologici posibili) şi rezultatele microscopiei;

o tratament ţintit, adaptat la sensibilitatea tulpinii izolate, determinată prin antibiogramă.

sediul infecţiei; particularităţi ale pacientului; criterii ecologice; criteriul economic.

3.a. Antibiograma difuzimetrică

Principiu: pe suprafaţa mediului Mueller-Hinton însămânţat în pânză cu tulpina de testat depunem microcomprimate cu diferite antibiotice; antibioticul difuzează circular în mediu, realizând

1

sensibil intermediar

concentraţii descrescătoare; cultura este inhibată în zona în care antibioticul realizează concentraţii ≥ CMI.

Indicaţii: testarea uzuală a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor cu creştere rapidă;

Necesar şi procedură: - realizarea unei suspensii a tulpinii de testat (folosind cultura pură) cu densitatea de 108 UFC/ml, apreciată cu standardul de 0,5 Mac Farland; - impregnarea cu această suspensie a unui tampon de vată steril cu ajutorul căruia se însămânţează în pânză suprafaţa mediului Mueller-Hinton;- depunerea microcomprimatelor cu antibiotice;- incubare la 35ºC, timp de 18-24 ore;- în cursul incubării, antibioticul difuzează circular în mediu, realizând concentraţii descrescătoare în raport cu distanţa faţă de microcomprimat; cultura este inhibată în zona în care antibioticul realizează concentraţii ≥ CMI.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC – American Type Culture Collection) care si-a păstrat sensibilitatea naturală la antibioticele testate, cu ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru.

Citire şi interpretare: diametrul zonei de inhibiţie a creşterii, în mm, se compară cu cele două diametre critice stabilite de experţi:

– când această valoare este ≥ diametrul critic superior (D), tulpina este considerată sensibilă (S)

– când valoarea găsită este ≤ diametrul critic inferior (d), tulpina este considerată rezistentă (R)

– când diametrul măsurat este situat între valorile celor două diametre critice considerăm tulpina ca intermediară (I).

Avantaje: posibilitatea testării simultane a sensibilităţii faţă de mai multe antibiotice Dezavantaje: lipsa de concordanţă a rezultatelor obţinute in vitro cu rezultatele terapiei in vivo.

rezistent

≥ D ≤ d

2

Lp 11: Testarea sensibilitatii la antibiotice. Tehnici cantitative

Obiective:1. Cunoaşterea şi utilitatea practică a metodelor cantitative de testare a sensibilităţii

bacteriilor la antibiotice:a) metoda diluţiilor în mediu lichid– principiu, indicaţii, necesar, procedură, citirea şi interpretarea, control de calitate, avantaje şi dezavantaje;

b) metoda diluţiilor în mediu solid;c) testul E.

2. Aprecierea eficienţei terapiei cu antibiotice.

1. Metode cantitative

Principiu: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânţat într-un gradient discontinuu de concentraţii de antibiotic; după incubare este urmărită CMI.

Indicaţii:- precizarea categoriei de sensibilitate a unei tulpini clasificate intermediară prin antibiograma difuzimetrică;- determinarea sensibilităţii bacteriilor fastidioase;- testarea sensibilităţii la penicilină a tulpinilor de S. pneumoniae izolate din sânge sau

LCR;- testarea rezistenţei S. aureus faţă de vancomicină;- testarea sensibilităţii la penicilină a tulpinilor de streptococi viridans izolate din

endocardite.

a. Metoda diluţiilor în mediu lichid

Necesar şi procedură: - realizarea de diluţii duble succesive de antibiotic în bulion Mueller-Hinton;- se adaugă câte 0,1ml din suspensia de 105UFC/ml a tulpinii de testat;- se utilizează un martor cultivare şi a unui martor sterilitate mediu;- incubarea mediilor la 35ºC timp de 18-24 ore.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC), cu ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru

Citire şi interpretare: CMI corespunde celei mai mici concentraţii de antibiotic, în µg/mL, care determină inhibarea

vizibilă a creşterii, comparativ cu martorii pentru cultivarea tulpinii şi sterilitatea mediului; raportăm această valoare la cele două concentraţii critice, maximă (C) şi minimă (c) pentru

definirea tulpinii ca S, R sau I.Rezultatul este formulat după ce am verificat dacă, CMI a tulpinii de referinţă se încadrează între

valorile recunoscute de standard.

3

sensibil intermediar

Avantaje: determinarea cu exactitate a CMIDezavantaje: realizarea testării faţă de un singur antibiotic folosind o cantitate mare de materiale şi medii.

b. Testul E îmbină acuratețea testării cantitative și simplitatea testării difuzimetrice cu mare economie

de timp; pe o suprafață a unei langhete de 5mm / 50 mm din plastic inert, neporos este fixat un

gradient exponențial de antibiotic, desicat și stabilizat, cu 15 diluții între 0,016 și 256 ml/L sau 0,002 și 32 ml/L, iar pe cealaltă suprafață este marcată scala de lectură în µg/ml corespunzătoare CMI;

pe suprafața unei plăci cu mediu agarizat preînsămânțată cu tulpina testată în condiții standardizate, langhetele cu antibiotic sunt depuse radiar. După incubarea corespunzătoare, CMI este indicată de intersecția dintre zona elipitică de inhibiție a culturii și scala de gradiente a langhetei;

testul este fiabil, reproductibil și permite determinarea concomitentă, pe aceeași placă, a CMI ale mai multor antibiotice pentru bacterii aerobe sau anaerobe, supravegherea pacienților pe parcursul terapiei antimicrobiene pentru a surprinde selectarea de clone rezistente, testarea pneumococilor față de beta-lactamine, a enterococilor față de aminoglicozide cu depistarea rezistenței de nivel înalt, a enterobacteriaceelor producătoare de beta-lactamaze cu spectru extins.

2. Aprecierea eficientei terapiei cu antibiotice.Criterii clinice:

- scăderea febrei;- ameliorarea stării generale.

Criterii paraclinice:- scădere / normalizarea valorilor:

o CRP (detalii);o Procalcitoninei;o VSH.

- normalizarea leucogramei.Criterii bacteriologice:

rezistent

≤ c ≥ C

4

- negativarea examenelor bacteriologice.

5

6