Universitatea Politehnic Bucureti Facultatea de Chimie Aplicat i tiina Materialelor

Cu tema: ,, Lipoxigenaza

Student: Petcu Adina Roxana Grupa: CATB Anul : IV

Bucureti

2010

2

Cuprins1. Introducere..................................................................................................3

2. Produii lipoxigenazei.................................................................................7 3. Activitatea lipoxigenazei n seminele plantelor.........................................10 4. Metabolizarea acidului arahidonic cu ajutorul lipoxigenazei....................11 5. Bibliografie.................................................................................................13

3

1. LIPOXIGENAZAIntroducere Lipoxigenaza (EC 1.13.11.) este o dioxigenaz care conine fier i care catalizeaz oxidarea acizilor grai polinesaturai (cum sunt acizii linoleic, linolenic i arahidonic) la hidroperoxizi. Enzima acioneaz asupra configuraiei cis a acestor acizi, configuraia trans nefiind afectat. De asemenea, ca substrat al enzimei pot servi i gliceridele sau esterii metilici ai acestor acizi. Funciile biologice i clasificarea lipoxigenazelor Lipoxigenazele se gsesc n plante unde sunt implicate n diverse aspecte ale fiziologiei plantelor, incluznd creterea i dezvoltarea, rezistena la parazii i rezistena la injurii. La mamifere, un numr de izoenzime ale lipoxigenazelor sunt implicate n metabolismul prostaglandinelor i leucotrienelor. Se cunosc urmtoarele enzime lipoxigenaze: Lipoxigenazele plantelor (EC 1.13.11.12/PR001246). Plantele prezint o varietate de izoenzime citosolice similare cu izoenzimele cloroplaste. 5 lipoxigenaza arahidonic la mamifere (EC 1.13.11.34/PR001885). 12 lipoxigenaza arahidonic la mamifere (EC 1.13.11.31/PR001885). 15 lipoxigenaza eritroid specific celulei la mamifere (EC 1.13.11.33/PR001885). 15 lipoxigenaza (albastr) la iepure cu inhibitor (galben) legat de un situs activ. Structura tridimensional a lipoxigenazei Structura cristalin a lipoxigenazei din boabele de soia i a celei provenite de la iepure sunt bine cunoscute. Proteina const dintr-un domeniu plat mic Nterminal i un domeniu catalitic C-terminal, care conine situsul activ. Att la plante, ct i la mamifere, domeniul N-terminal conine opt iraguri antiparalele mpletite, dar la boabele de soia, domeniul este semnificativ mai mare dect la enzimele iepurelui. Lipoxigenazele vegetale pot fi scindate enzimatic n dou fragmente care sunt strns asociate atunci cnd enzima rmne activ. Separarea celor dou domenii conduce la pierderea activitii catalitice. Domeniul C-terminal (catalitic) const din 18 22 helice i una (la iepure) sau dou (enzimele din soia) planuri antiparalele la captul opus. Situsul activ Atomul de fier din lipoxigenaz este legat cu patru legturi, din care trei sunt resturi de histidin. ase histidine se regsesc n secvenele lipoxigenazei, cinci dintre ele sunt prinse ntr-un grup de 40 aminoacizi. Regiunea aceasta

4

conine doi din cei trei liganzi cu zinc. Celelalte histidine s-a artat c sunt foarte importante n activitatea lipoxigenazei.

Figura 1. Reprezentarea n panglic a lipoxigenazei din boabele de soia Violet domeniul N-terminal. Verde nchis domeniul C-terminal. Verde deschis helix 9. Albastru deschis helix 18

Figura 2. Structura situsului activ Galben helicele 494 506; roz helicele 685 690; liganzii de fier His499, His504, His690, Ile839 i Asn649

Cele dou helice centrale traverseaz situsul activ. Ambele helice includ grmezi interne de helix- care asigur trei liganzi de histidin (His) ai fierului din situsul activ. Dou caviti din domeniul major al lipoxigenazei din boabele de soia (cavitatea I i II) se ntind de la suprafa pn la situsul activ. Forma de plnie a cavitii I poate funciona ca un canal dioxigenat. Cavitatea lung liniar este probabil un substrat buzunar. Enzimele animale, mult mai compacte, conin numai o cavitate n form de cizm (cavitatea II). La soia, lipoxigenaza 3 este o a treia cavitate care se ntinde de situsul cu fier pn la interfaa domeniilor catalitice. 5

Cavitatea III, situsul cu fier i cavitatea II formeaz un pasaj continuu prin moleculele de proteine. Situsul activ cu fier este coordonat de ctre N aparinnd la trei resturi histidinice i un oxigen al grupului carboxil C-terminal. n plus, la enzimele din soia lanul lateral de oxigen cu aspargin este slab asociat cu fierul. La lipoxigenaza iepurelui, acest reziduu Asn este nlocuit cu His care este coordonat de fier via atomul de N . De aceea, numrul de coordinare al fierului este fie 5, fie 6, cu un hidroxil sau un ligand de ap la un fier hexacoordinat. Reaciile care au loc la oxidarea acizilor grai polinesaturai R CH = CH CH2 CH = CH R1 (acid gras nesaturat cis/cis) Lipoxigenaz

O

2

(R CH = CH - CH = CH R1) + OOH (radical cis/cis)

R CH = CH CH = CH - CH R1 OOH Hiperoxid cis/trans Sub aciunea direct sau industrial a lipoxigenazei endogene sau exogene, n produsele alimentare au loc modificri de culoare, arom, textur, precum i de diminuare a valorii nutritive. La esuturile vegetale vii, lipoxigenaza ndeplinete o serie de funciuni specifice. Modificri de culoare Albirea finii de gru prin distrugerea carotenului (aciune benefic). Albirea produselor finoase prin distrugerea carotenului. Participarea la pierderea culorii dorite de verde prin distrugerea clorofilei n produsele vegetale congelate (aciune nedorit). Distrugerea xantofilei i a altor carotenoizi n nutreurile animale (aciune nedorit). Distrugerea coloranilor vegetali adugai n produsele alimentare (aciune nedorit). Distrugerea pigmenilor pielii la unele produse de pete. Modificarea superficial a culorii la mere.

6

Modificri de arom Producerea de substane volatile dorite la fructe i vegetale proaspete (tomate, banane castravei). Producerea de arome nedorite la produsele vegetale congelate. Producerea de substane de arom nedorite la cerealele depozitate (aroma de carton la orz). Producerea de substane de arom nedorite la produsele bogate n proteine (semine de leguminoase). Participarea la rncezirea crnii. Modificri de textur Producerea de efecte favorabile privind proprietile reologice ale finii de gru, aluatului (prin controlul balanei legturilor S S i S H) prin controlul legrii hidrofobice a lipidelor de proteinele glutenice. Modificri nutriionale Distrugerea vitaminei A i a provitaminei A. Distrugerea acizilor grai eseniali polinesaturai. Interaciunea produselor de degradare cu aminoacizi eseniali din proteine, ceea ce face s scad valoarea nutriional a proteinelor i funcionalitatea lor. Funciuni n vivo ale lipoxigenazei Participarea la biosinteza etilenei prin producerea de oxigen activ necesar transformrii metioninei n etilen. Transformarea carotenoidelor n factori care afecteaz dezvoltarea plantei (inhibitori ai dezvoltrii). Transformarea acizilor grai polinesaturai (acidul arahidonic) n hidroxiacizi. Distrugerea anaerob a peroxizilor n cazul esuturilor vtmate.

Lipoxigenaza se gsete n mazre, fasole, ridichi, cartofi i n soia de unde se i extrage. Lipoxigenaza din soia este de dou feluri: una activat de ionul de Ca2+ i alta inhibat de Ca2+. n biologia animal lipoxigenaza intervine n principal n leucocite unde catalizeaz oxidarea acidului arahidonic ntr-o familie de compui denumii leucotriene care au rol important n manifestri alergice. S-a constatat c finurile din gru, suplimentate cu lipoxigenaz purificat, conin un numr mai mic de grupri -SH i un numr mai mare de legturi -S-S-, fa de fina martor. Aceast cretere este atribuit oxidrii gruprilor SH de ctre lipoxigenaz. S-a mai constatat totodat, c pinea obinut a avut un volum mai mare dect martorul i un miez mai alb.

7

Cea mai bogat i studiat surs de lipoxigenaz o constituie boabele de soia, dei s-a artat c exist cca. 38 de surse pentru aceast enzim. n cazul majoritii surselor studiate, enzima a fost identificat sub forma mai multor izoenzime, care difer ntre ele prin pH-ul optim de aciune, capacitatea de albire, specificitate de substrat, produi rezultai etc. Aciunea enzimei asupra reologiei aluatului se refer la creterea capacitii acestuia de a rezista la frmntare excesiv, n spe la creterea stabilitii acestuia. Pe aceast observaie s-a elaborat ulterior ipoteza c mecanismul de aciune al lipoxigenazei are la baz procese de oxidare. S-a constatat c timpul de relaxare a aluatului crete prin adaosul de lipoxigenaz de soia. Efectul apare n prezena lipidelor libere i a oxigenului, lipsind n fina degresat. Ca rezultat, se obine o pine cu volum mai bun i cu o rat de nvechire mai redus. Adiia de peroxizi lipidici n aluat nu determin efecte semnificative asupra reologiei acestuia, iar adaosul de acid nordihidroguaiaretic care este antioxidant, reduce accentuat formarea peroxizilor, dar nu afecteaz efectele reologice ale lipoxigenazei. Ca urmare, s-a concluzionat c nu peroxizii lipidici sunt ageni activi ai mbuntirii proprietilor vscoelastice ale aluatului, ci este implicat un mecanism de oxidare cuplat. Fr a fi elucidat n ntregime, se consider c mecanismul de oxidare a gruprilor sulfhidril din aluat de ctre lipoxigenaz, aparine nu peroxizilor lipidici, ci radicalilor liberi ai acizilor grai polinesaturai. Mecanismul prin care sunt oxidai pigmenii n prezena lipoxigenazei nu este pe deplin cunoscut. S-a artat c activitatea de albire variaz pentru diferite izoenzime i c totodat, lipoxigenaze de origine diferit, au ca substrat preferenial, pigmeni diferii (de exemplu, spre deosebire de lipoxigenaza din soia sau bob, lipoxigenaza grului este o carotenoxidaz slab). Majoritatea mecanismelor propuse pentru explicarea proceselor de albire implic disocierea complexului enzim-radical al acidului gras. Sunt cercettori care susin c radicalul peroxidic este reactiv n activitatea de albire, n timp ce alii susin c n urma disocierii se produce radicalul neoxigenat al acidului gras, care apoi atac pigmenii. n afar de caroten, lipoxigenaza determin distrugerea parial a tocoferolilor, dar nu afecteaz vitaminele B1 i B2, probabil datorit caracterului lor hidrofil. Lipoxigenaza acioneaz n aluat alturi de alte sisteme oxidoreductoare, ntre care sunt posibile interaciuni. Produii lipoxigenazei Dei oxidarea (albirea) carotenoidelor a fost recunoscut de foarte mult timp ca o proprietate a boabelor de soia, conceptul activitii lipoxigenazelor a fost propus abia n 1932, cnd a fost sugerat prezena unei oxidaze lipidice n boabele de soia. Patru ani mai trziu a fost demonstrat c proteinele prezente n seminele de Lupinus albus sunt capabile, de asemenea de oxidarea unei game de lipide. Mai precis, a fost artat prezena unei carotenoxidaze n extractele 8

apoase din boabele de soia, aciunea ei fiind dependent de prezena grsimilor nesaturate sau a acizilor grai. Foarte curnd a fost artat c lipidele nesaturate i-au crescut numrul de peroxid n prezena finii de soia. Multe lipoxigenaze din plante i animale produc muli hidroperoxizi (acizi hidroperoxi eicosantetraenoici sau HpETE) de la acizi grai C18 C20 (n principal acid arahidonic). Aceste reacii enzimatice regio-specifice dintre oxigen i acizi grai polinesaturai dau natere unor compui, numii oxilipide, care au frecvent o configuraie S (5-HpETE, 12-HpETE or 15-HpETE). Acizii grai vegetali C18, acidul linoleic i acidul linolenic, pot fi convertii de enzime ntr-o multitudine de oxilipide. Aceti compui sunt implicai n rspunsurile la stres. Unele oxilipide au proprieti antimicrobiene directe, n timp ce altele pot aciona ca reglatori n sistemul de aprare al plantei. Un element structural esenial al acidului gras C20 pentru inseria enzimatic a oxigenului molecular este 1,4-pentadiena cu un rearanjament al dublei legturi de la forma conjugat a dienei 1,3 care absoarbe puternic n jurul valorii de 236 nm.

Aceste HpETE se formeaz ntr-o mulime de esuturi i pot suferi o mulime de reacii dependent de implicarea HpETE. Aceste reacii conduc la produi hidroxi (HETE) via reducerea prin glutation peroxidaz, leucotriene (LT) via izomerizare i deshidratare, prostaglandine (PG), compui dihidroperoxi (DiHpETE) i lipoxine (Lx) prin izomerizare. HpETE sunt intermediari centrali, dar pot avea, de asemenea, propriile lor activiti biologice. HpETE diferii formai sunt redui la produii hidroxi stereospecifici corespunztori. Ei se pot forma, de asemenea, via citocromul P450.

Mai departe HpETE pot fi transformai n molecule mai puternice, de exemplu 10,11-dihidro-12-ETE. HETE se gsesc n multe tipuri de celule de la nevertebrate pn la om. Ele se formeaz n vasele de snge, epiteliu, neuroni i celulele germinative. S-a descoperit c sunt capabile s fie incorporate n fosfolipidele membranare.

9

Ali produi n formarea crora este implicat lipoxigenaza sunt leucotrienele, considerate hormoni locali care se formeaz atunci cnd este necesar un rspuns celular specific la stimuli hormonali, chimici sau imunologici.

Este cunoscut faptul c o mulime de acizi grai polihidroxilai sunt produi prin reacii mediatizate de lipoxigenaz ale acidului arahidonic. Acesi produi se formeaz n leucocite, eosinofile sau platelete. Sunt implicate n general n contraciile musculare, degranularea celulelor, producerea de superoxid i chemotactism. Sunt determinate i cuantificate datorit absorbie UV puternice a aproximativ 270 nm.

10

Hepoxilinele sunt un grup de substane bioactive produse de o varietate de esuturi (creier, epifiz, pancreas, piele) i sunt cunoscute c modific concentraiile calciului i potasiului intracelular. Dintre aceste substane fac parte acidul jasmonic, acidul tuberonic, acidul cucurbic, etc.

Acidul jasmonic

Acidul tuberonic

Acidul cucurbic

Activitatea lipoxigenazei n seminele plantelor Lipoxigenazele prezint un interes foarte mare pentru industria alimentar i pentru biotehnologiile aplicate n industrie deoarece sunt un mijloc de obinerea a substanelor aromatizante naturale. Lipoxigenazele (EC.1.13.11.12, Linoleat oxidoreductaz) sunt dioxigenaze care conin fier n situsul lor activ i catalizeaz reaciile de oxidare ale acizilor grai polinesaturai, cum ar fi acidul linoleic i acidul linolenic ce posed sistem de cis, cis 1,4 pentadiene i conduc la formarea acizilor nesaturai conjugai hidroperoxidienoic sau trienoic. Lipoxigenazele se gsesc n majoritatea esuturilor vegetale, dar abund mai ales n semine. Acidul linoleic este des utilizat ca i substrat de testare pentru activitatea lipoxigenazei i a produilor primari, care sunt acizii 9- i 13hidroperoxioctadecadienoici izomeri (9-HPODE i 13-HPODE, figura 3). Inseria oxigenului este poziional specific i depinde de sursa lipoxigenazei. Lipoxigenaza din soia, tipul 1, este o lipoxigenaz 13, dar este atipic, prezentnd o activitate maxim la pH 9,0, n timp ce tuberculii de cartof i tomatele conin predominant lipoxigenaz 9, iar fasolea att lipoxigenaz 9 ct i 13. Hidroperoxizii nesaturai sunt mai departe degradai de liazele hidroperoxidice la aldehide volatile. Scindarea 9-hidroperoxizilor duce la formarea a dou fragmente 9-C: un 9-C oxo-acid i o aldehid nesaturat. Scindarea 13hidroperoxizilor duce la formarea unui 12-C oxo-acid i a unei aldehide 6-C (figura 3). Se formeaz, de asemenea, acizi hidroxidienoici.

11

Figura 3. Cile lipoxigenazei n materialul vegetal

Aldehidele produse n fructe i legume au o influen foarte mare asupra aromei lor. De asemenea, pot fi eficiente mpotriva patogenilor i pot fi un factor al rezistenei la boli. Hidroperoxizii pot, de asemenea, oxida lipidele i constituenii acestora, inclusiv carotenii, prin iniierea formrii radicalilor liberi carbon centrai. Producerea biocatalitic a hidroperoxizilor i aldehidelor volatile de ctre lipoxigenaze prin aciunea subsecvent a liazelor hidroperoxidice n extractele brute sau cu enzime recombinate deschide o cale pentru producerea componentelor aromatice naturale. De aceea, lipoxigenazele i liazele hidroperoxidice prezint un interes deosebit pentru industria alimentar i biotehnologiile industriale ca i mijloace de obinere a substanelor aromatice naturale. Metabolizarea acidului arahidonic cu ajutorul lipoxigenazei Una din cile metabolice pe care o poate urma acidul arahidonic, este s sufere aciunea lipoxigenazei i s se transforme n leucotriene (LT). Iniial, sub aciunea acestei enzime, acidul arahidonic se transform ntr-o serie de compui intermediari, dintre care cei mai importani sunt acidul hidroperoxieicosatetraenoic (HPETE) i acidul hidroxieicosatrienoic (HETE). Din aceti compui intermediari se formeaz iniial leucotriena A4 (LTA4). Din LTA4 se poate forma LTB4 i LTC4, iar LTC4 se poate transforma n LTD4. LTB4 este un puternic factor chemotactic pentru leucocite, fiind implicat n inflamaie. LTC4 i LTD4 sunt ceea ce se numea alt dat substana lent reactiv a anafilaxiei (slow reacting substance of anphilaxy, SRSA) i au un foarte intens efect bronhoconstrictor, fiind implicate n patogenia astmului bronic la om. Exist mai multe tipuri de lipoxigenaz, dintre

12

care cea mai studiat este probabil lipoxigenaza 5. Lipoxigenaza 5 nu este activ ca atare, dar poate fi activat de o protein specific numit proteina activatoare a 5 lipoxigenazei (five lipoxigenase activator protein, FLAP). La rndul ei, FLAP activeaz lipoxigenaza 5 numai n condiiile n care crete concentraia intracelular a calciului. Leucotrienele acioneaz tot prin intermediul unor receptori cuplai cu proteinele G i au fost descrise dou tipuri de astfel de receptori, unii specifici pentru LTB4 i alii specifici pentru LTC4 i LTD4, aceste ultime 2 leucotriene acionnd prin intermediul acelorai receptori. Rolul proinflamator al LTB4 explic, cel puin teoretic, intensitatea mai mare a efectului antiinflamator al cortizonilor, comparativ cu cel al antiinflamatoarelor nesteroidiene. Antiinflamatoarele nesteroidiene, inhibnd ciclooxigenaza, scad numai producia de prostaglandine, pe cnd cortizonii, inhibnd fosfolipaza A2, scad producia de acid arahidonic, deci vor diminua att sinteza de prostaglandine, cat i pe cea de leucotriena B4. Pe de alt parte, scderea produciei de LTC4 i LTD4, se poate constitui ntr-unul din mecanismele efectului antiastmatic al cortizonilor. La rndul lor, antiinflamatoarele nesteroidiene, inhibnd COX, pot devia acidul arahidonic ctre sinteza de leucotriene i acest fapt este explicaia actual a patogeniei astmului bronic produs de aceste medicamente ca reacie advers anafilactoid. Medicamentele care blocheaz receptorii pentru LTC4 i LTD4, cum sunt montelukastul i zafirlukastul au efect antiastmatic, efectul lor fiind desigur cu att mai intens cu ct, n producerea astmului bronic respectiv, mecanismul leucotrienic are o importan patogenic mai mare. n mod logic, aceste medicamente vor avea cel mai intens efect n astmul bronic produs de antiinflamatoarele nesteroidiene, iar studiile clinice confirm acest fapt. Tot un efect antiastmatic asemntor se poate obine prin inhibarea FLAP, ca urmare a scderii produciei de leucotriene, ceea ce este posibil spre exemplu cu ajutorul medicamentului zileuton.

13

BIBLIOGRAFIE

1. Catherine L. Allen, Jane E. Lancaster, David S. Robinson Lipoxygenase activity in seeds from New Zeeland native plants, http://pdfserve.informaworld.com/427534__919945511.pdf 2. Carmen Fulga - Influenarea farmacologic a sistemului acidului arahidonic, http://www.emcb.ro/article.php?story=20060613162949946 3. *** - http://www.cyberlipid.org/prost1/pros0002.htm 4. *** - http://metallo.scripps.edu/PROMISE/2SBL.html 5. *** - http://en.wikipedia.org/wiki/Lipoxygenase

14