ADER 2.2.7TEHNICI DE PRODUCERE ŞI MENŢINERE A MATERIALULUI SĂDITOR POMICOL DIN CATEGORIILE BIOLOGICE CANDIDAT, PREBAZĂ ŞI BAZĂ

Director proiect: Dr. ing. Valentina ISAC

INSTITUTUL DE CERCETARE – DEZVOLTAREPENTRU POMICULTURĂPITEŞTI - MĂRĂCINENI

OBIECTIVUL GENERALPerfecţionarea tehnicilor şi metodologiilor de producere, menţinere şi

control sanitar al materialului din categorii biologice superioare învederea creşterii calităţii şi reabilitări sectorului de producere amaterialului săditor pomicol, conform normelor în vigoare.

NECESITATEAObţinerea materialului săditor pomicol liber de virusuri, conservarea si utilizarea

lui în producerea pe scară largă a pomilor certificaţi. Prin programul decertificare sunt garantate statutul sanitar al materialului săditor pomicol cât şiautenticitatea acestuia.

RELEVANŢAProiectul este relevant pentru domeniul ştiinţific şi pentru cel economic al

producerii materialului săditor pomicol, deoarece produsele obţinute prinactivitatea de CD (ramuri altoi şi portaltoi libere de virusuri) sunt promovateşi valorificate direct în sectorul economic prin producerea pe scară largă dematerial săditor pomicol certificat.

2005

Ord. 1295 4 filiere de certificare a materialului de înmulţire

1. PB, B, C – liber de virus (vf)2. PB, B, C – testat de virus (vt)3. CAC

4. PB, B, C – autenticitate – la cererea RO 

2010

Ord. 82

1. PB, B, C – liber de virus (vf)2. PB, B, C – testat de virus (vt)3. CAC

4. PB, B, C – autenticitate – la cererea RO 

3 filiere de certificare a materialului de înmulţire

Reglementările noi, promulgate îndeosebi prin Legea 266/2002 ordinele 382/2002, 1295/2005 şi 82/2010 iau în considerare atât legislaţia UE (Directivele Europene 77/93/CCE, 92/103/CEE si 92/34/CEE) cât şi recomandările OEPP privind starea fitosanitară

Oct. 2012

SELECTIE IDENTIFICARE

FURNIZORPARCELA DE VERIFICARE 

AUTENTICITATE

MATERIAL CANDIDATTESTARE VIROTICA SI ORGANISME 

DAUNATOARE

MENTINERE”IN VITRO”

PARCELA CONTROLAUTENTICITATE

PARCELA CONTROLAUTENTICITATE

PARCELA CONTROLAUTENTICITATE

PREBAZAVIRUS FREE

PREBAZAVIRUS TESTED

BAZAVIRUS FREE

BAZAVIRUS TESTED

CERTIFICATVIRUS FREE

CERTIFICATVIRUS TESTED

MATERIAL DE PLANTARE FRUCTIFER

Certificat Vf.

MATERIAL DE PLANTARE FRUCTIFERCertificat Vt.

C.A.C.

MAT

ERIAL DE INMULTIRE

SCHEMA DE PRODUCERE SI CERTIFICARE (ord. 82/2010)

PARTENERI ŞI BUGET

657.250 627.900 95,5ICDP Piteşti ‐Mărăcineni

Buget iniţial Buget realizat %

124.125 118.226 95,2SCDP Bistriţa

41.125 39.688 96,5SCDP Constanţa

822.500 785.814 95,5TOTAL

OBIECTIVELE SPECIFICE• Crearea condiţiilor pentru menţinerea plantelor din categorii biologice superioare(spaţii insect proof).• Evaluarea şi implementarea unor metodelor rapide de testare (ELISA, PCR) pentrudeterminarea stării de sănătate virală.• Dezvoltarea procedeelor pentru eliminarea virusurilor şi menţinerea materialuluibiologic liber.• Managementul producerii materialului săditor pomicol conform schemelor decertificare din legislaţia actuală, prin folosirea unor elemente biotehnologice înînmulţirea plantelor sănătoase.• Realizarea unor verigi tehnologice privind obţinerea materialului biologic dincategorii biologice superioare.

REZULTATE MĂSURABILE

• Cuantificarea gradului de infectare cu virusuri;• Bază materială formată din 10 spaţii izolate care să

asigure condiţii pentru evitarea reinfectării;• 1-2 protocoale de lucru optimizate pentru testare şi

diagnosticare virală;• 35 - 45 clone selecţionate conforme privind

caracteristicile de autenticitate şi stare fitosanitară şitestate de virusuri;

• Verigi tehnologice privind eliberarea de virusuri la1 - 3 specii pomicole;

• Biotehnologii de înmulţire pentru obţinereamaterialului prebază la 1-2 specii pomicole;

• Plante prebază şi bază din soiurile a 10 - 12 speciipomicole.

Elaborarea metodologiei de lucru - Stabilirea materialului biologic şireabilitarea facilităţilor

Selecţionarea celor mai bune clone din punct de vedere al autenticităţii,calităţilor pomologice şi al productivităţii - 76 soiuri:

• 10 soiuri de măr: Jonathan, Idared, Florina, Goldspur, Golden Delicious, Prima,Generos, Romus, Starkrimson, Mutsu şi portaltoii M 106 şi M9;

• 9 soiuri de păr: Williams, Cure, Tudor, Monica, Argessis, Carpica, Williams roşu,Euras, Conference şi portaltoiul Gutui A;

• 9 soiuri de prun: Agent, Ialomiţa, Gras ameliorat, Centenar, Silvia, Minerva, Diana,Andreea, Delia şi portaltoiul Mirobolan BN 4Kr;

• 6 soiuri de cireş: Ponoare, Daria, Tentant, Superb, Stella, Germrsdorf şi portaltoiulIPC 5.

• 6 soiuri de vişin: Mocăneşti 16, Ţarina, Rival, Stelar, Ilva, Schattenmorelle;• 7 soiuri de cais: Tudor, Goldrich, Traian, Sulmona, Sirena, Harcot, NJA 42;• 8 soiuri de piersic: Catherine sel. 1, Cora, Creola, Liana, Delta, Florin, Cardinal,

Redhaven;• 6 soiuri de căpşun: Premial, Real, Red Gauntlet, Coral, Magic, Benton;• 3 soiuri de zmeur: Cayuga, Opal, Ruvi;• 4 soiuri de mur: Darrow, Thornfree, Dar 8, Dar 24;• 6 soiuri de coacăz: Abanos, Deea, Tsema; Jonkheer van Teets, Red Lake,

Houghton Castle;• 2 soiuri de agriş: Virens, Verda;Studiu documentar referitor la sursele de material vegetal şi caracterizarea

genotipurilor luate în studiu (22 pagini).

Crearea condiţiilor impuse de reglementările în vigoare pentru menţinereaplantelor CANDIDAT şi PREBAZĂ (spaţii insect proof)

ICDP PITEŞTI(toate speciile)

•Izolator de 180 mp, cu plante crescute în containere şi cu fertirigare programată

SCDP BISTRIŢA(specia prun)

•Izolator de 52 mp, cu plante crescute în containere.•Izolator (300 mp), cu plante crescute în ghivece mari de 50 l, câte 6 ghivece pentru fiecare soi şi portaltoi de prun.

Reabilitarea a 10 izolatoare (2.200 mp), pentru menţinerea plantelor Iniţiale şi Prebază în

conformitate cu normele în vigoare şi asigurarea condiţiilor necesare evitării reinfectării cu virusuri.

TESTAREA VIROTICĂ A MATERIALULUI SELECTAT,  RETESTAREA MATERIALULUI PREBAZĂ ŞI BAZĂ

Indexarea prin metode biologice, teste serologice şi moleculare (ELISA, PCR)pentru 68 boli virale, a arătat că:

• Plantele candidat selecţionate sunt sănătoase (-) şi pot fi utilizate pentru obţinereamaterialului PREBAZĂ şi ulterior BAZĂ.

• Rezultatele testelor ELISA au arătat că soiurile de cireş Ponoare, Daria şi Superbsunt infectate cu virusuri (ArMV, CLRV, PNRSV) iar soiul de vişin Mocăneşti cu PPV.

• Retestarea DAS–ELISA la PREBAZA de prun – Bistriţa, efectuată pentru PPV, PDV,PNRSV, ACLSV, ApMV şi MLRSV a fost negativă.

• De asemenea, rezultatele IC-RT-PCR au confirmat absenţa PPV.

Testare căpşun pe F. vesca UC – 04 Altoire de foliolă R. o.”Munger” - zmeur Altoire cu ramură detaşată - zmeur

Protocoale de lucru optimizate pentru testare şi diagnosticare 

DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL VIRUSULUIPLUM POX

IC-RT-PCR foloseste kitul Qiagen One Step RT-PCRşi perechea de amorse polivalente P1/P2 careamplifică un fragment de 243 bp corespunzătorregiunii C-terminus a proteinei capsidale (Wetzelşi colab., 1991). Pentru imunocaptură seutilizeaza antiser produs de BIOREBA.

Ciclul termic utilizat pentru RT-PCR cuprinde:Reverstranscriere - 30 min la 50°C,denaturare/inactivarea reverstranscriptazei timpde 2 min la 94 °C urmată de 35 de cicluri:denaturare ADNc - 30 s la 94 °C, hibridarea cuamorsele - 45 s la 61 °C, elongaţia ADNc - 60 sla 72 °C.

După ultimul ciclu urmeaza elongaţia finală la 72 °Cpe durata a 10 min.

Produşii de amplificare se separa prin electroforeză,în gel de agaroză (Sigma) 1,5%.

Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat înlumină UV, imaginea gelurilor fiind achiziţionatăcu o cameră video DocPrint.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL FITOPLASMEIEUROPEAN STONE FRUIT YELLOW (ESFY)

Nested-PCR, se realizează în două etape deamplificare

Pentru amplificare se utilizeaza ADN-ul total dinfloem şi nervurile frunzelor de prun, extras cuajutorul kit-ului de extracţie Dneasy Plant MiniKit (Qiagen).

Pentru prima amplificare se recomanda primeriiP1/P7 (Schneider si colab., 1995), iar pentrucea de-a doua amplificare setul de primeriR16(X)F1/R16(X)R1 (Lee si colab., 1995).

Ciclul termic utilizat pentru Nested-PCR în ambeleetape de amplificare este următorul:denaturare - 5 min la 94°C, urmată de 35 decicluri: denaturare ADNc - 20 s la 92°C,hibridarea cu amorsele - 20 s la 55 °C,elongaţia ADNc - 40 s la 72 °C.

După ultimul ciclu urmeaza elongaţia finală la 72 °Cpe durata a 10 min.

Migrarea si vizualizarea produşilor PCR se faceidentic cu procedura pentru IC-RT-PCR

Au fost experimentate şi pot fi implementate protocoale ELISA - kit + protocol Bioreba şi kit + protocol Sediag pentru detectarea a 17 virusuri şi phytoplasme.Tehnicile moleculare de diagnostic au un potenţial foarte ridicat de detecţie virală şi sunt utile în procedura de certificare a materialului săditor.

Înmulţirea materialului selecţionat - devirozare• A fost înmulţit fondul biologic plante Candidat (iniţiale) la speciile pomicole

lemnoase şi la căpşun şi arbuştii fructiferi.• În urma lucrărilor de altoire efectuate la ICDP au fost înmulţite 13 soiuri la specia

măr (78 plante), câte 10 soiuri păr şi prun (50 de plante din fiecare specie), 3 soiurila cireş (15 plante), iar la vişin s-au obţinut 25 de plante din 5 soiuri.

• La prun, Bistriţa a înmulţit prin altoire în vederea obţinerii plantelor Candidat 7 soiuri(64 plante) testate serologic şi molecular şi stabilite ca „Virus free”.

• Aplicarea înmulţirii prin butaşi a permis realizat nucleul de plante Candidat la 3soiuri de coacăz negru şi 3 soiuri de coacăz roşu totalizând un număr de 32 plante lacontainer menţinute în prezent în spaţii izolate.

• Pentru realizarea nucleelor de Plante iniţiale şi Prebază (material in vitro) au fostfolosite şi elemente biotehnologice:

- Au fost optimizate protocoale de lucru şi randamentele în fiecare fază aculturii in vitro.

- au fost create nucleele de plante iniţiale in vitro la 5 soiuri de căpşun, 4soiuri de zmeur, 3 soiuri de mur şi a portaltoilor M9 şi M106 (măr), Gutui A (păr), IPC5 (cireş, vişin), Mirobolan BN 4Kr (prun). Plantele obţinute sunt folosite laproducerea prin micropropagare a nucleelor de plante Prebază în funcţie denecesităţile activităţii de producere a materialului săditor pomicol.

În procesul de devirozare au fost introduse un numar de 3 soiuri de cireş şi un soi devişin. Metoda aplicată a fost prin culturi de meristeme. A fost stabilit mediul decultura LF cu 0,3 mg/l GA3 si 0,01 mg/l IBA cât şi protocolul de lucru pentruspeciile respective.

Plante căpşun ‐ arbuşti fructiferi certificate la categoria Prebază

Specia/soiul Plantat la aclimatizare Număr plante certificate

Lot nr.

Premial 5400 2500 3AG6091 – 3AG01

Real 1100 500 3AG6101 – 3AG01

Magic 3000 1500 3AG6111 – 3AG01

Redgauntlet 1700 800 3AG6121 – 3AG01

Benton 1250 500 3AG6131 – 3AG01

Darrow 1500 250 3AG6471 – 3AG01

Thornfree 750 250 3AG 6481– 3AG01

Opal 1560 360 3AG3411 – 3AG01

Ruvi 440 40 3AG3421– 3AG01

Star 200 18 3AG3431– 3AG01

Gustar 500 10 3AG3491– 3AG01

Cayuga 960 165 3AG7361– 3AG01

Vely 500 100 3AG3551 – 3AG01

Testarea/retestarea şi menţinerea materialului Prebază şi Bază existent

P1 - În urma inspecţiei efectuate la SCDP Bistriţa, ITCSMS Cluj a eliberat documentele oficiale decertificare la categoria PREBAZA a şase soiuri de prun: Agent, Gras ameliorat, Centenar,Minerva, Andreea şi Delia. Rezultatele analizelor au reconfirmat statusul „virus-free” al plantelorBAZA menţinute în biodepozitarele de la SCDP Bistriţa.

P2 - A fost constituit nucleul de material Prebază format din 24 soiuri de piersic şi 23 soiuri la cais.Toate soiurile retestate au prezentat test negativ fără soiul Cardinal infectat cu PPV.

CP - A fost constituit un nucleu de plante Prebază pentruramuri altoi la speciile lemnoase pentru care a fost depusădocumentaţia la ITCSMS Argeş în vederea certificării.

• Retestarea virală a Prebazelor a identificat numai la prun,infecţie cu PPV: 3 plante din soiul Gras ameliorat şi 2 plantedin soiul Ialomiţa diagnostic confirmat atât prin metoda DAS-ELISA cât şi prin AGRISTRIP.

• Materialul sănătos rămas în biodepozitarul ICDP Piteşti-Mărăcineni constituie materialul din care se vor înmulţiplantele BAZĂ, necesare înfiinţării plantaţiilor mamă ramurialtoi, de butaşi şi a marcotierelor.

• Rezultatele retestărilor efectuate la soiurile de căpşun şiarbuştii fructiferi au arătat că plantele testate sunt sănătoase,starea lor sanitara fiind liber de virusuri.

Plante PREBAZĂ la container ICDP Piteşti

Specia Soiuri Nr. plante Specia Portaltoi Nr. planteMăr 10 42 Măr M 106 250Păr 9 24 M 9 2Prun 9 12 Păr, gutui BN 70 2Cireș 6 22 Gutui A 2Vișin 6 12 Prun  Mirobolan dwarf 3Cais 4 5 Mirobolan C5 2Piersic 2 6 Mirobolan BN 4Kr 2Nectarin 1 1 Cireș, vișin IPC 2 2Zmeur 6 365 IPC3 2Mur 4 550 IPC4 2Coacăz negru 3 3 IPC5 2Coacăz roșu 3 3 IPC 7 2Agriș 2 2 Piersic Adaptabil 2Afin 2 2 Cais Apricor 2Cătină 2 2Căpșun 5 10.000

PREBAZA  – ICDP ‐ 2013

Materialul biologic certificat la categoria Prebază în 2013  SCDP Bistriţa – prun

Soi/portaltoi Cant.

Lot nr. Etichete oficiale atribuite

Nr. total/serie/de la...pana la

Agent/Mirobolan29C 3 3BN0671-3BN01 3/BN/799840-799842Gras

ameliorat/Mirobolan29C

3 3BN0672-3BN01 3/BN/799843-799845

Centenar/Mirobolan29C 3 3BN0673-3BN01 3/BN/799846-799848Minerva/Mirobolan29C 3 3BN0674-3BN01 3/BN/799849-799851Andreea/Mirobolan29C 3 3BN0675-3BN01 3/BN/799852-799854Delia/Mirobolan29C 3 3BN0676-3BN01 3/BN/799855-799857Total 18

Aspecte din faza de fortificare la ghiveci a prebazelor de zmeur (A), căpşun(B), mur (C), portaltoi (D)

A B

C D

Diseminare - participare la 8 simpozioane şi sesiuni ştiinţifice, o conferinţănaţională şi o conferinţă internaţională. Au fost publicate 14 lucrări ştiinţifice atât înreviste cu caracter ştiinţific dar şi tehnic, utile instituţiilor de cercetare, universităţide profil horticol, pepiniere de producţie.

Sprijin financiarPERMANENT

Sprijin financiarPARTIAL

PREBAZA BAZA CERTIFICAT

‐ investiţii‐ întreţinere‐ testari virotice

‐ Investiţiespecifica

2013 2018 material de plantare fructiferPr. sectorial

Pentru creşterea competitivităţii sectorului de producere a materialului săditor din România, dar şi pentru acreşterea vizibilitatea şi credibilitatea ţării noastre pe plan internaţional în acest domeniu de interes pentruagricultură este necesară continuarea activităţii proiectului prezentat.