indrumǍtor de laborator · pdf filelaborator 5-6. lipide ... laborator 13.pigmenŢi .....69...
TRANSCRIPT
PURCǍREA CORNELIA
INDRUMǍTOR DE LABORATOR
BIOCHIMIE
pentru studenţii de la specializările:
CONTROLUL SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE
TEHNOLOGIA PRELUCRARII PRODUSELOR AGRICOLE
EDITURA UNIVERSITǍŢII ORADEA
2015
Referenti stiintifici:
Conf. univ. Dr. Vicaş Simona
Conf. univ. Dr. Alina Caraban
Tehnoredactare: Cornelia Purcărea
EDITURA UNIVERSITATII ORADEA ISBN:978-606-10-1467-5 CD
1
CUPRINS
LABORATOR 1. Măsuri de protecţia muncii în laboratoarele de biochimie .......................... 4
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse alimentare ........................... 6
Soluţii de reactivi ...................................................................................................................... 7
LABORATOR 2. METODE DE ANALIZǍ FOLOSITE ÎN BIOCHIMIE ........................... 12
LABORATOR 3 - 4.GLUCIDE............................................................................................... 22
Extragerea glucidelor din produsele alimentare ...................................................................... 23
3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul ............................................ 24
3.2.Determinări cantitative ale glucidelor ............................................................................... 27
3.2.1.Determinarea glucidelor reducătoare cu ajutorul reacţiei Fehling .............................. 27
3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool ............................................................. 29
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu .............................. 32
LABORATOR 5-6. LIPIDE .................................................................................................... 35
5.1.Determinarea principalilor indici la grăsimi ..................................................................... 35
5.1.1. Determinarea punctului de topire ............................................................................... 35
5.1.2. Determinarea indicelui de iod ..................................................................................... 37
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare ....................................................................... 38
5.1.4. Determinarea indicelui de aciditate ............................................................................ 39
5.1.5. Indice de peroxid ........................................................................................................ 39
5.1.6. Reacţia Kreis ............................................................................................................... 41
6.1. Determinarea grăsimii –metoda Soxhlet –principiul metodei .......................................... 42
6.2. Determinarea grăsimii din produsele lactate – metoda Gerber – principiul metodei ....... 43
LABORATOR 7-8-9. DETERMINAREA PROTEINELOR DIN PRODUSELE
ALIMENTARE ........................................................................................................................ 45
7.1. Obţinerea extractelor proteice .......................................................................................... 46
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire ........................................ 46
8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen .......................... 49
8.2. Determinarea conţinutului de cazeinӑ din lapte ............................................................... 51
9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului ................................................................... 52
9.2.Determinarea proteinelor – metoda Kjeldhal –principiul metodei .................................... 54
LABORATOR 10. ENZIME ................................................................................................... 55
10.1. Evidenţierea unor enzime ............................................................................................... 56
10.1.1.Evidenţierea peroxidazei din hrean ........................................................................... 56
2
10.1.2. Evidenţierea activităţii peroxidazei din lapte ........................................................... 56
10.2. Influenţa factorilor fizico-chimici asupra activităţii enzimelor ...................................... 57
10.2.1.Influenţa temperaturii asupra activităţii enzimelor................................................... 57
10.2.2. Influenţa pH-ului asupra activităţii enzimatice. ....................................................... 58
LABORATOR 11-12. VITAMINE ......................................................................................... 60
11.1. Metode de identificare ale vitaminelor ........................................................................... 60
11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale ........................................................................... 64
11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans ......................................................... 66
LABORATOR 13.PIGMENŢI ................................................................................................ 69
13.1.Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subţire ............................... 69
13.2. Determinarea spectrofotometricӑ a conţinutului de clorofilӑ ......................................... 71
LABORATOR 14. EVALUARE LABORATOR. .................................................................. 73
BIBLIOGRAFIE ...................................................................................................................... 74
3
Prefaţӑ
Alimentele sunt produse naturale, cu o compoziţie complexă, de origine vegetală sau
animală. Ele constituie suportul material al vieţii, al sănătăţii omului, asigurând energia şi
substanţele de bază necesare desfăşurării proceselor metabolice.
Substanţele componente ale alimentelor se numesc nutrienţi. Nutrienţii sunt compuşi
organici sau anorganici, care pot avea rol structural, energetic şi funcţional ca de exemplu :
glucide, lipide, protide, enzime, vitamine, elemente minerale şi produşi secundari de
metabolism.
Prezenta lucrare este astfel realizată, încât să poată fi utilizată cu succes de studenţii
de la secţiile Tehnologia Prelucrării Produselor Alimentare, Controlul şi Expertiza Produselor
Alimentare dar şi de cei de la Facultăţile de Agricultură, Zootehnie şi Biotehnologii, care
studiază biochimia.
Indrumӑtorul începe cu protecţia muncii, continuӑ cu o prezentare generală a
laboratorului de biochimie, a soluţiilor de reactivi folosiţi şi a metodelor de analiză utilizate în
mod curent în biochimia analitică calitativă şi cantitativă.
Următoarele lucrӑri cuprind numeroase experienţe privind identificarea şi dozarea
constituenţilor principali ai materiei vii (glucide, lipide, protide), a substanţelor cu rol
funcţional (enzime, vitamine), a produselor de origine secundară (pigmenţi).
La sfârşitul fiecărui capitol, am întocmit câte un test de verificare, care vine în
sprijinul studenţilor, pentru a adânci cunoştinţele dobândite la orele de laborator şi pe cele
predate la orele de curs.
4
LABORATOR 1. Măsuri de protecţia muncii în laboratoarele de biochimie
Laboratoarele de biochimie alimenterӑ sunt destinate activităţilor didactice, ştiinţifice
respectiv aplicative (agricole, alimentare. etc). In astfel de laboratoare se poate executa o
mare diversitate de lucrări necesitând substanţe, sticlărie, ustensile, aparatură şi instalaţii
adaptate scopurilor propuse.
Accidentele de orice natură pot fi evitate dacă se respectă cu stricteţe condiţiile de
lucru prescrise la executarea diferitelor lucrări. In acest scop exista prescripţii generale, cu
caracter normativ, referitoare la protecţia şi securitatea muncii (P.S.M.) care trebuie să fie
bine cunoscute de către pesoanele care desfăşoară activităţi în laboratoare de profil. Intregul
personal şi studenţii care lucrează în laborator trebuie să cunoască şi să respecte regulile de
protecţia muncii şi asigurarea securităţii pentru prevenirea accidentelor de muncă.
Intregul personal şi studenţii care lucrează în laborator trebuie să cunoască şi să respecte
regulile de protecţia muncii şi asigurarea securităţii pentru prevenirea accidentelor de muncă.
1. Personalul din laborator este obligat să poarte halat.
2. Pentru a evita inhalarea diferitelor substanţe din praful care se ridicӑ odatӑ cu mӑturarea
poelelor, acestea nu se mătură, ci se spală cu apă sodată, detergenţi sau soluţii antiseptice.
3. Aparatele electrice trebuie să aibe prizele împământate şi izolarea electrică să fie perfectă.
4. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor.
5. Incăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, unde se lucrează cu solvenţi
organici trebuie să fie prevazută cu nişă, exhaustor şi ventilaţie electrică.
6. Solvenţii şi acizii se depozitează în subsolul clădirii, unde trebuie să existe căi de acces cât
mai largi.
7. In chiuvete nu se vor arunca precipitate sau reactivi tari care atacă conducta, dacă totuşi se
întâmplă, se lasă să curgă o cantitate mare de apă pentru a evita deteriorarea chiuvetei.
8. La destuparea sticlelor trebuie să se acorde o atenţie deosebită manipulării dopurilor.
Acestea se aşază cu partea plată pe masă şi partea cilindrică în sus.
5
9. Pentru a evita impurificarea reactivilor surplusul de reactivi ce rămâne în vase nu se toarnă
din nou în sticlă.
10. Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă
electrice, sub nişe cu tiraj convenabil.
11. Sticlele cu reactivi se etichetează clar şi durabil, iar turnarea reactivilor din sticle nu se
face în dreptul etichetelor, pentru a evita distrugerea lor.
12. După terminarea lucrărilor se verifică dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize şi
dacă robinetele au fost închise.
13. In laborator se păstrează curăţenie perfectă. Pe masa de lucru se vor afla numai vasele şi
reactivii cu care se lucrează.
14. Este interzisă gustarea soluţiilor şi substanţelor de laborator.
15. Mirosirea substanţelor gazoase se face cu prudenţă printr-o mişcare de vânturare deasupra
vasului spre nas.
16. Eprubetele în care se fac experienţele nu trebuie îndreptate nici spre cel care face
experimentul, nici spre vecin.
17. Substanţele volatile, foarte inflamabile se vor feri de căldura mare şi de lumina solară. Cu
ele se lucrează numai în camere bine aerisite şi la o depărtare de 5 metri de orice sursă de
flacără.
18. Subsţantele sensibile la lumină sunt păstrate în sticle colorate.
19. Măsurarea soluţiilor toxice nu se face prin pipetare, ci numai cu ajutorul biuretelor sau
pipetelor automate.
20. Substanţele periculoase ca: fosforul, metalele alcaline, benzina, sulfura de carbon,
carbidul, acetona, iodul, etc. nu se aruncă în chiuvetă, ci se adună în borcane sau se
transformă în substanţe inofensive. Fosforul alb se păstrează sub apă, iar metalele alcaline sub
petrol.
21. La diluarea acizilor se va turna acidul în apă şi nu invers, lăsând să se prelingă foarte încet
acidul pe pereţii vasului.
22. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid se depozitează în afara laboratoarelor.
23. Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului şi
prevăzute cu ventilaţie.
24. Substanţele toxice se ţin sub cheie.
25. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu trusă de prim ajutor.
6
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse
alimentare
Analiza biochimică trebuie efectuată imediat ce mostrele recoltate sunt aduse la laborator
pentru că acestea se depreciază foarte repede fie datorită activităţii microorganismelor ce se
găsesc în sau pe produse, fie activităţii enzimelor tisulare, ambii factori fiind favorizaţi de
temperatura camerei, de prezenţa oxigenului din aer şi de lumină.
Laboratorul trebuie astfel dimensionat încât să se poată efectua cu promptitudine analizele
solicitate pentru a putea stabili operativ starea produsului.
Orice laborator de control biochimic al alimentelor trebuie să se compună din următoarele
încăperi:
1. Sala de primire a probelor;
2. Sala de pregatire a materialului.
3. Laboratorul de lucru propriu-zis prevăzut cu mese faianţate sau acoperite cu
materiale termorezistente şi rezistente la acizi şi baze, chiuvete, etajere metalice
pentru reactivi uzuali, becuri de gaz şi prize;
4. Camera frigiderelor pentru pӑstrarea probelor si contraprobelor
5. Camera de balanţe si aparatura performanta- amplasatӑ în acea parte a clădirii în
care trepidaţiile sunt minime.Balanţa trebuie sӑ fie instalatӑ pe o consolӑ fixatӑ în
perete sau mese fixe;
6. Depozit de reactivi, cu minimul de reactivi pe timp de un an. Aici e interzisă instalarea
de prize, surse de apă si gaz. Reactivii toxici vor fi amplasaţi într-un dulap metalic cu
cheie, iar cheile vor fi pӑsrate de cӑtre şeful de laborator;
7.Sala pentru spӑlarea sticlӑriei.
7
Soluţii de reactivi
Concentraţia este o caracteristică esenţială a unei soluţii şi reprezintă raportul dintre
cantitatea de substanţă dizolvată şi cantitatea dizolvantului utilizat.
Există mai multe moduri de exprimare a concentraţiei unei soluţii.
a. Concentraţia procentuală: reprezintă cantitatea de substanţă dizolvată în 100g soluţie,în
acest caz exprimarea fiind "g/g".
Dacă soluţia se prepară prin cântărirea solvatului şi aducerea acestuia la
volum constant cu solventul, este exprimare "g/V".
Dacă soluţia se prepară volumetric, ambele componente ale soluţiei fiind
lichide, avem exprimare "V/V".
b. Concentraţia molală se referă la numărul de moli de substanţă dizolvată în 1000ml
solvent.
c. Concentraţia molară reprezintă numărul de moli de substanţă dizolvată în 1000ml
soluţie.
d. Concentraţia normală se referă la numărul de echivalenţi (vali) în 1000ml soluţie.
Normalitatea unei soluţii se notează fie cu "n", fie cu "N". Soluţia
care conţine un val substanţă în 1000ml soluţie, se numeste soluţie 1N.
Echivalentul gram (val) reprezintă cantitatea dintr-o substanţă în grame, egală cu
echivalentul său chimic. Echivalentul se calculează diferit pentru acizi, baze şi săruri,
conform următoarelor relaţii:
Pentru acizi
Se calculează împărţind masa moleculară a acidului la numărul atomilor de hidrogen ai
acidului.
Exemplu:
Pentru baze
Se calculează împărţind masa moleculară a bazei la numărul de grupări hidroxilice
8
Exemplu
Pentru sare
Se calculează împărţind masa moleculară a sării la numărul atomilor de metal înlocuiţi de
hidrogen :
Exemplu
EMgCO3=84,3/2=42,15g
Utilizarea soluţiilor normale în volumetrie prezintă avantajul că soluţiile de aceeaşi
normalitate reacţionează între ele în volume egale, deoarece conţin dizolvate substanţe în
cantităţi echivalente.
Titrul (T) unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame, care se
găseşte dizolvată într-un ml de soluţie. Soluţia al cărei titru se cunoaşte se numeşte soluţie
titrată.
De exemplu, dacă în 1000ml soluţie se găsesc 40,0005g NaOH, într-un ml de soluţie se
află T g NaOH, adică :
T=40,0005/1000=0,040005g NaOH
Pentru obţinerea unei soluţii cu un anumit titru se procedează după următoarele metode:
a). fie prin cântărirea unei anumite cantităţi de substanţă etalon sau titrimetrică.
Substanţele etalon sunt acele substanţe din care prin simplă cântărire şi dizolvare în balon
cotat, la volum cunoscut, se pot obţine soluţii cu concentraţia cunoscută.
b). fie prin titrare cu ajutorul unei substanţe etalon. Se cântăreşte o anumită cantitate din
substanţa etalon (0,15-0,20g), se dizolvă în apă şi se titrează cu soluţia al cărei titru dorim să
îl determinăm.
Pentru stabilirea titrului sunt necesare cel puţin două titrări în scopul verificării
concordanţei dintre rezultate.
Factorul soluţiei (F) este un factor de corecţie al concentraţiei unei soluţii, este numărul
care arată corespondenţa dintre un ml soluţie aproximativ normală şi o soluţie exact normală.
9
De exemplu, pentru o soluţie exact 0,1N de NaOH titrul teoretic este de 0.004. Pentru o
soluţie aproximativ 0,1 N să presupunem că titrul real este 0.004328. Factorul acestei soluţii
va fi:
F= == 0,004328/ 0,004 =1,0820
Aceasta înseamnă că la 1ml din soluţia noastră corespund 1.082ml din soluţia exact 0.1N.
In general, dacă se titrează o soluţie a substanţei A cu greutate moleculară MA, cu
reactivul B având normalitatea n şi factorul F, folosind V ml din reactivul B, cantitatea de
substanţă A din proba analizată va fi:
TEST
1. Laboratoarele de chimie trebuie să fie dotate obligatoriu cu:
a.Nisă
b.Ventilatie
c.Extinctor
d.Aer conditionat
e. Trusă de prim ajutor
2. Solventii organici se evaporă pe:
a. flacără
b. plită electric
c. baie de apă
d. baie de nisip
3. Cu solventii organici se lucrează la o distantă de minim…. de orice sursă de
flacără
a. 1m
b. 3m
c. 5m
d. 10m
10
4. Balanta analitică se instalează in:
a. camera de primire probe
b. camera frigorifică
c. laboratorul propriu-zis
d. cameră specială in care trepidatiile sunt minime
5. Solutiile de reactivi se prepară in:
a. cilindru gradat
b. pahar Berzelius cotat
c. balon cotat
6. Concentratia normală reprezintă:
a. număr de moli de substantă in 1000 ml solutie
b. cantitatea de substantă dizolvată in 100 g de solutie
c. număr de echivalenti dizolvati in 1000 ml de solutie
7. Cât hidroxid de sodiu trebuie cântărit pentru a obtine 250 ml solutie 10% NaOH?
a.5 g
b. 30g
c. 25g
d. 60g
8. Pentru a prepara 500 ml solutie NaOH 0,3N avem nevoie de:
a. 120 gNaOH
b. 6 g NaOH
c. 40g NaOH
d. 12 g NaOH
9. Pentru a prepara 300 ml NaCl 2M trebuie să cântărim:
a. 58,5g NaCl
b. 117 g NaCl
c. 11,7 g NaCl
d. 35,1 g NaCl
10. Câti ml de HCl sunt necesari pentru a prepara 250 ml HCl de concentratie 1M,
folosind HCl 36% cu densitatea 1,183g/cm3?
a. 18,56 ml
b. 21,43 ml
c. 56,71 ml
d. 33,11 ml
11
12
LABORATOR 2. Metode de analizǎ folosite în biochimie
După caracteristicile lor, metodele de analiză pot fi:
calitative, atunci când se execută numai identificări de substanţă sau se evidenţiază
însuşiri fizico-chimice ale acestora şi
cantitative, atunci când se execută determinări evaluate prin măsurare şi exprimate în
unităţi de masură.
Metodele cantitative se împart în trei mari grupe: metode gravimetrice, volumetrice si
fizico-chimice.
2.1. Metodele gravimetrice al căror principiu se bazează pe cântăriri analitice.
2.2. Metodele volumetrice se bazează pe măsurări de volume, de exemplu reacţiile de
titrare.
2.3. Metodele fizico-chimice la care determinările se bazează pe evidenţierea unor
însusiri fizico-chimice specifice substanţei care se analizează, care permit evaluarea
cantitativă. Aceste metode se împart în:
2.3.1. Metode optice:
- Colorimetrice
- Fotometrice
- Spectrofotometrice
- Flamfotometrice
- Refractometrice
- Polarografice
2.3.2. Metode de separare – metode cromtografice
2.3.3. Metode electrochimice
- Electroforetice
13
- Potenţiometrice
- Conductometrice
2.3.1. Metode optice
a. Metodele colorimetrice reprezintă metodele de analiză care se bazează pe compararea
vizuală a intensităţii coloraţiei soluţiilor de concentraţii diferite cu cea a unei soluţii standard.
Aceste analize prezintă avantajul că necesită cantităţi mici de substanţă şi un timp relativ
redus în comparaţie cu analizele chimice.
b. Metoda fotocolorimetrică se bazează pe fenomenul efectului fotoelectric (fotoefect),
adică fenomenul de desprindere a electronilor din atomii substanţei sub influenţa fluxului
luminos.
Celulele fotoelectrice transformă energia luminoasă în energie electrică. Fotocurentul care
ia naştere este proporţional cu intensitatea I a radiaţiei şi se măsoară cu un galvanometru de
sensibilitate mare.
Inlocuirea ochiului observatorului cu celule fotoelectrice elimină erorile subiective.
c.Metoda spectrofotometrică se bazează pe determinarea coeficientului de extinţie a
soluţiei la diferite lungimi de undă.
Fig. Spectrofotometru
Pe baza raportului dintre lungimea de undă şi capacitatea de percepere a ochiului omenesc
radiaţiile luminoase se împart în trei categorii:
radiaţii vizibile, a căror lungime de undă se situează în domeniul 400-760nm;
radiaţii ultraviolete, cu lungimea de undă mai mică de 400nm;
radiaţii infraroşii, cu lungimea de undă mai mare de 760nm.
Lungimile de undă corespunzătoare spectrului vizibil sunt redate în următorul tabel.
14
Culoarea Domeniul lungimilor de undă
Violet 400-450 nm
Albastru 450-500 nm
Verde 500-570 nm
Galben 570-590 nm
Portocaliu 590-620 nm
Roşu 620-760 nm
d.Metoda flamfotometrică (fotometria cu flacără) este una din metodele de analiză
cantitativă de interes deosebit pentru laboratoarele de biochimie. Este o metodă de analiză
rapidă, precisă şi necesită o aparatură relativ simplă. Are o aplicabilitate practică limitată
îndeosebi la metalele alcaline şi alcalino-pământoase.
Fig. Flamfotometru principiu de functionare si aparat
http://www.multilab.ro/spectrometre/flamfotometru_fotometru_flacara.html
Fotometria cu flacără se bazează pe înregistrarea spectrelor de emisie ale diferitelor
elementelor excitate în flacără cu ajutorul unei celule fotoelectrice. Fiecare element are o
radiaţie specifică numită bandă spectrală de emisie. Majoritatea atomilor posedă o bandă de
emisie principală şi mai multe benzi secundare. Benzile individuale ale diferitelor elemente se
pot suprapune cum este cazul sodiului şi calciului, la aproximativ 590nm.
15
e.Refractometria se bazează pe fenomenele de refracţie sau de reflecţie totală a unui fascicol
de radiaţii luminoase la limita de separaţie dintre două medii cu indici de refracţie diferiţi.
f.Polarimetria constituie o metodă analitică cu ajutorul căreia se masoară deviaţia luminii
polarizate produse de substanţele optic active şi pe această bază se determină concentraţia lor.
Lumina polarizată se obţine trecând lumina naturală prin prisme speciale, numite nicoli, care
au proprietăţi birefringente.
Caracteristica substanţelor optic active o constituie disimetria moleculară datorată
carbonului asimetric. Rotaţia luminii polarizate se poate face spre dreapta, caz în care unghiul
de rotaţie se notează cu (+), sau spre stânga (-).
Polarimetre
Pentru o anumită lungime de undă, unghiul de rotaţie specifică a unei substanţe aflate sub
formă de soluţie, este proporţional cu grosimea stratului traversat şi cu concentraţia ei.
Constanta de proporţionalitate specifică fiecărei substanţe se numeşte ―unghi de rotaţie
specifică‖ şi se notează cu (α)D20
, unde 20 reprezintă temperatura la care se face citirea, iar D,
linia sodiului (ca sursă de lumină, aparatele sunt echipate cu lămpi de sodiu).
In practica, polarimetria se foloseşte pentru determinarea concentraţiei unor glucide cu
ajutorul aparatelor numite polarimetre.
Fiecare substanţă optic activă are un unghi specific de rotaţie, în condiţii determinate de
lucru. In tabelul următor sunt trecute valorile unghiului de rotaţie specifică a unor glucide de
importanţă biologică.
Substanţa (α)D20
Substanţa (α)D20
Glucoză +52.74
Fructoză -93.78
Galactoză +80.70
Maltoză +136.90
Zaharoză +66.50
Lactoză +55.30
Manoză +14.50
Arabinoză +105.0
Xiloză +19.00
Celobioză +35.00
16
2.3.2. Metode de separare - Metode cromatografice
Permit separarea substanţelor dintr-un amestec pe baza capacităţii de distribuţie între o fază
staţionară şi una mobilă având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a componentelor
purtate de faza mobilă de-a lungul fazei staţionare.
Metodele cromatografice se pot clasifica după starea de agregare a fazei staţionare şi
mobile şi după fenomenul de absorbţie sau de repartiţie între două faze nemiscibile în:
cromatografie pe hârtie
cromatografie în strat subţire
cromatografie pe coloană de sephadex
cromatografie în fază gazoasă
lichid cromatografia
a.cromatografia pe hârtie are loc o repartiţie a substanţelor ce se separă între stratul de
lichid polar (apă) aderent de hârtie şi faza mobilă (organică), nemiscibilă cu apa. Deci, este o
cromatografie de repartiţie de tip lichid-lichid.
Ca suport se utilizează hârtia cromatografică Whatman, Schleicher-Schűll, etc.
-Pentru aplicare se pot folosi siringi, micropipete, pipete Pasteur.
-Developarea se face în aparate speciale de sticlă, care să asigure o atmosferă închisă.
-Soluţiile developante sunt specifice substanţelor ce se cercetează.
După developare şi uscare la aer a cromatogramelor, acestea se pulverizează uniform cu o
soluţie revelatoare cu compoziţie specifică substanţelor ce se cercetează. Se usucă din nou la
aer, apoi se expun la etuvă, la temperatura de 90-100ºC pentru evidenţierea spoturilor.
Fig. Cromatografia pe hartie
http://lumea-cunoasterii.blogspot.ro/
Pentru identificare se pot folosi două procedee:
prin comparare cu standardele de referinţă preparate din substanţe cunoscute
cu ajutorul factorului de retenţie numit Rf
17
Rf-ul se defineşte ca fiind raportul dintre distanţa parcursă de substanţa separată prin
cromatografie şi distanţa parcursă de solvent. Deci, pentru calcularea Rf-ului se măsoară
pe de o parte distanţa de la punctul de start până la linia de migrare a solventului (L), iar
pe de de altă parte distanţa de la punctul de start până la centrul geometric al spotului
substanţei respective (l).
Rf=l / L
Valoarea Rf-ului este totdeauna subunitară şi în aceleaşi condiţii de lucru fiecare
substanţă are un Rf cu valoare absolut specifică.
Pentru evaluarea cantitativă, fiecare spot identificat se decupează, eluează şi se supune
determinării fotometrice faţă de un standard de referinţă cu concentraţie cunoscută.
In biochimie, cromatografia pe hârtie are multiple domenii de aplicare, dar se foloseşte în
special pentru separarea, identificarea şi determinarea aminoacizilor şi a substanţelor
glucidice.
b. Cromatografia în strat subţire este asemănătoare cromatografiei pe hârtie cu deosebirea
că în locul hârtiei se folosesc plăci de sticlă acoperite cu un strat adsorbant, uniform distribuit,
de grosime prestabilită, din silicagel sau alt material asemănător. Prezintă avantajul unei mai
bune separări a compuşilor din amestec şi a unei foarte bune reproductibilităţi. Metoda poate
fi utilizată şi în cazul unor substanţe developante care ar ataca hârtia cromatografică.
http://images.1233.tw/tlc-developing-tanks/
Fig. Cromatografia in strat subtire
http://www.bio-rad.com/en-za/applications-technologies/chromatography
18
c. Cromatografia pe coloană de sephadex. Principiul este asemănător cu al cromatografiei
pe hârtie sau în strat subţire cu deosebirea că suportul şi faza staţionară sunt introduse într-o
coloană cilindrică de sticlă. Substanţele din amestec sunt purtate de faza mobilă de-a lungul
fazei staţionare, distribuindu-se în mod specific, în funcţie de capacitatea lor de migrare, în
acest fel realizându-se separarea lor.
Cromatografia pe coloane
http://www.drgpdreamdot.com/chromatography/
Sephadex-ul este o substanţă hidrofilă de tipul dextran-ului, care are proprietatea de a se
îmbiba foarte repede cu apă, formând geluri poroase. Aceste geluri sunt formate din
macromolecule filiforme, legate între ele încrucişat, formând o reţea tridimensională care se
comportă ca o adevărată ―sită moleculară‖. Efectul acestei site este acela că modelează viteza
de parcurgere a ei de către substanţe în funcţie de masa lor moleculară.
Metoda se foloseşte pentru separarea diferitelor fracţiuni proteice, inclusiv pentru
separarea şi purificarea enzimelor, acizilor nucleici, polipeptidelor, aminoacizilor, precum şi
a unor polizaharide.
c.Cromatografia în fază gazoasă reprezintă una din cele mai perfecţionate tehnici
cromatografice cunoscute până în prezent, cu ajutorul căreia se determină substanţele dintr-un
amestec, în domeniu nanogramelor. Faza mobilă este alcătuită dintr-un ―gaz purtător‖, iar
faza staţionară este formată din substanţe specifice care sunt lichide la temperatură înaltă şi
care sunt fixate de un suport inert pulverulent. Complexul de substanţe care alcătuiesc faza
staţionară sunt introduse într-o coloană lungă şi îngustă, din sticlă, alcătuind aşa-numita
―umplutură de coloană‖. Extractul din proba de cercetat purificat printr-o tehnică specială se
injectează în partea superioară a coloanei de unde este preluat de gazul purtător şi vehiculat
de-a lungul fazei staţionare. In funcţie de structura lor chimică componentele amestecului
19
străbat coloana cu viteze diferite, deci, se separă unele de altele. La extremitatea opusă a
coloanei există un sistem de detecţie care semnalizează ieşirea din coloană a fiecărui element.
Intensitatea semnalelor emise este proporţională cu concentraţia fiecărei substanţe, ceea ce
permite evaluarea cantitativă. Semnalele transmise de detector sunt amplificate, apoi se
înregistrează grafic sub forma de ―picuri‖ a căror înalţime sau arie e proporţională cu
concentraţia. Identificarea şi evaluarea cantitativă se fac cu ajutorul standardelor de referinţă
cu concentraţie cunoscută.
d. Cromatografie de lichide de înaltă performanţă - Metoda se bazează pe acelaşi
principiu ca şi celelalte metode cromatografice şi anume repartizarea diferită a componentelor
unui amestec de substanţe între o fază staţionară şi o fază mobilă. Deosebirea majoră între
această metodă şi cromatografia de gaz este aceea că faza mobilă este lichidă şi nu gazoasă.
În plus, faza mobilă nu are un simplu rol de cărăuş ci participă activ la procesul de separare
datorită unor interacţiuni complexe.
2.3.3. Metode electrochimice
a.Electroforeza este tehnica analitică ce are la bază capacitatea particolelor încărcate
electric dintr-o soluţie coloidală de a migra spre polul (+) sau (-) atunci când prin mediul
respectiv trece un curent electric. Mai exact, dacă într-un mediu se găsesc particole încărcate
electric, pozitiv sau negativ, şi dacă în mediul respectiv se creează un câmp electric între doi
electrozi sub tensiune, atunci particolele migrează către electrodul de semn contrar.
Viteza de migrare e condiţionată de mai mulţi factori, dar în primul rând de mărimea
încărcăturii electrice a fiecărei particole. In aceleaşi condiţii de lucru (pH, temperatură,
intensitatea câmpului electric, natura suportului) viteza de migrare a substanţelor dintr-un
amestec e diferită în funcţie de natura fiecărei substanţe.
In practica de laborator, electroforeza se utilizează în special pentru separarea fracţiunilor
proteice din lichidele biologice sau din extractele de ţesuturi, ulterior fiind posibilă
identificarea şi evaluarea lor cantitativă.
b.Metodele potenţiometrice se bazează pe determinarea concentraţiei ionilor din soluţie
măsurând valoarea sau variaţia potenţialului unui electrod indicator.
Aceste metode pot fi:
directe (pH-metria)
indirecte (titrări potenţiometrice)
20
pH-ul se defineşte ca fiind logaritmul cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de
hidrogen dintr-o soluţie. Se exprimă prin valori cuprinse între 1-14.
Valoarea 7 corespunde mediului neutru
Valorile mai mici decât 7 corespund mediului acid
Valorile mai mari decât 7 corespund mediului bazic (alcalin)
pH-ul are o importanta deosebita in desfasurarea reactiilor biochimice din organism.
In mediul biologic, valoarea constantă a pH este 7.2-7.4.
Determinarea pH-ului se poate face prin metoda cu hârtie indicator, metoda cu soluţie
indicatoare, dar pentru determinarea exactă a pH-ului se foloseşte metoda potenţiometrică –
pH-metria.
hârtie de pH pH-metru
Principiul metodei constă în măsurarea diferenţei de potenţial electric între un electrod de
referinţă şi un electrod de măsurare introduşi în soluţia de cercetat şi exprimarea acesteia sub
formă de unităţi de pH.
Aparatele folosite se numesc pH-metre. Pentru etalonarea lor se folosesc soluţii tampon.
Acetea sunt formate din soluţii în care solvatul este alcătuit din două sau mai multe substanţe
chimice, care prin particularitătile lor se opun la schimbarea pH-ului atunci când variază
concentraţia ionilor de hidrogen.
Exemple de sisteme tampon:
Sistemul tampon constituit dintr-un acid slab şi sarea lui cu o bază tare – acid acetic,
acetat de sodiu
Sistem tampon constituit dintr-o bază slabă şi sarea ei cu un acid tare – hidroxid de
amoniu, clorură de amoniu
Sistemele tampon îndeplinesc un rol biochimic esenţial în organism pentru că ele asigură
menţinerea pH-ului în limite fiziologice specifice vieţii.
21
c. Conductometria cuprinde metode de analiză bazate pe determinarea conductibilităţii
soluţiilor. Conductibilitatea soluţiilor de electroliţi se datorează deplasării sarcinilor electrice
(ionilor) sub influenţa unui gradient de potenţial realizat cu ajutorul a doi electrozi.
Există o dependenţă lineară între concentraţia unui ion din soluţie şi contribuţia acestui
ion la conductibilitatea totală a soluţiei.
TEST
1. Ce este cromatografia ? Daţi exemple de diferite tipuri de cromatografie.
2. Precizaţi care este metoda cea mai des utilzată în biochimia analitică cantitativă
3. Care sunt cele 3 categorii în care se împart radiaţiile luminoase, pe baza raportului
între lungimea de undă şi capacitatea de percepere a ochiului omenesc ?
4. Ce este pH-ul ? Indicaţi două metode de determinare a pH-ului.
5. Ce determinări se realizează cu ajutorul metodelor refractometrice ?
6. Ce sunt soluţiile tampon ?
22
Laborator 3 - 4.Glucide
Glucidele sunt substanţe naturale universal răspândite în organismele vegetale şi animale.
Au rol structural şi energetic, reprezentând combustibilul principal al tuturor organismelor.
De exemplu, pentru un adult furnizează 60% din energia necesară.
Glucidele sunt substanţe cu funcţiuni mixte, care conţin în molecula lor grupări
carbonilice şi hidroxilice, ele fiind polihidroxialdehide sau polihidroxicetone.
In funcţie de complexitatea structurală glucidele se clasifică în două categorii:
Oze – denumite şi monozaharide – sunt compuşi la care hidroliza acidă sau enzimatică nu
conduce la compuşi mai simpli care să păstreze totuşi proprietăţile grupului.
Ozide – sunt glucide care prin hidroliza acidă sau enzimatică pun în libertate una sau mai
multe molecule de monozaharide. In funcţie de moleculele care rezultă în urma hidrolizei,
ozidele se împart în:
- Holozide - care conţin în structura lor monozaharide
- Heterozide – care sunt constituite din monozaharide şi o componentă neglucidică
numită aglicon.
Reacţiile chimice folosite pentru identificarea şi dozarea glucidelor, sunt reacţii de
culoare, condensare, deshidratare, oxido-reducere, hidroliză, etc.
23
Extragerea glucidelor din produsele alimentare
Extragerea monoglucidelor şi a oligoglucidelor din produsele alimentare se poate realiza
prin presare sau prin extracţia produsului respectiv cu anumiţi solvenţi.
Extracţia prin presare
Se aplică produselor alimentare cu conţinul mare de apă şi glucide solubile. In urma
presării se obţine un suc care conţine glucide solubile. Acest suc se utilizează la dozarea
glucidelor prin metode refractometrice şi densitometrice. Rezultatele acestor măsuratori sunt
orientative deoarece în sucul obţinut pot exista şi alte substanţe solubile în apă.
Extracţia cu solvenţi specifici
Această metodă este folosită frecvent în scopuri analitice şi industriale. Solvenţii utilizaţi
sunt: apa la 75-80ºC sau etanolul la temperatura de fierbere.
a). Extracţia apoasă la cald cu defecare
Extractul primar obţinut prin această metodă are un grad de puritate mai mare decât prin
presare, deoarece prin procesul de defecare se îndepărtează substanţele neglucidice cu
ajutorul unor reactivi numiţi defecanţi. (In latină, termenul de ―defecare‖ înseamnă desfacere,
purificare).
b). Extracţia alcoolică
Metoda se foloseşte pentru produsele cu conţinut ridicat de amidon sau în scopuri
microanalitice. Amidonul este insolubil în etanol şi în felul acesta se înlătură posibilitatea
antrenării sale în extract. In cazul microanalizei glucidelor se aplică extracţia alcoolică,
deoarece etanolul are un rol dublu: de extractant şi de defecant. Extractul alcoolic poate fi
tratat cu schimbător de ioni pentru a scoate eventualii anioni şi cationi existenţi în extract sau
poate fi tratat cu cărbune activ pentru înlăturarea pigmentilor solubili în etanol.
24
3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul
Refractometrie este metoda pentru determinarea indicelui de refractie "n", sau a
refractiei molare Rm.Analiza refractometrica este utilizata pentru a determina concentratiei
unuei substante dintr-o solutie in functie de indicele de refractie.
Metoda refractometrica se aplica pentru determinarea concentratiilor solutiilor în
industria zaharului, conserve vegetale, produse zaharoase, glucoza, etc.; determina substanta
uscata solubila si concentratia de zahar daca în extractul solubil al unui produs alimentar
predomina zaharurile iar nezaharul este constant.
Refractometria se utilizeaza si pentru determinarea indicelui de refractie al grasimilor,
respectiv pentru determinarea continutului de grasime al unui produs alimentar.
Se numeşte indice de refracţie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase faţă de
verticala (α) şi sinusul unghiului de refracţie (β).
Indicele de refracţie=sin α/sin β
Indicele de refracţie este o constantă specifică fiecărei substanţe. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mărimea şi structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraţia unei soluţii şi astfel se poate stabili procentul de substanţă
uscată sau de apă.
Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abbé.
Indicele de refracţie este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca determinările
să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele sunt cuplate de
obicei cu baie ultratermostatată.
Indicele de refracţie
25
Tipuri de refractometre:
Se numeşte indice de refracţie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase faţă de
verticala (α) şi sinusul unghiului de refracţie (β).
Indicele de refracţie=sin α/sin β
Indicele de refracţie este o constantă specifică fiecărei substanţe. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mărimea şi structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraţia unei soluţii şi astfel se poate stabili procentul de substanţă
uscată sau de apă.
Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abbé.
Indicele de refracţie este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca
determinările să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele
sunt cuplate de obicei cu baie ultratermostatată.
Modul de lucru pentru refractometrul Abbe-Zeiss
1. Se depărtează prismele una de alta, se spală suprafaţa cu alcool şi se lasă să se usuce.
Indicele de refracţie
26
2. Cu o pipetă se pun câteva picături din lichidul de studiat pe suprafaţa prismelor, după
care se închide blocul prismelor.
3. Cu ajutorul oglinzii se îndreaptă fasciculul luminos către prisme.
4. Privind prin luneta din dreapta se pune la punct imaginea firelor reticulare prin învârtirea
ocularului. Apoi se caută domeniul de separaţie dintre câmpul luminos şi întunecat
învârtind butonul din stânga. Dacă în câmpul lunetei se observă o figură neregulată,
înseamnă că lichidul nu a acoperit întreaga suprafaţă a prismei. În acest caz se mai pun
câteva picături de lichid, până când domeniul luminos şi cel întunecat sunt separate
printr-o linie dreaptă.
5. Cu butonul din stânga se aduce încrucişarea firelor reticulare în suparapunere cunlinia de
separaţie. Cu lupa din stânga se citeşte pe scala gradată direct indicele de refracţie IR al
lichidului
6. Se repetă măsurătorile de cel puţin 3 ori.
Date experimentale:
Nr
probei.
Repetitii/medie IR Conc SU
solubila in apa
1 R1
R2
R3
M
2 R1
R2
R3
M
3 R1
R2
R3
M
27
3.2.Determinări cantitative ale glucidelor
3.2.1.Determinarea glucidelor reducătoare cu ajutorul reacţiei Fehling
Reacţia Fehling poate servi şi pentru determinarea cantitativă a glucidelor
reducătoare. Pentru aceasta trebuie să determinăm ―titrul soluţiei Fehling‖, adică
corespondenţa în glucoză sau alt glucid reducător al reactivului Fehling, cu care se lucrează.
Prin titrul soluţiei Fehling se înţelege cantitatea de glucoză exprimată în miligrame,
care reduce amestecul format din 10ml soluţie Fehling I+ 10ml soluţie Fehling II.
Determinarea titrului soluţiei Fehling.
Se cântareşte 1g glucoză pură, uscată în prealabil la 100ºC şi se dizolvă într-un balon
cotat de 100ml, completându-se la semn cu apă distilată.
Intr-un flacon Erlenmeyer se pun exact 10ml reactiv Fehling I şi 10ml reactiv Fehling
II şi se adaugă 10-20ml apă distilată.Flaconul se încălzeşte până la fierbere pe o sită de azbest
şi se adaugă din biuretă soluţie de glucoză picătură cu picătură, până când soluţia va deveni
incoloră şi se observă depunerea unui precipitat roşu-cărămiziu, care se depune pe fundul
vasului. Dacă se depăşeşte punctul de viraj soluţia va deveni galbenă din cauza caramelizării
glucozei şi reacţia trebuie repetată.
Este bine ca reactivul Fehling să fiarbă tot timpul, glucoza să se adauge numai în
picături şi titrarea să se facă cât mai repede.
Titrul soluţiei Fehling =N·10 mg
N= nr.ml de glucoză utilizaţi
In cazul determinării glucidelor din soluţii necunoscute se procedează la fel ca şi în cazul
stabilirii titrului, cu deosebire că în biuretă se pune soluţia de cercetat.
Glucoză mg =Titrul solutiei Fehling·1000/ N1
unde:
N1= numarul de ml utilizaţi din soluţia de glucidă necunoscută
Calcule si observatii
28
29
3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool
Determinarea zahărului reducător dupa această metodă este mult mai rapidă, nu
necesită aparatura specială (filtru G4) însă este mai puţin exactă decât metoda Bertrand.
Prin această metodă, cantitatea de oxid cupros formată se determină indirect, prin
dozarea iodometrică a sulfatului de cupru existent în soluţia Fehling, înainte şi după reducere.
Diferenţa obţinută reprezintă cantitatea de cupru redusă de către zahăr .
Reacţiile chimice care au loc sunt următoarele:
2 CuSO4 + 4 KI = 2 CuI + 2 K2SO4 + I2
I2 + Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6
Reactivi necesari: - soluţie Fehling I
- soluţie Fehling II
- tiosulfat de sodiu 0,1N
- iodură de potasiu 10%
- acid sulfuric, d=1,11
- amidon solubil 1%
Mod de lucru: Intr-un balon Erlenmeyer de 300ml se introduc 10ml soluţie Fehling I, 10ml
soluţie Fehling II şi 20ml din soluţia de analizat. Balonul se încălzeşte pe sită de azbest,
reglându-se astfel flacăra becului încât soluţia să fiarbă după trei minute. Se fierbe două
minute, se răceşte apoi soluţia în curent de apă după care se adaugă 20ml soluţie de iodură de
potasiu şi 15ml acid sulfuric.
Se titrează iodul pus în libertate, prin reducerea cuprului în iodură cuproasă, cu Na2S2O3
0,1N în prezenţa amidonului ca indicator. Titrarea se continuă până la dispariţia culorii
albastre.
Se face o probă martor pentru stabilirea titrului cantităţii de cupru din cei 10ml soluţie
Fehling.
Proba martor se lucrează în aceleaşi condiţii ca şi proba de analizat, cu diferenţa că în
locul soluţiei de zahăr se adaugă 20ml apă distilată.
Cantitatea de cupru redusă de către zahăr se află în funcţie de cantitatea de tiosulfat de
sodiu 0,1N folosită la titrare, pe baza relaţiei :
V =V1 – V2 în care
V = ml Na2S2O3 0,1N corespunzător zahărului care se găseşte în proba de analizat, in ml
V1 = ml tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei martor, în ml
V2 = ml de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei de analizat în ml
30
Determinarea zahărului invertit şi glucozei după Schoorl
Soluţia de
Na2S2O3 0,1N ml
Cupru mg Glucoză mg Zahăr Invertit
mg
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
6,4
12,7
19,1
25,4
31,8
38,2
44,5
50,9
57,3
63,6
70,0
76,3
82,7
89,1
95,4
101,8
108,1
114,4
120,8
127,2
133,5
139,8
146,2
152,6
159,0
3,2
6,3
9,4
12,6
15,9
19,2
22,4
25,6
28,9
32,3
35,7
39,0
42,4
45,8
49,3
52,8
56,3
59,8
63,3
66,9
70,7
74,5
78,5
82,6
86,6
3,2
6,4
9,7
13,0
16,4
19,8
23,2
26,5
29,9
33,4
36,8
40,3
43,8
47,3
50,8
54,3
58,0
61,8
65,5
69,4
73,3
77,2
81,2
85,2
89,2
Cantitatea de zahăr analizată, corespunzătoare volumului V de tiosulfat de sodiu se află cu
ajutorul unui tabel, exprimarea fiind în zahăr invertit sau glucoză.
Calcul şi observaţii
31
32
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu
Lactoza din lapte este unul din componentele extractului uscat total reprezentând
aproximativ 35%. Lactoza este un compus instabil suferind fermentaţii sub infuenţa
microorganismelor prezente în lapte.
Pentru determinarea lactozei din lapte se folosesc mai multe metode chimice
(metoda Bertrand, varianta Elser, metoda cu fericianurӑ de potasiu), sau se folosesc metode
instrumentale (metoda polarimetricӑ).
Lactoza, reduce în mediu alcalin şi la cald, fericianura de potasiu K3[Fe(CN)6] în
ferocianură de potasiu, K4[Fe(CN)6], ceea ce va duce la decolorarea soluţiei galbene de
fericianură.
Reactivi necesari : - sulfat de cupru, soluţie saturată
- soluţie alcalină de fericianură de potasiu: se dizolvă 23g fericianură de
potasiu în cca.400ml apă, iar în alt pahar 23g hidroxid de potasiu tot în cca. 400ml apă.
Cele două soluţii se trec în balon cotat de 1000ml, se completează cu apă la semn şi se
omogenizează.
- soluţie standard de lactoză: 5g lactoză se aduc cu apă în balon cotat de
1000ml, se completează la semn şi se omogenizează.1ml din această soluţie conţine
5mg lactoză.
Mod de lucru
Stabilirea titrului soluţiei de fericianură de potasiu : Intr-un vas Erlenmeyer se introduc
10ml soluţie alcalină de fericianură de potasiu, peste care se adaugă 30ml apă distilată şi se
aşează pe sita de azbest, iar deasupra lui se potriveşte biureta cu soluţie standard de lactoză.
Se porneşte flacăra şi când începe fierberea se picură soluţie de lactoză din biuretă agitând
flaconul după fiecare picătură, până în momentul în care culoarea galbenă dispare brusc.
Ritmul de picurare trebuie să fie rar,iar soluţia din vas în continuă fierbere moderată.
Titrul soluţiei de fericianură de potasiu exprimat în numărul de mg lactoză necesar pentru a
reduce 1ml soluţie de fericianură, se stabileşte cu ajutorul formulei :
T = V x5 / 10
în care : V = volumul soluţiei de lactoză folosit, în ml
5 = conţinutul de lactoză, în mg , corespunzător la 1ml soluţie
10 = volumul soluţiei de fericianură folosit,în ml
33
Determinarea: Intr-un balon cotat de 100ml se introduc 10ml lapte peste care se adaugă cca.
40ml apă şi se omogenizează. Adӑugӑm 1 ml soluţie saturatӑ de CuSO4, (0,5 ml solutie
saturata de fericianura de potasiu). Amestecul se agitӑ de 3-4 ori şi se completeazӑ cu apa
pâna la semn, dupa care se lasӑ 5 minute în repaus. După un repaos de 5 minute se filtrează
prin filtru cutat şi se obţine un lichid clar de culoare slab albăstruie. Pentru a îndepărta
excesul de sulfat de cupru adăugăm 0,5-1,0g pulbere de zinc, se omogenizează şi se filtrează
din nou. Astfel se obţine un lichid incolor şi perfect limpede.
Filtratul se introduce în biuretă şi se procedează în continuare ca la stabilirea titrului
soluţiei de fericianură.
Calculul rezultatelor
a. Calcul Titru
b. Calcul continut lactoza
Conţinutul de lactoză din lapte, exprimat în g la 100ml, se calculează astfel :
Lactoză, g la 100ml = (Tx10x10 /V x1000)x 100
în care :
T = titrul soluţiei de fericianură de potasiu
10 = volumul soluţiei de fericianură de potasiu luat în lucru,în ml
10 = raportul între volumul balonului cotat (50 ml) şi laptele luat în lucru (5 ml)
V = volumul de filtrat folosit, în ml
1000 = factor de transformare mg în g
100 = factor de exprimare pentru 100ml lapte
34
Interpretarea rezultatului
Continutul în lactoza al laptelui de vaca este în medie 4,55%.
Cantitatea de lactoza din lapte scade în cazul falsificӑrii laptelui cu apa precum si în cazul
modificarilor inflamatorii ale glandei mamare. Laptele cu aciditate de peste 21ºT nu se
preteazӑ pentru determinarea lactozei. În acest caz se vor obtine valori mai mici decât
cele pentru laptele proaspӑt deoarece procesele fermentative se desfӑşoarӑ în primul rând
pe seama lactozei.
Test
1. Care este rolul glucidelor în organism ?
2. Cum se pot extrage glucidele din produsele alimentare ?
3. Daţi exemplu de reacţie de reducere, care permite identificarea şi determinarea
cantitativă a glucidelor reducătoare.
4. Ce monoglucide rezultă în urma hidrolizei lactozei ?
5. Care este substanţa de baza din reactivul Fehling?
35
Laborator 5-6. Lipide
5.1.Determinarea principalilor indici la grăsimi
5.1.1. Determinarea punctului de topire
Valoarea punctului de topire al grăsimilor este în strânsă corelaţie cu natura şi proporţia
acizilor graşi din structura lor chimică. Astfel, grăsimile care conţin şi acizi graşi saturaţi
inferiori de tipul acizilor butiric, caproic, caprilic, care la temperatura camerei sunt lichizi sau
semilichizi, vor avea consistenta mai moale decât alte grăsimi, cum este cazul grăsimii
laptelui. Invers, grăsimile în structura cărora predomină acizii graşi saturaţi superiori de tipul
acidului stearic vor avea consistenţa mult mai fermă, cum este cazul seului de rumegătoare.
Toţi acizii graşi nesaturaţi sunt lichizi la temperatura de 20˚C. Exemplul cel mai evident
îl constituie uleiurile vegetale, la care proporţia de acizi graşi nesaturaţi este de 60%.
Pentru că grăsimea fiecărei specii are o structură chimică specifică şi valoarea punctului
de topire va fi relativ specifică.
Punctul de topire poate fi socotit ca indicator util pentru stabilirea speciei de la care
provine grăsimea supusă analizei.
Valoarea punctului de topire este dată de temperatura corespunzătoare momentului în
care grăsimea introdusă într-un tub capilar şi încălzită lent, se clarifică brusc.
Materiale necesare:
- tuburi capilare din sticlă, uniform calibrate, bine degresate şi uscate, cu diametrul interior
de 1mm şi lungimea de 15 mm.
- termometru cu mercur de 0…100˚C, gradat din 0,1 în 0,1˚C
- pahar Berzelius de 100ml
- stativ cu clemă pentru suspendarea termometrului
36
- glicerină
- plită electrică sau bec de gaz
Mod de lucru : Intr-un creuzet mic de porţelan se introduc câteva grame de grăsime şi se
încălzeşte uşor până la topire completă. In acest moment, cu ajutorul unei pense, se introduc
în creuzet două tuburi capilare care se vor umple complet cu grăsime topită.Se lasă apoi
creuzetul în repaos pentru răcire şi închegarea grăsimii. Se scot cele două tuburi capilare şi se
curăţă de grăsimea aderentă la suprafaţa lor externă. Coloana de grăsime din interiorul
capilarelor trebuie să fie compactă şi să ocupe tot lumenul acestora. Cu ajutorul unui inel
subţire de cauciuc se fixează cele două capilare de o parte şi alta a rezervorului cu mercur al
termometrului şi termometrul astfel pregătit se introduce la congelatorul frigiderului unde se
ţine 24 de ore
Paharul Berzelius umplut cu glicerină se trece pe plita electrică sau pe sita de azbest şi în
el se suspendă termometrul cu cele două tuburi capilare. Termometrul se fixează cu ajutorul
unei cleme în poziţie perfect verticală, în aşa fel încât să se ocupe centrul geometric al masei
de glicerină din pahar, iar tuburile capilare la rândul lor să fie în poziţie perfect verticală.
Fig. Instalaţie pentru determinarea punctului de topire a grăsimii
Se acţionează căldura şi se urmăreşte temperatura pe scala gradată a termometrului şi
aspectul grăsimii din cele două tuburi capilare. Incălzirea trebuie să fie lentă, încât viteza de
creştere a temperaturii să înregistreze un ritm de 2-3˚C/ minut.
In preajma punctului de topire coloana de grăsime din capilare începe să se clarifice de
la exterior spre interior. In momentul în care s-a realizat clarificarea completă se citeşte
valoarea temperaturii. In acest moment o bulă de grăsime se va profila brusc la capătul
superior al tubului capilar, ca urmare a alunecării coloanei de grăsime topită împinsă de
37
presiunea de jos în sus a glicerinei din pahar. Aproape instantaneu picătura de grăsime se
desprinde de capătul tubului capilar şi se ridică la suprafaţa stratului de glicerină.
5.1.2. Determinarea indicelui de iod
Dublele legături ale acizilor graşi nesaturaţi din compoziţia grăsimilor conferă acestora
caracter de instabilitate chimică, ce se traduce şi prin capacitatea lor de a adiţiona uşor
halogeni la nivelul acestor duble legături.
Indicele de iod este cantitatea de iod, în grame, adiţionată de 100g grăsime.Valorea
acestui indice este condiţionată de natura şi proprţia acizilor gra6si nesaturaţi (adică de
numărul dublelor legături) din compoziţia grăsimilor. Grăsimile care au un conţinut mic de
acizi graşi neasturaţi vor avea indicele de iod cu valoare mai mică (grăsimile animale în
general), iar cele care au un conţinut mare de acizi graşi nesaturaţi, vor avea un indice de iod
cu valoare mare (uleiurile)
De exemplu, untul de vacă are un indice de iod cuprins între 21 – 36 ; untura de porc
între 43 – 70 ; uleiul de floarea soarelui intre 119 – 135.
Indicele de iod constituie un criteriu pentru aprecierea purităţii grăsimii.
In condiţii specifice de lucru, se tratează o cantitate dată de grăsime cu o soluţie de iod de
concentraţie cunoscută, apoi se titrează excesul de iod cu o soluţie echivalentă de tiosulfat de
sodiu. Cantitatea de iod adiţionată se calculează din diferenţă.
Reactivi necesari : - cloroform sau tetraclorură de carbon
- reactiv Hanus (monobromură de iod)
- iodură de potasiu, soluţie 15% proaspăt preparatӑ
- tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1N
- amidon, soluţie 1%, proaspăt preparată
Mod de lucru: Cantitatea de grăsime care se ia în lucru, se va corela cu indicele de iod
probabil al acesteia după cum urmează:
- 1,0g , pentru indicele de iod cuprins între 10-50
- 0,6g, pentru indicele de iod cuprins între 50-70
- 0,25g, pentru indicele de iod cuprins între 70-120
- 0,15g, pentru indicele de iod mai mare de 120
Intr-un flacon Erlenmeyer de 300ml cu dop rodat, se cântăreşte la balanţa analitică
grăsimea în prealabil topită. Se adaugă apoi 10ml cloroform, 25ml reactiv Hanus şi se lasă la
întuneric 30-60 minute, funcţie de valoarea indicelui de iod. Se adaugă apoi 20ml iodură de
38
potasiu, şi 100ml apă distilată, apoi se titrează repede cu tiosulfat de sodiu. Spre sfârşitul
titrării, când culoarea soluţiei se deschide la galben, se adaugă 3-5 picături soluţie de amidon;
soluţia se colorează în albastru. Se continuă titrarea agitând mereu, foarte energic, până la
dispariţia culorii albastre.
In aceleaşi condiţii se face si o probă martor, dar fără grăsime.
Calculul rezultatelor :
Indicele de iod = 0,01269 • (V – V1) • 100 / m în care:
0,01269 = cantitatea de iod, în g, corespunzătoare la 1ml tiosulfat de sodiu soluţie 0,1N
V = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martor
V1 = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei ce se analizează.
m = cantitatea de grăsime, în g, luată în lucru.
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare
Indicele de saponificare exprimă numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar
pentru a saponifica total un gram de grăsime.
Cu cât este mai mare masa moleculară a gliceridei, respectiv a acizilor graşi, cu atât
cantitatea de hidroxid de potasiu necesară saponificării este mai mică.Valoarea indicelui de
saponificare dă indicaţii asupra constituţiei chimice a grăsimii cercetate.
Reactivi necesari: - soluţie alcoolică de hidroxid de potasiu aproximativ 0,5N- se preparӑ
dizolvând 32g hidroxid de potasiu în puţină apă şi completând la
1000ml cu alcool de 95ºC
- fenolftaleină 1% în alcool 95ºC
- acid clorhidric 0,5N
Mod de lucru: Intr-un balon de 150-200ml se cântăresc 1-2g grăsime la care se adaugă apoi
25ml hidroxid de potasiu alcoolic.
Balonul se astupă cu un dop, prin care trece un refrigerent ascendent răcit cu apă, apoi se
încălzeşte pe o baie de apă fierbinte 30-40 minute. După acest timp soluţia din flacon se
titrează cu HCl 0,5N. Dacă soluţia este puternic colorată, se diluează cu alcool pentru ca să se
poată observa cât mai bine culoarea roşie a fenolftaleinei.
Intr-un balon se face o titrare martor cu 25ml de hidroxid de potasiu alcoolic.
Diferenţa dintre numărul de ml folosiţi la titrarea soluţiei martor N1 şi a celor folosiţi la
titrarea soluţiei cu grăsime N2, dă numărul de ml de hidroxid de potasiu întrebuinţaţi la
saponificarea grăsimii luată în lucru.
39
Din aceştia se calculează apoi numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru
saponificarea unui gram de grăsime şi care reprezintă indicele de saponificare.
Indicele de saponificare = (N1 – N2)• FHCl • 28 / G în care:
N1 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei martor
N2 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei de grăsime
28 = cantitatea de hidroxid de potasiu, în mg, corespunzătoare la 1ml hidroxid de potasiu,
G = masa de grăsime
5.1.4. Determinarea indicelui de aciditate
Indicele de aciditate reprezintă numărul de miligrame de hidroxid de sodiu necesar pentru
neutralizarea acizilor graşi liberi dintr-un gram de grăsime.
Reactivi necesari : - hidroxid de sodiu 0,1N
- fenolftaleină, soluţie alcoolică 2%
- amestec alcool-eter 1:1 (un volum alcool etilic 95°C se amestecă cu un
volum eter etilic) înainte de folosire se neutralizează cu NaOH 0,1N în
prezenţă de fenolftaleină .
Mod de lucru : Intr-un pahar Berzelius se cântăresc 5g de grăsime şi se încălzeşte până la
topire. Se adaugă 20ml amestec alcool-eter neutralizat faţă de fenolftaleină şi se titrează cu
NaOH 0,1N sub agitare continuă, până la apariţia culorii roz care trebuie să persiste 30 de
secunde.
Calcul :
Aciditate, în acid oleic % = 0,0282 • V • 100 / m în care :
0,0282 = cantitatea de acid oleic, în g, corespunzătoare la 1ml hidroxid de sodiu 0,1N
V = volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,1N, în ml, folosit la titrare
m = masa probei luată pentru determinare.
5.1.5. Indice de peroxid
Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de peroxid şi alte substanţe oxidante dintr-o
cantitate dată de grăsime, care oxidează iodura de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o
soluţie de tiosulfat de sodiu iar exprimarea rezultatelor se face în miliechivalenţi de peroxid la
1 kg produs.
Reactivi necesari : - cloroform + acid acetic glacial
- iodură de potasiu, soluţie apoasă saturată, proaspăt preparată
40
- tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1N şi 0,01N
- amidon, soluţie 1%, proaspăt preparată
Mod de lucru: Probele de grăsime pentru această determinare se recoltează în borcane brune
de sticlă cu dop rodat. Recipientul se umple complet cu grăsime fără a se forma goluri de aer,
se închide etanş şi se păstrează la rece şi întuneric pe tot parcursul, până în momentul
analizei.
Proba se încălzeşte moderat pe baia de apă cu 5-10°C peste punctul de topire al
grăsimii, apoi se omogenizează uşor fără a se îngloba aer. Dacă grăsimea topită are un
conţinut mare de apă (este pronunţa tulbure) se adaugă cca. 20% sulfat de sodiu anhidru, se
omogenizează şi se lasă în repaus pentru decantare.
Din stratul clar de la suprafaţă se cântăreşte foarte exact într-un flacon cu dop rodat o
cantitate corelată cu indicele probabil de peroxid şi anume.
Indicele de peroxid probabil (miliechivalenţi/kg) Cantitatea de grăsime (g)
Până la 19
între 19…31
între 31…50
între 50…88
5 ± 0,05
2,0 -1,2
1,5 -0,8
0,8 -0,5
In flaconul cu grăsime se introduc 10ml cloroform si se omogenizează până la
dizolvare. Se adaugă 15ml acid acetic, 1ml soluţie de iodură de potasiu, se închide cu dopul,
se agită 1 minut si se lasă în repaus la întuneric exact 5 minute.
Se adaugă 75ml apă distilată şi se titreză repede cu soluţie de tiosulfat de sodiu, 0,01N
dacă indicele de peroxid este până la 19, sau 0,1N dacă indicele de peroxid este mai mare.
Către sfârşitul titrării se foloseşte soluţia de amidon (până la dispariţia culorii albastre).
In paralel se efectuează o determinare martor în aceleaşi condiţii dar fără grăsime.
Calculul rezultatelor:
Indice de peroxid, miliechivalenţi/kg = (V – V1) ·n ·1000 / m
în care :
V = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei
V1= volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martorului
n = normalitatea soluţiei de tiosulfat de sodiu folosită la titrare
m= masa probei de grăsime, în g, luată în lucru
41
5.1.6. Reacţia Kreis
Aldehida epihidrinică se formează în mod constant în procesul de oxidare avansată a
grăsimilor. Ea reacţionează cu fluoroglucina în mediu acid, formând un compus colorat.
Intensitatea culorii este proporţională cu cantitatea de aldehidă epihidrinică, deci şi cu
procesul de oxidare.
Reactivi necesari: - fluoroglucină, soluţie eterică 0,1%. Se păstrează max 1 sӑpt. în sticle
brune
- acid clorhidric concentrat(d=1,19)
Mod de lucru: Intr-o eprubetă curată se introduce o anume cantitate din proba de grăsime,
după topirea prealabilă la temperatură moderată (cca.50°C). Se adaugă acelaşi volum de acid
clorhidric concentrat şi se omogenizează bine. Se adaugă în continuare acelaşi volum de
soluţie de fluoroglucină şi se omogenizează din nou.
Dacă untura este proaspătă soluţia din eprubetă rămâne incoloră sau capătă o tentă gălbuie.
Dacă sunt instalate procese de oxidare, apare o culoare roşie de diferite intensităţi, funcţie
de gradul râncezirii. Culoarea se dezvoltă imediat şi este stabilă o oră.
Calcule si observatii
42
6.1. Determinarea grăsimii –metoda Soxhlet –principiul metodei
În produsele naturale, substanţele grase sunt înglobate de obicei în celule grăsoase, a
căror membrană este de natură proteică. Extragerea cantitativă din proba care se analizează,
presupune eliberarea grăsimii din corsetul proteic.
Distrugerea membranei sau peliculei proteice se poate realiza pe două căi: pe cale
fizică (cu ajutorul căldurii), sau pe cale chimică (prin hidroliza acidă sau alcalină). Separarea
grăsimii de celelalte componente organice şi minerale se poate realiza prin extracţie selectivă
cu ajutorul solvenţilor organici, sau prin centrifugare.
Determinarea grăsimii din produsele alimentare de origine animală se poate realiza
prin mai multe metode: prin extracţie cu solvenţi organici, cum ar fi metoda Soxhlet,
Goldfish, Mojonnier sau folosind hidroliza acidă sau alcalină - metoda Gerber, Babcock.
Metoda de referinţă utilizată în laboratoarele de stat este metoda Soxhlet.
Principiul metodei
Grăsimea din proba de cercetat este extrasă până la epuizare cu solvenţi organici şi
după îndepărtarea solventului de extracţie se cântăreşte şi se exprimă procentual. Pentru
asigurarea extracţiei complete, proba este supusă în prealabil unui tratament termic la
temperatură moderată prin care se realizează deshidratarea şi distrugerea membranei sau
peliculei proteice a microstructurii în care este înglobată.
Extractoare Soxhlet
43
6.2. Determinarea grăsimii din produsele lactate – metoda Gerber –
principiul metodei
Componentele majore din ţesurile şi umorile animale au greutate specifică 1,00 (apa) sau mai
mare de 1,00 (protidele, glucidele şi substanţele minerale). Lipidele au greutate specifică mai
mică decât unu. Există deci posibilitatea separării şi determinării lipidelor prin centrifugare.
Pentru aceasta este necesar ca toate componentele să se găsească sub formă de soluţie,
emulsie sau suspensie coloidală, situaţie ce se poate realiza în condiţii optime prin hidroliză
acidă.
Metoda se foloseşte în special pentru determinarea grăsimii din lapte şi din produsele
lactate. Prin adaptări corespunzătoare însă, se poate utiliza pentru determinarea grăsimii din
orice produs de origine animală.
Produsul de cercetat este introdus într-un recipient de sticlă special numit butirometru
unde este supus unei hidrolize rapide cu ajutorul acidului sulfuric. Grăsimea eliberată din
structura în care este încorporată, se separă prin centrifugare. Pentru uşurarea separării se
foloseşte alcoolul amilic. Cantitatea de grăsime, exprimată procentual, se citeşte direct pe tija
gradată a butirometrului.
Butirometre
Centrifugă Gerber
44
Test
1. Care este rolul lipidelor în organism ?
2. Ce fel de acizi graşi conţin uleiurile? Precizaţi care este reacţia folosită pentru
determinarea gradului de nesaturare a grăsimilor.
3. Enumeraţi constantele caracteristice lipidelor.
4. Care este metoda folosită pentru a pune în evidenţă degradarea oxidativă avansată a
grăsimilor ?
5. Care este principiul metodei de determinare a grăsimilor din lapte şi alte produse
lactate ?
6. Indicaţi solventul folosit pentru extragerea grăsimilor prin metoda Soxhlet.
45
Laborator 7-8-9. Determinarea proteinelor din produsele alimentare
Protidele sunt substanţe chimice esenţiale ale materie vii. Ele sunt formate în special din
aminoacizi. Sunt substanţe complexe care conţin C, H, O, N şi uneori sulf, fosfor, fier sau
cupru.
Rolul fundamental este cel plastic şi funcţional şi mai puţin energetic. Ele sunt
considerate cele mai importante substanţe prezente în regnul animal şi vegetal.
Aminoacizii sunt acizi carboxilici în care un atom de hidrogen a fost înlocuit cu o
grupare amino, -NH2; ei rezultă prin hidroliza acidă, bazică sau enzimatică a proteinelor.
Din punct de vedre al comportării faţă de diferiţi solvenţi protidele se clasifică în
proteine simple şi proteine conjugate. Prin hidroliză proteinele simple eliberează numai
aminoacizi, iar proteinele conjugate eliberează pe lângă aminoacizi şi o componentă
neproteică numită grupare prostetică.
In constituţia corpului omenesc se găsesc câteva mii de proteine diferite, cu structuri
speciale care corespund anumitor funcţii specifice.
Analiza calitativă şi cantitativă a aminoacizilor se bazează pe reacţiile specifice date
de gruparea amino, carboxil, de radicalul moleculei fiecărui aminoacid, de legăturile
peptidice, pe valoarea punctului izoelectric şi pe masa moleculară.
Reacţiile chimice prin care pot fi identificate protidele se împart în:
- Reacţii de culoare specifice sau generale
- Reacţii de precipitare
46
7.1. Obţinerea extractelor proteice
a.Albumina vegetală: 25g făină de grâu se amestecă cu 100ml apă distilată şi se lasă să
stea 30 minute, agitând din când în când. Se filtreză pe filtru cutat. Dacă primele porţiuni sunt
tulburi se filtrează din nou.
b.Albumină de origine animală : La 50ml lapte se adaugă un volum egal de apă distilată
şi apoi, în picături amestecând, 0,2-0,3ml acid acetic concentrat, până la obţinerea unui
precipitat floconos.
După 5-10 minute amestecul se filtrează printr-o pânză umezită în prealabil. Primele
cantităţi se refiltrează. Soluţia limpede, puţin gălbuie conţine albumină şi o parte din
globulina din lapte. Reziduul de pe filtru este constituit din cazeină şi grăsime.
c.Obţinerea proteinelor din albuşul de ou
O soluţie concentrată de proteine se formează dintr-un albuş de ou la care se adugă 5-6g
NaCl. Se agită puţin, se pune într-un vas de 500ml . Când trebuie preparată o soluţie diluată,
se ia un anumit volum din soluţia concentrată şi se diluează de două sau de trei ori cu apă
distilată.
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire
Proteinele sunt alcătuite dintr-un amestec de aminoacizi în diferite proporţii şi din această
cauză este important să cunoaştem aminoacizii constituenţi.
Separarea şi identificarea aminoacizilor constituenţi este posibilă prin cromatografie pe
hârtie sau în strat subţire.
In cromatografia pe hârtie se foloseşte hârtie de filtru îmbibată şi străbătută de diferite
amestecuri de solvenţi, de exemplu fenol-apă sau butanol–apă. Aceleaşi amestecuri de
solvenţi sunt folosiţi şi în cromatografia în strat subţire cu deosebirea că în acest caz faza fixă
este dispusă pe o placă de sticlă, şi este constituită dintr-un material poros solid–silicagel sau
oxid de aluminiu.
Aminoacizii se deplasează cu viteze diferite de-a lungul hârtiei sau a plăcii cromatografice.
Deoarece aminoacizii sunt incolori, trebuie să se realizeze o reacţie de culoare cu ninhidrină.
Aminoacizii se prezintă sub formă de pete de dimensiuni diferite, cu intensităţi diferite de
culoare.
Pentru a identifica în parte se face o cromatogramă de comparaţie, folosind câte un
aminoacid cunoscut, astfel se poate cunoaşte poziţia fiecărui aminoacid în cromatogramă.
Aparaturӑ necesara : - amestec de 2-3 aminoacizi (1mg/ml apă, 0,1%)
47
- soluţii de control de aminoacizi (1mg/ml)
- amestec de developare butanol-acid acetic- apă 4:1:5
- ninhidrină 0,1-0,2% în butanol
- Hârtie cromatografică Whatman nr.1 sau plăci cromatografice
Mod de lucru: Pe o placă cromatografică se trag linii paralele la distanţe de 1cm. La 2cm de
marginea inferioară se aşează cu micropipeta câte o picătură din soluţia de cercetat şi din
soluţiile de control. Diametrul fiecărei picături trebuie să fie cca. 2-3mm, iar cantitatea
maximă de aminoacizi într-o pată în jur de 0,03mg/. Placa cromatografică se introduce în
tancul de cromatografiere care conţine amestecul de developare, astfel încât capătul pe care
au fost puşi aminoacizii să ajungă în soluţie. Petele de aminoacizi nu trebuie să intre în
amestecul de developare. Se lasă un timp, până când frontul solventului ajunge la 2cm de la
marginea superioară a plăcii. Se scoate placa, se usucă în etuvă la 100°C şi se pulverizează
cu ninhidrină. Se introduce 10 minute în etuvă la 90°C, apoi se observă poziţia şi intensitatea
culorii petelor apărute şi se calculează Rf-ul.
Distanţa de la linia de start la pată
Rf = ——————————————————————
Distanţa de la linia de start până la frontul solventului
Acidul aminat Rf Culoarea ninhidrină
Alanină 0.38 Violetă
Arginină 0.20 Violetă
Cisteină 0.07 Brună
Cistină 0.08 Brună
Acid glutamic 0.30 Violetă
Glicină 0.26 Violetă
Histidină 0.20 Violetă-brun
Izoleucină 0.72 Violetă
Leucină 0.73 Violetă
Lizină 0.14 Violetă
Metionină 0.55 Violetă
Ornitină 0.15 Violetă
Fenilalanină 0.68 Violetă
Prolină 0.43 Galbenă
Serină 0.27 Violetă
Treonină 0.35 Violetă
Triptofan 0.50 Violetă-brun
Tirozină 0.45 Albastră
Valină 0.60 Violetă
48
http://www.reachdevices.com/TLC_aminoacids.html
http://www.youtube.com/watch?v=tDaKxskUwA0
49
8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen
Laptele de vacӑ contine în medie 3,4% proteine reprezentate de:
• cazeina (2,7%);
• lactalbumina (0,4%-0,5%);
• lactoglobulina (0,1-0,2%).
In structura proteinelor aminoacizii sunt legaţi între ei prin legături peptidice între
gruparea amino a unui aminoacid şi gruparea carboxilică a altui aminoacid. In lanţurile
polipeptidelor există şi grupări amino şi carboxilice libere. Pentru determinarea cantitativă
este necesară punerea în libertate a aminoacizilor din macromolecula protidică. In acest scop
soluţia este supusă hidrolizei alcaline.
Principiul metodei
Grupele aminice libere ale proteinelor (-NH2 ) reactioneaza cu formaldehida formând grupӑri
(N=CH2) caracteristice bazelor Schiff. În acest fel aciditatea datorata gruparilor carboxilice
(-COOH) se poate mӑsura prin titrare cu soluţie de hidroxid de sodiu si se poate corela cu
continutul de proteine prin înmultirea cu un factor empiric. Reactiile chimice sunt
urmӑtoarele:
Reactivi: - NaOH 0,143N. 1ml din această soluţie corespunde la 1% proteina
- aldehidă formică soluţie 40%, neutralizată faţă de fenolftaleina inainte de folosire
- oxalat de potasiu soluţie 28%, neutralizată faţă de fenolftaleina inainte de folosire
- sulfat de cobalt heptahidrat, soluţie 5%
- fenolftaleină soluţie alcoolică 2%
50
Mod de lucru:
Prepararea probei martor
– într-un vas Erlenmeyer de 100ml se introduc 25ml lapte, 1ml soluţie de oxalat de potasiu şi
0,5ml soluţie de sulfat de cobalt, după care se omogenizează. Se dezvoltă imediat o culoare
roză care este stabilă. Fenolftaleina s-a adăugat la neutralizarea celor două soluţii.
Determinarea titrului proteic: Intr-un vas Erlenmeyer asemănător cu al probei martor se
introduc 25ml lapte, 1ml soluţie de oxalat de potasiu şi eventual 2-3 picături de fenolftaleină.
Se omogenizează bine şi după 1 minut se neutralizează cu hidroxid de sodiu până la o
coloraţie identică cu a probei martor. Prin această operaţie s-au neutralizat toţi acizii liberi din
probă. Pentru ca determinarea să fie precisă este necesar ca la această neutralizare să nu se
întrebuinţeze un volum de hidroxid de sodiu 0,143N, mai mare de 1,75 ml. Laptele cu
aciditate proprie mai mare nu este apt pentru determinarea proteinelor prin această metodă.
In proba astfel neutralizată se adaugă 5ml aldehidă formică şi se omogenizează. Culoarea
roz dispare brusc şi laptele îşi reia culoarea albă specifică. După 1 minut se titrează din nou
cu soluţia de hidroxid de sodiu până la culoare identică cu a probei martor, notându-se
volumul de hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare.
In condiţiile în care s-a respectat întocmai metoda de lucru descrisă, volumul soluţiei de
hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare reprezintă conţinutul de proteine, în procente al
probei de lapte supusă analizei.
Rezultatul se exprimă ca media aritmetică a două determinări efectuate în aceleaşi condiţii.
Metoda are caracter orientativ.
Titrul proteic =V ,
unde V este volumul de solutie NaOH 0,143N (în ml) folosit la a doua titrare.
Rezultatul se exprima prin media a doua determinari efectuate pe aceeasi proba.
Calcul si observatii:
51
8.2. Determinarea conţinutului de cazeinӑ din lapte
Principiul metodei
Metoda are la bazӑ determinarea titrului proteic prin metoda Sorensen.Formaldehida adӑugatӑ
în lapte blocheazӑ grupӑrile amino, din proteine si determinӑ creşterea aciditӑţii libere.
Mӑsurarea nivelului aciditӑţii libere dupӑ blocarea grupӑrilor aminice stӑ la baza determinӑrii
proteinelor din lapte.
Mod de lucru
Intr-un balon Erlenmeyer de 100 ml se adaugӑ 10 ml lapte; 0,5 ml soluţie alcoolicӑ de
fenolftaleinӑ şi se titreazӑ cu NaOH 0,1 M pânӑ la culoarea roz. Adӑugӑm 2 ml formaldehidӑ
20% şi se titreazӑ din nou cu NaOH 0,1M pânӑ la apariţia coloraţiei roz care persist 30
secunde.
Conţinutul de casein se calculeazӑ cu ajutorul formulei urmӑtoare
Caseinӑ g% = V x 1,47
Unde, V = – volumul NaOH folosit la a doua titrare
1,47 – factor de conversie pentru cseiӑ
Conţinut mediu de cazeinӑ în diferite tipuri de lapte:
vacӑ - 2,60%,
caprӑ - 2,90%,
oaie - 4,50%,
52
9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului
Principiul metodei
Sulfatul de cupru în mediu bazic reacţioneazӑ cu substanţele care conţin 2 sau mai
multe legӑturi peptidice formând un complex colorat în albastru- violet. Intensitatea culorii
este direct proporţionalӑ cu numӑrul legӑturilor peptidice din proteinӑ. Numele metodei
provine de la compusul biuret H2N-CO-NH-CO-NH2 care dӑ reacţie pozitivӑ tipicӑ. Metoda
este folositӑ pentru determinarea unor cantitӑţi relativ mari de proteinӑ (1-20 mg).
Reactivi
- Soluţie standard de albuminӑ sericӑ bovinӑ 5mg/ml preparatӑ extemporaneu
- Reactiv biuret (3g CuSO4 x 5 H2) si 9 g tartrat de sodiu si potasiu in 500 ml solutie NaOH
0,2M, se adaugӑ 5g KI şi se aduce la 1 l cu NaOH 0,2 M.
- extract proteic total obţinut prin centrifugarea unui omogenat (1g tesut hepatic /10 ml apӑ
distilatӑ)
Mod de lucru
In 6 eprubete se pipeteazӑ:
Nr.
crt
ml solutie
standard
ml apa
distilatӑ
Proteinӑ
mg/2ml
Absorbanta
DO
1 0 2,0 0
2 0,1 1,9 ,5
3 0,5 1,5 2,5
4 1,0 1,0 5
5 1,5 0,5 7,5
6 2,0 0 10
In fiecare eprubeta adӑugӑm 3 ml de reactiv biuret. Probele se agitӑ energic, se
incubeazӑ timp de 10 minute la 37 °C si dupӑ rӑcire se colorimetreazӑ la 540 nm faţӑ de apӑ.
Se construieşte o curbӑ de etalonare trasând pe abscisӑ mg/2ml proteinӑ- iar pe ordonatӑ DO
la 540nm. Se determinӑ concentraţia proteicӑ în extractul proteic total, incubând 2ml preparat
cu 3ml reactiv biuret la 37°C timp de 10 minute. Dupӑ rӑcire, proba se colorimetreazӑ la 540
nm faţӑ de apӑ – iar DO mӑsuratӑ este transformatӑ in concentratie proteicӑ mg/2ml cu
ajutorul curbei de etalonare. Dacӑ intensitatea culorii este prea puternicӑ se dilueazӑ
preparatul proteic pânӑ când DO se încadreazӑ în curba de etalonare. Valorile obţinute trebuie
multiplicate prin factorul de diluţie.
53
Calcule şi observaţii
54
9.2.Determinarea proteinelor – metoda Kjeldhal –principiul metodei
Componenta de bază, cu valoare nutritivă, din majoritatea produselor alimentare de
origine animalădar si vegetalӑ este proteina. Calitatea acestor produse se apreciază, în primul
rând, după conţinutul lor în proteine.
Proteinele dintr-un anumit tipde aliment au un conţinut de azot cu valoare relativ
constantă, la 100g proteine. Cunoscând conţinutul de azot se poate calcula cantitatea de
proteine cu ajutorul unui factor de convertire
Exemplu pentru carne -Continutul de azot este 16 g la 100 g protein. Factorul de
convertire este 6,25 (rezultat din raportul 100/16).
Principiul metodei
Proba de analizat se mineralizează prin încălzire cu acid sulfuric concentrat în
prezenţa unui catalizator. în urma degradării proteinelor şi a celorlalţi compuşi cu azot, se pun
în libertate ionii de amoniu care se combină cu acidul sulfuric formând bisulfatul de amoniu.
Amoniacul pus în libertate prin alcalinizare puternică este distilat şi titrat.
TEST
1. Care sunt metodele de obţinere a extractelor proteice ?
2. Care este rolul proteinelor în organism ?
3. De câte feluri pot fi reacţiile de precipitare ?
4. Ce este punctul izoelectric ?
5. Care sunt cele trei etape ale metodei Kjeldahl ?
55
Laborator 10. Enzime
Enzimele sunt substanţe de naturӑ proteicӑ, fiind constituite fie numai din resturi de
aminoacizi, legaţi prin legături peptidice, fie din catene polipeptidice şi alte componente
organice sau anorganice. Acestea prezintă structuri spaţiale complicate.
Enzimele, numite şi biocatalizatori, accelerează viteza reacţiilor biochimice de 108 –
1011
ori prezentând o capacitate catalitică superioară catalizatorilor chimici.Reacţiile care în
laboratoarele de chimie decurg în condiţii speciale de temperatură, presiune, pH, în prezenţa
enzimelor decurg în condiţii moderate.
Activitatea catalizatorilor, indiferent de natura lor chimică, se caracterizează prin
faptul că poate fi decelată când aceştia se găsesc în cantităţi foarte mici. La sfârşitul reacţiei
atât catalizatorul chimic cât şi enzima se regăsesc, într-o stare neschimbată, putând participa
la un nou atac catalitic.
Enzimele au un grad deosebit de complexitate, motiv pentru care sunt uşor
denaturabile prin modificarea temperaturii, pH-ului, prin acţiunea razelor UV, a
ultrasunetelor, prin congelări şi decongelări repetate etc.
Deosebirea esenţială dintre enzime şi catalizatorii chimici constă în înalta specificitate
de acţiune a enzimelor, având capacitatea de a cataliza un singur tip de reacţie biochimică,
uneori a unei singure substanţe chimice (specificitate absolută de substrat).
Determinarea activităţii enzimatice
Prezenţa unei enzime într-un amestec de reacţie poate fi pusă în evidenţă şi urmărită
fie prin dispariţia substratului, fie prin apariţia unui produs de reacţie. Enzima este incubată
cu substratul, în condiţii de concentraţii, pH şi temperatură strict controlate şi din amestecul
de reacţie se scot la anumite intervale de timp probe, care sunt analizate.
Fiecare probă este însoţită de un martor, în scopul depistării reacţiilor chimice
nespecifice şi spontane care au loc independent de enzimă.
Dacă urmărim variaţia în timp a vitezei enzimatice vom constata că la început acest
parametru creşte linear, după care scade. Abaterea de la linearitate a vitezei de reacţie în
funcţie de timp poate fi datorată fie inversării sensului reacţiei (echilibrul este atins şi reacţia
inversă devine mai importantă), fie scăderii în timp a concentraţiei substratului când enzima
nu mai este saturată în acesta, fie inhibiţiei printr-un produs al reacţiei. Pentru a minimaliza
aceste efecte, în cercetările enzimologice se determină viteza iniţială de reacţie vo cand v
creşte linear în timp.
56
Activitatea enzimatică este frecvent exprimată în unităţi (U), astfel că o unitate reprezintă
cantitatea de enzimă ce catalizeză transformarea a 1 micromol de substrat într-un minut, în
condiţii definite. Unitatea internaţională sistematică a activităţii enzimatice este katal-ul (kat)
care reprezintă transformarea unui mol de substrat pe secundă .
Puritatea unei enzime se exprimă prin activitatea specifică, care este numărul de unităţi
enzimatice (U) pe mg proteină sau numărul de catali pe kg proteină.
10.1. Evidenţierea unor enzime
10.1.1.Evidenţierea peroxidazei din hrean
Peroxidaza catalizează oxidările cu oxigen peroxidic, deci activează şi următoarea reacţie
în care donorul de electroni este pirogalolul.
Trecerea culorii în portocaliu-brun indică apariţia configuraţiei chinonice în purpurogalină.
Reactivi necesari : - peroxidază (extract apos de hrean)
- pirogalol 2%
- apă oxigenată 0,5%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml extract apos de hrean, la care se adaugă 0,5ml
pirogalol şi două picături de apă oxigenată. Imediat apare o culoare portocalie –brună.
10.1.2. Evidenţierea activităţii peroxidazei din lapte
Peroxidaza existentă în laptele care nu a fost supus unui tratament termic descompune apa
oxigenată cu eliberare de oxigen. Evidenţierea acestui fenomen se poate face prin reacţii de
culoare specifice ale oxigenului cu unele substanţe uşor oxidabile, cum ar fi ; parafenilen
diamina, tinctura de guaiac sau benzidina.
Evidenţierea activităţii peroxidazei este utilă pentru identificarea laptelui nepasteurizat.
Reactivi necesari : - apă oxigenată 3%
- parafenilendiamină
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 5ml lapte, 5 picături apă oxigenată şi cca. 1g
amestec de parafenilendiamină cu nisip, după care se omogenizează, se lasă în repaos 2
minute, apoi se citeşte reacţia.
In cazul prezenţei peroxidazei (lapte nepasteurizat) lichidul din eprubetă capătă culoare
albastră cenuşie
In cazul absenţei peroxidazei (lapte corect pasteurizat) lichidul nu-şi modifică culoarea sau
capătă o tentă cenuşie slab perceptibilă.
57
10.2. Influenţa factorilor fizico-chimici asupra activităţii enzimelor
10.2.1.Influenţa temperaturii asupra activităţii enzimelor
Acţiunea temperaturii asupra reacţiilor enzimatice este dublă:
- modifică viteza reacţiei enzimatice
- denaturează enzima, respectiv apoenzima care este de natură proteică
Majoritatea enzimelor au o temperatură optimă, între 20-40°C. La temperaturi sub 0°C,
activitatea enzimelor scade foarte mult, fără să fie distruse. Sub formă uscată, enzimele îşi
păstrează activitatea şi unele pot rezista scurt timp la o temperatură de 100°C. Se preferă ca
temperatură de lucru +37°C, deoarece distrugerea enzimei este practic nulă, iar viteza reacţiei
este suficient de mare.
Reactivi necesari : - salivă diluată
- soluţie de amidon 1% în clorură de sodiu 0,3%
- reactiv Fehling
Mod de lucru: In două eprubete se măsoară câte 4ml soluţie amidon 1% în clorură de sodiu
0,3%. Intr-o eprubetă se adaugă 1ml salivă proaspătă, nefiartă, iar în a doua 1ml salivă fiartă.
Se agită şi se introduc în termostat la + 37°C timp de 15 minute. Se adaugă în fiecare
eprubetă 1ml reactiv Fehling şi se fierbe pe baie de apă 5 minute. In eprubeta cu salivă
nefiartă, reactivul Fehling este redus la suboxid de cupru de culoare roşie cărămizie. In
eprubeta cu salivă fiartă, unde amilaza este distrusă prin fierbere, amidonul; nefiind
hidrolizat, reactivul Fehling nu este redus, deci culoarea nu se schimbă.
58
10.2.2. Influenţa pH-ului asupra activităţii enzimatice.
Fiecare enzimă dezvoltă o activitate maximă la o anumită valoare a pH-ului= pH optim.
Extractul enzimatic s-a obţinut din cartofi 10 g cartofi se mojarează cu 5 g carbonat de
calciu. Amestecul se trece cantitativ in cilindru de 100 ml si după o oră se filtrează prin vată.
Modul de lucru
Reactiv Balon 1 Balon 2 Balon 3 Balon 4
Extract enzimatic 5 ml 5 ml 5 ml -
HCl 1 N (pH=2) 2 ml - - -
NaOH 1 N (pH=14) - - 2 ml -
Apă distilată (pH=7) - 2 ml - 5 ml
Se agită
H2O2 1% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Se lasă în repaos 15 minute
H2SO4 15% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
KI 10% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Molibdat de amoniu 1% 2-3 picături. Agitare energică 2-3 minute
Probele se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N în prezenţa amidonului ca indicator până
la decolorare.
Calcul
Datele experimentale exprimate în ml tiosulfat de sodiu se scad din ml tiosulfat folosit
la titrarea probei martor. VM – VP
Folosind aceste date si pH-ul la care a acţionat enzima se trasează curba care indică
influenţa pH-ului asupra activităţii enzimei.
Calcule şi observaţii laborator 10.
59
TEST
1. Ce sunt enzimele şi ce rol au în organism ?
2. Care este diferenţa între cataliza enzimatică şi cea chimică ?
3. Care sunt factorii care influenţează activitatea enzimatică ?
4. Care este enzima care catalizează hidroliza amidonului ?
5. Ce importanţă prezintă determinarea activităţii peroxidazei în industria alimentară
6. Care este enzima determinată din mierea de albine, ce constituie un criteriu de
autenticitate al mierii de albine ? Descrieţi principiul metodei de lucru folosite.
60
Laborator 11-12. Vitamine
Celulele conţin pe lângă componentele lor de bază, anumite substanţe organice, active la
concentraţii foarte mici, numite vitamine, care sunt vitale pentru organism. Unele organisme
nu pot sintetiza vitamine şi trebuie să le obţină din surse exogene.
Lipsa vitaminelor din organism (avitaminoză), insuficienţa (hipovitaminoză) sau
concentraţia crescută (hipervitaminoză) dau naştere la tulburări metabolice mai mult sau mai
puţin grave.
Vitaminele au structură chimică heterogenă şi din această cauză clasificarea lor este foarte
dificilă.Cel mai des folosit criteriu este în funcţie de solubilitate şi după acest criteriu există
vitamine liposolubile (A, D, E, K) şi vitamine hidrosolubile (vitaminele B, C, PP).
Fiecare vitamină prezintă reacţii caracteristice majoritatea lor fiind reacţii de culoare.
11.1. Metode de identificare ale vitaminelor
Identificarea vitaminei A
a. Vitamina A dă cu acidul tricloracetic o coloraţie galbenă care virează în albastru.
Reactivi necesari: - soluţie uleioasă de vitamina A 0,1mg%
- soluţie cloroformică de acid tricloracetic 30%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluţie uleioasă de vitamina A şi 1ml soluţie
acid tricloracetic 30%. Apare o coloraţie galbenă care virează în albastru.
b. Vitamina A tratată cu fenol în prezenţa guaiacolului dau o coloraţie roşie purpurie.
Reactivi necesari : - soluţie uleioasă de vitamină A 0,1mg%
- guaiacol cristale
- fenol p.a.
- acid clorhidric concentrat
- cloroform
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluţie vitamină A la care se adaugă un
cristal de guaiacol, 2 picături fenol, 1ml acid clorhidric concentrat şi 5ml cloroform. După
agitare apare o coloratie roşie-purpurie.
c. Reacţia dintre vitamina A şi clorura de stibiu în soluţie cloroformică, cu formarea unei
coloraţii albastre, poartă denumirea de reacţia Carr-Price. Reacţia poate fi folosită şi pentru
dozarea vitaminei A.
61
Reactivi necesari : - concentrate de vitamina A
- cloroform purificat
- soluţie cloroformică de clorură de stibiu
Mod de lucru : la 4-5 picături de soluţie de vitamina A se adaugă 1ml cloroform şi 1-2 ml
soluţie cloroformică de clorură de stibiu. Se agită conţinutul eprubetei. Apare o coloraţie
albastră proporţională cu conţinutul de vitamina A.
In cazul determinărilor cantitative se compară culoarea obţinută cu o scară etalon sau
colorimetric.
Identificarea vitaminei D
a. Reacţia cu aldehide: Vitaminele D reacţionează cu aldehidele aromatice (vanilină,
furfural), în prezenţa acidului percloric, cu formarea de produşi coloraţi.
Reactivi necesari : - soluţie benzenică de vitamina D
- soluţie 0,1% de aldehidă aromatică în benzen
- acid acetic glacial
- amestec de acid percloric ; 2ml aldehidă acetică se tratează
2,5ml acid acetic glacial şi se încălzeşte la 95-100°C, timp
de 30 minute .
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml soluţie benzenică de vitamina D şi 1ml de aldehidă
aromatică în benzen şi se încălzesc la fierbere. Se adaugă apoi două picături de reactiv
percloric şi se fierb încă un minut, apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Soluţia
devine tulbure, colorată în verde. Se adaugă 1,5ml acid acetic şi se urmăreşte culoarea
formată.
a. Reacţia cu clorura de stibiu : soluţia benzenică de vitamina D se tratează cu cloroform
în raport de 1:10 şi apoi cu o soluţie cloroformică de clorură de stibiu.şi se obţine o coloraţie
galben-portocalie.
b. Reactia cu anilină
Reactivi necesari: - untură de peşte
- amestec anilină : HCl, în raport 15:1
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se introduc 3ml untură de peşte sau soluţie uleioasă de
vitamina D, şi 1ml amestec de anilină :HCl. Se agită uşor si se încălzeşte la fierbere. Emulsia
galbenă devine la început verde şters apoi trece în roşu. După 2-3 minute emulsia se separă în
două straturi dintre care cel inferior are o culoare roşie intensă.
62
Identificarea vitaminei E
a. Reacţia cu acidul azotic
α- tocoferolul se oxidează în prezenţa clorurii ferice sau a acidului azotic la α-
tocoferilchinonă, de culoare roşie
Reactivi necesari : - soluţie uleioasă de vitamina E
- etanol
- acid azotic concentrat
Mod de lucru : Se iau într-o eprubetă câteva picături dintr-o soluţie uleioasă de vitamina E,
se tratează cu câteva picături de acid azotic concentrat. Conţinutul se încălzeşte de la sine şi
apare o coloraţie brună roşie (se lucrează cu atenţie şi la nevoie se răceşte).
c.Reacţia cu clorura ferică
Datorită grupării hidroxil tocoferolii dau reacţie pozitivă cu clorura ferică. Reacţia este
specifică fenolilor, care sunt oxidaţi la compuşi chinonici.
Reactivi necesari : - soluţie alcoolică de vitamină E 0,1mg %
- soluţie clorură ferică 10%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 0,5ml solutie alcoolică de vitamină E şi 2-3
picături soluţie clorură ferică 10%. După agitare apare o coloratie galben-roşiatică
Identificarea vitaminelor B
a.Vitamina B1: In mediu alcalin este oxidată de fericianura de potasiu la tiocrom de culoare
roşie, care prezintă o fluorescenţă albastră în UV.
Reactivi necesari : - soluţie vitamina B1 1g ‰
- solutie de fericianură de potasiu 2%
- metanol
- NaOH 30%
- izobutanol
- etanol 96°
Mod de lucru: Intr-o pâlnie de separare se pipetează 1ml din soluţia de vitamină, 4 picături
metanol şi 1-2 picături de fericianură de potasiu 2%. Se agită şi se adaugă 1ml sol. NaOH
30%. Se lasă în repaus 2 minute şi se introduc 10ml izobutanol, după care se agită energic. Se
lasă în repaus câteva minute, după care timp se separă cele două straturi. Stratul inferior apos
se îndepărtează şi se reţine stratul cu izobutanol care conţine tiocromul. Se spală cu 3ml apă
distilată. Se separă apa, iar stratul de izobutanol se tranvazează într-o eprubetă şi se adaugă
63
2ml etanol. Eprubeta se aşează în faţa unei surse de lumină UV, când se observă apariţia unei
fluorescente albastre.
b. Vitamina B2: prezintă fluorescenţă galben-verzuie şi sub acţiunea reducătorilor trece în
leucoderivat, care nu mai prezintă fluorescenţă. Reacţia este reversibilă şi îşi recapătă
fluorescenta în prezenţa oxigenului.
Reactivi necesari : - soluţie vitamina B2 50mg %
- zinc metalic granule
- soluţie acid clorhidric 10%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 1ml soluţie vitamină B2, care prezintă o
fluorescenţă galben-verzuie. Se adaugă 20-30 mg zinc metalic şi 2ml acid clorhidric 10%. Se
agită de câteva ori şi se observă dispariţia fluorescenţei. Se astupă eprubeta cu degetul şi se
agită. Se observă apariţia fluorescenţei, datorită oxidării vitaminei sub acţiunea oxigenului
atmosferic.
Identificarea Vitaminei C
a. Vitamina C datorită proprietăţii de a se oxida uşor, reduce sărurile de argint la argint
metalic.
Reactivi necesari : - soluţie vitamină C 3g%
- soluţie azotat de argint 5g%
- soluţie hidroxid de amoniu 20%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 1ml azotat de argint şi se adaugă hidroxid de
amoniu picătură cu picătură până la dizolvarea precipitatului format iniţial. Se adaugă 2ml
soluţie de vitamină C şi se încălzeşte pe baie de apă 5-10 minute. Va apărea argintul metalic
depus pe pereţii eprubetei.
b. Vitamina C se extrage din ţesuturi cu soluţii slab acide pentru a fi evitată alterarea ei, apoi
se identifică cu ajutorul fericianurii de potasiu. In prezenţa clorurii ferice, vitamina C, reduce
fericianura de potasiu, formând albastrul de Berlin.
Reactivi necesari : - soluţie de HCl 2%
- fericianură de potasiu 1%
- clorură ferică soluţie 1%
Mod de lucru: Se cântăresc 4-5g din materialul vegetal şi se introduc într-un mojar unde se
mojarează cu nisip şi HCl 2%. Se aduce apoi volumul la 100ml cu acid clorhidric şi se
filtrează. Din acest lichid se introduc 5ml într-o eprubetă şi se tratează cu o picătură de sol.
fericianură de potasiu şi o picătură de sol. de clorură ferică. Rezultă o coloraţie albastră.
64
11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale
Se bazează pe proprietatea reducătoare a acidului ascorbic. Acidul ascorbic prin
oxidare se transformă în acid dehidroascorbic. Dozările se fac prin volumetrie iar solutia de
titrare este - iodat de potasiu,
Extracţia din produse vegetale
15 g produs vegetal se mojarează timp de 10 minute cu 2,5 g de nisip si 10 ml de acid
metafosforic. Se complectează la 50 ml cu acid metafosforic, se filtrează sau se
centrifughează. Din filtrat se iau 10 ml si se dozează vitamina C la fel ca din suc.
Dozarea vitamine C
Reactivi: - soluţie standard vitamina C 1 mg/ml
- amidon 1%
- HCl 1M
- Iodat de K 0,004N (1,2g KI + 0,478g I2, se aduce la 1000 ml cu apă distilată).
- acid metafosforic 5%
10 ml de soluţie standard de vitamina C se amestecă cu 20 ml apă distilată, 2 picături
de HCl 1 M şi 15 picături de amidon 1%, se titrează cu iodat de K până la culoarea albastră
care persistă 15 secunde. Se notează cu V volumul de iodat folosit la titrare.
Se repetă aceleaşi operaţii pentru suc sau pentru supernatant, în loc de 10 ml soluţie
standard se vor folosi 10 ml suc sau filtrat.
Se notează cu V1 volumul de iodat folosit la titrare.
Calcul
Pentru suc
10 x V1
vitamina C mg /10 ml suc = -------------
V
Pentru vegetale
10 x V1 x 5
vitamina C mg /100 g produs = ----------------- x 100
V x m
V = vol. de iodat folosit la titrarea soluţiei standard
V1 = vol. de iodat folosit la titrarea probei
5 = dilutia
10 = ml solutie standard luata in lucru
m = masa probei (15g)
100 = raportarea la 100 g produs
65
Calcul si observatii
66
11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans
In mediu acid vitamina C este oxidată la acid dehidroascorbic de către reactivul Tillmans
(2,6-diclorfenolindofenol) de culoare roşie, care se reduce consecutiv transformându-se în
leucoderivatul corespunzător incolor.
Reactivi necesari : - soluţie Tillmans-10mg 2,6-diclorfenolindofenol în 100ml apă distilată –
se păstrează câteva zile la frigider.
- soluţie de acid metafosforic 5%în apă distilată
- acid acetic glacial
- carbonat de calciu pulbere
- soluţie de acetat de plumb 5%
- material de analizat
Mod de lucru :
Stabilirea titrului în acid ascorbic al soluţiei de reactiv Tillmans
Se pipetează într-un balon Erlenmeyer 10 ml soluţie de vitamina C şi se titrează din biureta
cu soluţie Tillmans cu picătura, până în momentul în care culoarea virează în roz şi persistă
30 secunde.
T= 0,088 · 10 / V
în care:
0,088 = cantitatea de acid ascorbic, în mg existentă în 1ml
10 = volumul soluţie de acid ascorbic luat în lucru
V= volumul soluţiei de indicator folosit la titrare
Intr-un flacon Erlenmeyer se pun 20ml lapte, peste care se adaugă sub agitare, 8ml soluţie
de acid metafosforic . Se omogenizează şi apoi se filtrează. Inr-un alt flacon Erlenmeyer se
pipetează 14ml filtrat (echivalentul a 10ml de lapte) şi se titrează cu reactiv Tillmans, până la
apariţia culorii roz persistente 30 de secunde.
67
Calcul : Conţinutul în vitamină C, exprimat în mg la 100ml lapte, se calculează cu ajutorul
formulei:
Vitamină C, mg la 100ml = V·T·100 / V1
în care:
V = volumul soluţiei de indicator, în ml, folosit la titrare
T = titrul soluţiei de indicator
V1= volumul de lapte corespunzător celor 14ml filtrat luat în lucru (10ml)
Conţinutul vitaminei C din lapte este cuprins între 10 şi 80 mg/l cu variaţii în funcţie de
specie , tipul de alimentaţie şi sezon, fiind mai ridicat vara când animalele se hrănesc cu iarbă
şi cu diferite nutreţuri verzi.
Calcule şi observaţii laborator 12
68
TEST
1. Ce este acidul ascorbic, ce rol are în organism ? Dati exemple de surse naturale de acid
ascorbic.
2. Mentionaţi pentru fiecare vitamină din grupul B, numele şi rolul în organism
3. Ce rol are vitamina A în organism, şi care sunt produsele alimentare bogate în vitamina
A? Ce sunt provitaminele A?
4. Indicaţi o metodă de identificare a vitaminei A care poate fi utilizată si pentru
determinarea cantitativă a vitaminei A.
5. Care sunt factorii care influenţează stabilitatea vitaminelor ? Daţi exemplu pentru
vitamina A, B1 şi C.
69
Laborator 13.Pigmenţi
Culoarea diferitelor organe ale plantelor se datoreazӑ unor substanţe colorate, numite
pigmenţi.
Pigmenţii naturali au rol biochimic şi fiziologic foarte important. Iau parte la
numeroase procese metabolice, formează sisteme de oxidoreducere, dau gustul, aroma şi
coloritul unor produse alimentare. Pigmenţii clorofilieni au rol esenţial în procesul de
fotosinteză
Sub aspect chimic, pigmenţii naturali sunt substanţe foarte heterogene. Ei se găsesc
în celule şi ţesuturi în stare liberă sau sub formă de cromoproteide, glicozide etc.In general se
găsesc în cantităţi mici şi se determină prin metode cromatografice, colorimetrice şi
spectrofotometrice.
13.1.Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subţire
Amestecul de pigmenţi este extras cu un solvent potrivit si se separӑ prin
cromatografie in strat subtire pe placi acoperitecu silicagel-material adsorbant, fiecare
pigment situându-se într-o anumită zonă, de-a lungul plӑcii.
Reactivi necesari :
- acetonă
- hexan
- sulfat de sodiu anhidru
- mojar cu pistil
- nisip sau sticlӑ pisatӑ
- tuburi capilare
- hârtie de filtru
Obţinerea extractului: pentru prepararea extractului de pigmenţi se mojarează 2g frunze de
spanac cu puţin nisip şi 3 ml acetonă.Se decanteazӑ soluţia si se trece pe o pâlnie cu vatӑ, se
stoarce vata pentru a recupera extractul. Porţiunile de extract se reunesc într-un tub cu capac.
Reziduul din mojar se reia cu 3 ml de acetonӑ, se repetӑ operaţia anterioarӑ. La final se
adaugӑ 3ml de acetonӑ şi 5ml de hexan în mojar şi se mojareazӑ pânӑ reziduul se decoloreazӑ.
Soluţia obţinutӑ se trece intr-o eprubeta cu dop.
Se adaugӑ 3 ml de saramurӑ se agita si se lasӑ sӑ se separe. Startul de sus va fi verde inchis
iar cel de jos verde deschis.
Extractul spălat se usucă adăugând sulfat de sodiu anhidru până la limpezirea soluţiei.
70
Cromatografie -Mod de lucru:
Soluţia cu amestecul se aplică în picături la baza plăcii, cu ajutorul unei micropipete. Se usucă
picăturile prin suflare şi se introduce placa în amestecul de eluare cu capătul cu picături în jos
astfel ca picăturile să nu ajungă în eluent.
Linia de start trebuie sӑ fie la 1,5-2 cm.
Developarea durează aproximativ 30 de minute.Identificarea componentelor se face prin
compararea poziţiei lor cu cea a componentelor din soluţii etalon sau prin stabilirea valorilor
Rf.
La terminarea separării, pe placă ordinea pigmenţilor de sus în jos va fi :
- β caroten
- diceto-carotenoide
- cetohidroxi-carotenoide
- hidroxi-carotenoide
Spoturile obţinute se pot determina şi cantitativ folosind metode colorimetrice.
http://www.uni-
regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC-e.htm
Calcule şi observaţii laborator 13.1.
71
13.2. Determinarea spectrofotometricӑ a conţinutului de clorofilӑ
Mod de lucru
- Se cântӑresc 100 mg frunzӑ /probӑ.
- Se mojareazӑ cu 10 ml acetonӑ 80% cu ajutorul nisipului sau a sticlei pisate
- Se filtreazӑ si filtratul se colecteazӑ intr- eprubetӑ.
Determinarea concentratiei de clorofilӑ.
Blanckul folosit este acetona. Se umple cuva spectrofotometrului cu extractul obtinut
si se citesc absorbantele la urmӑtoarele lungimi de undӑ: 663 nm; 645 nm; 470 nm.
Calcule:
Folosind ecuaţia Arnon se calculeazӑ continutul de clorofila
Chl a (mg/g) = [(12.7 × A663) - (2.6 × A645)] × ml acetona / mg frunze
Chl b (mg/g) = [(22.9 × A645) - (4.68 × A663)] × ml acetona / mg frunze
Total Chl = Chl a + Chl b.
C x+c = 1000 A470 – 1.90Chla – 63.14 Chlb/214, (x = xantofila si caroten)
72
TEST
1. Care este rolul pigmenţilor naturali?
2. Care este rolul clorofilei în organismele vegetale ?
3. Indicaţi metodele cel mai des utilizate pentru identificarea si dozarea pigmenţilor.
73
Laborator 14. Evaluare laborator.
Determinarea unor parametrii, efectuarea unor calcule
74
BIBLIOGRAFIE
1. Dumitru IF., - Biochimie - Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti 1980.
2. Dumitru IF., D.Iordăchescu – Introducere în enzimologie- Ed. Medicală, Bucureşti ,
1981.
3. Iordăchescu D., I.F.Dumitru-Biochimie practică – Tipografia Universităţi, Bucureşti,
1980.
4. Neamţu G.,- Biochimie alimentară- Ed.Ceres, Bucureşti, 1997
5. Neamţu G.,- Lucrări Practice de biochimie alimentară- Tipo Agronomia, Cluj-Napoca,
1997
6. Popescu N., Meica S., - Noţiuni şi elemente practice de chimie analitică sanitar
veterinară, Ed.Diacon Coresi, Bucureşti, 1993.
7. Purcărea C.,- Biochimie alimentară practică, Ed.Univ.Oradea,2003.
8. Purcărea C.,– Biochimie agroalimentară. Edit.Univ. Oradea, 2005.
9. Socaciu C.,- Chimie alimentelor- Ed.Academic.Press, Cluj-Napoca, 2003.
10. Socaciu C., O.Bobiş - Caiet de lucrări practice, Chimia alimentelor, Ed. Academic
Press, Cluj-Napoca, 2003.
75