LABORATOR 6

4.3. Examinarea microorganismelor pe preparate fixe (frotiuri)

Frotiul este un preparat microscopic constituit dintr-un strat subire i uniform de celule, care este supus unor tratamente speciale de fixare i colorare, n vederea examinrii.

Examinarea frotiurilor permite studierea morfologiei germenilor, evidenierea unor structuri intra i extraparietale. Pot fi executate din culturi microbiene dezvoltate pe mediu solid cu ajutorul ansei, sau din cultur lichid cu pipeta Pasteur.

Avantajele metodei:

se pot observa anumite particulariti morfologice specifice i vizibilitatea la microscop este mult sporit se elimin riscul contaminrii, deoarece microorganismele sunt omorte prin utilizarea coloranilor preparatele se pot pstra mult timp fr a se altera forma i structura microorganismelor e mai clar i mai stabilDezavantajele metodei:

nu permite studierea mobilitii germenilor din preparat necesit mai mult experien i dexteritate pot surveni modificri n structura microorganismelor n timpul uscrii i fixriiMateriale necesare:

culturi microbiene crescute n mediu lichid sau solid ap fiziologic steril ans sau pipet Pasteur lame curate i degresate cristalizoare stative de colorare bec de gazMod de lucru:

a) Flambarea. nainte de efectuarea frotiului, lamele se flambeaz pe faa pe care se va efectua frotiulb) Etalarea. ntr-o pictur de ap fiziologic steril luat n bucla ansei i pus pe lam se omogenizeaz o cantitate mic de cultur recoltat n bucla ansei. Etalarea se face cu ajutorul ansei prin micri circulare concentrice. Frotiul trebuie s fie subire i uniform pentru a mpiedica suprapunerea germenilor. Suprafaa de etalare se mrete, frotiul nu trebuie s depeasc marginile lamei.c) Uscarea. Se face la temperatura camerei (nu se recomand agitarea n aer) d) Fixarea are mai multe scopuri:

realizarea unei adeziuni a celulelor bacteriene de suprafaa lamelor, pentru a nu fi splate de diferite soluii folosite pentru colorare

evitarea infeciilor accidentale de laborator, cu microorganisme patogene, prin omorrea acestora

asigur o colorare mai eficient i posibilitatea evidenierii unor detalii structurale att datorit permeabilizrii peretelui celular pentru diferii colorani, ct i fixrii structurilor extra- i intracelulare

Pentru efectuarea frotiului din mediu lichid se procedeaz la fel, dar se folosete pipeta Pasteur. Fixarea frotiului se face doar dup uscarea acestuia. Fixarea se realizeaz: cu cldur se trece lama cu faa opus frotiului prin flacra becului de gaz de cteva ori; se controleaz temperatura trecnd-o pe dosul palmei stngi.

cu ageni chimici (metanol, etanol sau alcool-eter) - se acoper frotiul cu cteva picturi din aceste lichide i se las pn la evaporarea total a acestora. (fig.4.2.)

Fig. 4.2. Prepararea i fixarea unui frotiu:

A- din mediu lichid; B- din mediu solid.

e) Colorarea. Coloranii sunt substane organice colorate, capabile s interacioneze cu diverse substraturi, crora le cedeaz culoarea, punndu-le n eviden. Coloranii utilizai sunt substane organice din grupul anilinei, extrai din gudroanele de huil sau substane chimice de tipul srurilor cu caracter bazic sau acid: fucsina bazic, violet de genian, albastru de metilen, fucsina acid, eozina. tehnici de colorare: metode simple de colorare - presupun colorarea preparatului cu un singur colorant (albastrul de metilen i fucsina bazic -colorant Ziehl)

metode complexe de colorare: presupun colorarea succesiv a preparatului, cu mai muli colorani (coloraia Gram i metoda Ziehl-Neelsen de colorare a bacteriilor acido-alcoolo-rezistente). Pe lng caracterele morfologice, acestea permit aprecierea afinitii tinctoriale, adic, capacitatea diferit a bacteriilor de a fixa i a reine anumii colorani, chiar n condiiile splrii cu diverse soluii decolorante.

pentru colorarea frotiului se procedeaz n felul urmtor: se aeaz frotiul pe suporturi metalice sau formate din dou baghete de sticl reunite la capete printr-un tub de cauciuc i aezate deasupra unui cristalizor folosit numai pentru coloraii

colorantul se pune direct pe frotiu, cu ajutorul unei pipete cu tetin de cauciuc sau cu o sticl picurtoare

uscarea frotiului dup colorare se face aeznd lamele cu frotiuri n stelaje de lemn speciale, n poziie vertical, n termostat, sau ntre dou buci de hrtie de filtru Coloraia GramPrincipiul coloraiei Gram - se utilizeaz aciunea a doi colorani: fucsin bazic i violetul de genian- difereniaz toate bacteriile n dou grupe: Gram pozitive i Gram negative, care se bazeaz pe diferenele structural biochimice i biologice, dar n special pe structura diferit a peretelui celular. Este o coloraie cu valoare taxonomic, descrierea ncepnd cu caracterul Gram..Tehnica de colorare (fig.4.3.): pe frotiul fixat la flacr se depune violet de geniana i se menine pe lam 2-3 minute (dup grosimea frotiului). n timpul acestei operaii, iodul formeaz cu violetul de genian un complex iodat cu greutate molecular mare care la unele bacterii este stabil, la altele este instabil se spal colorantul cu soluie iodo-iodurat (Lugol) iar apoi se acoper preparatul cu aceast soluie i se las 2-3 minute (pn ce devine aproape negru)

se vars soluia iodo-iodurat i se decoloreaz cu alcool-aceton, prin turnarea decolorantului de sus n jos pe lama nclinat, astfel frotiul s fie splat continuu (pn ce picturile ce se scurg nu mai sunt colorate)

se face o splare abundent cu ap pentru a opri aciunea decolorantului se recoloreaz frotiul cu soluia de fucsin bazic diluat 1/10, timp de 30 secunde -1 minut

preparatul se spal bine cu ap, se usuc i se examineaz la microscop cu obiectivul cu imersie

Fig. 4.3. Etapele metodei de colorare Gram1-prepararea frotiului; 2-fixarea frotiului; 3-coloraie primar cu violet de geniana; 4-splare cu ap de robinet; 5-aplicarea soluiei Lugol(mordant); 6-splare cu ap de robinet; 7-decolorare cu soluia alcool-aceton; 8-splare cu ap de robinet; 9-recolorare cu soluia de fucsin diluat; 10-splare cu ap de robinet; 11-uscareInterpretarea rezultatelor:

n urma colorrii, microorganismele aparinnd unor specii bacteriene apar colorate n albastru-violet, iar cele aparinnd altor specii bacteriene apar colorate n rou, ceea ce se explic prin faptul c unele specii bacteriene fixeaz violetul de genian, nefiind decolorate de soluia de alcool-aceton, iar alte specii bacteriene nu au capacitatea de a reine violetul de genian, sub aciunea decolorant a soluiei de alcool-aceton

capacitatea sau incapacitatea de a reine violetul de genian sub aciunea alcool-acetonei, depinde de compoziia chimic diferit a peretelui celular

bacteriile care se coloreaz n albastru-violet, se numesc Gram-pozitive, iar cele colorate n rou, Gram-negative bacterii Gram pozitive: bacilii sporulai - Bacillus subtilis, Bacillus aureus, specii ale genurilor Staphylococcus, Streptococcus, bacteriile lactice- Lactobacillus bacterii Gram negative: Escherichia coli, Proteus, Salmonella, gonococul Neisseria, se comport la fel toate celulele eucariote, cu excepia levurilor i a unor spori de mucegaiuri.f) Examinarea la microscop a frotiurilor se face cu obiectivul cu imersie. Pentru examinarea unui frotiu cu obiectivul de imersie se procedeaz astfel: se aeaz lama pe platina microscopului i se fixeaz, astfel nct locul unde a fost etalat materialul microbian s fie situat n dreptul lentilei frontale a obiectivului

se ridic condensatorul la maxim

se stabilete luminozitatea maxim a cmpului cu ajutorul unuia din obiectivele uscate

se pune o pictur de ulei de cedru pe frotiu

se coboar ncet tubul microscopului, folosind viza macrometric, pn cnd obiectivul de imersie se cufund n ulei i atinge suprafaa lamei. Coborrea tubului se face privind lateral, cu mult grij, ferindu-se de o izbire brutal a lentilei de suprafaa lamei.

se ridic tubul microscopului cu ajutorul vizei macrometrice, privind prin lentila ocular, foarte ncet, pn la apariia imaginii care se regleaz cu viza micrometric

pe tot parcursul observaiei microscopice, se regleaz claritatea imaginii cu viza micrometric

dup terminarea observaiei, se ridic tubul microscopului cu viza macrometric la o distan de 2-3 cm de lam, se scoate lama de pe platin i se sterge obiectivul de imersie cu pulpa degetului sau cu o crp moale, uor umectat cu xilol sau cloroform

pentru ndeprtarea uleiului de cedru de pe lam, aceasta fie se scufund ntr-un vas coninnd xilol, toluol sau benzol, fie se acoper frotiul cu hrtie de filtru mbibat cu una din aceste substane i se terge suprafaa lamei executnd o micare de translaie

ca medii de imersie pot fi folosite diverse lichide al cror indice de refracie este ct mai apropiat de cel al sticlei (n-1,5); -uleiul de cedru (n-1,515), -benzoatul de metil (n-1517), -parafina lichid (n-1,47), -uleiul de ricin, -glicerina