1 Lp 12 Hemostaza

Hemostaza secundara coagularea

Scopul hemostazei secundare este producerea cheagului de fibrina pentru a inchide o leziune vasculara. Procesul este initiat cand celulele purtatoare de Factor Tisular tromboplastina tisulara - F III (TFBC miocite, fibroblasti - cel adventicei, cel gliale, cel stromale, cel epidermale; tesuturi bogate in TF creier, plaman, uter, placenta) sunt expuse sangelui, secundar unei leziuni vasculare. TF este receptor si activator pt. F VII plasmatic care se activeaza la F VIIa (e implicat si F Xa + autoclivare). Complexul TF/FVIIa (tenaza caii extrinseci) este localizat la nivelul TFBC si: activeaza F X si F IX. F Xa format la niv. TFBC interactioneaza cu cofactorul sau = FVa (activat in prealabil de F Xa) pentru a forma complexul protrombinazic suficient pentru a genera mici cantitati de trombina (F IIa) in apropierea TFBC. Cantitatile scazute de trombina generate pe cel purtatoare de TF realizeaza: activarea plachetara, activeaza F V, F VIII, F XI. Activitatea F Xa format complexul TF/F VIIa este limitata la niv. TFBC iar F Xa care difuzeaza pe pe suprafata celulara este rapid inactivat de TFPI si AntiTrombina (AT). Spre deosebire de F Xa, F IXa format de complexul TF/F VIIa se formeaza pe suprafata plachetelor activate din apropierea cel. purtatoare de TF si poate difuza pe suprafata cel adiacente pentru ca nu este inhibat de TFPI. Plachetele joaca un rol major in localizarea reactiilor coagularii in zona leziunii pentru ca plachetele adera si agrega strict la nivelul leziunii vasculare. Odata plachetele activate, cofactorii F VIIIa, F Va (activati de trombina F IIa) sunt rapid localizati la nivelul membranei plachetare legarea cofactorilor fiind mediata in mare parte de expunerea fosfatidil serinei printr-un proces de flip-flop de pe fata interna pe cea externa a mb. plachetare formandu-se tromboplastina plachetara = fosfolipid din mb. plachetara =FP3). Tromboplastina partiala este echivalentul trombolastinei plachetare.

2 F IXa (format sub actiunea complex TF/F VIIa) se ataseaza de suprafata mb. a plachetelor activate prin receptori specifici si se incurajeaza formarea de complexe active F IXa/F VIIIa care, alaturi de FP3 (fosfolipide mb. fosfatidil serina) si in prezenta , constituie tenaza plachetara = tenaza caii intrinseci. Tenaza plachetara recruteaza F X din plasma si il activeaza la F Xa la suprafata plachetelor activate. FXa se asociaza cu cofactorul sau F Va alaturi de FP3 in prezenta formand protrombinaza (complexul protrombinazic) care genereaza trombina in cantitati suficiente pentru a cliva fibrinogenul si a forma cheagul de fibrina. Fibrinogenul prezinta un domeniu central (E) si doua domenii (D) periferice. Trombina se leaga de domeniul central al Fbg. si prin proteoliza desprinde cate 2 fibrinopeptide A si B expunand situsurile de legare pentru domeniul D ai altor monomeri de fibrina formandu-se protofibrile interconectate cu aspect cross-linked, insolubile. Trombina care formeaza fibrina si initiaza polimerizarea fibrinei activeaza si F XIII care stabilizeaza polimerul de fibrina. Trombina (F IIa) are urmatoarele actiuni: cliveaza fibrinogenul (F I) la fibrina (F Ia) activeaza F XIII F XIIIa: asigura cross-link-area fibrinei si formarea cheagului impermeabil activeaza cofactorii F VIII, F V activeaza F XI atasat de mb. plachetaraF XIa legata de trombomodulina activeaza proteina C care in complex cu cofactorul sau prot. S cliveaza F VIIIa si F Va. legata de trombomodulina activeaza TAFI indeparteaza lizina si arginina carboxiterminala din produsii de degragare ai fibrinei impiedicand astfel activarea plasminogenului la plasmina si inhiband fibrinoliza F XI se ataseaza de suprafata plachetelor activate (prin receptor specific GP IX) si este activat de trombina intrun proces de amplificare mecanicm de booster pentru a creste generarea de trombina (probabil pentru a asigura activitatea TAFI si a proteja cheagul nou format de fibrinoliza). F XIa in prezenta activeaza F IX. Acest rol de booster al F XI este sugerat si de faptul ca deficite severe de F XI (hemofilia C) nu conduc la hemoragii comparabile cu cele din deficiul de F VIII sau F IX (hemofilia A/B) deci exista o activitate tenazica bazala suficienta pentru activarea F X si formarea de trombina necesara formarii cheagului de fibrina. In vitro F XI este activat si de F XIIa generat prin activarea de contact a coagularii care presupune interactiuni proteine-proteine dar si proteine-suprafata (in vivo aceasta activare exista dar este nesemnificativa) F XI alaturi de F XII, HMWK (kininogen cu greutate moleculara mare), PK (precalicreina) formeaza sistemul activarii de contact. F XII prezinta spre capatul N terminal o zona intens electropozitiva (histidina, glicina, lizina) prin care se ataseaza usor de suprafetele electronegative (colagenul subendotelial expus secundar unei leziuni vasculare sau sticla in vitro) simpla atasare a F XII determina o slaba activare a acestuia. Activarea F XII cea mai eficienta este scindarea in zona leg. disulfidice dinspre capatul carboxi-terminal efectuata de kalikreina si/sau plasmina rezultand F XIIalfa; sub actiunea C1s este scindat in afara leg. disulfidice rezultand F XIIbeta (activator mai slab) intre F XII si sistemul compementului exista potentari reciproce. HMWK prezinta o zona centrala intes electropozitiva prin care se ataseaza colagenului denudat simpla atasare conducand la modificari conformationale ce expun situsurile de legare pt. F XI si prekalikreina (PK). Initial pe colagenul expus se ataseaza F XII si HMWK. F XIIa scindeaza PK la kalicreina care amplifica activarea F XII dar si formarea bradikininei din HMWK. F XIIa actioneaza pe F XI FXIa. FXI are situsuri de legare pt.: HMWK, protrombina/trombina, F XIIa, F IX, plachete (GP IX) Activarea de contact a coagularii este evaluata de aPTT (timpul de tromboplastina partiala activata) plasma + tromboplastina partiala + reagent activator(caolin/ac. elagic) care se comporta ca o suprafata incarcata negativ. Desi F XII, HMWK, PK sunt necesare pt. aPTT normal ele nu sunt necesare pt. o hemostaza normala in vivo nu exista tendinta la sangerare la pacienti cu deficit de acesti factori. Chiar daca fiecare etapa a modelului coagularii a fost exprimata ca un set de reactii izolate aceste etape ar trebui privite ca evenimente continue ce se suprapun/interpatrund. Factorii coagularii dependenti de vit. K : F II, F VII, F IX, F X + proteina C, S, Z prezinta un Gla domain care este sintetizat cu ajutorul enzimei gamma glutamil carboxilaza al carei cofactor este vit. K hidroquinone (forma redusa ) si care in cursul reactiei se oxideaza la epoxid. Vit K epoxid reductaza asigura cantitati suficiente de Vit K forma redusa necesare sintezei zimogenilor dependenti de vit K. si este inhibata de warfarina, acenocumarol. Retractia cheagului: pasiv (sinereza 20%) si activ (trombostenina = fp7 80%) eliminrea ser. din cheag pe lama 1 pic sg +1 pic ulei ricin la 6-12 min se form cheag apoi se masoara timpul de incepere a retractiei cheagului = cand apare prima pic de ser =la 30 min; injumatatirea diam. cheag la 1 ora; investigheaza hemostaza primara/functia Tc.

3

Investigarea hemostazei secundare1. Timpul de coagulare Definitie: masoara timpul necesar coagularii sangelui total in vitro in contact cu o suprafata nesiliconata (ar inactiva F.XII). Evalueaza coagularea declansata pe calea intrinseca si calea comuna dar este influentat si de trombocite (fp3). Avantaje : usor de efectuat, se poate urmari si evolutia cheagului (*retractia cheagului incepe la 30 minute, la aproximativ 1 ora diametrul cheagului trebuie sa ajunga la jumatate fata de diametrul initial, investigheaza hemostaza primara/functia Tc. Dezavantaje : sensibilitate si specificitate scazute. A. Tehnica Lee-White valori normale : 6-12 minute punctie venoasa ; recoltarea a 1-2 ml sg. in eprubeta de sticla cu mentinerea la 37 grade Celsius se masoara timpul pana cand eprubeta poate fi rasturnata fara ca sangele sa curga. cheagul se poate urmari la intervale diferite pina la 24 ore urmarindu-se retractia cheagului si fibrinoliza. B. Tehnica Millan valori normale : 10-12 minute utila cind nu se poate realiza punctia venoasa (copii, soc hipovolemic, etc.) ; se inteapa pulpa degetului se lasa o picatura de sange sa cada liber peste o picatura de ser fiziologic pe o lama de sticla se masoara timpul pana cand picatura de sange nu se mai deformeaza la inclinarea lamei

Timp de coagulare prelungittulburari ale factorilor de coagulare apartinand caii intrinseci si comune (XII, XI, IX,VIII,X,V,II,I) trombocitopenii/trombocitopatii tratamente anticoagulante (heparina/ACO)

2. Timpul Howell (timpul de recalcifiere) Definitie: timpul de coagulare al plasmei anticoagulate cu oxalat/citrat (cu rol chelator de Ca) bogata in trombocite dupa recalcifiere cu clorura de calciu (Ca Cl2). Evalueaza coagularea declansata pe calea intrinseca si calea comuna dar este influentat si de trombocite (fp3). valori normale :60-120 sec. Tehnica : peste plasma plasma anticoagulata mentinuta la 37 grade Celsius se adauga Ca Cl2 si se porneste cronometrul cronometrul se opeste cind apar primele filamente de fibrina Timp Howell prelungit - aceleasi cauze ca in cazul timpului de coagulare

3. Timpul de tromboplastina partiala activata (aPTT) Definitie: timpul de coagulare al plasmei anticoagulate (recoltate pe citrat de Na), saraca in trombocite (centrifugata), recalcifiate (CaCl2) la care se adauga tromboplastina partiala activata (cu caolin, acid elagic) Evalueaza global coagularea declansata pe calea intrinseca si calea comuna dar nu depinde de trombocite. valori normale : 25-35 sec. tromboplastina partiala (cefalina ~ extract de creier de iepure) echivalentul tromboplastinei plachetare fp 3. timpul de tromboplastina partiala (PTT) = timpul de cefalina = nu mai are loc activarea cu caolin/ac. elagic care se comporta ca o suprafata incarcata electronegativ iar valoarea normala creste la 70-110 sec.

aPTT prelungit deficit ai factorilor de coagulare apartinand caii intrinseci si caii comune: deficit de HMWK deficit de F. IX hemofilia B deficit de prekalicreina deficit de F. VIII hemofilie A, boala von Willebrand deficit de F. XII hemofilia Hageman deficit de F. X parahemofilia Stuart-Prower deficit de F. XI hemofilia C = Sd. Rosenthal deficit de F. V parahemofilie Oxen ***deficitul factorilor sist. de contact (XII, HMWK, PK) nu det. manifestari hemoragice dar determina alungirea aPTT

4 tratamente anticoagulante : heparina : se leaga de ATIII amplificandu-i rolul si inhiband mai ales trombina si F. Xa, dar si XIIa, XIa, IXa anticoagulante orale cumarinice : actioneaza ca antivit K inhiband factorii vit. K dependenti (II, VII, IX, X). Sd. Ac anti fosfolipidici in vitro se ataseaza si blocheaza tromboplastina prelungind timpii de coagulare dependenti de fosfolipide (aPTT/TQ/dRVVT) ; in vivo ei se ataseaza de complexul 2GPI fosfolipide mb (fosfatidil serina) ; 2GPI are rol anticoagulant prin inhibarea CI si agregarea plachetara dep. de ADP => ac. fosfolipidici (anticoagulantul lupic + ac. anticardiolipina) au efect procoagulant ( + blocheaza anticoagulanti naturali : proteina C, AT III ; stimuleaza expresia TF pe celule endoteliale si leucocite ; s.a.)!!

Functii aPTT controlul tratamentului cu heparina (valori tinta 1,5-2 ori val. normale) test screening pentru calea intrinseca si comuna

4. Timpul Quick (timpul de protrombina)- TQ/TP Definitie : timpul de coagulare al plasmei anticoagulate recoltate pe citrat sarace in trombocite (prin centrifugare) in prezenta tromboplastinei tisulare si (CaCl2); Evalueaza global coagularea declansata de calea extrinseca si calea comuna ; nu depinde de trombocite ; valori normale 12-15 (10-15) sec. tromboplastina tisulara = extract de creier/plaman echivalentul factorului tisular TF /F III ;

Activitatea protrombinica(indicele de protrombina)/INR- pentru standardizarea metodeiActivitatea protrombinica (AP) = TQ martor/TQ bolnav X 100 - valori normale: 70%- 120% INR (international normalised ratio) = TQ bolnav/TQ martor valori normale: 0.9-1.2

TQ prelungit/ AP scazuta/ INR crescutdeficit de F. I (sub 50 mg/dl), F. II, F. V, F. X, F. VII parahemofilia Alexander, deficit de vitamina K (afecteaza II, VII, IX, X) insuficienta hepatica (deficit de vit K si deficit de sinteza fact. coagularii) ciroza hepatica sd. antifosfolipidic tratament anticoagulant oral (cumarinice afecteaza imediat TQ prin afectarea F VII) /heparina (amplifica activit AT III ce inhiba F IIa, F Xa)

Functii TQ controlul tratamentului cu anticoagulante orale (ACO) test de evaluare a functiei hepatice

Scaderea activitatii protrombiniceAP = 50-60% - prudenta -risc de sangerare prelungita la manevre parenterale (punctii venoase/arteriale, in.j IM) AP = 40%- risc crescut de sangerare la manevre parenterale ; se contraindica punctii, biopsii, extractii dentare. AP =30% - reprezinta limita terapeutica pentru tratamentul cu ACO. AP = sub 30% risc crescut de singerare spontana (in special AP=10%)

INR-ul in monitorizarea tratamentului cu ACO F VII (vit. K dependent) are T1/2 cel mai scurt in vivo = 3-6 ore INR tinta = 2-3 pt. tratamentul cu ACO adm. pentru tromboflebita profunda, TEP, profilaxia trombembolismului cardiac FiA, valvulopatii, trombi murali post IM, profilaxia TVP si TEP) INR tinta = 2,5-3,5 pt. tratamentul cu ACO adm. pentru proteze valvulare cardiace sau proteze mecanice articulare

Testul Koller efectuat cind se suspicioneaza un deficit de vit. K se efectueaza TQ initial, apoi se administreaza vit. K - 10 mg i.m/zi. 3 zile consecutiv se repeta TQ : corectarea cu peste 15% din valoarea initiala = > deficit de vitamina K

5

5. Diluted Russells Viper Venom Time (dRVVT) valori normale : 23-27 sec. Evalueaza calea comuna, veninul activand direct F X se adauga plasmei anticoagulate veninul si suspensie diluata de creier de iepure (tromboplastina partiala) (fp3)

dRVVT prelungitdeficit de factor I (hipo-/a-/dis-fibrinogenemii) , deficit/inhibitori F II/F IIa, X, V sd. antifosfolipidic;

6. Timpul de trombina (TT) Definitie: timpul de formare a cheagului dupa adaugarea de trombina exogena plasmei sarace in trombocite recoltate pe citrat. valori normale :10-15 (20)sec. Functii : controlul tratamentului cu heparina; valoarea tinta: 2-3 ori valoarea normala. TT prelungit: prezenta inhibitorilor de trombina : tratament cu heparina, PDF (produsi de degradare ai fibrinei inhiba trombina), Ac anti trombina hipo/a/dis fibrinogenemie CID (hipo/a fibrinogenemie prin consum +PDF)

7. Timpul de reptilaza (TR) valori normale: 20 sec. Evalueaza ultima parte a caii comune foloseste extract de venin de sarpe reptilaza = enzima trombin-like care este insensibila la actiunea inhibitorilor de trombina : heparina/heparin-like (mediat de AT III), PDF, Ac anti trombina. Timp de reptilaza prelungit: hipo/a/dis fibrinogenemie/CID

Interpretarea combinata TT si TR Timp de reptilaza prelungit: hipo/a/dis fibrinogenemie/CID Timp de trombina prelungit + Timp de reptilaza normal: existenta inhibitorilor de trombina

8. Fibrinogenul Valori normale :200-400 mg/dl Functii: Utilizat in controlul tratamentului fibrinolitic (streptokinaza) Valori scazute: hipo-/a-/dis- fibrinogenemii; CID Valori crescute: inflamatie (apartine proteinelor de faza acuta)

Identificarea disfunctiilor hemostazei secundareA. Interpretarea combinata a mai multor teste de coagulare TP crescut + aPTT normal => deficit F. VII TP normal + aPTT crescut => deficit la nivelul CI TP crescut + aPTT crescut => deficit la nivelul CC /deficite combinate : isufic. hep., deficit de vit. K, trat anticoag. TP crescut + aPTT crescut + TT normal => deficit la nivelul CC/deficite combinate dar fara deficit de fibrinogen TP crescut + aPTT crescut + TT crescut => deficit la nivelul CC/deficite combinate inclusiv deficit de fibrinogen

6

Teste de corectie pe calea intrinseca (pt. aPTT/TH crescut + TP normal aPTT/TH crescut necorectat cu plasma proaspata integrala => prezenta de inhibitori ai F VIII, IX, XI, XII aPTT/TH crescut corectat cu plasma proaspata integrala, dar necorectat cu ser vechi => deficit de F.VIII aPTT/TH crescut corectat cu plasma proaspata integrala dar necorectat cu plasma proaspata adsorbita pe BaSO4=> deficit de F.IX aPTT/TH crescut corectat cu plasma proaspata integrala, corectat cu ser vechi, corectat cu plasma proaspata adsorbita pe BaSO4 => deficit de F XI, XII (dar deficitul de FXII nu det. manifestari hemoragice)

B. Teste de evaluare a activitatii factorilor de coagulare Plasma normala (martor) si plasma de la pacient sunt comparate in capacitatea lor de a corecta INR ul sau aPTT unei plasme cu deficit sever cunoscut al unui anumit factor de coagulare. Evaluarea se face cu dilutii ale plasmelor respective. De examplu daca o dilutie de 1/10 a plasmei pacientului corecteaza la fel ca dilutia de 1/100 a plasmei normale inseamna ca factorul de coagulare respectiv are o activitate de 10% (0.1 unitati) fata de normal. Pot fi evaluate activitatile factorilor I, II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, factorului von Willebrand si AT III.

C. Evaluarea inhibitorilor Serul pacientului se amesteca cu ser normal in mixtura de 1:1 si se masoara aPTT sau TQ O mixtura de 1:1 va corecta deficienta de factor insa existenta unui inhibitor va impiedica normalizarea testului de coagulare. Exemple : inhibitor de F. VIII tip IgG la pacienti cu hemofilie A care au primit transfuzii anticoagulant lupic in cadrul sd. antifosfolipidic care se poate asocia in 50 % cazuri cu LES Ac specifici anti fact de coagulare postpartum, LES, hemofilie severa cu transfuzii multiple