GENETICA

=

EREDITATE + VARIABILITATE

EREDITATEA proprietatea unui individ de a transmite la

urmaşi caracterele personale precum şi celeale speciei sale.

Se transmit informaţiile pentru realizareacaracterelor.

Ereditatea = proces informaţional care presupune stocarea, expresia şi transmitereainformaţiei necesare pentru realizarea caracterelor unui individ.

Ereditatea este o FUNCŢIE.

Substratul molecular al eredităţii:

acidul deoxi-ribonucleic (ADN)3 funcţii majore.

deţine informaţia ereditară . exprimă informaţia ereditară . transmite informaţia ereditară .

ADN deţine informaţia ereditară

macropolimer de nucleotidecodificată - unitate de cod:CODON (3 nucleotide învecinate) ↔ AMINOACIDGENOM = totalitatea informaţiei din ADN.GENA = unitatea de informaţie ereditară

"o genă → un caracter " MUTAŢIE (modificare a structurii genice) →variantă genică normală sau anormală.Mutaţiile = cauze majore de boală saupredispoziţie la boală

J.D. WATSON F. CRICK1953, Cavendish Lab, Cambridge

-A-T-C-G-C-G-A-T-T-A-C-G-A-T-

-T-A-G-C-G-C-T-A-A-T-G-C-T-A-

În anul 1953, J.D. WATSON şi F. CRICK au propus un model al structurii ADN:

alcătuit din două catene polinucleotidice (A, G, T,C),

legate complementar prin bazele azotate: A-T; G-C,

înfăşurate într-o elice dublă, răsucită spre dreapta.

STRUCTURA ADN

U.M.F IAŞI

ADN deţine informaţia ereditară

ADN + proteine → cromosomi (= fibre decromatină)cromosomi – substratul morfologic aleredităţii; în celulele somatice → 46 de cromosomi

(2n= număr diploid); în celulele sexuale → 23 de cromosomi

(n= număr haploid).cromosom = succesiune caracteristică de gene

EVOLUŢIA TEHNICILOR DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ

(1) TEHNICI DE GENERAŢIA I(1956)- cromozomi uniformcoloraţi;- identificare imprecisă*

(2) TEHNICI DE GENERAŢIA II(1970)- marcaj în benzi G sau R cromozomi metafazici

(400 benzi);- identificare precisă

U.M.F IAŞI

G I

G II

Identificarea precisă a

cromozomilor

TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ

(3) TEHNICI DE GENERAŢIA III (1977)

- Înaltă rezoluţie: cromozomi

pro-matafazici (550 benzi) sau profazici(850 benzi)

- o bandă = 3-5 Mb

U.M.F IAŞI

M PM P

TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP)

(4) TEHNICI DE GENERAŢIA IV(1991)- citogenetică moleculară- FISH metafazic- se pot identifica f. precis remanierile cromozomiale şi microdeleţiile- FISH interfazic

U.M.F IAŞI

Trisomie 21

t(1q;2q)

Del 15q

Ce este FISH ?tehnică de analiză cromosomicăF fluorescenceI inS situH hybridization

Hibridare fluorescentă in situ

Tehnică moleculară pentru detecţia anomaliilor cromosomice

Tehnică moleculară pentru localizarea secvenţelor genice

TIPURI DE SONDE FISH

Sondă specifică de locus

Sondă centromerică

Sonde telomerice

Sondă pancromosomică

Sonde din ADN repetitiv

Exemple de sonde

Sondă centromerică

(celulă interfazică)

Exemple de sonde

Sonde telomerice

(celulă metafazică)

Exemple de sonde

Sonde specifice de locus

(preparat prometafazic)

Sondă pancromosomică

(preparat prometafazic)

Exemple de sonde

AVANTAJELE TEHNICII FISH

SENSIBILITATE ŞI SPECIFICITATE CRESCUTE TIMPUL SCURT DE OBŢINERE A REZULTATELOR DEFINITIVE; POSIBILITATEA ANALIZEI DE CELULE ÎN DIVIZIUNE SAU

INTERFAZĂ REZOLUŢIE MARE (sonde de până la 40 kb)

DEZAVANTAJELE TEHNICII FISH

COSTUL RIDICAT AL SONDELOR ŞI REACTIVILOR; COSTUL RIDICAT AL APARATELOR FOLOSITE GRADUL ÎNALT DE TEHNICITATE

Sindromul DiGiorge – identificarea microdeletiilor cromosomice

Cromosom 22 anormal

Cromosom 22 normal

19

STRUCTURA GENEI

GENA = un ansamblu liniar de secvenţe nucleotidice de ADN necesar pentru a produce un produs funcţional: un polipeptid sau o moleculă de ARN

Gena este o unitate de transcripţie. Genele :segmente de ADN, imprecis delimitatedivizibile = structură discontinuăocupă un locus distinct

U.M.F IAŞI

20

STRUCTURA UNEI GENE CARE CODIFICĂ PROTEINE

prezintă o regiune centrală, transcrisă integral în ARN mesager precursor, numită "cadrul de lectură" al informaţiei genetice → necesară pentru sinteza proteinei;

flancată de două părţi laterale, ne transcrise, cu rolul de a regla expresia genei

U.M.F IAŞI

21

ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFICĂ PROTEINEU.M.F IAŞI

1.1.REGIUNEA CENTRALĂ

transcrisă integral în ARN mesager precursor (“ORF*”); alternanţa de secvenţe

codante = exoni şi necodante = introni

Începe cu: - situsul de iniţiere al transcripţiei (SIR sau INR) şi - regiunea netrasnlată 5’UTR ce conţine şi codonul iniţiator ATG

5’-CCAGCCATG-3’

Situs de iniţiere al

transcripţiei

codon iniţiator

* ORF= open Reading Frame

22

EXONII secvenţe transcrise

în pre ARNm şi păstrate în ARNm matur.

Regiuni codante pt anumite părţi din proteină = domenii.

U.M.F IAŞI

REGIUNEA CENTRALĂ A GENEI

23

U.M.F IAŞI

INTRONII

Secvenţe necodante Transcrise iniţial în preARNm

şi apoi decupate precis şi îndepărtate din ARNm matur, alcătuit numai din asamblarea exonilor (“matisare”)

încep cu 5’ GT şi sfârşesc cu AG 3’ – semnale pentru decuparea precisă*.

REGIUNEA CENTRALĂ A GENEI

24

Regiunea centrală se termină cu o secvenţă 3’UTR necodantă ce conţine: Unul din codonii stop (TAA;

TAG, TGA) Situsul de terminare al

transcripţiei (AATAAA) Situsul de poliadenilare –

locul de desprindere a moleculei de ARNm sintetizată şi adăugare unui segment poliadenilic (rol în stabilitatea şi transportul ei din nucleu)

U.M.F IAŞI

REGIUNEA CENTRALĂ A GENEI

25

1.2. REGIUNILE LATERALE

Flanchează regiunea centrală (ORF)

Netranscrise

Rol de reglare a transcripţiei

U.M.F IAŞI ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFICĂ PROTEINE

26

U.M.F IAŞI

După 1970 s-au descoperit: enzimele de restricţie, veritabile "bisturie" genetice,

cu ajutorul cărora a devenit posibilă secţionarea ADN şi izolarea genelor*.

tehnici de amplificare unui fragment specific de ADN = clonarea genelor (celulară sau acelulară –PCR)**.

tehnici de analiză şi secvenţiere

METODE DE CLONARE ŞI ANALIZĂ A GENELOR

27

U.M.F IAŞI

TEHNOLOGIA ADN

a inaugurat “era ingineriei moleculare” cu multiple şi

importante aplicaţii practice:

• analiza structurii, cartografierii lu funcţiei genelor;

• elucidarea patogeniei bolilor genetice şi dobândite (infecţii, cancere);

• diagnosticul bolilor: preimplantator, prenatal, presimptomatic;

• biosinteza unor molecule terapeutice (insulină, hormon de creştere, eritropoietină etc)

• tratamentul bolilor genetice şi terapia genică

28

U.M.F IAŞI

1. CLONAREA ADN

Clonarea ADN este amplificarea selectivă a unei gene sau fragment de ADN – prin multiple runde de replicare – care vor produce un număr mare de copii a fragmentului respectiv, ce vor permit analiza structurii şi funcţiei sale.

2 tipuri majore de clonare: Celulară, in vivo, utilizează mecanismul natural de replicare

a unor fragmente de ADN – obţinute prin diferite metode şi introduse cu ajutorul unor vectori (plasmide, bacteriofagi, cromozomi artificiali) în celule gazdă (bacterii, levuri)

Acelulară, in vitro, folosind o reacţie de plomerizare în lanţ(PCR)

29

U.M.F IAŞI

1.1. OBŢINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

Trei metode:

(1). Secţionarea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de restricţie;

Enzimele de restricţie (Pr. Nobel, 1978) – recunosc şi taie ADN la nivelul unor secvenţe nucleotidice specifice(“situsuri de restricţie”) producând fragmente de ADN cu capete adezive.

30

U.M.F IAŞI

OBŢINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(2). Obţinerea de ADN complementar unei molecule de ARNm, cu ajutorul transcriptazei inverse

Transcriptaza inversă (Pr. Nobel, 1975) – sintetizează o catenă de ADNc pe baza unei molecule de ARNm extrasă din celule.

31

U.M.F IAŞI

OBŢINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(3). Sinteza artificială (chimică) a unor fragmente de ADNprin polmerizarea dezoxiribo-nucleotidelor într-o ordine determinată anterior (de ex., pe baza secvenţei de aminoacizi şi codului genetic).

Fragmentele de ADN vor fi utilizate ca sonde sau amorse în alte tehnici.

32

U.M.F IAŞI

Clonarea ADN in vivo utilizează mecanismul natural de replicare al ADN în celule a unor segmente de ADN introduse în celule cu ajutorul unor vectori

formarea ADN recombinant, prin ataşarea in vitro a fragmentelor de ADN uman la "un vector sau replicon " capabil de replicare independentă;

transferarea moleculelor de ADN recombinant în celule gazdă, în care vectorul recombinant se replică independent de cromosomul celulei gazdă;

amplificarea sau producerea de clone celulare multiple.

izolarea clonelor de ADN recombinant.

1.2. CLONAREA ADN ÎN CELULE

33

U.M.F IAŞI

Foloseşte tehnica "polymerase chain reaction" (PCR) (Mullis şi Smith; Premiul Nobel, 1993)

se poate amplifica selectiv o secvenţă scurtă de ADN sau ARN.

Amplificarea se realizează pe baza principiului extensiei unei amorse("primer").

PCR este o reacţie în lanţ deoarece catenele de ADN nou sintetizate vor acţiona ca matriţe pentru sinteza ADN în ciclurile următoare.

Amplificarea este considerabilă (de miliarde de ori) şi rapidă (în câteva ore), fiind integral automatizată.

1.3. CLONAREA ACELULARĂ A ADN (metoda PCR)

34

U.M.F IAŞI

2. METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI

În medicina practică analiza directă a genei sau produselor sale este folosită pentru:

studiul patologiei moleculare; diagnosticul genotipic prenatal sau presimptomatic al

unor boli, chiar şi atunci când gena şi efectele ei nu sunt cunoscute sau nu sunt evidente;

recunoaşterea unei infecţii virale.

35

U.M.F IAŞI

METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI:PRINCIPII

Pentru a identifica o genă este necesară o sondă genotipică adecvată care să permită: fie recunoaşterea genei (sonde directe) fie recunoaşterea unor markeri genotipici (secvenţe

necodante) situaţi în vecinătatea genei (sonde indirecte).

Această recunoaştere se realizează pe principiul hibridizării moleculare a acizilor nucleici.

36

U.M.F IAŞI

METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI:TEHNICI

a).Analiza ADN genomic uman prin metoda de transfer Southern

b). Analiza cu sonde oligo-nucleotidice specifice unei alele (ASO) (dot blot).

c). Analiza ARNm prin Northern blot.

d). Analiza proteinelor prin Western blot.

e) Secvenţierea unor gene

ADN exprimă informaţia ereditară

Transcripţie + Translaţie

Transcripţie - copierea informaţieigenetice corespunzătoare unei gene →moleculă de ARNm (mesager):

Translaţie – decodificarea informaţieigenetice dintr-o moleculă de ARNm →secvenţă peptidică

A.CONŢINUTUL GENETICII UMANEGENETICA − ŞTIINŢA EREDITĂŢII ŞI VARIABILITĂŢII

ADN transmite informaţia ereditară

Replicarea ADN + diviziunea celulei

Replicare - autocopierea informaţiei genetice din toatemoleculele de ADN → 2 molecule noi de ADN:

Semiconservativă; Asincronă; Foarte precisă;

Diviziune – procesul de împărţire totală şi egală ainformaţiei genetice dintr-o celulă → 2 celule fiiceidentice (mitoză) sau nu (meioză) cu celula de origine

GENETICA

ADN

VARIABILITATE EREDITATE

STOCARE

Codon

EXPRIMARE

Translaţie (ribosomi)

Transcripţie (nucleu)

ARNm

Peptid

REPLICAREA ADN (semiconservativ)

DIVIZIUNEA CELULEI

Mitoza (celule somatice)

Meioza (celule germinale)

Transmiterea informaţiei în succesiunea generaţiilor celulare

Ovare

Testiculi Spermatozoizi

Fecundare

Transmiterea informaţiei în succesiunea generaţiilor de organisme

Ovule

Zigot

RECOMBINARE GENETICĂ

Meioză

Recombinare intracromosomică

Recombinare genomică

Fecundare

Recombinare intercromosomică

MIGRAŢII

MUTAŢII

genice

cromosomice

genomice

mitocondriale

TRANSMITERE

VARIABILITATEA fenomenele care produc diferenţele

genetice dintre indivizii unei populaţii,precum şi între populaţii diferite .

3 surse de variabilitate: Recombinările genetice – fenomene normale în

meioză şi fecundare. Mutaţiile genetice – fenomene anormale în cursul

diviziunilor celulare; Migraţiile populaţionale

VARIABILITATEA

fiecare individ are o structură genetică unică şi

specifică.

Mutaţiile

Mutaţiile:modificări

în secvenţasau aranjarea

nucleotidelor (secvenţelor) din ADN

Nenaturale, permanente (±), ereditare

Consecinţe:• fără efect,• variaţii fenotipice

normale,• boală.

Clasificarea mutaţiilor

Mărimea materialului genetic: M. genice

(10-6/locus) M. cromozomiale

(anom. structură)(10-6/diviz. cel)

M. genomice(anom. număr)

(10-2/diviz. cel)

Tipul de celulă afectată: M. germinale → ereditare M. somatice → clone an.

→ ne-ereditare

Cauză: M. Spontane (majoritatea)

→ erori de replicare a ADN

→ erori de recombinare(CO inegal)

→ erori de distribuţie (nedisjuncţie)

M. induse ← de ag.mutageni

Consecinţe fenotipice M. germinale:

M. patogene M. neutre M. benefice

M. somatice → clone → cancer, îmbătrânire

MUTATIILE GENICE

MUTAŢIILE GENICE

MG = modificări ale secvenţei nucleotidice sau aranjării ADN unei gene → variante alelice

m1gena N m2

m3

Clasificarea mutaţiilor genice

după mecanism:

modificarea secvenţei N:• substituţii = înlocuirea unei perechi

de baze (pb).• deleţii = pierderea unei/unor pb• inserţii= introducerea unei/unor pb

modificarea aranjării N:• recombinări omoloage nealelice

→ deleţie / duplicaţie segmente ADN• amplificarea repetiţiilor trinucleotidice

AT

A T

G C

A T T

G T

A

G CÎMPERECEHERE GREŞITĂ

A

G

T

C

A

A

T

T

TA

G C C

TA

G

MUTAŢIE

Substituţii nucleotidice prin erori de replicare a

ADN

Mecanismele reparare a leziunilor ADN

Erorile de împerechere au o frecvenţă mare, de ~1:10.000 (10-4).

Rata mutaţiilor este menţinută la un nivel scăzut (10-10) prin intervenţia unor mecanisme de recunoaştere şi reparare a leziunilor (“controlul calităţii ADN”).

Acţiunea lor este cuplată cu mecanismele de control aprogresiei prin ciclul celular şi cu apoptoza.

G1 → Go → ± reparare → G1 sau apoptoză

NU au o eficienţă absolută; în final, se produce o mutaţie nouă la fiecare replicare / diviziune celulară.

RECOMBINAREA GENICĂ ABERANTĂ(recombinare omoloagă nealelică)

Are loc în profaza meiozei I:- împerecherea (sinapsa) greşită între regiuni omoloage (secvenţe de ADN identice sau cvasiidentice; ex., R1 ~ R2) dar nealelice;

- CO → schimb inegal între crz. omologi → deleţii, duplicaţii, inversii a unor segmente mari

Sinapsă greşită

CO inegal

Duplicaţie

2.1. SUBSTITUŢIA NUCLEOTIDICĂ

Substituţie = înlocuirea unui singur nucleotid (şi deci a unei pb) = “mutaţie punctiformă”.

S = cel mai frecvent tip de mutaţie întâlnit la om.

a).Substituţia nucleotidică:localizare intragenică

În EXONI:a). Codon sens → (1) codon sens sinonim

→ proteină N (silent m.)(2) alt codon sens AA1→ AA2

→ proteină An (missens m.) (3) codon nonsens prematur →

proteină An scurtată (instabilă)(non-sens m.)

b). Codon nonsens → → codon sens → proteină An

alungită→ alt codon nonsens → proteină N

ADN N (1) (2) (3) TTT TTC CTT ATT

ARNmAAA AAG GAA UAA

Pr..liz... ...liz... ..glu.. ..STOP..

Substituţia nucleotidică: localizare intragenică

În INTRONI:Anulare situsuri de decupare (splice site mutations)

5’GT---------AG3’

Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3

GT GTAG AG

Exon 1’ (exon 1 + intron 1 + exon 2) Intron 2 Exon 3

GC GTAG AG

Exon 1 Intron 1’ (intron 1 + exon 2 + intron 2) Exon 3

GT GTAT AG

Mutaţie la nivelul secvenţei dinucleotidice GT

Mutaţie la nivelul secvenţei dinucleotidice AG

Substituţia nucleotidică: localizare intragenică

În SECVENŢELE DE REGLARE

→ reg 5’ - promotor → modificări cantitative ale sintezei proteinelor

→ reg 3’ – anomalii de poliadenilare → ARNm instabil

DELEŢII ŞI INSERŢII MICI

Del /Ins - care NU sunt multiplu de 3 nucleotide → decalarea (defazarea) cadrului de lectură al genei (m. frameshift) → schimbarea secvenţei AA în aval de del/ins

Del /Ins a 3 nucleotide / multiplu de 3→ ± 1-n aminoacizi

EXPANSIUNEA INSTABILĂ A REPETIŢIILOR TRINUCLEOTIDICE

Tip nou de mutaţii – instabile sau dinamice – diferit de mutaţiile “clasice”= permanente şi stabile

Se produc în genomul uman în regiuni cu repetiţii trinucleotidice: dispuse în tandem: CGG CGG CGG…→→→→→ polimorfice (într-un număr diferit la persoanele normale); ex

CGG = 6-50 repetiţii. situate în diferite segmente ale genei (promotor; exoni; introni);

ex. CGG – în regiune promotor a genei FMR1 (Xq27.3 în situsul fragil FRAXA)

“inerte” funcţional (CGG=6-50 →fenotip normal) instabilitate intergeneraţională (“meiotică”)

Expansiunea instabilă a repetiţiilor trinucleotidice

instabilitatea intergeneraţională (“meiotică”): Pe măsură ce gena trece – prin meioză – de la o generaţie la alta →

nr. repetiţiilor trinucleotidice creşte progresiv dar moderat; se produce o premutaţie (pt CGG = 60-200 repetiţii) →normal mecanism: glisare sau derapare replicativă

Când se ajunge la un prag critic (ex. pt CGG = 230 repetiţii) → blocarea expresiei genei → mutaţie →boală

boli prin mutaţii dinamice (expansiunea trinucleotidelor): Sdr. X fragil (prin expansiunea CGG) – retard mintal legat de X Boala Huntington (prin expansiunea CAG) – boală neurologică

degenerativă Distrofia miotonică (prin expansiunea CTG) – afecţiune

neuromusculară

EFECTELE FENOTIPICE ALE MUTAŢIILOR GENICE PATOGENE

1. Pierderea (totală/parţială) a funcţiei(activităţii) genei- în majoritatea bolilor recesive (bolnavii = homozigoţi)

2. Câştigul de funcţie- creşterea nivelului de expresie a proteinei- ex., activarea permanentă a unui receptor în absenţa ligandului

3. Achiziţia unor proprietăţi noi a proteinei mutante- ex., deficit în alfa-1 antitripsină – varianta α1 AT Pittsburg – nu mai acţionează ca o anti- elastază ci ca un inhibitor al coagulării.

4. Expresia inadecvată a genei ca timp şi loc- ex., persistenţa ereditară a Hb fetale- oncogenele

MUTAŢIE GENICĂ

Mutaţie în regiune reglatoareMutaţie în regiune codantă

Proteină anormală Proteină normală

Scăderea cantităţii de proteină dacă aceasta este instabilă

Cantitate scăzută

Cantitate crescutăMECANISM PATOGENIC

Pierdere de funcţie (cel mai frecvent)

Câştig de funcţie (rareori)

Proprietăţi noi (rareori)

Corelaţii dintre genotip şi fenotip

“o genă → o boal㔕 În unele boli (ex., sicklemia) mutaţia este unică la toţi

bolnavii → manifestare identică a bolii;• În alte boli → bolnavii au mutaţii diferite în aceeaşi genă –

gravităţi dfierite. “o genă → mai multe boli”

• Mutaţii diferite în gena RET → b. Hirschprung (megacolon congenital); cancer ereditar tiroidă + suprarenale (sdr. MEN)

• Mutaţii diferite a genei beta-globină → sicklemia (AR); beta-talasmia (AR); methemoglobinopatia (AD)

“mai multe gene → o boal㔕 B. Hirschprung ← mutaţii gene RET sau ECE1 sau EDN3

Mutaţiile genice –cauză majoră de boală

sau depredispoziţie la îmbolnăvire

Genetica - DISCIPLINĂ CLINICĂ Genetica umană → genetica medicală relaţia ereditate ↔boală - importanţa mutaţiilor

în producerea bolilor sau predispoziţiei la boli. Genetica medicală - specialitate distinctă: diagnosticul şi îngrijirea pacienţilor cu boli genetice; îngrijirea familiilor bolnavilor prin:

sfat genetic, diagnostic prenatal, screening neonatal diagnostic presimptomatic.

Importanţă în asistenţa medicală a populaţiei →păstrarea stării de sănătate a generaţiilorviitoare.

61

BOLILE GENETICE

Boală = orice alterare majoră a structurii şi/sau funcţiei normale a organismului.

Cauze : factori de mediu (f.m.) ± factori genetici (f.g.) (mutaţii);

Clasificare etiologică: boli genetice ← f.g. boli multifactoriale ← f.g + f.m. boli ecologice (negenetice) ← f.m.

U.M.F IAŞI

Noţiuni generale – BOLI GENETICE

Bolile genetice ↔ probleme de sănătate publică: sunt frecvente - incidenţă globală 5-8% la nou-născuţi; sunt numeroase - 10.000 de afecţiuni; sunt grave - cauză majoră de mortalitate; nu se vindecă spontan; beneficiază de măsuri de profilaxie (primară sau

secundară) prin: identificarea persoanelor afectate şi a riscului de recurenţă al

afecţiunii - anamneză familială şi sfat genetic; depistarea precoce a persoanelor cu risc - diagnostic prenatal,

screening neonatal şi presimptomatic

interesează bolnavul, familia acestuia şi societatea [14]

Noţiuni generale – BOLI GENETICE

Tipuri de boli genetice: boli cromosomice boli monogenice; boli mitocondriale - mutaţia ADN-ului mitocondrial

60 de afecţiuni rare cu transmitere matriliniară; boli multifactoriale - produse prin interacţiunea complexă a factorilor

genetici (mutaţii la nivelul mai multor gene) cu factorii nefavorabili de mediu ereditatea determină predispoziţia genetică; reprezentate de malformaţii congenitale izolate şi bolile comune ale

adultului; incidenţă 5% din populaţie; risc 3-20% dependent de numărul de persoane afectate din familie;

boli prin mutaţii somatice mutaţiiile somatice intervin în patogenia cancerului, bolilor autoimune,

senescenţei; au caracter clonal; nu se transmit la descendenţi

64

Bolile cromozomiale (B.crz.)

B. crz. - produse de anomalii în numărul sau structuracromozomilor:vizibile (!) la microscop (inclusiv prin FISH), deci ≥ 4 Mb.

Ex. sdr. Down (trisomia 21); sdr. Turner (monosomia X); sdr. Velo-Cardio-Facial (del 22q11).

NU sunt ereditare (rare excepţii). Frecvenţa anomaliilor cromozomiale:gameţi (bărbaţi/femei normale şi fertile): → 10 % (spermatozoizi)

25 % (ovule)embrioni (std. preimplantator) → 25 %embrioni 5-8 spt (avorturi spontane) → 50 – 60 % nou-născuţi morţi → 10% nou-născuţi vii → 0,7 – 1 % (>1:140)

U.M.F IAŞI

65

Anomaliile cromozomiale – consecinţe fenotipice

48 % = anomalii crz. neechilibrate (~1:300 nn)→ trisomii / monosomii complete sau parţiale →

“anomalii de dozaj genic” (± segm.crz./gene N)→ fenotip anormal: ACM ± RM (~600 entităţi)

52 % = anomalii crz. echilibrate(t; ins; inv;)

→ fenotip normal;→ tulburări de reproducere: sterilitate, avorturi spontane,

nn morţi, nn vii plurimalformaţi.

Anomaliile cromozomiale sunt principalele cauze ale malformaţiilor congenitale multiple, retardului mental, tulburărilor pubertare sau de reproducere (sterilitate, avorturi spontane, nou-născuţi morţi).

(~1:250 persoane N !!!)

U.M.F IAŞI

66

Bolile monogenice (B. MG)

B. MG - produse de mutaţia unei alele (A/n) sau ambelor alele (a/a) ale unei gene nucleare cu efect major → proteină anormală.

B. MG - se pot transmite ereditar, în succesiunea generaţiilor : AD, AR, LX → boli mendeliene.

- ex., AD (An) : hipercolesterolemia familială, ADPKD;

- ex., AR (aa) : fibroza chistică (mucoviscidoza); sicklemia;

- ex., LX (XaY): hemofilia.

Indexate şi descrise îm catalogul « Mendelian Inheritance of Man »edt. Victor McKusick (ed.12, 1998; versiunea online = OMIM, actualizată permanent)

www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

Ex., Cystic fibrosis – OMIM # 219700

National Center for Biotechnology Information ; National Library of

Medecine ; National Institut of Health

U.M.F IAŞI

Noţiuni generale

BOLI MONOGENICE

Dominant autosomale

A>n

AA, An

nn

Dominant legat de crs. X

A>n

XAXA, XAXn XAY

XnXn XnY

Recesiv autosomale

N>a

aa

NN, Na

Recesiv legat de crs. X

N>a

XaXa XaY

XNXN ,XNXa XNY

Noţiuni generale – BOLI GENETICE

Boli moleculare boli monogenice la care se cunoaşte complet

mecanismul patogenic: mutaţia genică, proteina anormală, modificările fenotipice (simptomatologie);

1500 afecţiuni; clasificare: deficite enzimatice; boli anomalii ale proteinelor de transport; boli prin anomalii ale proteinelor structurale; boli prin anomalii ale proteinelor implicate în comunicarea

intercelulară; boli prin anomalii ale preteinelor implicate în homeostazie

[14];

Boli monogenice - noţiuni generale

transmiterea monogenică = cel mai simplu mod de transmitere → recunoaştere uşoară

numeroase dificultăţi de diagnostic şi evaluare a riscului de recurenţă ← variabilitatea expresiei fenotipică a mutaţiilor (interrelaţii genice şi influenţa factori de mediu): penetranţa incompletă, expresivitatea variabilă, specificitatea de organ, pleiotropia, eterogenitatea genetică consanguinitatea.

Boli monogenice - noţiuni generalePENETRANŢA INCOMPLETĂ

Penetranţa noţiune cantitativă valabilă în bolile dominante: frecvenţa manifestării genei mutante (numărul bolnavilor), în raport cu

numărul total de purtători ai genei anormale (AA, An).

În unele boli dominant autosomale unii heterozigoţi (An) sunt aparent sănătoşi, gena „A” nefiind manifestă, situaţie caracteristică penetranţei incomplete → posibilitatea transmiterii mutaţiei → descendenţi (An) cu manifestări complete → transmitere dominantă neregulată (similară transmiterii recesive).

Riscurile de recurenţă dificil de evaluat, deoarece un individ aparent sănătos heterozigot poate transmite mutaţia la copii, care, însă, pot manifesta boala.

La riscul obţinut pe baza legilor lui Mendel se înmulţeşte valoarea penetranţei incomplete, rezultând un risc mai mic decât cel teoretic pentru o boală dominantă.

Boli monogenice - noţiuni generaleEXPRESIVITATEA VARIABILĂ

Expresivitatea variabilă noţiune cantitativă = manifestarea clinică a anomaliei genetice cu grade diferite de intensitate, în aceeaşi familie sau în familii diferite.

Diverse aspecte: grade diferite de severitate la membrii aceleiaşi familii sau în familii diferite -

polidactilie unilaterală, bilaterală, la mâini, la picioare sau la toate membrele. forme tipice de boală sau forme incomplete, cu manifestări reduse → boli

dominante determinate de gene cu efect pleiotrop (sindrom Marfan): corelaţie cu vârsta de debut a bolii → anticipaţie (manifestarea bolii la vârste

din ce în ce mai tinere în generaţii succesive - de exemplu coreea Huntington). Predominanţa sau limitarea la unul dintre sexe apare în unele boli dominant

autosomale. hemocromatoza are o frecvenţă de zece ori mai mare la bărbaţi decât la femei,

explicaţia fiind aportul alimentar mai redus în fier şi pierderile menstruale prezente la femei.

aplazia emailului dentar sau căderea precoce a dinţilor sunt întâlnite mai frecvent la femei.

limitarea la un sex survine atunci când organul ţintă este prezent doar la unul dintre cele două sexe (de exemplu, sindromul Morris se manifestă clinic doar la subiecţii de sex masculin).

Boli monogenice - noţiuni generale

SPECIFICITATEA DE ORGAN

noţiune calitativă → tipul şi localizarea efectelor fenotipice ale genei mutante.

boli dominante care afectează mai multe organe sau ţesuturi.

boala Rendu-Osler (angiomatoza hemoragică ereditară) → hemoragii în diferite organe prin ruperea unor hemangioame.

Boli monogenice - noţiuni generale

PLEIOTROPIA

efecte fenotipice distincte în ţesuturi diferite, datorite aceleiaşi mutaţii.

sindromul Marfan → mutaţie dominantă la nivelul genei fibrilinei → anomalii: scheletice, oculare cardiovasculare.

Boli monogenice - noţiuni generaleETEROGENITATEA GENETICĂ

apariţia de consecinţe fenotipice identice sau similaregenerate de mutaţii diferite în aceeaşi genă (E alelică) sau în gene diferite (E de locus).

eterogenitate alelică → mucoviscidoză → 700 de mutaţii în gena canalului transmembranar pentru ionul de clor (CFTR).

eterogenitate de locus → retinopatia pigmentară → transmitere dominant autosomal, recesiv autosomal sau recesiv legat de cromosomul X → diagnostic clinic insuficient pentru evaluarea riscului de recurenţă → analiza arborelui genealogic al familiei.

75

BG sunt determinate de mutaţii germinale sau somatice

Metode de identificare a mutaţiilor : directe (DIAGNOSTIC GENOTIPIC) prin analiza ADN, prin analiza cromozomilor;

indirecte prin studiul efectelor primare (proteină anormală) sau efectelor secundare (la nivel celular)

U.M.F IAŞI

76

Mutaţiile genice au 3 categorii de efecte:(ex., sicklemia)

MUTAŢIE GENICĂ

Gena β-globină

Efect primarProteină anormală

Hb S

Efect secundar – la nivel celular: hematii în seceră

Efecte terţiare

(semne şi simptome)

anemie

Hemoliză

splenomegalie

Ocluzie capilară

microinfarcte

U.M.F IAŞI

PRINCIPALELE DIRECŢIIDE PROFILAXIE A BOLILOR GENETICE

1. PROFILAXIA PRIMARĂ = evitarea APARIŢIEI bolilor genetice.(a). Prevenirea PRODUCERII şi/sau TRANSMITERII MUTAŢIILOR.(b) Prevenirea APARIŢIEI BOLII la persoanele sănătoase dar cu PREDISPOZIŢIE GENETICĂ la boală.

2. PROFILAXIA SECUNDARĂ = DEPISTAREA PRECOCE a bolii(c) Prevenirea NAŞTERII unui copil cu genotip anormal – la cuplurile cu risc genetic crescut.(d) Prevenirea MANIFESTĂRILOR bolilor genetice sau ale COMPLICAŢIILOR lor la un copil născut cu o boală genetică.

U.M.F IAŞI

4 DIRECŢII DE PROFILAXIE, fiecare cu mai multe ACŢIUNI

PROFILAXIA PRIMARĂ:Prevenirea PRODUCERII MUTAŢIILOR.

Prevenirea PRODUCERII MUTAŢIILOR:

1. Cunoaşterea şi evitarea agenţilor mutageni*.

Majoritatea mutaţiilor sunt spontane,

prin erori de replicare / distribuţie – frecvenţa lor creşte cu vârsta

2. Reducerea vârstei reproductive:

femei → sub 35 - 38 ani → risc ↑ copii cu s. Down;

bărbaţi → sub 45 ani → risc ↑ copii mutaţii genice (ex. neurofibromatoza 1; acondroplazia).

U.M.F IAŞI

Prevenirea TRANSMITERII MUTAŢIILOR.

Prevenirea TRANSMITERII MUTAŢIILOR la descendenţi, prin:

1. sfat genetic → determinarea riscului genetic;2. diagnostic pre-simptomatic (înaintea reproducerii) la purtătorii

sănătoşi de mutaţii dominante care se manifestă clinic tardiv (ex. ADPKD= boala polichistică renală a adultului cu transmitere AD);

3. depistarea heterozigoţilor sănătoşi (purtători de mutaţii recesive) → Na + Na = 25% copii bolnavi;

4. evitarea căsătoriilor consanguine → cresc frecvenţa întâlnirii heterozigoţilor.

U.M.F IAŞI

PROFILAXIA SECUNDARĂ:DEPISTAREA PRECOCE A BOLII

Prevenirea NAŞTERII unui copil cu genotip anormal –la cuplurile cu risc genetic crescut, prin adoptarea unei “opţiuni reproductive”:

1. contracepţia voluntară (temporară/definitivă) ±adopţie

2. fecundare in vitro (FIV) ← donatori de gameţi,3. diagnostic preimplantator,4. screening şi diagnostic prenatal.

U.M.F IAŞI

PROFILAXIA SECUNDARĂ: DEPISTAREA PRECOCE A BOLII

Prevenirea MANIFESTĂRILOR sau ale COMPLICAŢIILOR bolii la un copil născut cu o boală genetică, prin:

1. screening neonatal → depistarea precoce a nou-născuţilor cu genotip anormal dar fără semne clinice de boală în perioada neonatală (ex., fenilcetonurie);

2. diagnostic postnatal precoce;3. diagnostic pre-simptomatic.

U.M.F IAŞI

SCREENINGUL BOLILOR GENETICE

1. DEFINIŢIE, PRINCIPII, CLASIFICARE.

Screeningul genetic:

identificarea PREZUMTIVĂ într-o populaţie a unei boli sau a unui genotip anormal – ne manifest clinic,

prin aplicarea unor proceduri simple, rapide, ieftine şi cu acurateţe ridicată,

în scopul SORTĂRII persoanelor aparent sănătoase care

probabil AU boala de cele care probabil NU au boala.

U.M.F IAŞI

SCREENINGUL BOLILOR GENETICE PRINCIPII:

Testele de screening :

NU PUN DIAGNOSTICUL de boală ci IDENTIFICĂ un grup populaţional, la care vor trebui făcute

ALTE TESTE DIAGNOSTICE.

OBIECTIVE - printr-o intervenţie precoce adecvată: procesele patologice să fie prevenite (dgn+trtm); sau persoanele implicate să ia o decizie reproductivă informată.

U.M.F IAŞI

TIPURI DE SCREENING GENETIC

1. Screeningul populaţional: prenatal : DTN, sdr. Down ş.a; neonatal : fenilcetonurie; hipotiroidie congenitală, ş.a. postnatal : purtători sănătoşi de mutaţii:

- heterozigoţi (Na sau X NX a) pentru o boală recesivă frecventă(talasemie, fibroză chistică; distrofie musculară Duchenne, etc);- în viitorul apropiat → determinarea susceptibilităţii individuală la boli comune (medicină predictivă).

U.M.F IAŞI

SCREENINGUL BOLILOR GENETICE: CLASIFICARE

2. Screening familial:depistarea precoce a bolii la rudelor gr.I – II sănătoase ale bolnavului, pentru a preveni boala sau pentru a lua o decizie reproductivă informată. 4 tipuri: presimptomatic (ADPKD; hipercolesterolemie familială, boală

Huntington; cancer sân sau colon); purtătorii sănătoşi de an. cromozomiale echilibrate; heterozigoţii în boli recesive (fibroza chistică; distrofia musculară

Duchenne); premutaţii (în sdr. X fragil şi alte boli prin mutaţii dinamice).

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

1. Tratament simptomatic;2. tratament patogenic;3. terapie de substituţie;4. terapie celulară;5. terapie genică: de înlocuire a genei mutante, de blocare a expresiei genei mutante.

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

1. Tratamentul simptomatic = metode de tratament care acţionează la nivelul fenotipului:

metode educaţionale → prevenirea unor factori declanşatori ai bolii, metode farmacologice → combaterea unor manifestări / complicaţii, intervenţii chirurgicale → corecţia malformaţiilor congenitale.

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

2. Tratamentul patogenic = tratamentul tulburărilor metabolice sau biochimice asociate bolilor genetice

Metode farmacologice sau nutriţionale ce urmăresc: restricţia substratului (ex., fenilalanină în PKU), utilizarea unor căi metabolice alternative pentru îndepărtarea

metaboliţilor toxici (ex., allopurinolul în gută), utilizarea unor inhibitori metabolici (ex., statinele în

hipercolesterolemia familială), înlocuirea produsului deficitar (ex., tiroxina în hipotiroidie).

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

3. Metode de tratament care acţionează la nivelul proteinei deficitareTerapia de substituţie: ex, factorul VIII în hemofilia A; enzime în boli lizozomale.

4. Terapia celulară:- transplante de organe,- implantarea unor celule diferenţiate sau celule stem.

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

5. Terapia genică

Terapia genică constă în MODIFICAREA GENETICĂ a celulelor bolnavului prin transferul ADN (gene, fragmente de gene, oligonucleotide) sau ARN

(oligonucleotide anisens),

cu ajutorul unui vector.

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

Terapia genică somatică:

Introducerea unei gene în celulele somatice prin: manipularea celulelor proprii ale pacientului în afara

organismului (terapie ex vivo), tratarea celulelelor fără îndepărtarea lor din organism

(terapie in vivo).

U.M.F IAŞI

STRATEGII DE TERAPIE A BOLILOR GENETICE

Terapia genică somatică:Din punct de vedere al scopului urmărit, se pot deosebi:

terapia genică de ÎNLOCUIRE (numită şi terapia genică “clasică”) -transferul în celulele somatice a unei gene normale

corespunzătoare genei mutantecu ajutorul unui vector viral sau non-viral;

terapia genică de BLOCARE a expresiei genei cu ajutorul uno oligonucleotide anti-sens, ribozime ARN interferent

U.M.F IAŞI