fosforilaza

7/27/2019 FOSFORILAZA

1/26

UNIVERSITATEA DE TIIN E AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR BUCURE TI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Fosforilaza-referat-

- BUCURE TI -2011


2/26

2


3/26

Imaginea de pe copert: o diagram a dimerului glicogen fosforilaza a complexat cu AMP. Situl AMP

allosteric apare n galben, aminoacidul Ser14 foforilat portocaliu, situsurile de legare a glicogenului

albastru, situsurile catalitice ro u

Cuprins

Introducere ........................................................................................................................ 5

Capitolul I Fosforilaza.....................................................................................................6

I.1 Mod de ac iune ...............................................................................................6

I.2 Structur.........................................................................................................6

I.3 Piridoxalfosfatul cofactor esen ial pentru fosforilaz ................................10

Capitolul II Metode de determinare a activit ii enzimatice a fosforilazei....................13

II.1. Metoda 1....................................................................................................14

II.2. Metoda 2....................................................................................................17

Capitolul III Rspndirea i rolul fosforilazei...............................................................23

Concluzii...........................................................................................................................25

Bibliografie.......................................................................................................................26

3


4/26

4


5/26

Introducere

Enzimele sunt printre cele mai remarcabile biomolecule cunoscute datorit

specificit ii i puterii lor catalitice. n anul 1926, J.B.Summer izoleaz sub form de

cristale enzima ureaz. Summer prezint dovezi c aceste cristale sunt alctuite din

proteine i conchide contrar opiniilor anterioare c enzimele sunt proteine. Acest punct de

vedere nu a fost imediat acceptat. n anii 1930-1936, J. Northrop cristalizeaz enzimele

pepsina, tripsina i chemotripsina i astfel natura proteic a enzimelor este bine stabilit.

Astzi sunt cunoscute peste 2000 de enzime. Multe din ele au fost izolate n stare

omogen i cel pu in 200 au fost cristalizate 1.

Numrul enzimelor este extraordinar de mare deoarece pentru fiecare compus dinlumea vie trebuie s existe o enzim sau mai multe care s catalizeze formrea i

degradarea sa metabolic. Un organism cum este Escherichia coli posed 1000-2000 de

activit i enzimatice distincte. La un mamifer superior i la om, numrul speciilor de

proteine enzimatice este de ordinul miliardelor1.

Enzimele se caracterizeaz printr-o putere catalitic enorm, de mii sau chiar

milioane de ori mai mare dect a catalizatorilor neenzimatici. De exemplu,

descompunerea apei oxigenate este catalizat de ionii Fe3+ , ca i de enzima catalaz.

Dar activitatea catalazei este de 2 milioane de ori mai mare dect a Fe, 1 miligram de

protein enzimatic exercit o activitate catalitic egal cu 2 kg fier1.

Capitolul I - Fosforilaza

1 Curs de biochimie, UMF Ia i, 1998 pag 157-158

5


6/26

Fosforilazele sunt enzime care catalizeaz adi ia unei grupri fosfat de la ogrupare fosfat anorganic (fosfat+hidrogen) la un acceptor1.

A-B+P A + P-B

Ele includ enzime allosterice care catalizeaz ob inerea de glucozo-1 fosfat de laun substrat de tip glucan cum ar fi glicogenul, maltodextrina sau amidonul. La sfr itulanilor 1930, Carl i Gerty Cori au descoperit c glicogen-fosforilaza din mu chiul scheletic se prezint sub 2 forme interschimbabile: glicogen-fosforilaza A, activ dinpunct de vedere catalitic i glicogen-fosforilaza B, mai pu in activ. Studii ulterioare realizate de Earl Sutherland au artat c fosforilaza B predomin n mu chiul relaxat, darn timpul contrac iilor puternice, epineferina declan eaz fosforilarea unui reziduu specific de Serin din fosforilaza B, convertind-o n form mai activ, fosforilaza A.Glicogen-foforilaza este de multe ori amintit doar ca fosforilaz, deoarece a fost primafosforilaz descoperit. Numele scurtat a rmas n uzul comun i n literatur 2.

Fosforilaza este enzima care catalizeaz legarea unei molecule anorganice (deobicei, glucoz) cu un grup fosfat. Aceasta se gse te n ficat i n rinichi, unde este implicat n descompunerea glicogenului n glucozo-1-fosfat.

Fosforilaza are codul E.C.2.4.1.1. ceea ce nseamn c face parte din clasatransferazelor, subclasa 4 enzima este o glicoziltransferaza, cataliznd reac ia detransfer a unei monoglucide pn la o molecul acceptor (n cazul nostru, o molecul defosfat anorganic); 1 subsubclasa hexoziltransferaze, cataliznd reac ia de transfer aunei hexoze; 1 ordinea n subsubclasa prima hexoziltransferaz.

Denumire sistemica: 1,4--D-glucan: fosfat -D-glucoziltransferaza.

Reactia catalizata de fosforilaza:

Glicogenn + Pi Fosforilazaa Glicogenn-1 + -D-Glucozo-1-fosfat

[(1,4)--D-glucozil]n + fosfat anorganic = [(1,4)--D-glucozil]n-1 + -D-glucozo-1-fosfat

I.1 Mod de ac iune:

Glicogenul (fiind un polimer formt prin unirea unit ilor de glucoz legate 1,4 i

1,6-glicozidic) va fi scindat sub ac iunea conjugat a dou sisteme enzimatice distincte.Acestea sunt sistemul fosforilazic, capabil s desfac numai legturile 1,4-glicozidice ia a-zisele enzime de deramificare care desfac legturile 1,6-glicozidice. Legtura 1,4-glicozidic sufer o fosforoliz, adic ndeprtarea restului de glucoz terminal prin

1 http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphorylase2 Lehninger Principles of Biochemistry 5th edition, David L. Nelson, Michael M. Cox, W.H.FREEMAANN DC OMPANY, USA 2008, pg. 603

6


7/26

ac iunea fosfatului pentru a form glucozo-1-fosfat(G-1-P), iar molecula de glicogen areo molecul de glucoz mai pu in 1:

Enzima ac ioneaz repetitiv, la captul nereductor al lan ului de glicogen pn cnd ntlne te o deriva ie 1,6, punct n care nu mai poate ataca. Ulterior, trebuie s intervin enzima de deramificare care hidrolizeaz legturile 1,6-glicozidice fcnd astfeldisponibil lan ul polizaharidic pentru ac iunea fosforilazei.

I.2.Structura:

Fosforilaza din mu chiul scheletic se gse te n dou forme: fosforilaza A(form activ) i fosforilaza b (form inactiv). Fosforilaza se gse te sub form de tetramer cnd este activ i de dimer n form inactiv. Fiecare subunitate a tetramerului con ine fosfoserina care este esentiala pentru activitate catalitic. Fosforilaza a, sub ac iunea fosforilaz-fosfatazei care hidrolizeaz grupele fosfat de la serin-fosfat trece n doumolecule de fosforilaz b care se gse te sub form de dimer.

1 Curs de biochimie, UMF Ia i, 1998 pag 237-238

7


8/26

Fosforilaza b este transformat napoi la fosforilaza a activ nu printr-o reac iereversibil celei de mai sus, ci prin ac iunea a 4 molecule de ATP ce ac ioneaz asupra a dou molecule de fosforilaz b n prezen a enzimei fosforilaz-kinaza 1.

Pe aceast cale, raportul dintre fosforilaza a activ i b mai pu in activ n celul se schimb variind n felul acesta viteza de transformare a glicogenului n G-1-P.

La nivelul ficatului, fosforilaza este activat de AMP-ciclic i reglat de hormonii hiperglicemian i (adrenalina i glucagonul), iar n mu chi numai de ctre adrenalin. Activarea fosforilazei b are loc n special cnd este necesar producerea unei cantit i mai

mari de glucoz n cazul unui efort fizic intens.n cazul amilozei, procesul continu pn la transformarea complet a catenelor

liniare n G-1-P. n cazul amilopectinei, partea ramificat a glicogen-fosforilazei i nceteaz activitatea cu 4 resturi de glucoz naintea ramifica iilor 1,6--glicozodice. La acest nivel intervin enzimele de deramificare: 1,4-1,6 glucan-transferaza i 1,6-glucozidaza care catalizeaz transferul a 3 resturi de glucoz din partea ramificat n

1 Curs de biochimie, UMF Iasi, 1998 pag 237-238

8


9/26

partea liniar, continuat de scindarea hidrolitic a restului de glucoz legat 1,6. Dupscindarea legturilor 1,6, procesul de glicoliz continu pn la transformarea complet aglicogenului n G-1-P.1

Structurile de nalt rezolu ie n raze X a fosforilazei A i fosforilazei b au fost

determinate de Robert Fletterick i Louis Johnson. Structura fosforilazei B, n lipsa fosfatului legat la Ser, este foarte similar cu fosforilaza A. Ambele structuri au doudomenii, un domeniu N-terminal (resturile 1 315; cel mai mare domeniu cunoscut) i un domeniu C-terminal (resturile 485 842). Domeniul N-terminal este mpr it mai departe ntr-un subdomeniu de interfa (1-315), ce include situsul de modificare covalent (Ser 14), situsul efector allosteric i restul de contacte intersubunit i din dimmer i un subdomeniu de legare a glicogenului (resturile 316 - 484) ce con ine situsul de depozitare a glicogenului. Situsul catalititc este localizat la centrul subunit ii unde aceste dou subdomenii se unesc mpreuna cu domeniul C-terminal.

2

Glicogenul formeaz un L-helix cu 6.5 resturi de glucoz per tur, similar cu -amilaza. Un cervix de aprox 30 A lungime pe suprafa a monomerului de fosforilaz are

aceea i raz a curburii precum glicogenul, conectnd situsul de deopozitare a glicogenului cu situsul de activare, ce l fosforileaz. Avnd n vedere c cervixul poateprimi 4-5 resturi de glucoz dintr-un lan , dar este prea ngust s permit i oligozaharide

1 Ivas E., Trinca L.C., Procese metabolice in organismele animale, USAMV Ion Ionescu de la Brad, IasiFacultatea de zootehnie, Specializarea zootehnie, Invatamant la Distanta, 2002 pag 23-242 Desen schematic al glicogen-fosforilazei aratand diferite situri de legatura ale enzimei (Biochemistry Voet&Voet, pagina 487)

9


10/26

ramificate, acesta ofer un raionament clar pentru incapacitatea fosforilazei de a despicaresturi de la mai puin de cinci uniti apropiate de un punct de ramificare.

Probabil c situl de stocare al glicogenului cre te eficien a catalitic a fosforilazei, permi ndu-i s fosforileze multe resturi de glucoz pe aceea i molecul de glicogen fr s trebuiasc s disocieze complet i s se reasocieze ntre ciclurile catalitice. 1

I.3 Piridoxalfosfatul cofactor esen ial pentru fosforilaz

Fosforilaza con ine piridoxal-5-fosfat (pyridoxal-5-phosphate PLP) i are nevoie de ea pentru a fi activ. Acest derivat de la vitamina B6 este legat covalent de fosforilazprintr-o baz Schiff la aminoacidul Lys 680. PLP este legat similar ntr-o varietate marede enzime implicate n metabolismul aminoacizilor, unde este un cofactor esen ial n reac iile de transaminare. Mecanismul prin care PLP particip la reac iile fosforilazei trebuie s difere de cele din alte enzime pentru c, de exemplu, reduc ia bazei Schiff cu

1 Biochemistry Second Edition Donald Voet & Judith G. Voet John Wiley & Sons, INC. 1995 pagina486-4872 Structura X-ray a glicogen-fosforilazei din mu chiul de iepure (Biochemistry Voet&Voet, pagina 487)

10


11/26

NaBH4 ( -HC=N- -H2C-NH- ) nu are nici un efect asupra activit ii fosforilazei, n timp ce enzimele PLP-dependente din metabolismul aminoacizilor sunt inactivate.

Acesta este un exemplu interesant al oportunismului naturii n folosirea aceluia i cofactor pentru a realiza reac ii chimice diferite. Studii extinse ale fosforilazei utiliznd analogi ai PLP-ului n care diferite pr i ale moleculei lipsesc sau sunt modificate indic faptul c numai gruparea fosfat a moleculei particip n procesul catalitic. ntr-adevr,structura deslu it prin raze X arat c numai gruparea fosfat a PLP-ului se afl n

apropierea sitului activ al fosforilazei. Aceast grupare fosforil func ioneaz cel mai probabil ca un catalist acido-bazic.1

Secven a de aminoacizi a fosforilazei a fost anun at n 1977 2, la timp pentru ajuca un rol important n studiile de cristalografie. Fiecare monomer con ine 841 aminoacizi i mpreun cu coenzima i fosfatul de pe Ser-14, are o mas molecular de 97.412 kDa pentru fosforilaza A. De atunci, aproape toat secven a a fost determinat pentru maltodextrin-fosforilaza din E. coli i fosforilaza gsit n cartof. n plus, secven a din jurul situsului fosforilabil i situsului coenzimei a fost determinat la fosforilaza din

drojdie i mu chiul de Caine-de-mare (Squalus acanthias). Exist aproape 100% omologie pentru resturile din jurul coenzimei pentru toate

aceste fosforilaze, n plus, unde resturile ce formeaz situsurile active sunt cunoscute

1 Biochemistry Second Edition Donald Voet & Judith G. Voet John Wiley & Sons, INC. 1995 pagina486-487-4892Complete amino acid sequence of rabbit muscle glycogen Phosphorylase. - Titani, K., Koide, A.,Ericsson, L. H., Kumar, S., Wade, R., Walsh, K. A., Neurath, H., andFisher, E. (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA - Biochemistry 74, 4762-4766.

11


12/26

(mu chi de iepure, E.coli i cartof) omologia se apropie de 100%. Asta sugereaz c structura de baz a tuturor fosforilazelor este remarcabil de similar. Cele mai maridiferen e apar n resturile ce formeaz situsul de stocare a glicogenului n enzima din mu chiul de iepure, n vreme ce la E. coli i la cartof enzimele nu au acest situs. Astfel enzimei din E. coli i lipsesc primele 17 resturi din fosforilaza din mu chi i deci, i

Serina fosforilabil. Fosforilaza din cartof, de asemenea prezint o mic omologie pncnd se ajunge la restul 80 al secven ei enzimei din mu chi. n enzima de Squalus acanthias, 12 din 14 resturi din jurul serinei foforilabile sunt identice cu enzima dinmu chi i enzimele interconvertible sunt liber interschimbabile. Cu toate acestea, restul fosforilabil din drojdie este o treonin ntr-o secven care nu este similar celor care con in Serina fosforilabil n alte fosforilaze.

Studiile secven ei prezint o imagine consistent a unei enzime antice care a prezentat o foarte puternic conservare a secven ei de aminoacizi implicat n mecanismul catalitic i n structura de baz a proteinei. Din punct de vedere evolu ionar, diferen a major are legatur cu resturile N-terminale unde se gsesc cele mai multe

elemente de control, incluznd i interconversia prin fosforilare, legarea AMP i activarea i interac iile dintre subunit i 1.

Capitolul II Metode de determinare a

activit ii enzimatice a fosforilazei

1 The Enzymes Edited by Paul D. Boyer, Edwin G. Krebs Volume 27 Control by phosphorylation PartA, Academic Press INC, 1986

12


13/26

Pentru a msura activitatea catalitic a unei enzime este esen ial n primul rnd s

identificm schimbrile de natur chimic ce au loc la conversia unui substrat/substrate n

produs/produ i. n prezent, literatura de specialitate ne ofer o incredibil varietate deactivit i enzimatice, grupate n func ie de reac ia pe care o catalizeaz (de exemplu:

oxido-reduceri, transfer de grupri, eliminri, izomerizri, rearanjamente, condensri,

carboxilri, etc.).

n orice caz, o determinare enzimatic se bazeaz pe abilitatea de a distinge ntre

propiet ile fizico-chimice ale unui substrat dat i cele ale unui produs, ntr-o manier

cuantificabil.

Pe scar larg, metode similare de msurare a activit ii au fost aplicate la enzime

variate, clasificate n subgrupe; ar fi prudent s concepem o metod avnd n vedere

metodele stabilite deja pentru enzime omoloage din organisme diferite sau pentru enzime

diferite ce catalizeaz o reac ie asemntoare.

Ideea principal a activit ii enzimatice este asigurarea msurtorii vitezelor de

reac ie ini iale, fie pentru scderea de reactant sau cre terea n produs de reac ie, la timpi

corespunztori unei conversii 5 %. Asta ne ofer o bun aproximare a vitezei ini iale la

nceputul unei reac ii sau la o concentra ie ini ial de substrat. 1

1Methods in enzymology, volume 463, Guide to Protein Purification,2nd Edition, Edited by Richard R. Burghess, Murray P. Deutscher, Academic Press, 2009, USA, pagina 65

13


14/26

II.1 Metoda 1

Principiu

Glicogenn + Pi Fosforilazaa Glicogenn-1 + -D-Glucozo-1-fosfat

-D-Glucozo-1-fosfat PGLUM-D-glucozo-6-fosfat

-D-glucozo-6-fosfat+ -NADP+ G-6-PDH 6-fosfogluconat + -NADPH + H+

* Pi = fosfat anorganic

-NADP+ = nicotinamidadenindinucleotid fosfat, form oxidat

-NADPH + H+ = nicotinamidadenindinucleotid fosfat, form redus

G-6-PDH = glucozo-6-fosfat dehidrogenaza

PGLUM = fosfoglucomutaza

Reactivi i solu ii

1. solu ie tampon fosfat de potasiu 0,5 M, pH=6,8, T=30C2. solu ie glicogen 4%

3. clorur de magneziu 0,3M

4. EDTA 0,1M

5. -NADP+ 6,5 mM (preparat proaspt)

6. solu ie -D-glucozo-1,6-difosfat 0,1% (G-1,6-DIP)

7. G-6-PDH

8. PGLUM

9. -glicerofosfat 40 mM cu solu ie cistein 80 mM, pH=6,8, T=30C

10. solu ie enzim fosforilaz a preparat nainte de utilizare n solu ia 9, rece

Mod de lucru

Se prepar o solu ie de reac ie prin pipetarea urmtorilor reactivi :

Reactiv Cantitate (ml)

Ap deionizat 99.50

14


15/26

Reactiv 1 15.00

Reactiv 2 17.50

Reactiv 3 0.67

Reactiv 4 0.15

Reactiv 5 10.00

Reactiv 6 0.50

Se omogenizeaz i se ajusteaz pH-ul la 6.8 cu 100mM HCl sau 100 mM NaOH(daca este nevoie) i temperatura la 30C.

Apoi se vor adauga:Reactiv PROBA (ml) MARTOR (ml)

Solu ie de reac ie 2.70 2.70

G-6-PDH 0.10 0.10

PGLUM 0.10 0.10

Se omogenizeaz, se aduce la temperatura de 30C i apoi se vor aduga:

Reactiv PROBA (ml) MARTOR (ml)

Reactiv 9 ----- 0.10

Reactiv 10 (enzima) 0.10 -----

Amestecati imediat i inregistrati cresterea A 340nm pentru aproximativ 10 minute.Obtineti o medie a A340nm / minut utilizand rata lineara maxima atat pentru proba cat ipentru martor.

Calcul

Unitati/ml enzim =0.1x6.22

Fx3xmartor)/minA-proba/min(A 340nm340nm

3 = Volumul total (n mililitri) de probF = factorul de diluie6.22 = Coeficientul mM de extincie a -NADH la 340 nm0.1 = volumul (n ml) de enzim folosit

Uniti / mg solid =enzimaml/solidmg

enzimaml/unitati

15


16/26

Uniti / mg protein =enzimaml/proteinamg

enzimaml/unitati

O unitate va form 1 mol de -D-glucozo-1-fosfat din glicogen i o-fosfat pe minut lapH=6,8, la 30C, masurata printr-o metoda ce con ine fosfoglucomutaza, -NADP+ i

glucozo-6-fosfat dehidrogenaza.

Concentratii finale:

n 3,00 ml solutie de reac ie, concentra iile finale vor fi: Fosfat de potasiu: 51mMGlicogen: 20%Clorur de magneziu: 1,4 mMEDTA: 0,10 mM-NADP+: 0,44 mMG-1,6-DIP: 0,0003%

-glicerofosfat: 1,3 mMcisteina: 2,7 mM1 unitate glucozo-6-fosfat dehidrogenaz1 unitate fosfoglucomutaz0,025 unit i fosforilaz a

Note:

1. O unitate glucozo-6-fosfat dehidrogenaz va oxida 1 mol de D-glucozo-6-fosfatla 6-fosfo-D-gluconat pe minut n prezen de -NADP+ la pH=7,4, la 25C.

2. O unitate fosfoglucomutaz va transform 1 mol de -D-glucozo-1-fosfat n 1mol de -D-glucozo-6-fosfat pe minut la pH=7,4, la 30C.1

1http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/phosphorylasea.pdf

16
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/


17/26

II.2 Metoda 2

Reactivi i solutii:

Solutie stoc 1 M glicerofosfat, pH 8.0

Solutie stoc 60 mM acetat de Mg, pH 7.3

Solutie tampon pentru pastrarea enzimei concentrate:

50 mM Tris, pH 8.0

50 mM glicerofosfat, pH 8.0

40% vol/vol glicerol

2 mM EDTA, pH 8.0

0.1% -mercaptoethanol

2 mM solutie ATP (2 mM ATP preparat n 60 mM acetate Mg, pH 7.3)

Solutie stoc glicogen fosforilaza b (Sigma catalog #P-6635): Dizolvati enzima

liofilizata n aproximativ 1000 unitati/ml n solutie tampon pentru enzima.

Separati parti alicote de 20 l i pastrati la 20C.

Solutie stoc glicogen fosforilaza kinaza (Sigma catalog #P-2014): Dizolvati

enzima liofilizata n aproximativ 2500 unitati/ml n solutie tampon pentru enzima.

Separati parti alicote de 20 l i pastrati la 20C.

30 mM solutie cisteina, pH 7.0 (preparati utilizand L-cisteina i pH pn la 7.0 cu

bicarbonat de sodium)

80 mM cysteine, pH 6.8 (preparati utilizand L-cisteina i pH pn la 6.8 cu

bicarbonate de sodium)

250 mM Tris tampon pH 7.7

250 mM glicerofosfat (preparat n 250 mM Tris,

pH 7.7)

40 mM glicerofosfat (preparat n 80 mM cysteine, pH 6.8 i ajustat pH-ul la 6.8

cu 1 M HCl sau 1 M NaOH daca este necesar)

Solutie glicogen fosforilaza b (100 unitati/ml) Diluati solutia stoc de enzima

1:10 n 30 mM cisteina pH 7.0

30 mM ATP solutie (preparata n apa deionizata i pH la 7.7 cu 1 M NaOH)

17


18/26

Solutie glicogen fosforilaza kinaza (diluati solutia stoc 1:125 n 30 mM cisteina,

pH 7.0

100 mM solutie acetate de Mg (preparat n apa deionizata cu acetat de Mg

tetrahidrat i ajustat pH-ul la 7.7 cu 1 M NaOH

500 mM Tampon fosfat de potastiu, pH 6.8

4% (wt/vol) solutie glicogen (Sigma catalog #G-8876)

300 mM MgCl2

100 mM EDTA, pH 8.0

6.5 mM solutie -nicotinamida adenina dinucleotid fosfat (-NADP) (preparat n

apa deionizata imediat nainte de utilizare)

0.1% (wt/vol) solutie -D-glucose-1,6-difosfat (preparat n apa deionizata) Solutie fosfoglucomutaza (10 unitati/ml)Sigma catalog #P-3397 (preparat n

apa deionizata imediat nainte de utilizare).

Solutie glucoz-6-fosfat dehidrogenaza (10 unitati/ml)Sigma catalog #G-6378

(preparat n apa deionizata imediat nainte de utilizare)

Solutie enzima glicogen fosforilaza a (2 unitati/ml)Sigma catalog #P-1261

Dilute a 1000-units/ml stock n concentrated enzyme storage buffer 1:500 n 40

mM glycerophosphate solution Solutie control glicogen fosforilaza b (2 unitati/ml) Diluati enzima stoc 1:500 n

solutia 40mM glycerofosfat

Solutie control glicogen fosforilaza b cu AMP (2 units/ml) Diluati solutia

enzimatica stoc 1:500 n solutie 40mM glicerofosfat continand 60 mM AMP.

Etape ale metodei:

1. Se pipeteaza n 3 microtuburi de centrifuga de 1.5ml substantele ca n tabelul demai jos. . Solutia stoc de glicogen fosforilaza i solutia de glicogen fosforilaza kinaza

trebuiesc diluate la concentratiile necesare cu 30 mM tampon cisteina, pH 7.0. Pentru a

incepe determinarea activitatii fosforilazei kinaza, se adauga 25 l de solutie 30 mM

ATP n fiecare tub i pipetati rapid n sus i n jos de cateva ori pentru a amesteca. Toate

cele trei reactii pot fi realizate simultan, ntarziind inceputul fiecarei reac ie cu 30

18


19/26

secunde. La exact 5 minute i 10 minute, se preia 100 l din fiecare reac ie i este oprita

prin adaugarea de 1.9 ml de 40 mM glicerofosfat pH 6.8 n eprubete. Fiecare din aceste

eprubete stop (6 la numar) trebuiesc aranjate naintea inceperii reactiilor i pe fiecare

eprubeta trebuie scris numarul reac iei i timpul (ex. Ep 1 5 min.). Aceste eprubete vor

fi utilizate la determinarea glicogen fosforilazei a, prin metoda descrisa mai jos. Puneti

toate aceste eprubete pe gheata pn cnd este gata etapa urmatoare.

Eprubeta Volum 30mMcisteina pH

7.0

Volum250mM

glicerofosfat

Volum100mM acetat

de Mg

Volum 100unitati/ml

fosforilaza b

Volum 20unitati/mlfosforilaza

kinaza1 122.5 l 62,5 l 25 l - 15 l

2 37,5 l 62,5 l 25 l 100 l -3 22,5 l 62,5 l 25 l 100 l 15 l

2. Se pregateste o solutie cocktail din urmatoarele solutii stoc (cantitatea estesuficienta pentru cel putin patru grupe):

Solutie cocktail Volum (ml)

Apa distilata 099.5500 mM tampon fosfat de potasiu, pH 6.8 15.004% (g/vol) glicogen 07.50

300 mM MgCl2 00.67100 mM EDTA 00.156.5 mM -NADP 010.00.1% (g/vol) glucoz-1,6-difosfat 00.50

3. 2.7ml din aceasta solutie cocktail se trece n 10 eprubete mici numerotate de la

A la J. La fiecare din aceste eprubete se adauga 100 l din solutia de 10 unitati/ml

glucoz-6-fosfat dehidrogenaza i 100 l din solutia de 10 unitati/ml fosfoglucomutaza.

Volumul total n fiecare eprubeta va fi de 2.9ml.

4. n eprubeta A se adauga 100 l apa i se amesteca timp de 10 secunde. La intervale de 1 minut, se masoara i se inregistreaza absorbtia la spectofotometru la A340.

Continuati sa luati masuratori pn cnd reac ia ajunge la o valoare stabile n timp (cel

putin 5 minute). Aceasta este o reac ie negativ de control ce nu con ine glicogen

fosforilaza sau glicogen fosforilaz-kinaza.

19


20/26

5. Realizati aceeasi procedura utilizand eprubetele B pn la G, adaugand 100 l din

diferitele reactii de determinare a fosforilaz-kinazei. Fiti atenti care reac ie a fosforilaz-

kinazei corespunde carei eprubete (ex. Eprubeta B este reac ia fosforilazei kinazei 1

5min; eprubeta C corespunde reac iei fosforilazei kinazei 1 10min, etc.). Se masoara i

se inregistreaza absorbanta (A340) la intervale de 30 secunde pentru cel putin 5 minute,

sau pn cnd valoarea se stabilizeaza n timp.

6. Se repeta pentru eprubeta H adaugand 100 l solutie de 2 unitati/ml fosforilaza

a (acesta este un control pozitiv pentru determinarea glicogen fosforilazei a). Se

masoara i se inregistreaza absorbanta (A340) la intervale de 30 secunde pentru cel putin

5 minute, sau pn cnd valoarea se stabilizeaza n timp.

7. Se repeta pentru eprubeta I adaugand 100 l solutie de 2 unitati/ml fosforilaza b

(acesta este un control negativ pentru determinarea glicogen fosforilazei a). Se masoarai se inregistreaza absorbanta (A340) la intervale de 30 secunde pentru cel putin 5

minute, sau pn cnd valoarea se stabilizeaza n timp.

8. Se repeta pentru eprubeta J adaugand 100 l solutie de 2 unitati/ml fosforilaza b

n 60mM AMP. Acesta determinare se realizeaza pentru a arata activrea allosterica a

glicogen fosforilazei b de catre AMP. Se masoara i se inregistreaza absorbanta (A340)

la intervale de 30 secunde pentru cel putin 5 minute, sau pn cnd valoarea se

stabilizeaza n timp.9. Se realizeaza un grafic a variatiei absorbantei n functie de timp pentru cele 10

reactii catalizate de glicogen fosforilaza (A-J). Determinati curba pentru fiecare grafic. Ar

fi de ajutor daca ati construi patru grafice, pentru eprubetele B-J: un grafic continand

datele pentru eprubetele B-C, altul pentru eprubetele D-E, altul pentru F-G i al patrulea

va con ine datele pentru eprubetele H-J.

10. Scopul acestei analize este de a determina concentratia (unitati per mililitru) de

fosforilaza kinaza utilizate n aceste reactii, deasemenea i concentratia de glicogen

fosforilaza a (unitati per mililitru) prezenta n fiecare reac ie dupa 5 minute i 10

minute. O unitate de fosforilaza kinaza reprezinta cantitatea de enzima ce va converti 1

mol de fosforilaza b n fosforilaza a per minut. O unitate de fosforilaza a reprezinta

cantitatea de enzima ce va produce 1 mol de glucoz-1-fosfat din glicogen per minut.

20


21/26

11. Determinarea activitatii glicogen fosforilazei prezente n eprubetele D pn la J se

face cu prin aplicarea urmatoarei formule :

AE [unitati/ml enzima] = ( A340/min test - A340/min martor)*(20)*(3 ml) / (6.22 mM-1

cm-1

)(l)(0.1 ml enzima)unde :

test = alta eprubeta dect A pn la C a carei activitate este testata; martor = martorul pentru reactiile H pn la J este eprubeta A (glicogen

fosforilaza absenta), martorul pentru reactiile D pn la F este eprubeta B(5 minute, glicogen fosforilaza b lipsa). Martorul pentru reactiile E i Geste eprubeta C (10 minute, fara glicogen fosforilaza b); 20 = factorul dedilutie (solutia enzimatica de glicogen fosforilaza a fost diluata nainte dedeterminare);

3 ml = volumul total de glicogen fosforilaza determinata;

6.22 mM-1 cm-1 = coeficientul de extinctie milimolara a NADPH la 340nm;

l = latimea cuvei spectofotometrice; 0.1 ml enzima = volumul de fosforilaza kinaza determinate sau volumul de

enzima utilizat n determinarea glicogen fosforilazei.

Nota: Nu este necesar factorul de dilutie (20) pentru calcularea activitatii glicogenfosforilazei n tuburile H J, deoarece solutia stoc de enzima a fost adaugata direct ladeterminare. n caz contrar, aceeasi formula poate fi utilizata pentru eprubetele H pn laJ.

12. Determinarea concentratiei de glicogen fosforilaza kinaza prezenta n reac ia 3

(etapa 1) folosind urmatoarea ecuatie:

AE [unitati/ml enzima] = (unitati glicogen fosforilaza test/ml) - (unitati glicogenfosforilaza martor/ml)(20) / (timp)*(0.015ml)

unde: test = punctele pentru 5 minute i 10 minute a reac iei 3 pentru fosforilaza

kinaza (eprubeta F, respectiv G); martor = punctele timp 5 minute i 10 minute a reac iei 2 pentru

fosforilaza kinaza (eprubeta D i E); 20 = factorul de dilutie (de cate ori a fost diluata solutia de glicogen

fosforilaza nainte de determinare); timp = numarul de minute (5 sau 10) a determinarii fosforilazei kinaze; 0.015ml = volumul de fosforilaza kinaza utilizat n reactiile 1 i 3.

21


22/26

13. Dupa terminarea acestor calcule veti obtine dou valori a concentratiilor pentruglicogen fosforilaza kinaza prezente n determinare, bazate pe o perioada de 5minute i una pentru 10 minute. De la aceste date, se determina media glicogenfosforilaza kinaza prezenta n determinare (unitati/ml enzima).

Se poate compara activitatea glicogen fosforilazei intre reactiile dintre eprubeta I i Ji se poate observa ce effect are AMP-ul asupra activitatii fosforilazei b, daca a crescutsau s-a micsorat activitatea n functie de acest activtor allosteric.1

Componente Eprubete

A B C D E F G H I J

Solutie cocktail 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7Glucoza-6-FosfatDehidrogenaza (10unitati/ml)

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Fosfoglucomutaza(10 unitati/ml)

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

AD 0.1 - - - - - - - - -Etapa 1(eprubetele)

- 1 5min

1 10min

2 5min

2 10Min

3 5min

3 10min

- - -

Volum din primaetapa (ml)

- 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - - -

Fosforilaza a(2u/ml)

- - - - - - - 0.1 - -

Fosforilaza b(2u/ml)

- - - - - - - - 0.1 -

Fosforilaza b(2 u/ml n solutie 60mM AMP)

- - - - - - - - - 0.1

1 Experimental biochemistry Theory and exercises in fundamental methods Robert Switzer, LiamGarrity, 3rd edition, 1999, W. H. Freeman page - 243

22


23/26

Capitolul 3 Rspndirea i rolul fosforilazei

Animalele i-au dezvoltat de-a lungul timpului o metod de stocare a glucozei ce

reduce nevoia de a cataboliza a proteinelor ca surs de energie. Principala form de

stocare a glucozei n mamifere este glicogenul. Depozitarea glucozei sub form depolimer reduce ncrctura osmotic intracelular, a adar reducnd cantitatea de ap

pentru hidratare i crescnd densitatea energiei glucozei stocate.

Glicogenul este prezent n aproape toate celulele corpului, dar n abunden n

ficat i mu chi. Cantitatea stocat n mu chi variaz foarte mult n func ie de cererea

metabolic i fiziologic, dar ntr-un individ aflat n repaus, dupa o mas, ficatul con ine

de obicei aproximativ 4-7% din masa sa glicogen, iar mu chiul cam 1%. Dar pentru c n

corpul nostru avem de 10 ori mai mult esut muscular dect hepatic, cantitatea total de

glicogen stocat n mu chi este mai mare dect cea din ficat.

Mu chiul necesit o surs rapid de glucoz pentru a alimenta glicoliza anaerob

atunci cnd n timpul contrac iilor musculare sngele poate s aib un aport insuficient de

oxigen i energie. Ficatul, n cele mai multe condi ii, oxideaz acizii gra i pentru acest

lucru; cu toate acestea, ficatul este responsabil i pentru men inerea glicemiei n timpul

perioadelor mice de post. Glicogenul din ficat este convertit n primul rand ca raspuns la

disponibilitatea glucozei sau a precursorilor gluconeogenici. Glicogenul din mu chi

variaz mai pu in n func ie de semnalele de nutri ie, ci depinde mai mult de rata

contrac iilor musculare sau a metabolismului oxidativ (respirarea esuturilor). 1

Avnd n vedere aceste no iuni de fiziologie, ne putem da seama unde n organism

are importante implicatii fosforilaza.

Incapacitatea organismului de a sintetiza aceast enzim sau imposibilitatea

activrii/regulrii acesteia duce la boli de metabolism glucidic.

Una dintre acestea este boala lui McArdle-Schmid-Pearson (deficit de miofosforilaz,

glicogenoz de tip V): boal ereditar cauzat de un deficit al fosforilazei n celulelemusculare. Se manifest prin crampe dureroase i printr-o oboseal muscular intens, n

timpul i dup un efort fizic important. Simptomele pot fi atenuate prin ingerarea de

glucoz sau de fructoz nainte de un efort fizic.2 Boala se transmite autozomal recesiv.

1 Medical Biochemistry, 4th Edition, N.V. Bhagavan, Academic Press, 2002, USA, pagina 2832 http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/mcardle-schmid-pearson-boala-lui_6082

23
http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/boala-ereditara_2936http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/boala-ereditara_2936http://www.sfatulmedicului.ro/Diverse/crampele-musculare_1251http://www.sfatulmedicului.ro/Boli-ale-inimii-si-vaselor/care-este-frecventa-cardiaca-optima-in-timpul-efortului-fizici_176http://www.sfatulmedicului.ro/Boli-ale-inimii-si-vaselor/care-este-frecventa-cardiaca-optima-in-timpul-efortului-fizici_176http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/simptom_2370http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/simptom_2370http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/glucoza_3619http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/fructoza_987http://www.sfatulmedicului.ro/Boli-ale-inimii-si-vaselor/care-este-frecventa-cardiaca-optima-in-timpul-efortului-fizici_176http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/boala-ereditara_2936http://www.sfatulmedicului.ro/Diverse/crampele-musculare_1251http://www.sfatulmedicului.ro/Boli-ale-inimii-si-vaselor/care-este-frecventa-cardiaca-optima-in-timpul-efortului-fizici_176http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/simptom_2370http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/glucoza_3619http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/fructoza_987http://www.sfatulmedicului.ro/Boli-ale-inimii-si-vaselor/care-este-frecventa-cardiaca-optima-in-timpul-efortului-fizici_176


24/26

Se manifesta prin fatigabilitate anormal, cu crampe musculare dureroase la efort i,

uneori, mioglobinurie, con inut mare al glicogenului n mu chi (2.5-4.1% fata de 0.2-

0.9% valoarea normala), scderea acidului lactic i piruvic din snge dup exerci ii fr

nici o scdere de pH post-exerci iu; rspuns hiperglicemic normal la epineferin (deci

activitate enzimatic normal n ficat).

Glicogenoza de tip VI, cu localizare hepatic, determinat de un deficit

par ial n fosforilaz, avnd drept consecin blocarea sintezei i partiala a

degradrii glicogenului. Clinic se observ o ntrziere a cre terii i

hepatosplenomegalie.1

Glicogenoza de tip IX este o boal hepatic congenital caracterizat prin

absen a fosforilazei i a altor enzime cu rol din metabolismul glicogenului, ceea ce

duce la hipoglicemii prin scaderea glicogenolizei i gluconeogenezei. 2

1 http://www.medical.news20.ro/word/GLICOGENOZA.html2 http://www.scritube.com/medicina/ALIMENTATIA-IN-HIPOGLICEMII21593.php

24


25/26

Concluzii

n aceast lucrare am cutat s acoperim ct mai bine aspecte generale ale

enzimologiei generale i, n principal informrii cu privire la enzima fosforilaza, o enzim important n procesul de metabolism glucidic al mamiferelor, respectiv omului.

Am atins i aspecte importante de biochimie structural i am observat ct de

importante sunt anumite elemente moleculare pentru activitatea enzimatic, de exemplu

valoarea aminoacidului Ser-14 i evolutia enzimei fr acest aminoacid n alte organisme,

sau importan a inhibitorilor i activatorilor enzimatici (ATP, G-6-P, respectiv AMP) i

influen a acestora asupra formei allosterice.

De i no iunile structurale sunt necesare pentru ntelegerea mecanismelor implicate

n func ionarea enzimelor i a complexelor enzimatice, este totu i insuficient. Baza

func ionrii lor st n dinamica structural a moleculelor din enzim.

De asemenea, nu trebuie s ignorm efectele pe care le produce absen a sau

inactivarea acestei enzime n organismul uman i animal, i anume tulburrile de

metabolism glucidic bolile McArdle, Hers. Important pentru viitoare cercetari, n

special n biotehnologii este faptul c izoforma glicogen-fosforilazei din creier a fost

propus drept biomarker pentru cancerul gastric (Shimada S, Matsuzaki H, Marutsuka T,

Shiomori K, Ogawa M - July 2001).

25


26/26

Bibliografie

1. Curs de biochimie, UMF Ia i, 1998

2. David L. Nelson, Michael M. Cox - Lehninger Principles of Biochemistry 5th

edition, W.H.F REEMAANN DC OMPANY, USA 2008, pg. 603

3. Donald Voet & Judith G. Voet Biochemistry 2nd Edition John Wiley & Sons,

INC. 1995 pagina 486-487-489

4. Ivas E., Trinca L.C. - Procese metabolice n organismele animale, USAMV Ion

Ionescu de la Brad, Iasi Facultatea de zootehnie, Specializarea zootehnie,

Invatamant la Distanta, 2002 pag 23-24

5. N.V. Bhagavan - Medical Biochemistry 4th Edition - Academic Press, 2002, USA,

pagina 283

6. Paul D. Boyer, Edwin G. Krebs - The Enzymes Volume 27 Control by

phosphorylation Part A, Academic Press INC, 1986

7. Richard R. Burghess, Murray P. Deutscher - Methods n enzymology, volume 463,

Guide to Protein Purification, 2nd Edition, Academic Press, 2009, USA, pagina

65

8. Robert Switzer, Liam Garrity - Experimental biochemistry 3rd edition Theory

and exercises n fundamental methods, 1999, W. H. Freeman page 2439. Titani, K., Koide, A., Ericsson, L. H., Kumar, S., Wade, R., Walsh, K. A., Neurath,

H., and Fisher, E.. - Complete amino acid sequence of rabbit muscle glycogen

Phosphorylase. - (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA - Biochemistry 74, 4762-

4766.

10. http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphoryl

asea.Par.0001.File.dat/phosphorylasea.pdf

11. http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphorylase

12. http://www.sfatulmedicului.ro/dictionar-medical/mcardle-schmid-pearson-boala-

lui_6082

13. http://www.medical.news20.ro/word/GLICOGENOZA.html

14. http://www.scritube.com/medicina/ALIMENTATIA-IN-HIPOGLICEMII21593.php
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphorylasehttp://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/phosphorylasea.Par.0001.File.dat/http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphorylase

fosforilaza

Documents