TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

CUPRINSCapitolul 1. Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. Caracteristicile proceselor biotehnologice Fazele unui proces biotehnologic Sinteza schemelor tehnologice de prelucrare n aval de bioreactor Criterii principale pentru o prelucrare eficient n aval de bioreactor 1 3 7 7 15 18 18 21 24 24 26 27 35 35 38 44 44 46 47 48 48 49 51 52 53 53 i

Capitolul 2. Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 2.1. Condiionarea lichidului de fermentaie prin floculare i coagulare 2.2. Separarea prin sedimentare gravitaional 2.3. Separarea prin filtrare 2.3.1. Mecanismul filtrrii 2.3.2. Teoria filtrrii. Posibiliti de mbunatire a filtrrii 2.3.3. Alegerea i dimensionarea echipamentelor de filtrare 2.4. Separarea prin centrifugare 2.4.1. Bazele teoretice ale sedimentrii n cmp de fore centrifugal 2.4.2. Tipuri de centrifuge utilizate n procesele de bioseparare 2.4.3. Aplicaii ale separrii centrifugale n biotehnologii 2.4.3.1. Separarea drojdiilor 2.4.3.2. Separarea bacteriilor 2.4.3.3. Separarea celulelor animale 2.4.3.4. Separarea resturilor celulare 2.4.3.5. Recuperarea i splarea corpilor de incluziune 2.4.3.6. Fracionarea plasmei umane 2.5. Separarea prin microfiltrare 2.6. Centrifugare sau microfiltrare ? Capitolul 3. Dezagregarea masei celulare 3.1. Susceptibilitatea la rupere a celulelor

Cuprins 3.1.1. Celule animale 3.1.2. Celule vegetale 3.1.3. Fungii i drojdii 3.1.4. Bacterii 3.2. Metode de dezagregare a celulelor 3.2.1. Metode mecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor 3.2.1.1. Forfecarea lichidului cu ajutorul ultrasunetelor 3.2.1.2. Forfecarea lichidului prin agitare mecanic 3.2.1.3. Forfecarea lichidului prin presurizare 3.2.1.4. Forfecarea fazei solide prin mcinare 3.2.1.5. Forfecarea fazei solide prin presurizare 3.2.2. Metode nemecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor 3.2.2.1. Dezagregarea celulelor prin deshidratare 3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode fizice 3.2.2.3. Permeabilizarea celulelor prin metode chimice 3.2.2.4. Permeabilizarea celulelor prin metode enzimatice 3.3. Influena dezagregrii asupra proceselor ulterioare de separare Capitolul 4. Separarea prin extracie 4.1. Extracia fizic lichid lichid 4.1.1. Aspecte generale privind extracia lichid lichid 4.1.2. Aspecte particulare ale extraciei lichid lichid n bioprocese 4.1.2.1. Solveni de extracie 4.1.2.2. Echipamente de extracie 4.1.2.2.1. Extractoare centrifugale 4.1.2.2.2. Extractoare rotative cu agitare 4.1.2.2.3. Extractoare cu talere pulsate 4.1.2.2.4. Alte echipamente de extracie 4.1.3. Aplicaii ale extraciei lichid lichid n bioprocese 4.1.3.1. Extracia antibioticelor 4.1.3.2. Extracia alcoolilor 4.1.3.3. Extracia acizilor carboxilici 4.2. Extracia n sisteme apoase bifazice 4.2.1. Formarea sistemelor apoase bifazice 4.2.2. Mecanismul extraciei biopolimerilor 4.2.3. Proiectarea procesului de extracie n sisteme apoase bifazice 4.2.4. Aplicaii ale extraciei n sisteme apoase bifazice 4.2.5. Procesul tehnologic de extracie n sisteme apoase bifazice ii 53 54 55 55 57 58 58 59 60 63 66 67 67 67 68 69 71 73 74 74 75 76 77 78 83 84 85 86 88 90 90 92 92 95 98 100 101

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.2.6. Recuperarea chimicalelor i reducerea costurilor 4.2.7. Transpunerea la scar a extraciei n sisteme apoase bifazice 4.2.8. Aspecte economice ale extraciei n sisteme apoase bifazice 4.3. Extracia cu micele inverse 4.3.1. Formarea i proprietile micelelor inverse 4.3.2. Mecanismul extraciei n micele inverse 4.3.3. Factorii care influeneaz transferul biomoleculelor n micelele inverse 4.3.4. Reextracia din micele inverse 4.3.5. Procesul tehnologic de extracie cu micele inverse 4.3.6. Aplicaii ale extraciei cu micele inverse 4.3.6.1. Extracia cu micele inverse n prezena masei celulare 4.3.6.2. Izolarea i renaturarea proteinelor 4.3.6.3. Sinteza proteinelor n micele inverse 4.4. Extracia cu afroni 4.5. Extracia reactiv 4.5.1. Mecanismul extraciei reactive 4.5.2. Ageni de extracie 4.5.2.1. Derivai organofosforici 4.5.2.2. Amine cu mas molecular ridicat 4.5.2.3. Compui macrociclici 4.5.2.4. Sinergismul agenilor de extracie 4.5.3. Echipamente pentru extraci reactiv 4.5.3.1. Instalaii cu uniti distincte amestector decantor 4.5.3.2. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic 4.5.3.3. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic 4.5.3.4. Alte tipuri de extractoare 4.5.4. Extracia reactiv a produilor de biosintez 4.5.4.1. Extracia acizilor carboxilici 4.5.4.1.1. Extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici 4.5.4.1.2. Extracia acizilor carboxilici cu amine 4.5.4.2. Extracia aminoacizilor 4.5.4.2.1. Extracia aminoacizilor cu derivai organofosforici 4.5.4.2.2. Extracia aminoacizilor cu amine 4.5.4.2.3. Extracia aminoacizilor cu eteri-coroan i calixarene 4.5.4.3. Extracia antibioticelor 4.5.4.4. Alte aplicaii ale extraciei reactive 4.5.4.4.1. Extracia acizilor organici din produse naturale 4.5.4.4.2. Extracia vitaminelor 103 104 105 107 107 113 115 117 119 121 121 122 122 125 127 128 132 134 135 137 140 141 141 142 142 143 143 143 144 145 151 152 154 156 159 162 162 164 iii

Cuprins 4.5.4.4.3. Extracia selectiv a enantiomerilor 4.6. Extracia cu membrane lichide 4.6.1. 167 175

iv

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

1. Etapele i caracteristicile proceselor de biosintezNoiunea de biotehnologie nu nseamn acelai lucru pentru toat lumea. Unii vd biotehnologia reprezentnd toate formele de cercetare biologic, fie c este vorb de fabricarea brnzei, obinerea berii sau tehnologia ADN-ului recombinat. Alii consider c biotehnologie nseamn doar tehnici biologice moderne (ADN recombinat, tehnologii de hibridizare, anticorpi monoclonali). n timp ce unii consider biotehnologia drept un nou set de unelte n ldia cu scule a biologilor, pe Wall Street biotehnologia reprezint doar o surs de noi oportuniti i de riscuri financiare. O definiie destul de ampl consider biotehnologia ca fiind orice tehnic ce utilizeaz organisme vii sau pri ale acestora pentru a elabora sau modifica produse, pentru a mbunti plante sau animale, ori pentru a dezvolta microrganisme cu utilizri specifice. O a doua definiie mai restrns definete biotehnologia drept utilizarea industrial a ADN recombinat, a fuziunii celulare i a noilor tehnici de bioprelucrare [1]. O definiie nc actual este cea adoptat n 1978 de ctre Federaia European de Biologie: utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei i ingineriei n scopul obinerii unei aplicaii tehnologice (industriale), cu ajutorul microrganismelor, culturilor de celule i a prilor componente ale acestora [2]. Cuvntul biotehnologie provine din grecescul bios, care nseamn via (din care provine i biologia = tiina vieii) i din tehnologie, care la rndul su provine tot din limba greac, technos = meteug + logos = tiin. Utilizarea microorganismelor pentru a transforma materialele de origine vegetal sau animal n produse alimentare fermentate este cunoscut nc din antichitate. De atunci biotehnologiile au evoluat i s-au diversificat, la ora actual fabricndu-se un numr enorm de produse, de la relativ ieftinii solveni organici i bio-etanol, pn la produse costisitoare ca antibiotice, proteine terapeutice, vaccinuri, hormoni, etc. Un proces biotehnologic (bioproces) necesit o abordare pluri- i interdisciplinar. Punerea la punct a unui bioproces industrial necesit o strns colaborare ntre specialiti din domeniul biochimiei, geneticii, enzimologiei, microbiologiei, ingineriei 1

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez biochimice. Aceast abordare este evident dac ne uitm la etapele de dezvoltare necesare unui proces industrial de obinere a unui produs pe baz de ADN recombinat: insulin, hormon de cretere, interferon (fig. 1.1).1 12: GENETICA5. Gena 1. Biochimicale 6. Portiune de cromozom 11. Multiplicarea plasmidei si inglobarea genei 9. Plasmida recombinata 3. Microorganism (ex: E. coli) 4. Plasmida 8. Plasmida sectionata 7. Gena taiata din cromozom 10. Inserare in microorganism

2. Tesut animal

12 14: MICROBIOLOGIE

12. Diviziunea celulara 13. Cultura la scara redusa 14. Bioreactor de laborator 15. Bioreactor pilot

14 18: INGINERIE DE PROCES

16. Instalatia industriala

17. Recuperarea produsului

18. Conditionare, ambalare si comercializare

Figura 1.1. Etapele de dezvoltare ale unui bioproces pentru producerea i comercializarea unui bioprodus pe baz de ADN recombinat [3] Un proces biotehnologic este un proces complex, format din mai multe procese tehnologice componente. Dintre procesele tehnologice componente nu trebuie s lipseasc procesul esenial, respectiv procesul biochimic. Aa cum ntr-un proces tehnologic din industria chimic trebuie s existe cel puin un proces chimic, proces care implic transformri de substan la nivel molecular, i n procesul biotehnologic va exista cel puin un proces biochimic, n care transformrile de substan la nivel molecular decurg la nivelul unui organism viu (microbian, vegetal sau animal) sau al unei poriuni din acesta (enzim). ntre un proces chimic i un proces biochimic nu exist deosebiri fundamentale. n ambele exist o transformare fundamental la nivel molecular (reacia chimic, respectiv reacia biochimic) nsoit de procese de transfer de mas sau de energie (fig. 2.1). Proces chimicREACTIE CHIMICA REACTII BIOCHIMICE

Fenomene de transfer

Fenomene de transfer

Proces biochimic Figura 1.2. Asemnri ntre procesul chimic i procesul biochimic 2

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 1.1. CARACTERISTICILE PROCESELOR BIOTEHNOLOGICE Faa de alte procese tehnologice ntlnite n industriile de proces, bioprocesele prezint o serie de particulariti, cum ar fi [2 - 4]: - capaciti de producie foarte variate: de la 20 milioane t/an (etanol) pn la mai puin de 20 kg/an (insulin, interferon, anticorpi monoclonali) tab. 1.1; - produsele de biosintez se gsesc deseori ntr-o concentraie foarte sczut n masa de reacie evacuat din bioreactor (lichidul de fermentaie); - separarea produsului se realizeaz n mai multe etape, acest lucru ducnd la creterea costurilor; costul separrii poate atinge n unele cazuri 90 % din costul total al procesului biotehnologic (tab. 1.2); - lichidele de fermentaie au comportare de fluid nenewtonian; acest lucru necesit o abordare specific n proiectarea echipamentelor n care se realizeaz procese de transfer de impuls, cldur i mas; - produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular mare, sunt labile termic i chimic, sunt sensibile la fore de forfecare i la tensiuni interfaciale ridicate; acest lucru face ca procedeele clasice de separare (distilarea, de exemplu) s nu poat fi utilizate; - n lichidele rezultate n bioprocese, alturi de produsul util exist o serie de compui secundari (impuriti) ale cror caracteristici fizice i chimice sunt similare cu ale produsului util; asemnarea proprietilor face foarte dificil separarea; - produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular ridicat, prezint o mobilitate foarte redus. Tabelul 1.1. Produse majore obinute prin biotehnologii [5]Produsul de fermentaie Solveni organici - etanol (fr utilizri alimentare) - aceton / butanol Biomas - culturi starter i drojdii pentru industria alimentar i agricultur - proteine monocelulare Acizi organici - acid citric - acid gluconic - acid lactic - acid itaconic Aminoacizi - acid L-glutamic - L-lisin - L-fenilalanin - L-arginin - ali aminoacizi Tipul de organism utilizat Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Bacterii lactice sau drojdie de panificaie Pseudomonas methylotrophus sau Candida utilis Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii Aspergillus itaconicus Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium spp. Producie mondial [kg/an] 2 x 1010 2 x 106 (butanol) 5 x 108 (0,5 1) x 108 (2 3) x 108 5 x 107 2 x 107 3 x 108 3 x 107 2 x 106 2 x 106 1 x 106

3

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintezTransformri microbiene - steroizi - D-sorbitol n L-sorboz (la fabricarea vitaminei C) Antibiotice - peniciline - cefalosporine - tetracicline - macrolidice (eritromicina) - polipeptidice (gramicidina) - aminoglicozidice (streptomicina) - aromatice (griseofulvina) Polizaharide extracelulare - xanthan - dextran Nucleotide - 5 guanozin monofosfat Enzime - proteaze - -amilaze - glucoamilaze - glucozizomeraz - pectinaze - renin - total alte enzime Vitamine - B12 - riboflavin Alcaloizi Ergot Pigmeni - shikonin - -caroten Vaccinuri - antidifteric - antitetanos - antipertussis (tuse convulsiv) - antipoliomielitic - antirubeolic - antihepatic B Proteine terapeutice - insulin - hormonul creterii - eritropoietin - factorul VIII-C - activatorul plasminogen de esut - interferonul 2 Anticorpi monoclonali Insecticide - spori bacterieni - spori de fungi Rhizopus arrhizus Acetobacter suboxydans Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythreus Bacillus brevis Streptomyces griseus Penicillium griseofulvum Xanthomonas campestris Leuconostoc mesenteroides Brevibacterium ammoniagenes Bacillus spp. Bacillus amyloliquefaciens Aspergillus niger Bacillus coagulans Aspergillus niger Mucor miehei sau drojdie recombinat Propionibacterium shermanii sau Pseudomonas denitrificans Eremothecium ashbyii Claviceps paspali Lithospermum erythrorhizon Blakeslea trispora Corynebacterium diphtheriae Clostridium tetani Bordetella pertussis virui activi atenuai crescui n rinichi de maimu sau n celulele diploide umane virui activi atenuai crescui n rinichi de pui de hamster antigen de suprafa evideniat n drojdia recombinat Escherichia coli recombinat Escherichia coli recombinat sau celule de mamifere recombinate celule de mamifere recombinate celule de mamifere recombinate celule de mamifere recombinate Escherichia coli recombinat Celule Hybridoma Bacillus thuringiensis Hirsutella thompsonii 4 x 107 (3 4) x 107 1 x 107 1 x 107 2 x 106 1 x 106

5 x 106 1 x 105 6 x 105 4 x 105 4 x 105 1 x 105 1 x 104 1 x 104 5 x 104 1 x 104 5 x 103 60 < 50

< 20

< 20

4

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Datele din tab. 1.1 nu sunt exhaustive: nu au fost incluse procesele de epurare a apelor uzate, de bioremediere a solurilor poluate, biolixivierea minereurilor sau procesele clasice de fabricare a unor produse alimentare tradiionale: iaurt, pine, bere, vin, oet. Tabelul 1.2. Costul separrii bioproduselor ca fraciune din costul total de producieSursa Celule de biomas de drojdie Produse de mare tonaj Enzime extracelulare Antibiotice Enzime/proteine intracelulare Produsul Proteine monocelulare, extract de drojdie Acid citric, lactic, malic Amilaze, proteaze Penicilin Antibiotice noi Insulin, interferon Costul separrii (% din costul total) 5 10 50 10 20 50 60 90

Produsele de biosintez se prezint n forme diverse i provin din surse variate. Ele pot fi molecule de diferite dimensiuni, de la metabolii organici cu mas molecular mic (etanol, acid citric, antibiotice), pn la peptide i proteine (insulin, anticorpi, enzime) sau molecule bazate pe nucleotide (ARN, plasmide ADN). Aceste produse pot fi metabolii ai microorganismelor, celulelor vegetale sau animale; pot reprezenta produsul unei reacii enzimatice sau al unei sinteze peptidice sau pot fi, pur i simplu, componente ale unei surse naturale: snge, lapte sau esut vegetal. Dac sursa produsului este un microorganism, acesta se poate regsi excretat n mediul de cultur, se poate acumula n citoplasma sau periplasma celulelor sau poate forma corpi de incluziune agregate mari de proteine denaturate care se gsesc n interiorul bacteriei. Concentraia produselor de biosintez poate varia pe o plaj foarte larg de valori: de la sute de g/L (etanol, acid citric) la mg/L (anticorpi recombinai) sau chiar g/L n cazul factorilor de coagulare ai sngelui. Dac n cazul produselor aflate n concentraie ridicat izolarea/purificarea nu pune probleme deosebite, putndu-se realiza prin intermediul operaiilor unitare clasice utilizate n industriile de proces (de ex. separarea i concentrarea etanolului prin distilare), n cazul produselor aflate n concentraii sczute, alturi de cantiti considerabile de impuriti, cum este cazul factorilor de snge, anticorpilor monoclonali sau proteinelor recombinate, separarea i purificarea este mult mai dificil i evident mai costisitoare. n general, ponderea costului purificrii n costurile totale de producie depinde de concentraia produsului n mediul de cultur, reprezentnd ntre 5 i 90 % din costurile totale (tab. 1.2). Ca o consecin a acestui fapt, se poate constata c exist o relaie direct ntre preul de vnzare al produselor de biosintez, pre care reflect costurile de producie, i concentraia bioprodusului n mediul de cultur (fig. 1.3). Cerinele de puritate ale produselor de biosintez sunt diferite. n funcie de destinaia acestora este stabilit nivelul maxim acceptabil de impuriti, precum i natura acestora. Produsele terapeutice de uz uman vor avea cele mai mari exigene de puritate, n timp ce enzimele industriale se situeaz la polul opus (fig. 1.4). n tab. 1.3 se prezint un exemplu de reglementare a compoziiei unei proteine terapeutice recombinate. Produsele de biosintez sunt caracterizate prin randamentul de obinere, puritate, activitate specific, noiuni definite astfel: 5

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez Randament = masa de produs separata 100 [%] (1.1) masa de produs alimentata in procesul de separare masa de produs 100 [%] (masa de produs) + (masa impuritatilor) unitati de activitate biologica UAB g masa produsului Enzime de diagnostic/cercetare Anticorpi monoclonali Enzime terapeutice

Puritate =

(1.2) (1.3)

Activitatea specifica =Aminoacizi Antibiotice Enzime ind.

Concentraia iniial, kg/m3

Pre de vnzare, $/kg

Figura 1.3. Relaia dintre concentraia produsului n materialul de pornire i preul de vnzare [6] Tabelul 1.3. Exemplu de reglementare a compoziiei unei proteine terapeutice recombinatePuritate Agregate Proteine din celula gazd Acizi nucleici (majoritar ADN) Endotoxine Virui Celule i particule Substana solubil *UE = uniti de endotoxine > 99 % 12 log reducere nedectabile < 1 ppm

6

Figura 1.4. Cerine de puritate pentru diverse enzime [7]

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 1.2. FAZELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC Un proces biotehnologic industrial, cuprinde, de regul, urmtoarele procese componente principale: selecia microorganismelor (celulelor), pregtirea mediului de cultur, procesul biochimic propriu-zis, recuperarea (capturarea) produsului urmat de separarea, purificarea i condiionarea acestuia (fig. 1.5). n funcie de poziia acestor procese fa de procesul biochimic propriu-zis, care decurge n bioreactor, ele pot fi incluse fie n prelucrarea n amonte de bioreactor (upstream processing), fie n prelucrarea n aval de acesta (downstream processing).UPSTREAM PROCESSING DOWNSTREAM PROCESSING CAPTURAREA PRODUSULUI UTIL SEPARAREA PRODUSULUI UTIL PURIFICAREA PRODUSULUI UTIL CONDIIONAREA PRODUSULUI

Pregtirea mediului de cultur

BIOPROCESSelecionarea microorganismelor

BIOPRODUS

AMBALARE

Figura 1.5. Fazele principale ale unui proces biotehnologic industrial Prelucrarea masei de reacie n aval de bioreactor este dictat de numeroi factori, doi dintre acetia fiind fundamentali: natura produsului de biosintez obinut i faza n care se gsete acesta n urma procesului de biosintez. n funcie de aceti factori, la care se adaug cerinele de puritate, se sintetizeaz schema tehnologic de separare care asigur obinerea produsului dorit n condiii de eficien economic (respectiv cu costuri totale minime). 1.3. SINTEZA SCHEMELOR TEHNOLOGICE DE PRELUCRARE N AVAL DE BIOREACTOR Elaborarea unei scheme de flux tehnologic pentru recuperarea i purificarea unui produs de biosintez este un proces creativ, bazat pe experiena i imaginaia inginerului de proces. Dei exist ncercri de transpunere a experienei acumulate n programe de calculator, sub forma sistemelor expert, majoritatea inginerilor cu experien se bazeaz 7

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez pe cteva reguli de bun sim tehnic, cunoscute i ca reguli euristice. Cteva dintre aceste reguli sunt enumerate n continuare [8]: 1. Iniial se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare; 2. Iniial se ndeprteaz impuritatea cel mai uor de separat; 3. Cea mai dificil i mai costisitoare separare se realizeaz la sfrit; 4. Se alege acel proces de separare care face apel la diferena maxim ntre proprietatile produsului i proprietile impuritilor; 5. Se aleg i se introduc alternativ n schema de separare procese care utilizeaz diferite fore motoare pentru realizarea separrii. n funcie de dimensiuni i de masa molecular, produsele de biosintez pot fi molecule de mici dimensiuni (solveni organici, chimicale fine, antibiotice, hormoni, aminoacizi, vitamine), molecule de dimensiuni mari (proteine, polizaharide, acizi nucleici) sau produse particulate (celule, spori, lipozomi, particule subcelulare). Tab. 1.4 prezint o clasificare a produselor de biosintez n conformitate cu acest criteriu. Tabelul 1.4. Categorii principale de produse de biosintez n funcie de mrimea acestora [7]Exemple Masa molecular (Da) Raza tipic Zaharuri 200 600 0,5 nm Aminoacizi 60 200 0,5 nm Molecule mici Vitamine 300 600 1 2 nm Acizi organici 30 300 0,5 nm Proteine 103 106 3 10 nm Molecule mari Polizaharide 104 107 4 20 nm 2 1000 nm* Acizi nucleici 103 1010 Ribozomi 25 nm Virui 100 nm Produse particulate Bacterii 1 m Celule de drojdii 4 m Celule animale 10 m * - piese singulare de ADN genetic pot avea dimensiuni desfurate de ordinul mm, n funcie de procedeul de izolare; diametrul elicii duble a ADN este de 2,5 nm. Produsul

Produsele obinute prin biosintez pot fi excretate de ctre celule, gsindu-se n lichidul de fermentaie: acestea sunt produsele extracelulare. Aproape toate produsele cu mas molecular mic i multe produse cu mas molecular mare sunt produse extracelulare. Recuperarea i purificarea acestora este relativ simpl, datorit cantitii reduse de impuriti existente n faza lichid n care se afl aceste produse de biosintez. Dac produsul biosintetizat rmne in interiorul celulei, vorbim despre un produs intracelular. Astfel de produse sunt, de exemplu, proteinele eucariote recombinate produse de ctre microrganismele procariote. Produsele intracelulare se acumuleaz n celule fie sub form nativ, fie sub form denaturat, caz n care, de cele mai multe ori formeaz corpi de incluziune. n alte cazuri, produsul biosintezei este celula nsi. Tabelul 1.5 prezint cteva exemple de diverse tipuri de produse de biosintez. 8

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 1.5. Clasificarea produselor de biosintez n funcie de faza n care se gsescTip de produs Extracelular Intracelular Celula nsi Exemple alcooli, acizi organici aminoacizi, enzime, antibiotice proteine pe baz de ADN recombinat drojdie de panificaie, proteine monocelulare Concentraie [g/L] 100 20 10 30

Indiferent de faza n care se gsete produsul util, prima etap n prelucrarea n aval de bioreactor este separarea masei celulare de lichidul de fermentaie (se aplic regula euristic nr. 1: se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare). Acest lucru fiind stabilit, prelucrarea ulterioar va merge pe una din cele trei ci redate n fig. 1.6, n funcie de faza n care se gsete produsul biosintetizat. n majoritatea cazurilor, biosepararea se realizeaz n patru trepte. Obiectivele i operaiile unitare utilizate n fiecare treapt sunt redate n tab. 1.6.RECUPERARE PRODUS EXTRACELULAR

Supernatant FERMENTARE SEPARARE LICHID-SOLID

PURIFICARE

RECUPERARE Celule DEZAGREGARE CELULE PRODUS CELULAR

PURIFICARE

PRODUS INTRACELULAR

RESTURI CELULARE

Figura 1.6. Schema general de prelucrare n aval de bioreactor Tabelul 1.6. Obiective i operaii unitare tipice la biosepararea n patru trepteTreapta Separare insolubile Izolare produs Purificare primar Purificare avansat Obiective - ndeprtarea celulelor, resturilor celulare i a impuritilor insolubile - reducerea volumului de prelucrat - ndeprtarea componentelor cu proprieti diferite de ale produsului - reducerea volumului de prelucrat - ndeprtarea componentelor cu proprieti similare cu ale produsului - ndeprtarea lichidelor - trecerea produsului n form cristalin Operaii unitare tipice - filtrare - sedimentare - extracie - adsorbie - extracie - adsorbie - ultrafiltrare - precipitare - cromatografie - metode bazate pe afinitate - cristalizare fracionat - precipitare fracionat - uscare - cristalizare

9

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez O structur generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor este redat n fig. 1.7. Pentru fiecare tip de produs (extracelular sau intracelular) exist mai multe alternative de prelucrare. Alegerea unei alternative de prelucrare i selectarea operaiei (operaiilor) unitare corespunztoare se face innd cont de proprietile produsului, proprietile impuritilor i de proprietile microorganismelor, celulelor sau esuturilor productoare. Sinteza procesului tehnologic de separare va consta n alegerea succesiunii operaiilor n conformitate cu cele 5 reguli euristice prezentate anterior, pe baza structurii redate n fig. 1.7. Majoritatea bioproceselor, n special n cazul obinerii produselor de mic tonaj i de valoare ridicat, sunt concepute pentru a fi conduse n regim discontinuu. Procesele continue de bioseparare sunt utilizate n cazul produselor de valoare relativ redus, fabricate n cantiti considerabile: etanol, butanol, acizi organici, etc. RECUPERAREA PRIMAR reprezint prima etap a procesului de prelucrare n aval de bioreactor, etap n care are loc o oarecare purificare i o reducere a volumului de material supus prelucrrii. Aa cum reiese din fig. 1.7, alegerea cii de urmate depinde de locul n care se gsete produsul, respectiv dac acesta este intracelular sau extracelular. n cazul produselor intracelulare, prima etap de purificare o reprezint recoltarea celulelor, respectiv ndeprtarea lichidului extracelular. Pentru realizarea acestui proces se face apel fie la centrifugare, fie la filtrarea membranar (att microct i ultrafiltrare). Centrifugarea este avantajoas n cazul microorganismelor de dimensiuni mari i cu densitate ridicat ( > 2 m, > 1,03 g/cm3), cum este cazul drojdiilor. Pentru microorganisme mai mici se pot utiliza diverse tehnici de coagulare pentru a mri dimensiunea particulelor care sedimenteaz. Filtrarea membranar este avantajoas pentru recoltarea celulelor mici i uoare. Pierderile tipice de celule prin centrifugare sunt cuprinse ntre 1 i 5%. Filtrarea membranar asigur o recuperare practic integral a celulelor, aceasta n cazul n care nu se produce dezagregarea celulelor sau sfierea membranei acestora. Dezagregarea celulelor este de regul al doilea pas n separarea produselor intracelulare. Scopul acestei operaii este de a deschide celulele gazd i de a elibera produsul intracelular. Dezagregarea bacteriilor i a drojdiilor se realizeaz fie n omogenizatoare de nalt presiune, fie n mori cu bile. Pentru capaciti mari (de civa m3/h) numai omogenizatoarele sunt eficiente economic. Pentru eliberarea produselor periplasmatice acumulate ntre membrana celular i peretele celular se utilizeaz adeseori ocul osmotic. naintea dezagregrii, concentratul de celule este deseori diluat cu un tampon litic al crui rol este de a minimiza denaturarea produsului dup eliberarea sa din celul. Pentru microorganismele greu de dezagregat sunt necesare treceri multiple prin omogenizator, la presiuni de 50 100 MPa. Trecerile multiple sunt necesare i pentru eliberarea produilor care formeaz corpi de incluziune. Suplimentar are loc fragmentarea resturilor celulare n particule foarte mici, facilitndu-se astfel separarea ulterioar a corpilor de incluziune de resturile celulare. n aceast etap are loc o oarecare degradare a produselor proteice datorit forfecrii puternice i a oxidrii. ndeprtarea resturilor celulare se realizeaz de regul prin centrifugare sau microfiltrare. Alte opiuni posibile sunt separarea n filtre rotative sub vid sau n filtre pres, filtrarea n adncime, extracia sau cromatografia de adsorbie n strat expandat (cromatografie ASE). 10

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

BIOREACTORProduse intracelulareRECOLTARE CELULE

Produse extracelulare

RECUPERARE PRIMAR

Centrifugare Microfiltrare Ultrafiltrare

NDEPRTARE BIOMAS

DEZAGREGARE CELULE

Omogenizare Mcinare cu bile oc osmotic

EXTRACIA PRODUSULUI

NDEPRTARE RESTURI CELULARE Centrifugare Microfiltrare Filtre la vid Filtre pres

Soluii apoase bifazice Solveni organici Adsorbie strat expandat Adsorbie discontinu Fluide supercritice Micele inverse Distilare extractiv

Filtrare la vid Centrifugare Microfiltrare Ultrafiltrare Filtre pres Filtre lumnare Flotaie

RECUPERARE INTERMEDIAR

Corpi de incluziuneRENATURARE Dizolvare Rempturire

CONCENTRARE Ultrafiltrare Evaporare Osmoz invers Precipitare Cristalizare Extracie Adsorbie Distilare

Se cere puritate ridicat

Se cere puritate sczut

PURIFICARE FINAL

PURIFICARE FINAL

Cromatografie Diafiltrare Electrodializ Electroforez

Pentru forma solid final

DESHIDRATARE (NDEPRTARE SOLVENT)

Atomizare Congelare Uscare n tvi

Figura 1.7. Schema-bloc generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor [9]

11

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez Dac produsul este solubil, el este recuperat n timpul ndeprtrii resturilor celulare fie n faza uoar a unei centrifuge, fie n permeatul unui filtru. Centrifugarea asigur doar ndeprtarea resturilor celulare mari (cu un diametru Stokes de peste 0,5 m), aa c dup centrifugare este necesar o finisare a separrii prin filtrare. n caz contrar, resturile celulare mici rmase n faza lichid pot provoca probleme serioase n etapele ulterioare de prelucrare n cazul separrilor cromatografice, de ex. Pentru finisarea separrii se pot folosi diverse tipuri de filtre (n strat adnc, pres, lumnare, rotative sub vid, microfiltre membranare, etc.). Aceste filtre pot fi utilizate pentru ndeprtarea resturilor celulare i fr o centrifugare prealabil a suspensiei. Dac produsul este insolubil i formeaz corpi de incluziune, el va trebui mai nti separat de resturile celulare, apoi dizolvat i renaturat (a se vedea cazul insulinei, de ex.). Din fericire, corpii de incluziune sunt uzual de diametru mare (0,3 1,0 m) i au densitate ridicat (1,3 1,5 g/cm3), putndu-se separa uor de resturile celulare ntr-o centrifug separatoare cu talere. Corpii de incluziune se regsesc n faza grea colectat din centrifug, n timp ce resturile celulare rmn n faza uoar. Faza grea este uzual resuspendat i re-centrifugat de 2 3 ori, pentru a asigura o puritate corespunztoare corpilor de incluziune. Resuspendarea se realizeaz ntr-o soluie diluat de detergent pentru a facilita ndeprtarea altor contaminani. Se regleaz pH-ul i tria ionic a soluiei astfel nct s se reduc hidrofobicitatea resturilor celulare i s se uureze trecerea lor n faza uoar. O puritate final a produsului mai mare de 70% n aceast etap reprezint un lucru comun. Separarea produsului de resturile celulare se poate face i prin extracie i/sau adsorbie. Pentru extracia produselor cu mas molecular mic (antibiotice, de ex.) se folosesc frecvent solveni organici, iar recuperarea proteinelor se poate realiza folosind sisteme apoase bifazice (SAB). Separarea produsului de resturile celulare i concentrarea simultan a acestuia se poate realiza prin tehnici de adsorbie, putndu-se folosi diveri adsorbani: schimbtori de ioni, adsorbani de afinitate, de schimbare de faz, etc. Acest tip de purificare necesit amestecarea suspensiei cu coninut de resturi celulare cu un adsorbant ntr-un recipient cu agitare. Dup adsorbie este necesar o etap de splare care are drept scop ndeprtarea impuritilor i a resturilor celulare. Mai recent se utilizeaz cromatografia ASE pentru separarea proteinelor de resturile celulare. Suspensia este pompat ascendent prin stratul expandat. Proteina int este legat de adsorbant n timp ce resturile celulare i ali contaminani trec prin strat fr a se reine. O etap de splare ndeprteaz materialul slab reinut. Dup splare se realizeaz eluia de pe adsorbant, urmat de o purificare avansat. n cazul produselor extarcelulare, prima etap n procesul de separare o reprezint ndeprtarea biomasei, care n acest caz este impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare. Aceast etap se realizeaz utiliznd una sau mai multe dintre urmtoarele operaii unitare: filtrarea n filtre rotative la vid, centrifugarea n centrifuge cu discuri sau centrifuge decantoare, filtrarea n filtre pres, ultrafiltrarea, flotaia, etc. ntruct fiecare operaie unitar prezint avantaje i dezavantaje pentru diverse produse i microorganisme, e dificil de selectat operaia optim pentru un sistem dat. Filtrarea n filtre rotative la vid, n special cu utilizarea unui strat de adjuvant, este metoda clasic cea mai utilizat pentru ndeprtarea organismelor micelare. Aceste echipamente pot fi exploatate continuu pentru perioade lungi de timp i, n plus, debitele de filtrat prelucrate sunt mari: peste 200 L/(m2.h), pn la 1000 L/(m2.h). Dezavantajul 12

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII principal al acestor utilaje este problema depozitrii amestecului de biomas i adjuvant, acesta din urm fiind adugat ntr-o cantitate cel puin egal cu biomasa. Reglementrile severe de mediu fac costisitoare depozitarea acestor materiale. Centrifugarea n centrifuge separatoare cu talere sau n centrifuge decantoare, se utilizeaz frecvent n instalaiile de capacitate mare. Centrifugele separatoare lucreaz la turaii mai ridicate, putnd ndeprta microorganisme mai mici i mai uoare. Performanele centrifugelor decantoare pot fi mbuntite prin adaosuri de ageni de coagulare. ntruct nu necesit adaos de adjuvant, centrifugarea este mai avantajoas dect filtrarea n filtre rotative sub vid. Uzual, pasta de biomas rezultat la centrifugare conine ntre 40 i 60% v/v lichid extracelular. Pentru recuperarea produsului dizolvat, pasta este de regul splat i apoi recentrifugat. Filtrarea membranar (micro- i ultrafiltrare) permite trecerea n permeat a produsului extracelular, reinnd n concentrat biomasa i alte componente particulate. Concentrarea este uzual urmat de diafiltrare, n vederea creterii randamentului de recuperare a produsului. Filtrele cu membran sunt utilizate n special n recuperarea produilor cu mas molecular redus, cum ar fi antibioticele din miceliu. Pentru produii cu mas molecular mare, aplicaiile sunt limitate la cazurile n care cantitatea de solide este mai redus dect n cazul culturilor celulare. RECUPERAREA INTERMEDIAR, care urmeaz recuperrii primare, are drept scop concentrarea i purificarea produsului. Dac produsul este solubil, etapa de recuperare intermediar o reprezint concentrarea. n cazul produselor denaturate insolubile, etapa de recuperare intermediar const n dizolvarea i renaturarea (rempturirea) produsului, urmat ulterior de concentrare i purificare. Concentrarea produsului este o etap necesar ntruct dup separarea primar, produsul se gsete, de regul, ntr-o soluie diluat. Reducerea volumului prin concentrare este n concordan cu regulile euristice 1 i 2. Dintre posibilitile de concentrare se pot meniona ultrafiltrarea, osmoza invers, evaporarea, adsorbia, precipitarea, extracia i distilarea. Ultrafiltrarea este utilizat n mod extensiv pentru concentrarea soluiilor de proteine. Masa molecular de tiere a membranei este aleas astfel nct s fie reinut produsul, n timp ce impuritile nedorite (de regul solubile i cu mase moleculare mici) s poat trece prin membran n fluxul de permeat. n comparaie cu evaporarea, ultrafiltrarea are avantajul operrii la temperaturi sczute i posibilitatea ndeprtrii impuritilor solubile. Parametrii tipici de operare sunt o cdere de presiune transmembranar de 0,2 0,5 kPa i un debit mediu specific de 20 L/(m2.h). Osmoza invers necesit membrane cu dimensiuni ale porilor mai mici, pentru a putea face posibil concentrarea produselor cu mase molrculare mai mici: antibiotice, anumii aminoacizi, etc. Evaporarea poate fi utilizat cu condiia asigurrii condiiilor blnde de prelucrare, pentru a nu periclita produsul. Se utilizeaz evaporatoare rotative cu film subire, operate la temperaturi relativ coborte (40 50 C), sub vid. n comparaie cu ultrafiltrarea, evaporarea prezint dezavantajul lipsei oricrui fel de purificare n timpul concentrrii, avnd ns avantajul obinerii unor soluii cu o concentraie mai ridicat i pe acela al posibilitii prelucrrii comode a unor volume mari de soluie. 13

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez Precipitarea este o modalitate de concentrare i purificare frecvent utilizat pentru fraciunile proteice din snge, sau pentru acidul citric, de ex. Pentru precipitarea compusului dorit, n soluie se pot aduga sruri, solveni sau polimeri, sau se poate modifica pH-ul, tria ionic sau temperatura soluiei. De multe ori precipitarea apare ca etap urmtoare extraciei realizate prin intermediul soluiilor apoase bifazice de polimer/sare (PEG i fosfat de potasiu, de ex.). Cnd produsul se recupereaz n faza bogat n polimer precipitarea se realizeaz prin adaos suplimentar de polimer n soluie. Din punct de vedere economic se recomand recuperarea i reciclarea agenilor de precipitare. Procesul de precipitare se poate utiliza i pentru ndeprtarea impuritilor. De ex., acizii nucleici pot fi ndeprtai prin precipitare cu sulfat de mangan i streptomicin sulfat. Distilarea este utilizat n cazul concentrrii i purificrii solvenilor organici care nu se degradeaz sub influen temperaturii: etanol, acid acetic, etc. Renaturarea produsului este necesar atunci cnd acesta se gsete sub form de corpi de incluziune. Proteinele eucariote sintetizate de ctre microorganismele procariote formeaz corpi de incluziune insolubili n celula gazd. Acetia pot fi dizolvai utiliznd soluii de haotropi1 puternici, cum ar fi clorhidratul de guanidin (6 M) sau ureea, n prezena unui agent reductor ca 2-mercaptoetanol (0,5 M) sau ditiotrietol (50 mM). Proteina dizolvat este lsat apoi s-i reia conformaia original, ndeprtnd agenii haotropi prin diafiltrare sau cromatografie i dilund soluia pn la o concentraie total de protein de 20 50 mg/L. Diluia este necesar pentru minimizarea interaciunilor intermoleculare care pot aprea n timpul rempturirii i pot conduce la inactivarea produsului. Procesul de rempturire este finalizat prin adaosul de mici cantiti de glutation n form redus (2 5 mM) i oxidat (1 2 mM), urmat de incubarea timp de 5 10 ore la 35 40 C. PURIFICAREA FINAL ine cont de cerinele de puritate ale produsului obinut. De regul produsele farmaceutice (antibiotice, hormoni, etc.) necesit o puritate ridicat, n timp ce produsele industriale (enzime pentru detergeni, solveni, acizi organici, etc.) necesit o puritate relativ sczut, ce poate fi asigurat prin deshidratare sau, mai general, prin ndeprtarea solventului. Pentru produsele de nalt puritate, etapa de purificare final implic o combinaie de etape de cromatografie i de filtrare, iar dac produsul finit este necesar n form solid, aceste etape sunt urmate de o deshidratare sau ndeprtare a solventului. Cromatografia se realizeaz de regul ctre sfritul procesului global de bioseparare, n conformitate cu regula euristic nr. 3: cea mai dificil i mai costisitoare separare se realizeaz la sfrit. n cazul produselor biologice cu valoare ridicat, pn la aplicarea separrilor cromatografice s-a ndeprtat deja cea mai mare parte a impuritilor, concomitent cu reducerea de 50 100 de ori a volumului de prelucrat, ajungndu-se la un influent cu 1 5% (m/v) coninut de proteine la intrarea n unitatea de separare cromatografic. Progresele recentele ale cromatografiei ASE permit utilizarea etapei cromatografice de separare n etapa de recuperare primar, deoareceHaotropismul (din cuvintele greceti chaos = dezordine, haos, confuzie i tropos = form) este proprietatea anumitor substane, de regul ioni (tiocianat, perclorat, guanidin), de a destructura proteinele, de a promova solubilitatea unor substane nepolare n solveni polari, n general de a modifica structura apei, proteinelor, organismelor vii, permind realizarea unor procese care altfel nu ar fi posibile. n contrast cu haotropismul este cunoscut cosmotropismul [10, 11].1

14

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII aceast tehnic cromatografic permite captura, concentrarea i purificarea produsului direct din lichidul de fermentaie care conine celule, resturi celulare i alte particule solide. n consecin, cromatografia ASE are potenialul de a elimina etapele preliminare de separare a biomasei sau a resturilor celulare sau de concentrare a produsului. O secven de mai multe etape de separare cromatografic este necesar de regul pentru atingerea gradului de puritate cerut, iar aceste etape se aleg n conformitate cu regulile euristice 4 i 5. De ex., n concordan cu regula euristic nr. 5, o etap de separare prin schimb ionic nu trebuie s fie urmat de o alt etap de separare de acelai tip, ci de o etap de separare bazat pe o alt for motoare: cromatografie de afinitate sau de inversie a fazelor. Etapele de filtrare membranar se intercaleaz de regul ntre separrile cromatografice, n vederea modificrii tamponului sau pentru concentrarea soluiilor diluate de produs. Deshidratarea sau ndeprtarea solventului se realizeaz prin uscare. Atunci cnd produsele suport temperaturi de 50 100 C se poate utiliza uscarea prin pulverizare, uscarea n strat fluidizat sau uscarea n strat fix. Dac produsele sunt termolabile se utilizeaz uscarea prin congelare (aa-numita frreeze drying). Echipamentele necesare pentru realizarea procesului implic costuri ridicate de investiii i se recomand evitarea, pe ct posibil, a utilizrii sale. Cu titlu exemplificativ, n fig. 1.8 sunt prezentate schemele tehnologice de obinere a dou bioproduse: sinteza, separarea i purificarea unui compus extracelular, cu valoare relativ sczut i cerine de puritate obinuite acidul citric (fig. 1.8 a); sinteza, separarea i purificarea unui compus intracelular, cu valoare ridicat i cerine calitative nalte insulina (fig. 1.8 b). Se poate remarca diferena de complexitate ntre cele dou procese, precum i numrul net superior de etape de separare i purificar n cazul producerii insulinei. 1.4. CRITERII PRINCIPALE PENTRU O PRELUCRARE EFICIENT N AVAL DE BIOREACTOR Aa cum s-a artat anterior, inginerul de proces are de ales ntre diverse ci de prelucrare a masei de reacie. Pentru fiecare cale de prelucrare exist mai multe operaii unitare posibil de aplicat, iar fiecare operaie unitar se poate realiza n cteva tipuri de echipamente. Pe lng regulile euristice enunate n capitolul precedent, este util de tiut c: - dac produsul are o valoare de piaa ridicat, gradul de recuperare trebuie s fie ct mai ridicat; - echipamentele alese trebuie s aib o fiabilitate ct mai nalt; - numrul etapelor de prelucrare trebuie redus la minimum, n acest mod scznd costurile de investiii i de exploatare; - procesul ales trebuie s asigure o reducere de volum considerabil de la bulionul de fermentare iniial pn la fluidul din faza final de recuperare a produsului: o reducere cu minimum trei ordine de mrime (1000 : 1) ar fi rezonabil; 15

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez

Etapa de fermentare Etapa de recuperare

Etapa de izolare

a Biosinteza acidului citricEtapa de recuperare primar Etapa de fermentare

Etapa de reacie

Etapa de purificare final

b Biosinteza insulinei Figura 1.8. Scheme tehnologice pentru obinerea produselor de biosintez ntr-o form comercializabil [8] 16

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII prelucrarea trebuie s conduca la un bulion epuizat final uor de reciclat, pentru a face posibil recuperarea nutrienilor neconsumai; prelucrarea n aval de bioreactor trebuie nceput imediat ce bulionul prsete seciunea de fermentare; orice ntarziere sau stocare necesit vase de stocare costisitoare, existnd i posibilitatea deteriorrii sau contaminrii produsului din bulion; ntrucat n majoritatea proceselor biotehnologice concentraia produsului este sczut, costul pe unitate de volum de bulion procesat n recuperarea primar va avea o pondere nsemnat n costul final de producie.

-

Alegerea metodei de recuperare este influenat i de alte criterii, cum ar fi: locul i starea n care se afl produsul, concentraia produsului, proprietile fizico-chimice ale produsului, aplicaiile acestuia, cerinele de minim puritate, caracteristicile fizicochimice ale impuritilor, preul de pia al produsului, etc. Tabelul 1.7. Categorii de produse de biosintezCaracteristici Producie Valoare de pia Puritate cerut Costuri de separare Etape de separare Tehnologia de separare Exemple Produse low-tech mare (peste 1.104 kg/an) mic (sub 100 USD/kg) mic (maximum 90 95 %) mici (sub 50% din costurile totale) puine clasic, fr probleme deosebite solveni (etanol, butanol, aceton) acizi organici aminoacizi proteine monocelulare enzime industriale antibiotice Produse high-tech mic (sub 1.104 kg/an) mare (peste 1000 USD/kg) mare (uzual peste 99 %) mari (pn la 90% din costurile totale) numeroase sofisticat vitamine pigmeni enzime de diagnoz enzime terapeutice vaccinuri proteine terapeutice

Produsele obinute prin biosintez pot fi ncadrate n dou mari categorii (tab. 1.7). n prima categorie intr produsele care se obin n cantiti mari, au o valoare de pia relativ sczut i nu necesit o puritate prea ridicat: etanol, butanol, aceton, acizi organici, proteine monocelulare, enzime industriale, antibiotice. Separarea i purificarea acestor produse se poate realiza folosind o succesiune de operaii unitare clasice, cunoscute i aplicate frecvent n industriile de proces: filtrare, centrifugare, flotaie, extracie cu solveni, adsorbie, precipitare, evaporare, uscare, etc. n a doua categorie sunt incluse produsele care se obin n cantiti mult mai reduse, au o valoare de pia ridicat i necesit o purificare avansat: vitamine, pigmeni, enzime de diagnoz i terapeutice, vaccinuri, proteine terapeutice, etc. Pentru separarea i purificarea acestor produse, operaiile unitare clasice nu sunt suficiente, fcndu-se apel la o serie de tehnici noi, de cele mai multe ori concepute iniial pentru operare la scar de laborator i uletrior transpuse la scar industrial: ultracentrifugare, dezagregare mecanic, precipitare fracionat, cromatografie n strat fix, ultrafiltrare, dializ, diafiltrare, osmoz invers, liofilizare, etc.

17

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

2. Separarea masei celulare de lichidul de fermentaieFie c este vorba de recoltarea celulelor sau de ndeprtarea biomasei, dup cum produsul dorit este intra- sau extracelular (vezi fig. 1.7), acesta este primul proces de prelucrare n aval de bioreactor, al crui scop este de a reine acea faz care conine produsul util, concomitent cu reducerea considerabil a volumului de prelucrat, prin ndeprtarea celeilalte faze. Pentru separarea celulelor de lichidul de fermentaie avem la ndemn cel puin cinci tehnici de separare: sedimentarea, filtrarea, centrifugarea, ciclonarea i microfiltrarea. Suplimentar, flocularea celulelor poate fi utilizat pentru mbuntirea eficienei tuturor acestor tehnici. 2.1. CONDIIONAREA LICHIDULUI DE FERMENTAIE PRIN FLOCULARE I COAGULARE Pentru facilitarea proceselor ulterioare de separare a masei celulare de lichidul de fermentaie este util aglomerarea particulelor celulare n agregate mari, uor separabile. n absena floculrii sau coagulrii, sedimentarea gravitaional a particulelor celulare i subcelulare decurge foarte lent (tab 2.1). Tabelul 2.1. Timpul de sedimentare natural al diferitelor particuleTipul particulei Bacterii Coloizi Diametrul particulei [m] 1 0,1 0,01 0,001 Suprafaa specific [m2/m3] 6 000 000 60 000 000 600 000 000 6 000 000 000 Durata de sedimentare 8 zile 2 ani 20 ani 200 ani

Flocularea este definit ca fiind fenomenul de agregare a particulelor solide, indus de adaosul unui polimer, n timp ce coagularea se refer la o agregare indus de 18

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII ctre fore de atracie electrostatice sau de tip van der Waals care apar ntre particule (fig. 2.1) [12]. Agregarea celulelor a fost definit drept aglomerarea acestora n scopul formrii unor asociaii multicelulare stabile i consistente, sub influena anumitor condiii fiziologice [13]. Din punctul de vedere al inginerului biotehnolog, distincia dintre E barier energetic coagulare, agregare, floculare i aglomerare, nu este ntotdeauna clar. ES Cuvinte ca: agregate, flocoane, distan aglomerate, clustere, sunt deseori utilizate drept sinonime. Ele se refer la un ansamblu de celule individuale, format din celule iniial libere sau prin absena dispersiei celulare, sub influena anumitor condiii fiziologice, sau dup adugarea anumitor ageni n energie van der Waals mediu. energie electrostatic n fig. 2.2 se prezint dou din energie rezultant mecanismele principale care produc aglomerarea celulelor. n primul caz Figura 2.1. Diagrama energetic a (fig. 2.2 a) aglomerarea se datoreaz suspensiilor coloidale formei naturale a celulelor, care prezint diveri apendici. Aceti apendici depesc bariera energetic (reprezentat punctat) care ine la distan celulele, permindu-le astfel apropierea i asociere. n al doilea caz, agentul de floculare (polimerul reprezentat prin linia curb) se ataeaz de celul (fig. 2.2 b). Dac tria ionic a soluiei este suficient de sczut, raza de repulsie (bariera energetic reprezentat punctat) se micoreaz, permind formarea punilor de polimer ntre celule (fig. 2.2 c).

a

b

c

Figura 2.2. Mecanisme principale de aglomerare a celulelor: a prin apendici; b, c prin puni de polimer n cazul separrii celulelor prin centrifugare, flocularea ar trebui s conduc la formarea unor flocoane cu rezisten mecanic sporit. n producerea microalgelor, metoda cea mai economic de recoltare s-a dovedit a fi flocularea chimic urmat de sedimentare, flotaie sau filtrare [14]. 19

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie Pentru aglomerare se pot utiliza particule coloidale, sruri, polimeri solubili, sau combinaii ale acestora. Eficiena aglomerrii poate fi hotrtor influenat de tria ionic a soluiei. La creterea triei ionice, eficiena aglomerrii scade dramatic. Celulele de Saccharomices cerevisiae formeaz flocoane n prezena particulelor submicronice de Al(OH)3 ncrcate pozitiv. De asemenea, pentru obinerea de flocoane din celule sau resturi celulare de S. cerevisiae i Escherichia coli se pot utiliza particule de polimer organic ncrcate pozitiv (de ex. polistiren-divinilbenzen cu grupri de amoniu cuaternar la suprafa, avnd diametrul particulelor de 0,27 m) [15]. Electroliii simpli favorizeaz coagularea particulelor prin comprimarea stratului dublu electric care nconjoar particulele coloidale. Efectul cel mai puternic l au ionii metalici cu sarcin mare (Al3+, Fe3+), a cror tendin de adsorbie este mai mare. Mai mult, prin hidroliz aceti ioni formeaz compleci polinucleari hidroxo, ncrcai pozitiv, care au capacitatea de a inversa sarcina superficial a coloizilor. Concentraia ionilor metalici trebuie s fie suficient de mare pentru a putea comprima stratul dublu electric. O supradozare poate duce ns la inversarea sarcinii particulelor coloidale i la restabilizarea lor. Polimerii solubili folosii pentru aglomerare sunt fie polimeri sintetici, fie biopolimeri de origine natural. Polimerii sintetici folosii ca floculani pot fi anionici (acrilamide i copolimeri acizi), cationici (copolimeri ai acrilamidei cu metacrilatul sau acrilatul de dimetil-aminoetil) i neionici (poliacrilamida PAA). Dintre acetia, PAA i derivaii si sunt folosii pe scar larg, datorit economicitii i eficacitii lor [16]. ntruct monomerul acrilamid are proprieti puternic neurotoxice i cangerigene, se fac eforturi pentru gsirea unor nlocuitori mai siguri, biodegradabili, cu un impact mai redus asupra sntii umane i asupra mediului nconjurtor. Astfel, s-a constatat c anumite microorganisme (Rhodococcus erythropolis) provoac flocularea celulelor de drojdii, de E. coli, de nmol activ, de Microcystis aeruginosa, etc. Procesul este efectiv la pH = 3 5, i este considerabil mbuntit prin adaos de ioni de Ca2+ [17, 18]. Polizaharidele sintetizate i excretate de Paecilomyces provoac flocularea E. coli la pH = 4 8 i trii ionice de 0,0001 0,1 M [19]. Fa de polimerii sintetici, chitosanul, un polimer natural derivat din chitin, componentul majoritar al exoscheletului crustaceelor, prezint cteva avantaje: monomerii nu sunt toxici, poate fi sterilizat termic fr degradare, este biodegradabil. La pH acid este solubil, gsindu-se sub form de lanuri liniare (datorit repulsiei dintre gruprile aminice ncrcate electric, NH3+), n timp ce la pH alcalin (peste 7,9, punctul de neutralizare) tinde s se ncolceasc i s precipite. Chitosanul poate fi folosit n flocularea E. coli, Euglena gracilis, sau n separarea selectiv a -D-galactozidazei de resturile celulare i acizii nucleici provenii prin dezintegrarea celulelor de E. coli [20]. Utilizarea adaosurilor pentru aglomerare prezint i o serie de dezavantaje, dintre care pot fi menionate: (1) cunoaterea insuficient a mecanismelor care provoac aglomerarea, ceea ce nseamn un control redus al procesului, (2) fermentaia avnd loc n arje, caracteristicile suspensiei pot varia de la o arj la alta, astfel nct comportarea la adugare de floculani poate fi nepredictibil, (3) de cele mai multe ori floculanii adaugai sunt incompatibili cu procesul de fermentare, fcndu-se astfel imposibil recircularea nutrienilor neconsumai din lichidul de fermentaie, (4) flocoanele formate sunt instabile, putnd fi degradate prin forfecare, (5) procedura este puin aplicabil deeurilor celulare, (6) apar costuri suplimentare. 20

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Flocularea poate fi controlat i de ctre factori genetici. Astfel, adugarea de amidon la o suspensie de E. coli a condus la formarea unor flocoane bacteriene, permind ulterior o separare foarte eficient a celulelor prin sedimentare. Flocularea a depins de un receptor maltoporin pentru amidon aflat la suprafaa celulei. Expresia acestui receptor maltoporin poate fi controlat genetic, astfel nct prezena sa la suprafaa celulei s fie independent de proprietile suprafeei. Agregarea amidono-dependent a celulelor este potenial aplicabil i altor microorganisme care rspund urmtoarelor cerine: (1) prezint receptori pentru amidon, (2) suprafaa celular nu este mascat de un strat de protein sau polizaharid, (3) celula nu produce enzime amilolitice extracelulare. Utilizarea amidonului n recoltarea celulelor bacteriene ofer cteva avantaje: (1) legarea de celule este rapid, (2) amidonul este netoxic, (3) spre deosebire de floculanii ncrcai electric, nu afecteaz pH-ul, iar legarea sa este efectiv n condiiile de pH n care au loc de regul procesele de fermentaie, (4) este un produs ieftin, (50 este uor separabil de bacterii, dac acest lucru este necesar [21]. 2.2. SEPARAREA PRIN SEDIMENTARE GRAVITAIONAL Sedimentarea gravitaional, ca proces de separare a celulelor de faza lichid, este aplicat n diverse procese de biosintez sau de bioseparare: (1) producerea proteinelor terapeutice sau de diagnoz din celule de mamifere, (2) atingerea unor concentraii ridicate de celule n fermentatoarele continue prin recircularea celulelor, (3) tratarea biologic a apelor uzate sau a deeurilor, (4) producerea berii, (5) studiul diverselor tipuri de celule implicate n rspunsul imunologic, (6) recoltarea celulelor obinute n micropurttori sau n culturi celulare n suspensie [22]. Utilizarea sedimentrii gravitaionale n separarea celulelor prezint o serie de aspecte particulare, i anume: - Sedimentarea ca proces de separare este o tehnic blnd. Acest lucru este important n biologia celular, cnd capacitile funcionale ale celulelor izolate nu trebuie alterate n timpul separrii. - Se preteaz foarte bine la manipularea aseptic. Echipamentele sunt uor de asamblat, curat i sterilizat. - Din punct de vedere practic, sedimentarea neajutat poate fi prea lent dac vitezele de sedimentare sunt mici. La scar industrial, durata prea mare a procesului poate periclita creterea microbian sau poate accelera degradri enzimatice nedorite. - n forma ei cea mai simpl, sedimentarea gravitaional poate fi cea mai ieftin tehnic de separare a celulelor. - Este o operaie simpl i fezabil. Spre deosebire de centrifugare, de ex., nu necesit o pregtire special a personalului de exploatare. Ca regul general, sedimentarea gravitaional poate fi utilizat pentru separare dac diametrul celulelor depete 1 m. La dimensiuni mai mici ale particulelor trebuiesc avute n vedere alte opiuni: centrifugare, ultracentrifugare, filtrare, separare membranar. 21

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie Civa factori mai importani influeneaz sedimentarea gravitaional a celulelor ntr-o faz lichid, i anume: - diferena dintre densitatea celulei (c) i densitatea mediului lichid nconjurtor (l); - densitatea fazei lichide (l); - mrimea, forma i concentraia celulelor; - viscozitatea fazei lichide (l). Legtura dintre aceti factori este dat de expresia vitezei de sedimentare n regim laminar (Re < 1), cunoscut i ca legea lui Stokes modificat: 1 ( l ) 2 v0 = c dc g (2.1) l 18

n care dc reprezint diametrul celulelor, iar g acceleraia gravitaional, ceilali termeni avnd semnificaia prezentat anterior. Pentru mrirea vitezei de sedimentare se poate actiona prin mrirea diferenei de densitate ntre celule i faza lichid, prin creterea mrimii particulelor care sedimenteaz (floculare, coagulare, agregare), sau prin micorarea viscozitii fazei lichide. n multe separri la scar industrial, viteza de sedimentare a celulelor este prea sczut, datorit faptului c celulele biologice i agregatele celulare au densiti mici. Deoarece viteza de sedimentare este direct proporional cu diferena de densitate ntre celule i faza lichid, modificarea densitii fazei lichide poate accelera separarea. Dac, de ex., avem de separat un amestec de dou tipuri de celule avnd densiti diferite (1,05 g/cm3 i 1,1 g/cm3), prin mrirea densitii fazei lichide (care se poate realiza prin adaos de ficoll, ser bovin fetal, albumin) se mrete raportul dintre vitezele relative de sedimentare ale celor dou tipuri de celule, ducnd la mbuntirea separrii (fig. 2.3). Pornind de la aceast observaie se poate utiliza un gradient de densitate n faza lichid n care are loc sedimentarea, realizndu-se aa-numita sedimentare izocinetic.Tabelul 2.2. Distana parcurs n timp de 1 h de o particul sferic (c = 2,0 g/cm3) printr-un lichid (l = 1,0 g/cm3) la 298 KRaza particulei [nm] 0,1 1,0 10 100 1000Densitatea fazei lichide [g/cm3]

Raportul vitezelor de sedimentare

Distana parcurs 0,08 nm 8 nm 0,8 m 80 m 8 mm

Figura 2.3. Efectul densitii fazei lichide asupra raportului vitezelor de sedimentare

n tab. 2.2 s-a calculat distana ipotetic parcurs ntr-o or de o celul sferic cu densitatea de 2,0 g/cm3 care sedimenteaz ntr-un lichid de densitate 1,0 g/cm3. Datele22

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

din tab. 2.3 ofer o idee asupra dimensiunilor tipice ale diverselor tipuri de celule ntlnite n practic.Tabelul 2.3. Dimensiuni tipice ale unor celuleTipul de celul Virui bacterieni Bacterii Celule de drojdie Globule roii umane (eritrocite) Globule albe umane (leucocite) Fungii filamentoase Celule de ficat uman Celule vegetale Protozoare (paramecium, didinium) Dimensiuni [nm] 0,08 0,1 2,5 2 10 68 8 12 10 40 30 10 100 100 200

Teoretic, viteza de sedimentare este direct proporional cu ptratul diametrului celulelor. Orice mrire a diametrului agregatelor celulare va duce la creterea considerabil a vitezei de sedimentare. Creterea real nu este cea dat de legea lui Stokes, ci mai redus: n cazul agregatelor celulare poroase de nmol activat s-a constatat o mrire a vitezei de sedimentare proporional cu d0,55 [23]. Viteza de sedimentare este invers proporional cu viscozitatea fazei lichide. ntruct viscozitatea nu variaz liniar cu concentraia, o diluare cu 25 50% poate conduce la o descretere mai mare a viscozitii, ducnd la creterea vitezei de sedimentare. Dac dimpotriv se dorete ncetinirea sedimentrii celulelor, se pot aduga n faza lichid substane care mresc viscozitatea (de ex., soluii de 4% dextran cu masa molecular medie de 500 kDa). n aplicaiile industriale, sedimentarea gravitaional se realizeaz de regul n rezervoare de sedimentare specifice. Acestea sunt prevzute cu un racord de alimentare, un racord de evacuare sau de preaplin i un racord pentru evacuarea materialului sedimentat. Exist i alte echipamente care pot fi foarte eficiente n anumite situaii. Un astfel de echipament, care utilizeaz un dispozitiv nclinat, format din plci paralele, este redat n fig. 2.4 [24]. Acest dispozitiv este utilizat pentru Evacuare faza recircularea celulelor n procesele lichid continue de de cultur a celulelor sau de fermentare. Concepia aparatului permite nu numai Dispozitiv de obinerea unor densiti ridicate sedimentare Alimentare de mas celular n fermentator, cu suspensia de celule ci i o modalitate eficient de reinere selectiv a celulelor.Conducta de retur pentru celulele sedimentate (Dac dispozitivul este cuplat cu un bioreactor, aceast conduct alimenteaz partea superioar sau lateral a bioreactorului)

Figura 2.4. Dispozitiv nclinat pentru sedimentarea celulelor 23

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 2.3. SEPARAREA PRIN FILTRARE

n filtrare, particulele solide sunt separate din amestecul solid-fluid, fornd fluidul s treac printr-un material sau strat filtrant care reine particulele solide. Solidele rmn pe filtru sub forma unei turte de filtrare, opunnd o rezisten suplimentar procesului ulterior de filtrare.2.3.1. Mecanismul filtrrii

Ca operaie unitar, filtrarea este rezultatul a trei procese elementare [25]: (1) sedimentarea proces prin care particulele solide se depun pe stratul/suprafaa filtrant ca ntr-un decantor, (2) cernerea sunt reinute acele particule solide care au dimensiuni mai mari dect dimensiunile porilor stratului/suprafeei filtrante, (3) adsorbia particulele mai mici dect deschiderea porilor stratului/suprafeei filtrante sunt reinute prin fore de suprafa n interiorul porilor, provocnd colmatarea (nfundarea) filtrului. n funcie de proprietile materialului filtrant, unul dintre aceste procese elementare poate deveni determinant n filtrare, astfel nct putem vorbi despre filtrare n adncime, filtrare superficial, filtrare cu efect de sit [26].

a.

b.

c.

Figura 2.5. Tipuri de filtrare n conformitate cu mecanismul filtrrii: a filtrare n adncime; b filtrare superficial; c filtrare cu efect de sit Filtrele n adncime (fig. 2.5 a) sunt constituite din materiale fibroase, granulare sau sinterizate care produc o structur poroas aleatoare. Cnd o suspensie traverseaz filtrul, particulele solide devin captive n structura tortuoas a canalelor de curgere. Particulele sunt reinute prin adsorbie aleatoare i capturare mecanic n matricea materialului filtrant. Astfel de filtre se confecioneaz din bumbac, rayon, polipropilen, celuloz sau fibr de sticl. Filtrele superficiale (fig. 2.5 b) sunt constituite din mai multe straturi suprapuse de sticl sau microfibre polimerice. n timpul filtrrii, particulele mai mari dect spaiile din matricea filtrului sunt reinute n special la suprafaa filtrului. Particulele mai mici pot fi capturate n interiorul matricii. Particulele mari sunt reinute ca urmare a efectului de sitare, cele mici fiind reinute prin adsorbie aleatoare i capturare mecanic. Filtrele superficiale se confecioneaz din materiale polimerice, hrtie armat cu rini sau cu fibr de sticl. Filtrele sit (fig. 2.5 c) au o matrice poroas cu structur geometric regulat, n care particulele sunt reinute ca urmare a efectului de cernere. Particulele mici i 24

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

microorganismele mai mari dect dimensiunile porilor sunt reinute la suprafa. Procesul de filtrare este absolut, ntruct nici o particul mai mare dect diametrul porilor filtrului nu este lsat s treac. Astfel de filtre sunt membranele utilizate n separrile submicronice i macromoleculare din biotehnologii. Structura materialului filtrant este mai rigid, iar fabricarea acestor materiale este mai bine controlat dect n cazul altor tipuri de filtre. Fa de suprafaa filtrant faza fluid poate curge perpendicular sau tangenial. La curgerea perpendicular (fig. 2.6 b) particulele solide se depun pe suprafaa filtrant, grosimea stratului depus crete n timpul filtrrii, opunnd o rezisten din ce n ce mai mare la curgere. La un moment dat rezistena stratului de precipitate depus este att de mare nct filtrarea devine neeconomic i este necesar ndeprtarea particulelor depuse, curirea i regenerarea suprafeei filtrante. Aceast modalitate de filtrare este ntlnit n majoritatea echipamentelor clasice de filtrare i se numete filtrare fr ieire (dead-end filtration). La curgerea tangenial (fig 2.6 a) fluidul care nainteaz paralel cu suprafaa filtrant provoac forfecri care limiteaz creterea stratului de precipitat. Aceast modalitate de filtrare este ntlnit n procesele de separare prin membrane i se numete filtrare n curent ncruciat (cross flow filtration). O mic parte a fluidului alimentat traverseaz membrana, formnd aa-numitul filtrat sau permeat; restul fluidului este reinut sub form de retenat sau concentrat. Retenatul este recirculat peste membran pn cnd acesta ndeplinete condiiile cerute de concentraie [27].

Filtrat

Alimentare

Concentrat

Alimentare

Filtrat

Filtrat

a

b

Figura 2.6. Reprezentarea schematic a filtrrii: a curgere tangenial pe suprafaa filtrant (cross-flow filtration) b curgere perpendicular pe suprafaa filtrant (dead-end filtration)

Uurina filtrrii depinde de proprietile solidului i ale fluidului; separarea prin filtrare a solidelor cristaline necompresibile din lichide cu viscozitate redus este o operaie relativ simpl. Separarea prin filtrare a masei celulare de lichidele de fermentaie este n schimb o operaie dificil, att din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor, ct i din cauza comportrii nenewtoniene a lichidelor de fermentaie. Factorul determinant l reprezint ns natura masei celulare; aceasta poate avea caracter fibros, mucilaginos sau de past. Majoritatea celulelor microbiene formeaz precipitate compresibile, a cror porozitate scade pe msur ce filtrarea avanseaz. 25

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 2.3.2. Teoria filtrrii. Posibiliti de mbuntire a filtrrii

Filtrarea este o operaie care decurge n regim dinamic, nestaionar. ntruct procesul de filtrare este influenat de un numr foarte mare de factori, o teorie a filtrrii simpl i concomitent util din punct de vedere practic nu poate fi dezvoltat. Teoriile simple existente (teoria filtrului ideal, teoria filtrrii prin stratul de precipitat, teoria filtrrii prin stratul de precipitat cu luarea n considerare a suportului), completate cu determinri experimentale, servesc la proiectarea filtrelor i la conducerea raional a filtrrii. n conformitate cu teoria filtrrii prin stratul de precipitat cu luarea n considerare a suportului [25], n cazul filtrrii la cdere de presiune constant volumul specific de filtrat poate fi determinat pe baza ecuaiei:VS2 + 2 VS = t (2.2) n care VS [m3/m2] este volumul de filtrat V [m3] care n timpul t [s] trece printr-un m2 de suprafa filtrant, este coeficientul de rezisten al materialului filtrant [m2/s], iar este coeficientul de rezisten al precipitatului [m3/m2]. Dac rezistena materialului filtrant este mult mai mic dect rezistena stratului de precipitat, iar stratul de precipitat este incompresibil, ecuaia (2.2) devine [4]:2 P V V = = t = t r CS A2 S 2

(2.3)

n care V [m3] este volumul de filtrat colectat n timpul t [s], A este aria suprafeei filtrante [m2], P este diferena de presiune de pe feele filtrului [Pa], este viscozitatea fazei lichide [Pa.s], r este rezistena specific a stratului de precipitat [m/kg], iar CS este coninutul de faz solid din suspensia supus filtrrii [kg/m3]. Rezistena specific a stratului de precipitat este independent de P dac precipitatul este incompresibil. Pentru precipitate compresibile: r = r '(P )s

(2.4)

s reprezentnd compresibilitatea precipitatului. Compresibilitatea are valoarea 0 pentru precipitate rigide, incompresibile i apropiat de 1 n cazul materialelor puternic compresibile, aa cum sunt cele rezultate la filtrarea lichidelor de fermentaie. Rezistena specific a stratului de precipitat este funcie de proprietile particulelor din strat:

2 (1 ) r= 3 p

(2.5)

unde este factorul de form al particulelor [adimensional], este suprafaa specific a particulelor [m2/m3], este porozitatea (fracia de goluri) a stratului de precipitat [m3/m3], iar p este densitatea particulelor [kg/m3]. Pentru precipitatele compresibile, att ct i sunt funcie de cderea de presiune prin strat. Viteza filtrrii este exprimat uzual prin debitul de filtrat colectat. Ecuaia (2.3) pus sub forma (2.6):26

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

mV =

V 2 A2 P [m3/s] = t r CS V

(2.6)

ne arat c debitul de filtrat (mV) este direct proporional cu ptratul ariei suprafeei filtrante, i este invers proporional cu rezistena specific a stratului de precipitat, viscozitatea fazei lichide, volumul i concentraia suspensiei. Pe baza acestei ecuaii se pot stabili o serie de msuri care pot fi luate pentru mbuntirea procesului de filtrare al unei suspensii date [3]: - Creterea ariei suprafeei filtrante, A. Dei viteza de filtrare crete cu ptratul suprafeei filtrante, creterea lui A necesit instalarea unor echipamente mai mari, mrindu-se astfel cheltuielile de investiii. - Creterea valorii diferenei de presiune pe feele filtrului, P. Soluia este valabil numai n cazul precipitatelor necompresibile. n cazul precipitatelor compresibile sau a precipitatelor cristaline sub form de ace sau plci, creterea P va conduce la nrutirea filtrrii. Pentru precipitatele compresibile (cum sunt marea majoritate a precipitatelor obinute din suspensii de mas celular), este necesar reducerea compresibilitii precipitatului, prin adugare de adjuvani de filtrare. - Reducerea masei precipitatului, CS = mp/V. La filtrarea n filtre rotative continue, acest lucru se realizeaz prin reducerea grosimii stratului de precipitat depus pe tambur la fiecare rotaie a acestuia i prin plasarea racletei care ndeprteaz precipitatul ct mai aproape de tambur, astfel nct pe pnza filtrant s rmn un strat de reziduu solid minim. - Reducerea viscozitii fazei lichide, . Dac viscozitatea iniial a suspensiei este foarte ridicat, diluarea poate conduce la reducerea viscozitii. Nu se recomand reducerea viscozitii prin mrirea temperaturii suspensiei, deoarece majoritatea lichidelor de fermentaie nu suport temperaturi ridicate fr o degradare termic a produselor. - Reducerea rezistenei specifice a stratului de precipitat, r. Pe baza ecuaiei (2.5), mijloacele posibile de micorare a valorii lui r sunt: o Creterea porozitii, . Porozitatea scade pe msur ce are loc filtrarea celulelor. Reducerea acestui efect se poate realiza utiliznd adjuvani. o Reducerea valorii factorului de form, . n cazul suspensiilor de micelii, morfologia celulelor se poate schimba modificnd condiiile de fermentare. o Reducerea suprafeei specifice a particulelor, . Creterea dimensiunilor medii ale particulelor i minimizarea variaiilor n mrimea particulelor conduce la scderea lui . Acest efect se poate atinge prin schimbarea condiiilor de fermentare sau prin condiionarea suspensiei (adaosuri de floculani i/sau coagulani) nainte de filtrare.2.3.3. Alegerea i dimensionarea echipamentelor de filtrare

Filtrarea lichidelor de fermentaie care conin mas celular cu caracter fibros (culturi de fungi din clasele Aspergillus i Penicillium) este o operaie relativ uoar, miceliul necolmatnd materialul filtrant i desprinzndu-se uor de pe acesta. La nivel27

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

de operare industrial se recomand filtrele rotative cu vid (filtrele Oliver), echipamente care confer o suprafaa mare de filtrare, posibiliti de splare a miceliului pe filtru pentru recuperarea avansat a produselor utile i n plus se preteaz la automatizare [3, 4].lichid de splare

lichid de fermentaie

biomas

A

5

B

Figura 2.7. Filtru celular rotativ cu vid (Oliver)A seciune transversal; B seciune longitudinal 1 tambur rotativ; 2 celule; 3 material filtrant; 4 tuburi de legtur ntre celule i capul de distribuie; 5 arbore; 6 roat dinat de acionare; 7 cap de distribuie; 8 raclet pentru desprinderea precipitatului; 9 cuv; 10 agitator pendular; 11 racord pentru alimentarea lichidului de splare; 12 racord pentru alimentarea lichidului de fermentaie (suspensia de mas celular).

Un filtru rotativ cu vid (fig. 2.7) este alctuit dintr-un tambur rotativ (1) cu lungimea de 1 4,5 m i diametrul de 0,5 3 m, construit din 2 cilindri orizontali coaxiali. Tamburul se rotete lent (0,1 2 rpm) fiind paial imersat ntr-o cuv (9) n care este alimentat i agitat (10) lichidul de fermentaie. Cilindrul exterior este perforat i acoperit cu material filtrant (3), iar spaiul dintre cilindri este mprit, prin perei radiali, n 6 12 celule etane (2) care funcioneaz succesiv i independent ca nite filtre nuce. Celulele sunt legate, prin intermediul unui cap de distribuie (7) i a tuburilor de legtur (4), de conductele de vid sau aer comprimat. Suprafaa tamburului este mprit n mai multe zone corespunztoare operaiilor de filtrare (a d), deshidratare (e, f), splare (g), deshidratare dup splare (h j), ndeprtare a stratului de miceliu (l) i regenerare a suprafeei filtrante (m). n timpul unei rotaii a tamburului, fiecare celul trece succesiv prin toate aceste zone. Capul de distribuie asigur crearea vacuumului n zonele de filtrare (a d), splare (g) i deshidratare (e, f, h j) i insuflarea de aer comprimat n zonele de ndeprtare a miceliului de pe filtru (l) i dezobturare a porilor suprafeei filtrante (m). Tamburul (1) are un grad diferit de scufundare n lichidul de fermentaie supus filtrrii, n funcie de caracterul stratului filtrant i de necesitile de splare i uscare. n obinerea antibioticelor, de ex., se utilizeaz filtre a cror adncime de scufundare a tamburului este de pn la 50 % [28]. Dac produsul util este localizat28

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

numai n faza lichid, splarea masei celulare dup filtrare nu este o operaie dificil. Debitul i amplasarea jeturilor de ap de splare trebuie alese astfel nct s se evite diluarea excesiv a filtratului. Miceliul de pe materialul filtrant se ndeprteaz cu ajutorul racletei (8). Dintre dezavantajele filtrului celular rotativ cu vid se pot meniona: - etanarea defectuoas a celor dou discuri ale capului de distribuie; - griparea suprafeei lefuite a discurilor prin particole de solid scpate n filtrat; - splarea insuficient a biomasei, datorit depunerii sale ntr-un stat cu grosime inegal, sau prin apariia fisurilor n stratul de biomas depus; - eliminarea nesatisfctoare a apei n faza de desecare a precipitatului de biomas; - evacuarea defectuoas a biomasei cu ajutorul racletei de desprindere. Aceste deficiene au fost eliminate prin construcia unor utilaje mai performante, cum ar fi filtrul Oliver perfecionat (fig. 2.8) [25]. Acesta utilizeaz un cap de distribuie care elimin frecrile ntre suprafeele metalice. Suprafaa i grosimea biomasei depuse pe filtru sunt uniformizate cu ajutorul unui dispozitiv cu rulori care conduc o pnz cu rol de egalizare a grosimii, stoarcere i astupare a fisurilor n stratul de precipitat. n locul pnzei se poate folosi un rulou de presare, apa din precipitat fiind ndeprtat mai bine. Desprinderea precipitatului se poate face att cu ajutorul racletei, ct i prin intermediul sforilor, lanurilor sau a unor rulouri de preluare din cauciuc.

lichid de splare

biomas

Figura 2.8. Filtru rotativ celular cu vid perfecionat a zon de filtrare; b zon de splare; c zon de desprindere a precipitatului. n medalion: desprinderea precipitatului cu ajutorul ruloului de preluare

Dimensionarea filtrelor se bazeaz pe stabilirea suprafeei necesare de filtrare, A. n cazul filtrelor aflate curent n exploatare, aceasta variaz ntre 5 i 40 m2 [4, 25].29

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Pentru o durat t a filtrrii impuse, cunoscndu-se fora motoare a filtrrii (P), caracteristicile suspensiei i ale precipitatului, aria filtrului n funcie de debitul de suspensie prelucrat se determin pe baza ecuaiei (2.3). Pentru precipitate compresibile, valoarea VS obinut prin calcul se corecteaz prin nmulire cu coeficienii K1 i K2:(VS ) corectat = K1 K 2 (VS ) calculat unde : K1 = 50 ; K 2 = P CS

(2.7)

Pentru filtrele rotative continue, t reprezint durata unui ciclu de filtrare, putndu-se calcula cu relaia: 1 t= [s] (2.8) n 100 n care n reprezint turaia filtrului (s-1), iar reprezint gradul de scufundare al filtrului n mediul supus filtrrii (%). Viteza de filtrare se determin n funcie de volumul de filtrat obinut pe unitatea de suprafa de filtrare ntr-un ciclu de filtrare: (V ) (2.9) v f = S corectat [m3/(m2.s)] t Valorile vitezei de filtrare calculate n acest mod sunt apropiate de valorile experimentale prezentate n tab. 2.4 [4].Tabelul 2.4. Viteza de filtrare a unor lichide de fermentaie [4]Lichid de fermentaie (produs) Penicillium (peniciline G i V) Streptomyces S. kanamyceticus (kanamicina) S. fradiae (neomicina) S. lincolnensis (lincomicina) Bacillus subtilis (proteaze) Hidrolizat de drojdii CS [kg/m3] 50 28 Caracteristicile filtratului r [Pa.s] [m/kg] 10,3 3,92 3,1.1011 1,6.1014 Tipul filtrului filtru rotativ cu vid filtru rotativ cu strat adjuvant filtru pres filtru rotativ cu strat adjuvant filtru rotativ cu strat adjuvant 18,5 9,8 3,5.1012 filtru pres filtru rotativ cu strat adjuvant filtru rotativ cu strat adjuvant filtru rotativ cu strat adjuvant vf [L/(m2.h)] 238 - 256 1413 - 1848 12,5 87 130 58 380 109 - 435 304

Tabelul 2.5. Viteza de filtrare a lichidelor de fermentaie a P. Chrysogenum (P = 0,054 MPa, = 40 %)r [m/kg] 2.1011 3.1011 5.1011 n = 1 rpm 1140 875 606 Viteza medie de filtrare, vf [L/((m2.h)] la n = 2 rpm n = 3 rpm n = 4 rpm 740 617 530 615 500 342 432 356 306 n = 5 rpm 407 390 375

30

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

n funcie de viteza de filtrare se determin turaia optim a tamburului, la diferite valori ale rezistenei precipitatului depus (r) i ale gradului de scufundare a filtrului n suspensie (). n tab. 2.5 este prezentat dependena dintre viteza de filtrare, r i pentru filtrarea lichidelor de fermentaie ale P. Chrysogenum, la biosinteza penicilinelor G i V. Pentru capaciti de producie mici se pot utiliza i filtrele pres, care acumuleaz treptat biomasa i sunt deschise periodic pentru ndeprtarea precipitatului. Aceste filtre sunt operate n regim discontinuu i de regul ndeprtarea precipitatului este operaia cea mai costisitoare i mai greoaie, necesitnd munca manual. Recent au fost introduse n practic filtrele presurizate Larox, care funcioneaz n regim pseudocontinuu i se preteaz la automatizare pe scar larg. Un astfel de filtru este alctuit din mai multe uniti de filtrare identice (fig. 2.9), amplasate pe nlime, prin care trece o band filtrant fr sfrit ghidat prin intermediul unor role de capt. Fiecare unitate de filtrare este alctuit din trei camere amplasate una peste alta. Camera superioar este separat de camera intermediar prin intermediul unei membrane elastice, n timp ce camera intermediar este separat de camera inferioar de ctre pnza filtrant.1 6

5 7 2

8

4 3

Figura 2.9. Unitate de filtrare a unui filtru presurizat Larox1 camera superioar; 2 camera intermediar; 3 camera inferioar; 4 pnza filtrant; 5 membran elastic; 6 racord de alimentare cu ap sub presiune; 7 racord de alimentare cu suspensie/ap de splare/aer comprimat; 8 racord de evacuare a filtratului.

n forma sa cea mai complet, procesul de filtrare decurge n ase etape succesive. Toate unitile de filtrare lucreaz simultan, fiecare dintre ele gsindu-se n aceeai etap a filtrrii. n prima etap, de filtrare propriu-zis, se umple camera intermediar cu suspensia supus filtrrii. Sub aciunea forei gravitaionale, faza solid se depune pe banda filtrant, iar lichidul trece prin aceasta, ptrunznd n camera inferioar, de unde este evacuat. n a doua etap, de stoarcere a precipitatului, n camera superioar se introduce ap sub presiune. Aceasta deformeaz membrana elastic provocnd stoarcerea mecanic a precipitatului aflat n camera intermediar. n a treia etap, de splare, n timp ce apa sub presiune este evacuat din camera superioar, n camera intermediar se introduce peste precipitat ap pentru splarea precipitatului. Aceasta se poate colecta mpreun cu filtratul sau separat. A patra etap const n31

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

stoarcerea precipitatului splat, prin pompare de ap sub presiune n camera superioar, deasupra membranei elastice. Etapa a cincea o reprezint uscarea precipitatului. Pe msur ce apa sub presiune prsete camera superioar, n camera intermediar se introduce aer comprimat deasupra precipitatului. Aerul trece prin stratul depus pe filtru realiznd uscarea. A asea i ultima etap este cea de descrcare a precipitatului. Toate unitile de filtrare se deschid, iar pnza filtrant execut o micare de deplasare fiind ghidat de rolele de capt exterioare. La trecerea pnzei peste role, sub aciunea forei gravitaionale, sau prin intermediul unor raclete, precipitatul se desprinde de pe pnz i cade pe un dispozitiv colector. Pnza filtrant este splat automat. Dup ce pnza filtrant a avansat de la o unitate de filtrare la alta, unitile se nchid i se reia ciclul de filtrare. Etapele procesului de filtrare sunt redate n fig. 2.10. Principalele caracteristici ale acestor filtre sunt redate n tab. 2.6.Tabelul 2.6. Caracteristici constructive ale filtrelor presurizate Larox [29]Caracteristica Suprafa filtrant Capacitate maxim Presiune de operare Putere consumat: - uniti de 9,5 38 m2 - uniti de 48 144 m2 18,5 kW (5,5 15 kW pentru presare diafragme) 86 kW (diafragme acionate pneumatic) 1,6 144 m2 150 t/h substan uscat max. 1,6 MPa Valoare

Utilizarea filtrelor presurizate Larox n industria produselor de biosintez a condus la realizarea de economii importante, n special prin creterea gradului de recuperare al filtratului. S-au redus de asemenea cu pn la 50% pierderile de miceliu, iar randamentele de recuperare au crescut de la 94 la 98 %, pe fondul scderii costurilor de filtrare. Separarea masei celulare din lichidele de fermentaie ale bacteriilor, actinomicetelor, a hidrolizatelor celulare se face mult mai dificil dect n cazul biomaselor fibroase. Aceasta se explic prin caracterul mucilaginos al masei celulare care obtureaz rapid porii materialelor filtrante. n acelai timp, trebuie remarcat dezavantajul creat de nestandardizarea mediilor de cultur, manifestat prin inconstana de la o arj la alta a principalilor parametri care determin filtrabilitatea: coninutul de suspensii, viscozitatea, caracteristicile biomasei, coninutul de proteine, etc [4]. ntruct ncercrile de separare a antibioticelor cu schimbtori de ioni direct din suspensia celular, utilizarea centrifugelor sau a filtrelor pres nu au dat rezultatele scontate, s-a ajuns la concluzia c rezolvarea problemei filtrrii lichidelor de fermentaie trebuie nceput cu modificarea radical a caracteristicilor de filtrabilitate a acestora, n scopul mririi vitezei de filtrare i a pierderilor de produse utile. n scopul mririi vitezei de filtrare, lichidele de fermentaie se supun unor tratamente preliminare termice, acide sau cu ali ageni chimici, n scopul coagulrii moleculelor proteice i a agregrii biomasei, cu sau fr adugarea suplimentar a unor materiale cu rol de strat adjuvant (materiale poroase obinute din diferite roci vulcanice:32

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

perlit, supercel, dicalit, sau din resturi ale exoscheletelor diatomitelor: kieselgur). Alegerea metodei de prelucrare preliminar este determinat de caracteristicile lichidului de fermentaie, de natura produsului biosintetizat (stabilitate chimic i termic), precum i de caracteristicile precipitatelor formate.

1. Filtrare Filtrat 2. Stoarcere Filtrat 3. Splare Filtrat 4. Stoarcere post-splare Filtrat 5. Uscare Filtrat 6. Evacuare precipitat Precipitat Ap sub presiune Aer comprimat Ap sub presiune Ap de splare Ap sub presiune Suspensie

Ap sub presiune

Precipitat

Figura 2.10. Etapele procesului de filtrare ntr-un filtru presurizat Larox 33

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Adjuvanii de filtrare se pot aduga fie nainte de filtrarea lichidului de fermentaie, formnd un strat care previne blocarea porilor materialului filtrant de ctre masa celular fie prin amestecare direct cu lichidul de fermentaie (fig. 2.11). Aceast ultim metod se recomand doar dac produsul util este extracelular. Adaosul de adjuvani mrete costul filtrrii, cantitatea minim de adjuvant stabilindu-se experimental (fig. 2.12). Kieselgurul adsoarbe lichid, i ca urmare, dac produsul util se gsete n faza lichid, vor aprea pierderi suplimentare. Alt dezavantaj este acela c dei adjuvanii mresc viteza de filtrare, limpiditatea filtratului scade. Apar probleme suplimentare i cu depozitarea precipitatului: biomasa cu coninut de kieselgur, de ex., nu poate fi utilizatn hrana animalelor dect dup ndeprtarea adjuvantului.Adjuvant adugat anterior filtrrii lichidului de fermentaie Precipitat format din masa celular i adjuvant

Productivitatea filtrului, L/m2

kieselgur mare

Direcia de curgere a lichidului de fermentaie

Filtrat

kieselgur mijlociu kieselgur fin fr kieselgur

Durata filtrrii, minutePnza filtrant Adjuvant adugat n lichidul de fermentaie

Figura 2.11. Utilizarea adjuvanilor n filtrarea lichidelor de fermentaie [3]

Figura 2.12. Efectul adaosului de kieselgur asupra productivitii filtrrii [25]

Prin coagulare, rezistena stratului depus i rezistena total (rezistena stratului + rezistena materialului filtrant care are depunerile reinute n pori) se reduc semnificativ (cu circa 2 ordine de mrime: de la 1013 1014 la 1011 1012). Reducerea rezistenelor la filtrare a permis utilizarea filtrelor continue de tipul filtrelor rotative cu vid i cu strat adjuvant, a cror vitez de filtrare este de 100 300 L/(m2.h) [4]. Un astfel de filtru este filtrul cu rennoirea suprafeei de filtrare. Acesta este un filtru Oliver prevzut cu un cuit cu avansare micrometric, care n timpul funcionrii se deplaseaz ndeprtnd biomasa depus mpreun cu stratul superficial de adjuvant. Depunerea stratului de adjuvant (dicalit de calitate medie i grosier) pe materialul filtrant (sit metalic cu ochiuri de 150 200 m sau estur sintetic) se realizeaz naintea nceperii operaiei de filtrare a biomasei. n timpul depunerii adjuvantului, viteza de filtrare se regleaz cu ajutorul vidului astfel nct n 45 60 min s se depun un strat gros de 20 100 mm. Apoi se regleaz viteza de naintare a cuitului micrometric, care s corespund unei deplasri de 0,15 0,45 mm n timpul 34

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

unei rotaii complete a tamburului. n cuva filtrului se introduce lichidul de fermentaie, n prealabil tratat chimic sau termic, i se filtreaz pna cnd pe suprafaa tamburului rmne un strat de adjuvant cu grosimea de 5 8 mm. Un ciclu de filtrare dureaz 6 24 h. Durata ciclului de filtrare se poate calcula cu relaia: hi h f t= (2.10) 60 h n n care t este durata ciclului de filtrare [h], hi i hf sunt respectiv grosimea iniial i final a stratului de adjuvant [mm], h este adncimea ptrunderii cuitului micrometric la o rotaie a tamburului [mm], iar n este turaia tamburului [rot/min]. Turaia tamburului influeneaz semnificativ procesul de filtrare. O dublare a turaiei, de la 0,5 la 1,0 rot/min conduce la dublarea aproape a vitezei de filtrare. Cea mai important cretere a vitezei de filtrare pentru biomasele bacteriene i actinomicetice se produce la turaii de 0,5 0,66 rot/min. La mrirea turaiei de la 0,66 la 1,0 rot/min, ritmul de cretere a vitezei de filtrare se diminueaz, iar consumul de adjuvant crete cu 0,1%. Nu se recomand creterea turaiei peste 1,0 rot/min ntruct stratul de biomas nu se deshidrateaz suficient, datorit micorrii duratei etapelor de uscare [4].2.4. SEPARAREA PRIN CENTRIFUGARE

Centrifugarea este o tehnic de lucru care permite realizarea unor procese de separare (sedimentare, filtrare, spargerea emulsiilor, extracie, etc.) ntr-un cmp de fore centrifugal, procese care uneori sunt dificil sau chiar imposibil de realizat numai sub aciunea gravitaiei. Acest capitol trateaz numai procesele i aplicaiile referitoare la sedimentarea n cmp de fore centrifugal. n biotehnologii, centrifugarea are numeroase aplicaii: separarea masei celulare din lichidele de fermentaie, ndeprtarea resturilor celulare, colectarea precipitatelor, prepararea unor medii de fermentare, separarea diferitelor tipuri de celule, extracia diverilor componeni (alcaloizi, arome, uleiuri eseniale din