curs salm zootehnie

7/28/2019 Curs Salm Zootehnie

1/37

Izolarea i confirmareabacteriilor din genul

Salmonella spp.bacterii patogene

pentru om


2/37

Izolarea Salmonella spp.

Izolarea i confirmarea Salmonella spp. din produse

alimentare de origine animal si nonanimala Pe plan mondial, cel mai des incriminat agent etiologic

al toxiinfeciilor alimentare (TIA) sunt salmonelele.

TIA sunt considerate cea mai frecvent zoonoz,

morbiditatea n cazul salmonelozelor este mult mairidicat n Europa dect n America, dei n ultimii anis-a constatat o escaladare a numrului de mbolnviripe ambele continente.

n Romnia, numai n 1997, au fost confirmate itipizate de ctre Centrul Naional de Referin pentruSalmonellade la Institutul Cantacuzino din Bucuretiun numr de 1 475 de tulpini de Salmonella spp.


3/37


4/37

Metode de izolare i confirmare Salmonella spp.

utilizate n laboratoarele veterinare de diagnosticdin Romnia:

SR EN ISO 6579/2003 actualizat n 2006 i 2007 -Metod orizontal pentru detectarea (izolarea i

confirmarea) bacteriilor din genul Salmonella.completat cu;

SR-EN 12 824/2004 i alte normative i prevederi

din literatura de specialitate.


5/37

DEFINIIEconform SR-EN -ISO 6579/2006-2007

Microorganismele care formeaz colonii tipice sau mai puintipice pe medii selective solide XLD i RVS cu soia, (respectivalte medii HK, IM, .a.)i care posed caracteristici biochimicei serologice descrise conform prezentului standard, suntconsiderate Salmonella spp.

SCOPconform SR-EN -ISO 6579/2006-2007Detectarea prezenei sau absenei germenilor din genulSalmonellantr-o cantitate determinat de produs (25g), atuncicnd analiza este efectuat conform prezentului Standard

Internaional.


6/37

Etapele de lucru

ETAPA 1. Prembogirea(mbogire neselectiv). Din proba de analizat se preleveaz 25 de grame (dinprofunzime) care se nsmneaz n unul din mediilede prembogire: ap peptonat tamponat.

Mediul de prembogire - ap peptonat tamponat(APT), poate fi utilizat i pentru efectuarea diluiilor.

APT se folosete n cantitate de 225ml la care se adaug25 g prob, respectnd raportul prob/mediu de 1/9.Incubaia se efectueaz la 350 C sau la 370C -/+ 10C,timp de 16-20 ore.


7/37

ETAPA 2. mbogirea selectiv.

din mediul de prembogire se preleveaz 0,1 ml decultur (din mediul de prembogire) care se introducen 10 ml de bulion cu verde malahit i clorur demagneziu, denumit i mediul RappaportVassiliadis cu

soia (R-VS), iar 1 ml din cultur se introduc n 10 ml de mediu MullerKauffman tetrationatnovobiocin (MKTTn).


8/37

Incubaia se efectueaz astfel:

eprubeta cuRappaportVassiliadiscu soia (RVS) seincubeaz timp de 24 ore +/-3 ore la 41,50C;

eprubeta cuMuller Kauffman tetrationatnovobiocin(MKTTn)seincubeaz la 370C +/- 10C, timp de 24 ore+/-3 ore .


9/37

ETAPA 3 . Izolare i identificare

cu ansa bacteriologic ncrcat cu cultura obinut

din MKTTn i RVS (medii de mbogire selectiv) sestriaz pe suprafaa uscat a unei n plci Petri dedimensiuni 10 cm diametru, n care s-a turnat mediulxiloz-lizin-deoxicolat (XLD) i o alt plac cu un altmediu selectiv RVS SEMISOLID

la alegere: agar Hektoen (HK), agar Mac-Conkey(McK), Istrati-Meitert (IM), agar-deoxicolat-citrat-lactoz (ADCL), Drigalsky (Dky), etc.

din cultura obinut n mediile selective se testeaz

biochimic, dup modalitatea pe care o vom descrie laconfirmarea tulpinilor care formeaz coloniicaracteristice sau mai puin caracteristice dar suspectede a fi Salmonella;


10/37

Citirea caracteristicilor coloniilor de Salmonella pe mediilemenionate prezint urmtoarele aspecte:

Mediul obligatoriu este mediul XLD, conform acestui standard; Coloniile de Salmonellasunt pe mediul XLD (xiloz, lizin,

lactoza, deoxicolat) (bioMerieux), de culoare roie, deoareceacestea nu utilizeaz lactoza.

Tulpinile de E. coli, Citrobacter, Enterobacter, etc., carefolosesc att lactoza ct i xiloza, determin apariia coloniilorde culoare galben n prezena indicatorului rou fenol,deoarece pH-ul devine acid.

Acest mediu este recomandat n special pentru difereniereacoloniilor de Salmonella de cele de Shigella, deoarece permiteproducerea de H2S, aceste colonii avnd centrul negru.


11/37

Colonii transparente (roii) de Salmonella spp. H2S pozitive, pe mediul XLD


12/37

Mediul Rappaport Vassiliadis

Coloniile de culoare gri cenusiu sunt

caracteristice pt. Salmonella

Coloniile de culoare alba sau alte culori sunt

necaracteristice


13/37

Mediul Hektoen (bioMerieux), este inhibitor al speciilor de E.coli, Citrbacter i Proteus, ns nu inhib dezvoltareavibrionului choleric.

Salmonella H2S (+) produce colonii de culoare verde cucentrul negru, iar Salm. H2S (-)prezint colonii de culoareverde cu centrul albastru.

Coloniile de culoare roz pot fi de Salm. Arizonae, dar se pot

dezvolta slab i colonii de E. coli, Enterbacter, Citrobacter,Klebsiella, Serratia,chiar cu acelai aspect.

Coloniile roz cu centru negru sunt produse de Proteusvulgaris.

Acest tip de colonii este ntlnit i n cazul dezvoltriispeciilor de Shigella, M. morgani, P. rettgeri, Providencia,Pseudomonas, iar Vibrio choleraeproduce colonii roz.


14/37

Interpretare:

Pentru diferenierea coloniilor de Salmonellade Shigellaurmrim:

colonii de culoare verde cu centrul negru sunt consideratecolonii suspecte, posibil de P. mirabilissau de Salmonella,

colonii verzi sau albastre sunt considerate suspecte i pot fide Shigella, tulpini H2S- de Salmonella, M. Morganii,Providencia rettgeri sau Pseudomonas,

colonii roz, galbene, cu sau fr centru negru nu suntsuspecte i pot fi colonii de: E. coli, Enterobacter, Klebsiella,

Serratia, Citrobacter, P. vulgaris, etc., Limitele mediului constau n faptul c speciile Salm.

Arizonaei Sh. Sonneinu sunt suspecte n aparen.


15/37


16/37

Formerea coloniilor H2S-pozitive, pe mediul Hektoen, la 24 i 48 ore (3x10)


17/37

Alte medii recomandate pt. Salmonella spp.;

Mediul cu rou fenol i verde briliant, BGA sau Edel iKampelmacher (Oxoid);

Pe mediul Edel-Kampelmacher coloniile prezumtive desalmonele sunt:

de dimensiuni mici, 1-2mm, roii, rotunde, cu suprafaabombat, umed;

mediul din jurul coloniei prezint coloraie rou-aprins sauroz-rou;

este un mediu utilizat pentru selectarea i izolareaSalmonella spp. din produse alimentare, n special bacteriilecare se gsesc n numr mic.


18/37

Principiu

mediul cu rou fenol i verde briliant are urmtoareleproprieti:

verdele briliant inhib bacteriile Gram pozitive iunele bacterii Gram-negative,

comparativ cu mediul Cristensen, acesta este mbogitcu factori nutritivi, inhibitori i reductori,

mediul conine carbohidrai, sucroz i lactoz, careprin fermentare schimb pH-ul mediului,

n prezena roului fenol ca pH indicator vor apreacolonii galbene n cazul bacteriilor care folosesc aceste

zaharuri, Salmonellaproduce colonii de culoare roz.


19/37

Interpretare

Mediul cu rou fenol i verde briliant prezint urmtoareacitire:

Colonii roz sau roii, lactoz/sucroz negative, sunt coloniisuspecte de Salmonella,

colonii roz, proliferate, rugoase sunt tulpini de Proteus,

colonii mici roz, sunt reprezentate de Pseudomonas,

colonii galbene, galben-verzui, nconjurate de o zon galben,sunt colonii de Escherichia, Citrobacter, Klebsiella,Enterobacter, deci tulpini lactoz i sucroz pozitive,

bacteriile Gram-pozitive sunt inhibate pe acest mediu.


20/37


21/37


22/37

Mediul Istrati-Meitertproduce colonii de culoare verde-albastrpentru Salmonella spp., cu centrul negru n cazul coloniilor H2S (+),cu diametrul de 2mm, semitransparente, lucioase, luminoase,uneori prezint centrul mai ntunecat sau chiar negru(in cazul salmonelelor care produc H2S), iar mediul din jurul coloniei vireaz nalbastru.


23/37

Salmonella spp., pe mediul SS


24/37

Salmonlla spp. produce colonii negre pe mediul Wilson Blair


25/37

Salmonella produce colonii roii, iar bacteriile coliforme colonii albastre

pe mediul RAMBACH


26/37


27/37

Salmonella spp., pe mediul nz


28/37

ETAPA 4. Confirmarea Salmonella spp.:

Efectuarea testelor biochimice;

Efectuarea reaciilor serologice;

Testarea AND-ului prin testul PCR.

Efectuarea testelor biochimice;

Mediul TSIglucoz, lactoz, zaharoz Interpretarea reaciilor biochimice se face prin

vizualizarea culorii pe coloana i panta mediului TSI:

coloana galben a mediului denot fermentarea glucozei

(reacie pozitiv);


29/37

panta mediului de culoare rosie denot

nefermentarea lactozei i/sau zaharozei(lactoz i/sau zaharoz pozitiv);

apariia coloraiei negre, denot

producerea de hidrogen sulfurat; producerea de gaz din glucoz se

vizualizeaz prin apariia bulelor de gaz

n mediu sau chiar prin rupereamediului.


30/37

- Salmonellanu produce indol, reacia

este negativ pe banda de hrtieimpregnat cu para-dimetilamino-benzaldehid.

- Salmonella spp. Sunt mobile, cuexcepia serotipurilor GallinarumiPullorum serotipuri care sunt imobile.


31/37

Mediul MILFmobilitate, indol, lizin, fenilalanin

apariia unei coloraii violete dup incubare indic o

reacie pozitiv, deci producerea lizindecarboxilazei,salmonelele fiind de regul lizindecarboxilaz pozitive;

verificarea producerii de feninalanindecarboxilaz severific prin adugarea clorurii ferice la suprafaamediului, salmonelele fiind feninalanindecarboxilaznegative nu se produce virarea culorii n verde (reacienegativ);

mobilitatea tulpinilor nsmnate determinmodificarea turbiditii mediului, indiferent de

modificrile de culoare care pot aprea;


32/37

Mediul citrat Simmonsbacteriile din genul Salmonellautilizez citratul de sodiureacie pozitiv, apariia coloraiei albastre a mediului,

deci virarea din verde n albastru, dup incubare;reacie negativ nu se modific culoarea iniial amediului.


33/37

Mediul MIU i Christensen este utilizat pentru verificarea utilizrii ureeii prin

hidroliz

germenii din grupul Salmonella nu folosesc urea-

reacie negativ, coloraia mediului (maronie pentru MIU i galben

deschis la mediul Cristensen) nu este modificat;

reacia pozitiv se produce o nglbenire a mediului.


34/37

Utilizarea ureii de Salmonella spp.pe mediul MIU


35/37

Utilizarea citratului de Salomnella spp.

pe mediul Citrat Simmons


36/37

DECARBOXILAREA ORNITINEI - pe mediul MIO


37/37

Teste biochimice pentru identificare i confirmare

curs salm zootehnie

Documents