CURS nr.8

Metode de verificare a strii de igiena a suprafeelorREZISTENA MICROORGANISMELOR LA DEZINFECIE

Apariia riscului rezistenei microorganismelor la dezinfectani este mai mic, comparativ cu aceea a rezistenei la antibiotice. Acest lucru este datorat faptului c dezinfectanii comparativ cu antibioticele posed numeroase cmpuri de aciune. Cteodat, ns, se poate observa aceast rezisten, dar problema nu a fost pe deplin elucidat.

Sensibilitate i rezistena reprezint termeni relativi. Se numete rezistent o su, a unei specii sau a unei familii, care nu poate fi distrus de un dezinfectant utilizat la o concentraie obinuit.

Rezistenta transferabil

Se pare c n cazul rezistenei la dezinfectani un rol important l joac plasmidele. Se poate cita cazul rezistenei bacteriei Staphylococcus aureus, la anumii dezinfectani cationici. Aceast rezisten apare simultan cu rezistena la anumite antibiotice. Se pare c, pentru bacteriile Gram-negative, plasmidele sunt mai puin implicate.Rezistena poate s apar sub diferite forme. De exemplu, bacteria poate s produc enzime care s inactiveze i s opreasc ptrunderea biocidului n celul, sau s fie capabil s excreteze biocidul absorbit. Inactivarea biocidelorAcest tip de rezisten a fost observat n cazul: mercurului, derivatelor organomercurice, cadmiului i arseniatelor. S-a observat c unele bacterii sunt rezistente la ionii de Hg++i ai derivatelor organomercurice. Aceast rezisten este dat de prezena enzimelor specializate de tipul hidrolazelor i reductazelor, care se gsesc n citoplasm. Numeroase hidrolaze acioneaz asupra legturilor carbon-mercur ale derivatelor organomercurice, cu formarea ionilor de Hg++. Aceti ioni sunt n continuare redui prin intermediul reductazei n mercur metalic, care poate s fie eliminat sub form de vapori (Chopra, 1982).

Acest factor de rezisten poate s fie purtat de plasmide i poate fi transferat prin conjugare i transducie (Silver i Mistra, 1988).

Protecia dat de biofilme

Aa cum s-a artat, anumite bacterii pot s adere ntre ele sau la suprafee datorit secreiilor exopolizaharidice. Indivizii care formeaz colonii sunt sudai ntre ei sau de suprafee printr-un biofilm continuu. n aceast etap, germenii sunt, de obicei, foarte rezisteni la biocide.

Pe aceast tem s-au emis diferite teorii: schimbri fiziologice ale microorganismelor, obstacole de penetrare a biocidelor etc.Experienele lui Stewart i Colab. (1996) au ajuns la concluzia c aceast rezisten are dou origini: una este legat de neutralizarea parial a biocidului de materiile organice ale biofilmului i alta este legat de gradientul de concentraie n biocid, care se stabilete n grosimea filmului.

Limitarea riscului de apariie a rezistenei la dezinfectant

Pentru a evita apariia de microorganisme rezistente la dezinfectani, trebuie luate anumite msuri obligatorii:

n primul rnd, respectarea strict a regulilor legate de igiena general; dezinfecia, ntotdeauna, s fie precedat de curire corespunztoare; este indicat ca dezinfecia s se realizeze alternativ cu dou sau mai multe produse care s aib mecanisme de aciune diferite. Aceast metod este preferabil aceleia care const n amestecarea empiric a mai multor produse, cteodat incompatibile ntre ele;

este absolut necesar s se reziste la tentaia de a diminua concentraia sau timpul de contact corespunztor, din spirit de economie de bani i timp. Eficiena igienizrii, apreciat prin examen microbiologic

Pentru a verifica eficiena igienizrii i a condiiilor de igien n spaiile de producie, depozitare, prelucrare, desfacere i consum a produselor alimentare de origine animal sau vegetal sunt necesare examene microbiologice de laborator, care urmresc evidenierea anumitor indicatori.

n continuare prezentm modul de evideniere al indicatorilor microbiologici specifici ai aerului din spaiile de producie i depozitare i al unor verigi a fluxului tehnologic.Controlul aeromicroflorei din spaiile de lucru i depozitare

Pentru a avea o imagine general a ncrcturii microbiene a aerului din spaiile de producie i depozitare se determin numrul total de germeni mezofili aerobi (NTGMA)/mm3 de aer i numrul total de drojdii i mucegaiuri/m3 de aer.

Pentru determinare se folosesc cutii Petri cu diametrul de 10cm, iar ca medii de cultur agar nutritiv sau agar Frazier pentru NTGMA i agar cu cartof sau agar cu mal pentru drojdii i mucegaiuri. Cte 2 cutii cu medii, att pentru bacterii ct i pentru drojdii i mucegaiuri, se expun, timp de 10 minute, n spaiile de lucru la nivelul suprafeelor, iar n depozitele cu alimente pe planeu i la nlimea de 0,8-1,0 m. Cutiile Petri nsmnate, dup trecerea pe capac a datelor de identificare, se incubeaz la 371C, timp de 48 de ore pentru NTGMA i la temperatura camerei (18-25C), 4-5 zile, n locuri ferite de lumin, pentru drojdii i mucegaiuri.

Numrul de microorganisme se calculeaz, fcnd media numrului de colonii de pe cele 2 cutii.

Controlul bacteriologic al suprafeelor de lucru, instrumentelor, utilajelor i echipamentului de protecie

Controlul bacteriologic al acestora se execut nainte de nceperea lucrului sau dup splare i dezinfecie. n mod obinuit se determin NTGMA/cm2 i prezena bacteriilor coliforme/10 cm2, n cazuri speciale se determin prezena salmonelelor i a stafilococilor coagulaz-pozitivi.

Pentru determinare se folosesc urmtoarele materiale:

eprubete de 160/16mm cu 10ml ser fiziologic i dopuri sterilizate; tampoane de vat de form cilindric cu lungimea de 2-2,5cm i diametrul de 0,5-1cm aezate ntr-o cutie Petri i sterilizate prin autoclavare sau eprubete de 160/16mm cu tampon cu tij sterilizate prin autoclavare;

abloane metalice de form ptrat cu latura de 10cm, sterilizate;

lamp de spirt, cutii Petri sterilizate, pipete gradate de 1,2 i 5ml sterilizate, o pens chirurgical i o rigl de 30 de cm;

medii de cultur: agar Frazier sau agar nutritiv, bulion-bil-lactoz-verde briliant (BBLV) cte 8-10ml n eprubete cu tuburi de fermentaie; mediul cu selenit i/sau M(ller-Kauffmann cte 8-10ml n eprubete, cu mediu selectiv de izolare pentru salmonele (Istrati-Meitert, Leifson, Wilson-Blair etc.), bulion hipersalin cu manit i indicator; un mediu selectiv de izolare pentru stafilococi (Chapman sau Baird-Parker etc.).

Recoltarea probei de pe suprafaa de cercetat se poate face cu tamponul fr tij (luat n mod aseptic cu o pens) sau cu tij. n primul caz, tamponul cu proba se introduce imediat n eprubeta cu ser fiziologic, iar n al doilea caz, n eprubeta din care a fost scos i care nu conine ser fiziologic. Dup delimitarea cu ablonul a suprafeei de 100cm2, cu tamponul (puin umectat n ser fiziologic, cnd proba se ia de pe suprafee uscate) trecnd de 3 ori pe acelai loc n direcii diferite (a doua trecere perpendicular pe prima, iar a treia oblic pe primele dou) se face recoltarea. Tamponul se introduce imediat n eprubeta cu ser fiziologic sau, n cazul controlului pentru salmonele sau stafilococi, n eprubete cu mediul de mbogire (selenit, M(ller-Kauffmann, respectiv bulion hipersalin). n cazul examenelor pentru salmonele i stafilococi, unde se urmrete prezena i numrul acestor germeni, recoltarea cu acelai tampon se poate face de mai multe ori pe obiectivul controlat, fr a lua n considerare suprafaa.

De pe instrumente (cuite, fierstraie), de pe prile din utilaje cu suprafee neplane (melc), la care suprafaa nu se poate delimita cu ablonul, proba se recolteaz de pe ntreaga lor suprafa (ex. cuite, ambele fee ale lamei) sau de pe o parte din acesta (ex. fierstrul, melcul) astfel nct s se poat calcula suprafaa de pe care s-a fcut recoltarea.

Ajunse la laborator, probele se introduc imediat n lucru.

Pentru stabilirea NTGMA i a bacteriilor coliforme, eprubetele cu ser fiziologic i cu tampoane (cele cu tij se desprind aseptic eliminndu-se tija) se agit bine, dup care, cte 1ml din lichidul din eprubet, se nsmneaz n 2 cutii Petri i ntr-o eprubet cu mediul BBLV i tub de fermentaie. Cnd se suspicioneaz prezena unei ncrcturi bacteriene foarte mari se fac diluii zecimale din care se nsmneaz n acelai mod cutiile i eprubetele cu BBLV.

n fiecare cutie nsmnat se toarn 14-16 ml agar Frazier sau agar nutritiv, se omogenizeaz i se las s se solidifice. Att cutiile ct i eprubetele se incubeaz la 371C, timp de 48 de ore. Se citesc cutiile Petri i se calculeaz numrul de germeni. Dezvoltarea bacteriilor Gram negative cu producere de gaze n eprubeta cu BBLV indic prezena bacteriilor coliforme/10 cm2.

Pentru decelarea salmonelelor i a stafilococilor, eprubetele cu probe recoltate n medii de mbogire se incubeaz la 371C, timp de 24 de ore. n eprubetele cu tampoane uscate (fr medii) se introduc cte 8-10ml din mediile de mbogire i se incubeaz ca mai sus.

Dup incubare, din fiecare eprubet se striaz cte o ans pe suprafaa mediilor selective de izolare corespunztoare, turnate n cutii.

Cutiile Petri se incubeaz la 37lC, timp de 24 de ore, dup care se controleaz, izolndu-se coloniile cu aspect caracteristic pentru Salmonella, respectiv Stafilococcus. n continuare se execut testele specifice pentru identificare.

Controlul bacteriologic al minilor persoanelor care lucreaz i manipuleaz produse alimentare

Acest control se execut nainte de nceperea lucrului i const n determinarea bacteriilor coliforme/ml lichid de splare, a salmonelelor /5ml lichid de splare i a stafilococilor coagulazo-pozitivi/4 ml lichid de splare.

Pentru determinare se folosesc urmtoarele materiale:

tampoane de vat, cu sau fr tij;

eprubete cu cte 10ml ser fiziologic i pipete gradate de 5ml;

medii de cultur: BBLV n eprubete cu tub de fermentaie; mediu cu selenit, M(ller-Kauffmann, cte 20ml n eprubete, medii selective de izolare pentru salmonele (Istrati-Meitert, Leifson etc.) i pentru stafilococi (agar Chapmann, Baird-Parker etc.).

Recoltarea probelor se face, cu tamponul uor umectat n ser fiziologic, prin tergerea feei palmare i a spaiilor interdigitale de la o mn, frecndu-se cu tamponul de 3 ori pe acelai loc. Se spal apoi bine tamponul n serul fiziologic din eprubet i se stoarce prin presarea lui pe pereii acesteia. Cu acelai tampon se execut n acelai mod tergerea celeilalte mini. Tamponul se introduce n eprubeta cu ser fiziologic i se prelucreaz n laborator.

Dup destrmarea tamponului de vat, prin agitarea eprubetei, se nsmneaz cte 1ml ntr-o eprubet cu BBLV, 4ml ntr-o eprubet cu bulion hipersalin i 5ml (restul lichidului plus tamponul) ntr-un recipient cu 20ml selenit sau M(ller-Kauffmann. Incubarea eprubetei cu BBLV se face la 371C, timp de 48 de ore, iar a celorlalte dou eprubete la aceeai temperatur ns timp de 24 de ore. Dup aceasta, se deruleaz tehnica de izolare i identificare, stabilindu-se prezena sau absena bacteriilor coliforme/ml, a salmonelelor/5ml i a stafilococilor/4ml lichid de splare.