1

III. METODE DE ANALIZĂ BAZATE PE INTERACŢIUNEA RADIAŢIILOR

ELECTROMAGNETICE CU MATERIA

Aprofundarea unor noţiuni predate la curs

III.4. SPECTROMETRIA DE ABSORBŢIE ÎN ULTRAVIOLET ŞI VIZIBIL (UV/VIS)

A. ABSORBŢIA RADIAŢIILOR DIN DOMENIUL UV-VIS ŞI FACTORII DE CARE DEPINDE ACEASTA

Energia necesară schimbării distribuţiei electronilor implicaţi în legături chimice (efecte electronice) este de ordinul a câţiva electronvolţi şi, în consecinţă, fotonii absorbiţi sau emişi în timpul unui astfel de fenomen sunt din regiunea ultraviolet şi vizibil situată între 190 şi 700 nm (~1-7 eV). Culoarea percepută de ochiul uman este rezultatul unor tranziţii electronice produse în urma absorbţiei radiaţiei din domeniul VIS.

Grupele de atomi la nivelul cărora are loc absorbţia radiaţiilor UV-VIS poartă numele de cromofori. Termenul „cromofor” a fost utilizat prima dată pentru legăturile nesaturate între grupe de atomi, esenţiale pentru producerea culorii, dar în timp, studiile de absorbţie a radiaţiilor s-au extins în regiunea ultraviolet, iar termenul s-a generalizat, incluzând toate grupările care absorb în UV-VIS. Există însă cromofori care absorb în regiuni inaccesibile spectrofotometrelor uzuale (sub 190 nm) şi de aceea analiza acestora este deseori imposibilă.

Tabelul 1. Cromofori conjugaţi şi auxocromi

Compus Cromofor λλλλmax [nm] εεεεmax

[M-1cm-1] Etenă C=C 185 8000 Butadienă C=C-C=C 217 21000 Crotonaldehida C=C-C=O 217 16000 Sulfanilamida în soluţie alcalină HN-O2S-C6H4-NH2 251 16300

Sulfanilamida în soluţie de HCl H2NO2S-C6H4-N+H3

218 265

12700 1080

Deplasarea lungimii de undă a maximului de absorbţie, λmax, şi modificarea

intensităţii benzii de absorbţie a unui cromofor, exprimată prin coeficientul molar de absorbţie εmax (termen care va fi definit ulterior), sunt determinate de ambianţele atomice din molecula din care face parte (tabelul 1), interacţiunea cu solventul, deplasarea echilibrelor de ionizare în soluţie etc. (figura 1). Variaţiile mici de temperatură nu modifică spectrele electronice în soluţie. Pentru a descrie aceste influenţe şi modificări spectrale se lucrează cu câteva noţiuni specifice: • grupare auxocromă – grupare saturată de atomi, -OH, -NH2, -S-, -Cl, -N+H3, care

ataşată unui cromofor modifică lungimea de undă λmax la care are loc absorbţia şi intensitatea maximului de absorbţie

• deplasare batocromă „spre roşu” – deplasarea maximului de absorbţie la lungimi de undă mai mari (energii de excitaţie mai mici)

• deplasare hipsocromă „spre albastru” - deplasarea maximului de absorbţie la lungimi de undă mai mici (energii de excitaţie mai mari)

• efect hipocrom – scăderea intensităţii absorbţiei

2

• efect hipercrom – creşterea intensităţii absorbţiei

Figura 1. Influenţa unor factor asupra benzii de absorbţie a unui cromofor În figura 2 sunt prezentate schematic deplasările unei benzi electronice de

absorbţie.

Figura 2. Tipuri de deplasări ale unei benzi de absorbţie (⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ iniţial, final)

Corelarea absorbţiei în UV-VIS cu structura este mai mult empirică, foarte mulţi compuşi având spectre electronice asemănătoare, de aceea, pentru identificarea completă a structurii unui compus, măsurătorile spectrofotometrice în UV-VIS trebuie să fie corelate cu alte tipuri de date spectrale şi/sau teste chimice. Totuşi spectrometria UV-VIS reprezintă o tehnică accesibilă şi relativ ieftină care permite obţinerea unor informaţii legate de detalii structurale (configuraţie, formarea complecşilor şi determinarea raportului lor de combinare etc.), de regulă după prelucrarea matematică a spectrelor (derivatele spectrelor), aplicarea unor metode chemometrice etc.

B. LEGEA BEER-LAMBERT

Ab

sorb

ţie

Lungime de undă

Efect batocrom

Ab

sorb

ţie

Lungime de undă

Efect hipsocrom

Ab

sorb

ţie

Lungime de undă

Efect hipercrom

Ab

sorb

ţie

Lungime de undă

Efect hipocrom

Ambianţa atomică (efecte electronice)

Interacţiunea cu solventul

Deplasarea echilibrelor de ionizare, etc.

← λmax →

↑ εmax ↓

3

Măsurarea gradului de absorbţie a unei radiaţii cu o anumită lungime de undă λ de către o substanţă în soluţie este guvernată de legea Beer-Lambert (figura 3):

Aλ = log (I0/IT)λ = aλ l c unde:

A - absorbanţă a - absorbtivitate sau coeficient de absorbţie a unei substanţe într-un solvent dat l - lungimea cuvei în care se află soluţia c - concentraţia substanţei I0 – intensitatea radiaţiei incidente, IT – intensitatea radiaţiei transmise

Indicele inferior λ se referă la faptul că mărimile depind de lungimea de undă la care se lucrează. Lungimea de undă de lucru este aleasă, de regulă, lungimea de undă corespunzătoare maximelor de absorbţie λmax (pot fi măsurate astfel cantităţi mici de substanţă, iar influenţa temperaturii asupra A la λmax este minimă). Denumirea şi valoarea lui a depind de modul de exprimare a concentraţiei. Dacă c se exprimă molar (număr de moli per litru de soluţie), a se notează ε şi se numeşte absorbtivitate molară (coeficient molar de absorbţie). Unitatea de măsură a lui ε este l mol-1 cm-1. În analiza farmaceutică, concentraţiile şi cantităţile sunt de regulă exprimate în grame sau miligrame şi mai puţin sub formă de moli şi, din această cauză, pentru determinări cantitative se lucrează cu absorbanţa specifică:

1%cm1A

care este absorbanţa unei soluţii cu concentraţia 1 g / 100 ml, măsurată în cuva de 1 cm. Unitatea de măsură a absorbanţei specifice este dl g-1 cm-1. Dacă se cunoaşte absorbanţa specifică la λmax, se măsoară absorbanţa soluţiei probă la aceeaşi lungime de undă în cuva de 1 cm, iar concentraţia, exprimată în g/100 ml, va fi:

1%1cmA

Ac =

Figura 3. Absorbţia luminii de către o soluţie Proporţionalitatea directă dintre A şi c stipulată de legea Beer – Lambert se respectă pe anumite domenii de concentraţii şi, de aceea, este important ca în determinările cantitative să se demonstreze că pe domeniul de concentraţii de lucru există liniaritatea A ∼ c (coeficientul de corelare r > 0,99 – vezi laboratorul de EAI corespunzător). În practica spectrometriei de absorbţie se mai lucrează cu noţiunea de transmitanţă, T, sau transmitanţă procentuală, T%, definite ca:

0

T

I

IT = 100

I

IT%

0

T=

relaţiile dintre absorbanţă şi transmitanţă fiind următoarele:

logTA −= logT%2A −=

Cuvă cu soluţia probă

I0 IT

l

c

4

C. APLICAŢII ALE SPECTROMETRIEI UV-VIS ÎN ANALIZA CANTITATIVĂ

DETERMINĂRI CANTITATIVE DIN PROBE CARE CONŢIN

UN SINGUR ANALIT În cel mai simplu mod, dozările spectrometrice în UV-VIS se pot realiza preparând

proba sub forma unei soluţii într-un solvent transparent (nu absoarbe în domeniul spectral în care se lucrează) şi măsurând absorbanţa acesteia la o lungime de undă adecvată. Determinarea concentraţiei se face apoi prin:

� Calcularea cu ajutorul absorbanţei specifice pornind de la legea Beer-Lambert � Compararea absorbanţei soluţiei probă cu cea a unei soluţii standard a

analitului de interes din probă; soluţia standard este obţinută în acelaşi mod ca proba, iar concentraţia acesteia este egală cu cea aşteptată în probă – metoda standardului extern

� Raportarea absorbanţei soluţiei probă la o scară de absorbanţe obţinută cu o serie de soluţii standard ale analitului de interes; soluţiile standard sunt preparate în acelaşi solvent ca soluţia probă, iar concentraţiile acestora sunt situate într-un domeniu care include concentraţia aşteptată în probă - metoda standardelor externe sau metoda curbei de calibrare

Caracteristicile acestor metode: - Lungimea de undă este, în general, selectată la un maxim de absorbţie (λmax) deoarece

astfel efectele variaţiilor de temperatură şi ale erorilor de setare ale scalei lungimilor de undă sunt minime.

- Ideal, concentraţia trebuie să fie ajustată aşa încât absorbanţa soluţiei să fie aproximativ 0,9, valoare în jurul căreia acurateţea şi precizia sunt optime. Atunci când se utilizează metoda curbei de calibrare, concentraţiile soluţiilor standard se aleg astfel încât absorbanţele să fie situate în domeniul 0,20 – 0,90 (în cazul spectrometrelor ultraperformante, domeniul A poate fi extins între 0,10 şi 1,50), dar în cazul măsurătorilor efectuate cu spectrometre de generaţie veche acestea au o precizie satisfăcătoare dacă absorbanţele sunt situate în domeniul 0,30 - 0,70.

- De obicei determinările cantitative se fac măsurând absorbanţa la o singură lungime de undă corespunzătoare unuia dintre maximele de absorbţie. Alternativ, absorbanţa poate fi citită din spectrul obţinut pe un anumit domeniu de lungimi de undă, această variantă fiind preferată în studiile calitative sau în anumite situaţii când este nevoie să se lucreze cu valori ale absorbanţei la mai multe lungimi de undă.

Determinări cantitative pe baza absorbtivităţii

Reprezintă o cale simplă pentru determinarea concentraţiei şi se bazează pe

folosirea directă a legii Beer - Lambert, cunoscând coeficientul de absorbţie. Principul este redat schematic în figura 4.

5

Figura 4. Principiul determinării cantitative pe baza absorbtivităţii specifice (factorul poate include gradul de diluţie, raportarea la o anumită cantitate de probă sau la un anumit mod de exprimare a concentraţiei, corecţia datorată lăţimii cuvei de măsură dacă aceasta nu este 1

cm etc.)

În continuare vor fi prezentate câteva aplicaţii ale acestei metode de evaluare cantitativă. Exemplul 1 O cantitate de pulbere de comprimate de furosemid echivalentă la 0,25 g furosemid este extrasă cu 300 ml NaOH 0,1 M sub agitare. Se completează la 500 ml cu acelaşi solvent, apoi o porţiune se filtrează şi 5 ml filtrat se diluează la 250 ml cu NaOH 0,1 M. Absorbanţa soluţiei finale la 271 nm este 0.596, iar absorbanţa specifică A(1%,1 cm) = 580 în soluţie bazică, la 271 nm. Să se calculeze cantitate de furosemid pe comprimat şi procentul acesteia faţă de cantitatea declarată. Se dau: cantitatea de pulbere de comprimate cântărită: 0,519 g; masa a 20 de comprimate: 1,656 g; cantitatea declarată de furosemid pe comprimat: 40 mg. Masa medie a unui comprimat va fi m = 1,656 / 20 = 0,0828 g A/A(1%, 1cm) g JJJ. 100 ml soluţie finală X JJJJJJJJJ.. 250 ml soluţie finală X = A/A(1%, 1cm) ⋅ 2,5 X JJJJJJJJJ. 5 ml soluţie iniţială Y JJJJJJJJJ. 500 ml soluţie finală totală Y = A/A(1%, 1cm) ⋅ 2,5 ⋅ 500/5 = A/A(1%, 1cm) ⋅ 250 YJJJJJJJJJ... 0,519 g pulbere de comprimate luată în lucru Z JJJJJJJJJ.. 0,0828 g masa medie a unui comprimat Z = A/A(1%, 1cm) ⋅ 250 ⋅ 0,0828 / 0,519 = A/A(1%, 1cm) ⋅ 39,88 De unde:

Z = 0,596 ⋅ 39,88 / 580 = 0,04098 g furosemid / comprimat ceea ce înseamnă în procente faţă de cantitatea declarată: Z% = 0,04098 / 0,040 = 102,4 % Exemplul 2 Calculaţi concentraţia în µg/ml a unei soluţii de triptofan (cu masa moleculară 204,2) în acid clorhidric 0,1 M, a cărei absorbanţă la λmax = 277 nm este 0,613 în cuva de 4 cm. Absorbtivitatea molară a triptofanului la 277 nm este 5432 M-1 cm-1. Din legea Beer-Lambert:

c = A/(εl) de unde:

1

11515

mlµg,765

lg0,00576lgx204,22,82x10lmol2,82x105432x4

0,613c

−

−−−−−

=

=====

Soluţia probă

Tabele specifice

Absorbanţa, A la lungimea de undă λ, cuva de 1 cm

Coeficientul de absorbţie, ε

sau A1cm1% la o

anumită λ

cx

factorA

,%(m/V)cx ⋅=ε

6

Metoda standardului extern de evaluare cantitativă

Se utilizează o soluţie standard din substanţa de referinţă a cărei concentraţie cs

trebuie să fie apropiată de valoarea concentraţiei aşteptate în probă cprobă. Determinarea cantitativă propriu-zisă se bazează pe proporţionalitatea A ∼ c, iar principiul este schematizat în figura 5.

Figura 5. Principiul determinării cantitative pe baza standardului extern (cx şi cs sunt concentraţia probei şi, respectiv, a soluţiei standard)

Metoda se aplică atunci când se verifică legea Beer – Lambert şi există substanţă

de referinţă cu puritate adecvată. Este des aplicată în monografiile din farmacopei.

Determinări cantitative pe baza curbei de calibrare

Pornind de la legea Beer - Lambert, pentru un sistem cu o singură specie absorbantă în regiunea de interes, absorbanţa este direct proporţională cu concentraţia analitului. Prin urmare, pentru o serie de soluţii standard de analit (minimum 5 soluţii) cu concentraţiile ci se măsoară absorbanţa acestora la lungimea de undă de lucru Ai şi se trasează o curbă de calibrare A = f(c). Această curbă aproximează cel mai bine variaţia A = f(c) în sensul că punctele sunt uniform repartizate de-a lungul acesteia. Concentraţiile soluţiilor standard trebuie să fie cuprinse într-un domeniu care acoperă concentraţiile aşteptate în probe. Orice altă soluţie de analit în acelaşi solvent, căreia i se măsoară absorbanţa în aceleaşi condiţii experimentale cu cele de la trasarea curbei de calibrare, poate fi estimată cantitativ din curba de calibrare prin interpolare grafică (figura 6) sau cu ajutorul ecuaţiei matematice care descrie această curbă.

Figura 6. Principiul determinării cantitative prin metoda standardelor externe (metoda curbei de

calibrare)

Cuva cu probă

Cuva cu soluţia standard

Absorbanţa Ap la lungimea de undă λ, în cuva de l cm

Absorbanţa AS la lungimea de undă λ, în cuva de l cm

s

spx A

cAc =

Probă

Serie de soluţii standard

Ai

ci J

A

c

Ax

cx

xx

x

x

x

A1

c1 A2

c2 A3

c3

Ax

cx

cx

cs

7

Curbele de calibrare sunt trasate, de regulă, ca fiind drepte, considerând directa proporţionalitate A = f(c), acestei proporţionalităţi corespunzându-i o ecuaţie de gradul unu: A = a ⋅ c + b. Dreapta este validă dacă r > 0,99 (r, coeficient de corelare– vezi laboratorul de EAI corespunzător). Cunoscând ecuaţia dreptei de calibrare, concentraţia unei probe se calculează cu relaţia c = (A-b)/a.

Atunci când absorbanţa variază neliniar pe domeniul de concentraţii considerat, se liniarizează computerizat datele sau se atribuie o funcţie neliniară care fitează cel mai bine punctele experimentale. Exemplu de calcul. Valorile absorbanţelor la 272 nm ale unor soluţii standard de substanţă medicamentoasă, unei soluţii probă cu aceeaşi substanţă şi martorului sunt date în tabelul următor. Calculaţi, folosind analiza de regresie liniară, parametrii ecuaţiei dreptei de calibrare şi concentraţia probei.

Concentraţia (µµµµg/ml) c

A272

0 10 20 30 40 50

Probă

0,000 0,125 0,243 0,364 0,478 0,598 0,128

Parametrii ecuaţiei dreptei de calibrare se calculează cu ajutorul unui program de calcul tabelar sau pe baza formulelor pantei şi intercepţiei, a şi b, date în cărţi de specialitate. Ecuaţia dreptei este:

A = 0,0118 c + 0,0073, iar r = 0,9999 Concentraţia probei va fi:

cx = (0,128 - 0,0073)/0,0118 = 10,22 µg/ml

D. APARATURĂ Spectrele de absorbţie se obţin cu ajutorul spectrofotometrelor. În figura 7 este

prezentat schematic un spectrofotometru de absorbţie cu monofascicul, format din patru componente principale:

Figura 7. Schema unui spectrofotometru de absorbţie a. Sursa de radiaţie O sursă ideală ar trebui să emită o radiaţie continuă, cu intensitate uniformă pe un domeniu larg de lungimi de undă. Pentru domeniile UV apropiat şi VIS (350 - 900 nm) sursele sunt lampa cu filament de tungsten sau cu halogen, iar pentru ultraviolet (190-350 nm) lampa cu descărcare în deuteriu, cu înveliş de cuarţ. O sursă foarte intensă pentru ambele regiuni este lampa cu arc în xenon la înaltă presiune. Lampa produce radiaţii până la valori mai mici de 200 nm. b. Monocromatorul Monocromatorul are rolul de a descompune radiaţia în componentele sale şi poate fi prismă, reţea de difracţie sau interferometru. c. Celula (cuva) de absorbţie Are formă paralelipipedică, ferestrele cuvelor fiind confecţionate din materiale care permit transmiterea radiaţiilor fără să absoarbă semnificativ: sticlă Pyrex, cuarţ, materiale plastice transparente pentru vizibil şi cuarţ topit pentru ultraviolet.

8

Figura 8. Cuve de diferite tipuri folosite în spectrometria UV-VIS

d. Detectorul Detectorul este sensibil la radiaţia care cade pe el, transformând-o într-un semnal electric. Acest semnal este redat apoi sub forma unui spectru trasat electronic pe un ecran sau pe hârtie cu ajutorul unui înregistrator. Spectrul poate fi înregistrat ca absorbanţă A sau transmitanţă procentuală T% în funcţie de frecvenţă ν, numere de undăν sau lungime de undă λ. Detectorii pot fi fotomultiplicatori în care fotonii care cad pe suprafaţa unui metal, cum este cesiu, duc la emisia de electroni (fotoelectroni). Aceşti electroni sunt acceleraţi sub tensiune şi cad pe suprafaţa unui alt electrod de unde, în urma ciocnirilor, prin schimb de energie se emit un număr mai mare de electroni secundari, procesul repetându-se astfel încât se obţine pe anod (ultimul electrod) un curent mare. Se mai pot folosi plăci fotografice sau detectori formaţi din şiruri (barete) de fotodiode (figura 9), care prezintă avantajul de a putea detecta un domeniu larg de lungimi de undă în acelaşi timp.

Figura 9. Schema unui spectrofotometru UV-VIS

cu detector cu şir de diode

Figura 10. Schema unui spectrofotometru UV-VIS cu fascicul dublu

În cazul spectrofotometrelor cu dublu fascicul (figura 10), radiaţia incidentă este împărţită în două, astfel încât aceasta trece simultan atât prin cuva cu probă, cât şi prin cuva cu soluţia martor (conţine toate componentele soluţiei probă, cu excepţia analitului de determinat). Prin această construcţie, scăderea absorbanţei martorului se face automat în timpul măsurătorii.