GENETICA

UMAN

CURS 2

B. STRUCTURA GENOMULUI UMANGenomul uman (GU) = coninutul ADN celular sau ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 n nucleu: 22 autosomi+X+Y i 1 n mitocondrii), = 3,2 miliarde de pb GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un genom mitocondrial (simplu i mic, 0,5%). U.M.F IAI

2. STRUCTURA GENOMULUI UMANGU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un genom mitocondrial (simplu i mic, 0,5%).U.M.F IAI25.000 gene

2.1. GENOMUL NUCLEAREnorm (3,2 miliarde pb),Fragmentat: (22A+X+Y) molecule de ADN + proteine cromozomiComplex, heterogen:ADN nerepetitivADN moderat repetitivADN nalt repetitivADN genic (25%) + ADN extragenic (75%)U.M.F IAI

2.1. Genomul nuclear a) ADN GENIC (25%)Gena = unitatea de informaie genetic codific un produs primar specific (proteine sau ARN)

Structura genelor este foarte complex - ADN genic:ADN codant = exoni (10%) ADN necodant (90%) = introni, secvene reglare, gene nefuncionale (pseudogene) sau fragmente de geneU.M.F IAI

b) ADN EXTRAGENIC (75%)Secvene netrasncrise (necodante);

Funcii puin cunoscute:- rol tampon a mutaiilor;- mperecherea corect a cromozomilor omologi n meioz i schimbul egal (CO) de segmente cromozomiale recombinare genic surs de variabilitate !!!.Alctuit din:ADN nerepetitiv = secvene unice sau un nr mic de copii (60%) ADN repetitiv (40%).U.M.F IAI

(1) ADN EXTRAGENIC NEREPETITIV (60%)

SECVENELE UNICE sauSECVENE NTR-UN NR MIC DE COPII

DUPLICAII SEGMENTALE (5% GU) blocuri (~10Kb) ce flancheaz genele (pe acelai cromozom) ; rol n sinapsa corect a omologilor in meioz * .Importan:fiind identice - pot genera erori de mperechere a cromozomilor omologi CO inegal mutaii: duplicaii /deleii genice BOLI GENOMICEU.M.F IAI

(2) ADN EXTRAGENIC REPETITIV (40%)ADN moderat repetitiv (~30%): secvene scurte repetate de sute de mii de ori, dispersate n genom(ex SINEs i LINEs)

ADN nalt repetitiv (~10%): secvene foarte scurte, repetate n tandem , de milioane de ori; 3 tipuri:ADN satelit (blocuri HCRT la centromer, telomere, CS) = rol structural;ADN minisatelit (minisatelii hipervariabili), dispersat n toi cromozomii = markeri genetici individuali = folosii n amprenta geneticADN microsatelitU.M.F IAI

3. GENOMUL MITOCONDRIALADNmt cteva mii de copii per celul = 0,5%Genomul mitocondrial difer de genomul nuclear: mic (16.569 pb);circular;neasociat cu proteine;fr ADN repetitiv;compact: 97%=secvene codante37 de gene:contigue, fr introni. Codul genetic mitocondrial difer puin de cel nuclearU.M.F IAI

GENOMUL MITOCONDRIALGenomul mitocondrial al zigotului provine, prin ovul, exclusiv de la mam.ADNmt poate suferi mutaii germinale sau somaticeMutaiile germinale produc o serie de boli degenerative n SNC, SNP, muchi, etc, care se transmit maternal:de la mam la toi descendenii; brbaii bolnavi nu transmit boala

U.M.F IAI

ADNmt poate suferi mutaii somatice, dup natere:produse de radicalii liberi de O2 (generai n mitocondrii);favorizate de structura ADNmit (absena histonelor; densitate mare de gene; etc) Mutaiile se acumuleaz rapid datorit absenei mecanismelor de reparareDetermin scderea produciei de energie boli degenerative, cancer i senescen U.M.F IAI

1. APARATUL GENETIC AL CELULEI(v. LP 1)APARATUL GENETIC: structurile celulare care conin ADN: nucleul + mitocondriile

(1). NUCLEUL 99,5% ADN

ADN + proteine (fibre) CROMATIN CROMOZOMI.

Cromatina i cromozomii = dou modaliti diferite de organizare morfo - funcionl a materialului genetic n inetrfaz i diviziune.

(2). MITOCONDRIILE 0.5% ADN, origine exclusiv matern.U.M.F IAI

2. CROMATINA (v. LP )2.1. EUCROMATINA I HETEROCROMATINAU.M.F IAI CROMATINA = ADN + proteineExclusiv n nucleu! Dou tipuri morfo-funcionale distincte: - EUCROMATINAactiv geneticdispersat - HETEROCROMATINAinactiv geneticcondensat (cromocentri)

CaracteristiciEUCROMATINAHETEROCROMATINACondensareFin dispersatPuternic condensat (cromocentri)ColorareSlabIntensReplicare n faza SPrecoceTardivActivitate geneticActivInactiv Compoziie chimicPredomin p.b. C - G; ADN nerepetitiv; proteine nehistonicePredomin p.b. A - T; ADN repetitiv; proteine histoniceRol morfologicAlctuiete benzile R pozitive (sau G negative)Alctuiete benzile R negative (sau G pozitive)

EUCROMATINA I HETEROCROMATINA (v. LP )HETEROCROMATINA:

constitutiv constant n structura cromozomilor: benzi G, benzi C (cen, Yq, p A, CS)

facultativ diferit n celule / organisme diferite (hetrocromatinizarea o form de reglaj genic)ex., cromatina sexualU.M.F IAI

2.2. CROMATINA SEXUAL (v. LP )CROMATINA SEXUAL - definiie:un corpuscul de HCRT, cu particulariti morfologice bine definite,care permite identificare NR cromozomilor sexuali- determinarea sexului genetic (XX sau XY);- anomaliile cromozomilor sexuali (XO, XXX, XXY).La femeie: cromatina X (corpusculul Barr)La brbat: cromatina Y (corpusculul F)U.M.F IAIpoziie, mrime, form ali cromocentriMorfologie v.LP= cromocentru

ORIGINEA CROMATINEI SEXUALE CROMATINA X:rezult prin inactivarea unui cromozom X (la femeile XX) va forma (prin heterocromatinizare) corpusculul Barr

Ipoteza Lyon (1961):(1) inactivarea cromozomului X este total; ambele sexe un singur X activ.(corect = parial* regiuni/gene active n ambii cromozomi X)(2) se produce precoce (i.u) i este definitiv; (posibil = uneori reversibil)(3) are loc la ntmplare (XM sau XP) i independent n fiecare celul (posibil = uneori ne ntmpltoare)U.M.F IAI

Numrul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi (numrul cromozomilor X = nr. c. Barr + 1)U.M.F IAI

DIAGNOSTICFemeieBrbatNr. C. Barr012012Sex genetic(n stri intersex)XXXYAnomalii de numrcromozomi sexuali n obs. clinice dedisgenezii gonadiceXOXXXXXYXXYYXXXY

CROMATINA SEXUAL CROMATINA Y:reprezint heterocromatina de pe 2/3 distale bra lung cromozom Y(colorat cu flurocromi ex., quinacrin i vizibilla microscop UV ca un corpuscul fluorescent )corpuscul F)exclusiv la barbatiNr. corpusculi F = nr. cromozomi Y ex., brbaii XYY au 2 corpusculi FU.M.F IAI

2.3. STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI Analiza cromatinei la microscopul electronic evideniaz un sistem ierarhizat de compactare a moleculei de ADN fibre de cromatin, de dimensiuni diferite, alctuite din ADN, histone i proteine nehistonice.U.M.F IAI

1) Filamentul cu nucleozomi (10nm) Un segment de ADN (146 pb) - se nfoar (1 tur i 3/4) - n jurul unui "miez" histonic, cilindric (8 mol.) un NUCLEOZOM. Nucleosomii legai printr-un segment de ADN liniar (60 p.b.) FILAMENTUL CU NUCLEOZOMI (~ "irag de mrgele"). FN - meninut mpachetat de ctre histona H1, ce leag doi nucleozomi vecini. Rat de "compactare" a ADN nativ este de circa 10:1 U.M.F IAI

2) Fibra de cromatin (30nm) Filamentul cu nucleozomi se spiralizeaz n solenoid fibra de cromatin (FC) (30 nm)Rat de "compactare" a filamentului cu nucleozomi este de circa 5:1 U.M.F IAI

3) Fibra pliat n bucle laterale (300 nm) FC (30 nm) se pliaz n bucle laterale ataate la un schelet de proteine nonhistoince FPBL = 300nmO bucl (domeniu crs) de ~75Kb cteva gene = unitate funcional (de transcripie i replicare).Rat de "compactare" este de circa 10:1U.M.F IAI

4) Cromozomul metafazic (300 nm)

n profaz fibra de cromatin se condenseaz (20:1) cromatida (700 nm) unui cromozom Cromozomii grad maxim de condensare n metafaza diviziuniiU.M.F IAI

STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEIsintez

ADN FILAMENT F I B R A F I B R A CROMATIDA CU DE PLIAT UNUI NUCLEOSOMI CROMATIN N BUCLE CROMOZOM

INTERFAZA DIVIZIUNE

Fiecare cromatid are o singur molecul de ADNorganizat n mai multe structuri succesive i ierarhizate,compactat de ~ 10.000 ori, pentru a face posibil:localizarea n nucleudistribuia corect a materialului genetic n diviziuneU.M.F IAI

STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEISintez Buclele fibrei de 300 nm se fixeaz neregulat de scheletul proteic: zone cu mici aglomerri = cromomerezone mai laxe

Prin condensarea cromatidei n profaz, cromomerele se unesc i formeaz benzi intens condensate i colorate (benzi G + = heterocromatin) care alterneaz cu benzi mai puin condensate i mai clare (benzi R + = eucromatin).U.M.F IAI

STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI

Sintez

Fiecare cromozom are o structur intern eterogen caracteristic (permite identificarea lui precis)U.M.F IAI

3. CROMOZOMII UMANICROMOZOMI = organite nucleare care fixeaz intens colorani bazici (chroma + soma)

Funcii:Transport + distribuie materialul genetic n cursul diviziunii stabilitatea proceselor ereditare.Asigur recombinarea genetic n meiozU.M.F IAI

3.1. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR UMANIa). Elemente comune tuturor cromozomilor:(1) COMATIDELE - Crz = bicromatidian dup replicare;- Cromatidele surori 1 molecul de ADN + PrU.M.F IAICromatideleCentromerulTelomerele

a). Elemente comune tuturor cromozomilor(2) CENTROMERUL

locul de ataare a cromatidele surori (prin proteina ISS)unic constricie primarmparte cromatidele n braele p i qpoziie fix determinat de o secven ADN repetitiv (ADN satelit) identic la toi cromozomii) + ADN specific fiecrui cromozom;cromozomi M, SM, AU.M.F IAI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor(2) CENTROMERUL

Rol esenial pentru SEGREGAREA cromozomilor din cursul diviziunii celulare:

La ADN cen se fixeaz proteine CENP = kinetocorii locul de fixare a filamentelor fus de diviziune ce vor tracta cromatidele la poli (n anafaz)U.M.F IAI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor(3) TELOMERELE = structuri specializate, formate din ADN repetitiv + proteine asociate, care acoper i protejeaz capetele cromozomilor.

Funcii:meninerea integritii structurale;asigurarea replicrii complete;poziionare cromozomilor omologi n nucleuU.M.F IAI

b). Elemente caracteristice unor cromozomiSATELIII = mase mici de heterocromatin ataate pe braele scurte ale cromozomilor acrocentrici (exceptnd Y) = variante normale

(2) CONSTRICIILE SECUNDARE= blocuri de heterocromatin situate pe 1q, 9q, 16q lng centromer = variante normale

(3) SITUSURILE FRAGILE = lacune necolorate pe cromatidele unor cromozomi. Majoritatea = variante normale; excepie fra Xq27 asociat cu retard mintal = Sdr. X fragil (RMLX-1:4000 nn) U.M.F IAI

c). Elemente specifice fiecrui cromozom: BENZILEPrin diferite tratament se observ pe cromozomii metafazici o serie continu de benzi longitudinale,- unele intens colorate (benzi G) - ce alterneaz cu benzi slab colorate (benzi R)U.M.F IAI

c). Elemente specifice fiecrui cromozom: BENZILEBenzile reflect structura intern, heterogen, a cromozomilor.Fiecare cromozom are un model caracteristic de benzi identificarea sa precis.U.M.F IAI

3.2. TEHNICI DE ANALIZ CROMOZOMIAL(v LP)a). Principiile metodelor (!!!)Obinerea de celule n diviziune:Culturi celulare: limfocite, fibroblaste, celule fetale ( amniocentez);- 0,5 ml snge periferic (recoltat steril, pe heparin) mediu cultur cu PHA (stimuleaz diviziunile) 72 oreesuturi care se divid activ: mduv osoas ( punvie medular), trofoblast ( placentocentez);Obinerea de celule n metafaz: blocare cu colchicinObinerea preparatelor: hipotonizare, fixare, etalare pe lame, colorare, tehici de marcaj n benzi.Analiza preparatelor* cariotipU.M.F IAI

EVOLUIA TEHNICILOR DE ANALIZ CROMOZOMIAL (v LP)(1) TEHNICI DE GENERAIA I (1956)- cromozomi uniform colorai;- identificare imprecis*

(2) TEHNICI DE GENERAIA II(1970)- marcaj n benzi G sau R cromozomi metafazici (400 benzi);- identificare precisU.M.F IAI

TEHNICI DE ANALIZ CROMOZOMIAL (v LP)(3) TEHNICI DE GENERAIA III (1977)- nalt rezoluie: cromozomi pro-matafazici (550 benzi) sau profazici (850 benzi)- o band = 3-5 MbU.M.F IAI M PM P

TEHNICI DE ANALIZ CROMOZOMIAL (v LP)(4) TEHNICI DE GENERAIA IV (1991)- citogenetic molecular- FISH metafazic- se pot identifica f. precis remanierile cromozomiale i microdeleiile- FISH interfazicU.M.F IAI

Ce este FISH ?tehnic de analiz cromosomicFfluorescenceIinSsituHhybridizationHibridare fluorescent in situTehnic molecular pentru detecia anomaliilor cromosomiceTehnic molecular pentru localizarea secvenelor genice

PRINCIPIUL TEHNICII FISHHibridare (formare de legturi de hidrogen) ntre o sond specific de ADN (marcat fluorescent sau imunohistochimic) i secvena complementar prezent ntr-un anumit segment cromosomic

hibridizarea se bazeaz pe legea complementaritii bazelor azotate, conform creia n moleculele de ADN se formeaz urmtoarele perechi: A-TC-G

PRINCIPIUL TEHNICII FISHa. Proba i ADN intb. Marcarea probei indirect (stg.) i direct (dr.)c. Denaturarea probei i a ADN-ului intd. Hibridarea ntre prob i ADN-ul inte. Fixarea fluoroforului la hapten (marcaj indirect)

AVANTAJELE TEHNICII FISHSENSIBILITATE I SPECIFICITATE CRESCUTETIMPUL SCURT DE OBINERE A REZULTATELOR DEFINITIVE;POSIBILITATEA ANALIZEI DE CELULE N DIVIZIUNE SAU INTERFAZREZOLUIE MARE (sonde de pn la 40 kb)DEZAVANTAJELE TEHNICII FISHCOSTUL RIDICAT AL SONDELOR I REACTIVILOR;COSTUL RIDICAT AL APARATELOR FOLOSITEGRADUL NALT DE TEHNICITATE