UNIVERSITATEA DIN BUCURESTIUNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

CICLUL 1. LICENTA IN BIOCHIMIECICLUL 1. LICENTA IN BIOCHIMIE

BiochimieBiochimie metabolicametabolica

Prof. Dr. Dana Prof. Dr. Dana IordachescuIordachescu

CATENE TRANSPORTOARE DE ELECTRONICATENE TRANSPORTOARE DE ELECTRONI

MitocondriiMitocondrii

NucleuNucleu

CloroplasteCloroplaste

MembranaMembrana procarioteprocariote

HidroxilantaHidroxilanta

DesaturanteDesaturante

22

CitocromiiCitocromii P450 (P450, CYP)P450 (P450, CYP)

familiefamilie de de hemhem--proteineproteine

prezentaprezenta îînn aproapeaproape toatetoate tipuriletipurile de de celulecelule ale ale mamiferelormamiferelor –– excepexcepţţieie in in eritrociteleeritrocitele mature mature şşii celulelecelulele mumuşşchilorchilor scheleticischeletici-- se se găsescgăsesc, de , de asemeneaasemenea, , la la procarioteprocariote

desemnareadesemnarea uneiunei proteineproteine ca ca citocromcitocrom P450P450

ss--a a realizatrealizat iniiniţţialial pepe bazabaza proprietăproprietăţţilorilor eiei spectralespectrale, , îînaintenainte ca ca funcfuncţţiaia eiei săsă fififostfost cunoscutăcunoscută

prezintăprezintă un un spectruspectru unicunic, , trasattrasat după după adăugareaadăugarea unuiunui agent agent reducătorreducător de de tipultipulditionituluiditionitului de de sodiusodiu la o la o suspensiesuspensie de de microzomimicrozomi, , urmatăurmată de de barbotareabarbotarea de de C0C0gazgaz îînn solusoluţţieie

complexulcomplexul format format îîntrentre C0 C0 şşi i proteinaproteina cucu hemulhemul redus are un redus are un spectruspectru de de absorbabsorbţţieie cucu un un maximmaxim la 450 nm la 450 nm

denumireadenumirea provineprovine de la de la majusculamajuscula PP--pigmentpigment si 450 si 450 -- lungimealungimea de de undăundă a a maximuluimaximului de de absorbabsorbţţieie..

33

DiferiteleDiferitele forme forme specificespecifice de de citocromicitocromi P450 P450 prezintăprezintă un un maximmaxim de de absorbabsorbţţieie care se care se găsegăseşştete îîntrentre 446 nm 446 nm şşi 452 nmi 452 nm

ReacReacţţiaia generalăgenerală catalizatăcatalizată de de citocromulcitocromul P450 este : P450 este :

undeunde AH AH -- substratsubstrat: un steroid, acid : un steroid, acid grasgras, medicament , medicament sausau altăaltă substantasubstantachimicachimica care are un care are un substituentsubstituent -- situssitus de de oxigenareoxigenare

ReacReacţţieie de de monooxigenaremonooxigenare, , citocromiicitocromii P450 P450 -- monooxigenazemonooxigenaze deoarecedeoarecenumainumai unulunul dindin ceicei doidoi atomiatomi de de oxigenoxigen este este incorporatincorporat îînn substrat. substrat.

In In timptimp cece la la procarioteprocariote proteineleproteinele P450 P450 suntsunt solubilesolubile, la , la omom P450 P450 suntsuntasociateasociate cu cu sistemelesistemele membranaremembranare ale REale RE sisi membranamembrana internainterna a a mitocondrieimitocondriei

NADPH + H+NADPH + H+ ++OO22 ++ AHAH NADPNADP++ ++ HH22OO ++ AAOOHH

44

SitusulSitusul activactiv al P450al P450–– Fe Fe hemichemic –– legatlegat la la proteinaproteina via via un un ligand ligand tiolattiolat –– un un rest rest CysCys din din secventasecventa inaltinalt conservataconservata la la totitoti citocromiicitocromii P450 P450 cunoscuticunoscuti: :

RXRXCCXGXG

DesiDesi citocromiicitocromii P450 P450 cunoscuticunoscuti catalizeazacatalizeaza multemulte reactiireactii extremextrem de de diferitediferiteexistaexista o o serieserie de de caracteristicicaracteristici generalegenerale ale ale mecanismuluimecanismului lorlor de de actiuneactiune::

1. 1. StareaStarea de de repausrepaus a a proteineiproteinei are Fe3+are Fe3+

2. 2. LegareaLegarea unuiunui substratsubstrat AH AH initiazainitiaza transportultransportul de de electronielectroni sisi legarealegarea O2O2

3. 3. ElectroniiElectronii care care reducreduc CYP (FeCYP (Fe3+3+--hemic) hemic) provinprovin de la de la altaalta proteinaproteina: :

citocromcitocrom P450 P450 reductazareductaza, , feredoxineferedoxine sausau citocromulcitocromul b5b5

4. 4. OxigenulOxigenul molecular molecular esteeste legatlegat la Fe la Fe hemichemic redusredus sisi suferasufera o o scindarescindare

5. Un oxidant 5. Un oxidant legatlegat la Fe induce la Fe induce oxidarea/hidroxilareaoxidarea/hidroxilarea substratuluisubstratului sisiregenerarearegenerarea stariistarii de de repausrepaus a CYPa CYP

55

2 H+

Cit P450.Cit P450.Fe2+Fe2+..AHAH..OO22¯̄

Cit P450.Cit P450.Fe2+Fe2+..AHAH..O2O2

O2O2

Cit P450.Cit P450.Fe2+Fe2+..AHAH

Cit P450.Cit P450.Fe3+Fe3+..AHAH..O2O2

EE--FADFAD

EE--FADH2FADH2NADP+NADP+

NADPHNADPH

ee¯̄

ee¯̄ Cit P450.Cit P450.

Fe3+Fe3+

AAOOHH

H2H2OO

AHAHNADPH:citNADPH:cit P450 P450 reductazareductaza (E(E--FAD)FAD)

Catena Catena transportoaretransportoare de de electronielectroni hidroxilantahidroxilanta

66

Substrate AHSubstrate AH

endogeneendogeneSteroiziSteroizi

Ac Ac grasigrasi

ProstaglandineProstaglandine

LeucotrieneLeucotriene

exogeneexogene MedicamenteMedicamente

AditiviAditivi alimentarialimentari

SubproduseSubproduse industrialeindustriale

Intra in Intra in orgaorga--nismnism prinprin hrahra--nana, , injectiiinjectii, in, in--halarehalare, absorb, absorb--tie tie pielepiele

CateneCatene TE TE hidroxilantehidroxilante

InactivareaInactivarea\\activareaactivarea unorunor agentiagenti terapeuticiterapeutici

TransformareaTransformarea unuiunui compuscompus chimicchimic intrintr--oostructurastructura reactivareactiva –– leziunileziuni celularecelulare nedoritenedorite

-- mutatiimutatii

-- moarteamoartea celularacelulara

EtapeEtape din din biosintezabiosinteza compusilorcompusilor hidroxilicihidroxilici

Metabolismul Metabolismul aciziloracizilor grasigrasi & & derivatiderivati

77

MetabolizareaMetabolizarea medicamentelormedicamentelor: 2 faze: 2 faze

P450 P450 esteeste implicatimplicat in in fazafaza II a a detoxifieriidetoxifierii care care constaconsta din din reactiireactii de de oxidareoxidare, , reducerereducere, , hidrolizahidroliza, , ciclizareciclizare, , deciclizaredeciclizare. . ReactiileReactiile de de oxidareoxidare care au loc de care au loc de regularegula in in ficatficat implicaimplica P450, NADPH P450, NADPH sisi OO22. .

DacaDaca produsiiprodusii suntsunt suficientsuficient de de polaripolari eiei suntsunt excretatiexcretati rapid. rapid. DacaDaca acestiacestiprodusiprodusi nunu pot pot fifi excretatiexcretati suferasufera fazafaza II.II.

FazaFaza IIII –– constaconsta din din reactiireactii de de conjugareconjugare (cu acid (cu acid glucuronicglucuronic, , sulfonatisulfonati, , glutationglutation sausau amino amino aciziacizi) ) –– care care cresccresc caracterulcaracterul polar al polar al produsilorprodusilor in in vedereavederea excretieiexcretiei

88

Forme multiple ale Forme multiple ale citocromuluicitocromului P 450P 450

-- au au apărutapărut acumacum 55--50 50 milioanemilioane de de aniani, , -- genegene primordiale au primordiale au codificatcodificat citocromicitocromi P450 P450 implicaimplicaţţii îînn metabolizareametabolizareasubstratelorsubstratelor endogeneendogene--ceicei mai mai vechivechi citocromicitocromi P450 au P450 au fostfost implicaimplicaţţii îînn metabolizareametabolizarea colesteroluluicolesterolului şşi i

aciziloracizilor grasigrasi -- au au jucatjucat un un rolrol primordial primordial îînn menmenţţinereainerea integrităintegrităţţiiii membranelormembranelorprimelorprimelor eucarioteeucariote--genomulgenomul umanuman codificacodifica

57 57 proteineproteine P450 (P450 (CypCyp)) implicateimplicate in in hidroxilareahidroxilarea sterolilorsterolilor, , aciziloracizilor biliaribiliari, , aciziloracizilor grasigrasi, , eicosanoideloreicosanoidelor si si vitaminelorvitaminelor liposolubileliposolubile + +

~50 ~50 proteineproteine P450P450 implicateimplicate in metabolismul in metabolismul medicamentelormedicamentelor si si altoraltormoleculemolecule xenobioticexenobiotice

GeneleGenele cece codificacodifica citocromiicitocromii P450 P450 sisi proteineleproteinele codificatecodificate suntsunt desemnatedesemnateprinprin abreviatiaabreviatia CYPCYP urmataurmata de un de un numarnumar arabarab cece indicaindica familiafamilia genicagenica, o , o literaliteramajusculamajuscula care care indicaindica subfamiliasubfamilia sisi un numeral un numeral cece indicaindica genagena individualeindividuale. .

De De exempluexemplu CYP2E1CYP2E1 esteeste genagena care care codificacodifica proteinaproteina CYP2E1CYP2E1 esteeste implicatimplicat in in metabolismul metabolismul acetaminofenuluiacetaminofenului ((paracetamolparacetamol)).

SuntSunt sisi abateriabateri: : CYP 5CYP 5 sausau TXASTXAS ((tromboxantromboxan A2 A2 sintazasintaza); ); CYP51CYP51 sausau LDMLDM((lanosterollanosterol 1414--αα--demetilazademetilaza))

99

18 18 familiifamilii sisi 43 43 subfamiliisubfamilii1010

--arboriarbori filogeneticifilogenetici, , comparareacompararea secvensecvenţţelorelor de de aminoaciziaminoacizi, , procesproces din din duplicareduplicare geneticăgenetică care care rezultatrezultat al al presiuniipresiunii selective a selective a influeninfluenţţeiei mediuluimediului

--citocromiicitocromii P450 P450 dindin acelaacelaşşii organorgan sausau dindin acelaacelaşşii organitorganit celularcelular au au masemasemolecularemoleculare şşi i altealte proprietăproprietăţţii fizicofizico--chimicechimice similaresimilare, , ceeaceea ce face ce face extremextrem de de dificilădificilă, , dacădacă nu nu imposibilăimposibilă separareasepararea şşi i purificareapurificarea lorlor

--o o posibilitateposibilitate de de caracterizarecaracterizare şşi de i de diferendiferenţţiereiere a a lorlor o o oferăoferă studiulstudiulspecificităspecificităţţiiii de substrat de substrat -- realizabilrealizabil numainumai pepe proteineproteine obobţţinuteinute prinprintehniciletehnicile biologieibiologiei molecularemoleculare ((exprimareaexprimarea cDNAcDNA))

--prinprin acestacest tiptip de de studiistudii ss--aa constatatconstatat că un că un anumitanumit citocromcitocrom P450 P450 poatepoatemetabolizametaboliza diferitediferite substratesubstrate neneîînruditenrudite structural.structural.

membriimembrii uneiunei familiifamilii CYP CYP prezintaprezinta >40% >40% aminoaciziaminoacizi identiciidentici, , membriimembrii unorunorsubfamiliisubfamilii >55% >55% aminoaciziaminoacizi identiciidentici

1111

InducInducţţiaia citocromuluicitocromului P450P450

de de cătrecătre compucompuşşii endogeniendogeni şşi i exogeniexogeni. .

diferitediferite mecanismemecanisme de de inducinducţţieie -- la la nivelnivel transcriptranscripţţionalional sausau postpost --transcriptranscripţţionalional, , nicionicio corelacorelaţţieie îîntrentre modulmodul de de inducinducţţieie şşi o i o anumităanumită clasăclasă de de agenagenţţii inductoriinductori

Ex 1Ex 1 :: etanoluletanolul şşi i acetonaacetona pot pot induceinduce membriimembrii a a două două subfamiliisubfamilii geneticegeneticediferitediferite de de citocromicitocromi P450 P450 prinprin mecanismemecanisme diferitediferite : : îînn primulprimul cazcaz inducinducţţieie la la nivelnivel transcriptranscripţţionalional, , îînn alal 22--lea lea cazcaz -- postpost--transcriptranscripţţionalional, , stabilizareastabilizarea mRNAmRNA

Ex2Ex2 :: inducereainducerea P450 IIE1P450 IIE1 la la şşobolanobolan, , prinprin tratamentultratamentul cucu etanoletanol, , acetonăacetonăsausau pirazolpirazol, , prinprin îînfometarenfometare sausau la la instalareainstalarea diabetuluidiabetului

la la majoritateamajoritatea –– productieproductie crescutacrescuta de P450 IIE1 de P450 IIE1 farafara afectareaafectarea mRNAmRNA; ; pirazolulpirazolul stabilizeazastabilizeaza P450 faP450 faţţă de ă de degradareadegradarea proteoliticăproteolitică

la la şşobolaniiobolanii diabeticidiabetici –– crecreşştete de 10 de 10 oriori nivelulnivelul mRNAmRNA -- inducinducţţieie de 6 de 6 oriori a a niveluluinivelului P450 IIE1 P450 IIE1 -- stabilizareastabilizarea mRNAmRNA

dificildificil de de prezisprezis mecanismulmecanismul de de inducinducţţieie îînn diferitediferite condicondiţţiiii, , chiarchiar îînn cazulcazulunuiunui singursingur citocromcitocrom P450P450

1212

StudiulStudiul procesuluiprocesului de de inductieinductie

Ex p450 IA1Ex p450 IA1

are o are o gengenǎǎ îînn care care secventasecventa promotorpromotor((--1642)1642)……(+57)(+57)

excizatexcizatǎǎ cu cu enzimenzim de de restricrestricţţieie HIND IIIHIND III

FragmentulFragmentul cu cu secvsecv promotorpromotor poatepoate fifiinseratinserat îînn plasmidaplasmida pSVOcatpSVOcat care arecare are: genagena catcat ((cloramfenicolcloramfenicol acetilacetil transfertransfer))

secvensecvenţţaa AmprAmpr –– care care conferconferǎǎ rezistenrezistenţţaala la ampicilinampicilinǎǎ

segmentulsegmentul OriOri

produsul rezultat este transfectat în celule hepatoma de şoarece

se adaugǎ în mediu TCDD (2,3,7,8-tetra clor dibenzo-p-dioxina) – un inductorcunoscut care interacţioneazǎ cu un receptor citosolic aril hidrocarbură (Ah)

dacǎ în acest sistem de exprimare genică se evidenţiazǎ activitatea enzimeiprocariotice CAT, înseamnǎ cǎ în secvenţa promotor existǎ elemente XRE(xenobiotic regulatory elements) implicate în reglarea acestei gene

1313

SecventializareaSecventializarea regiuniiregiunii promotorpromotor şşi i repetarearepetarea experimentuluiexperimentului permitepermitestabilireastabilirea cucu precizieprecizie a a situsuluisitusului secvensecvenţţeiei XREXRE

In In generalgeneral, , arenelearenele policiclicepoliciclice se se leagăleagă la la receptorreceptor ce ce formeazaformeaza un un complexcompleximplicatimplicat in in legarealegarea la la elementeelemente XRE XRE dindin regiunearegiunea promotorpromotor a a diferitelordiferitelor genegeneale ale citocromilorcitocromilor P450P450

1414

Inductori ai unor izoforme P4501515

Substrate Substrate exogeneexogene ale ale unorunor izoformeizoforme P450P450 1616

Substrate Substrate endogeneendogene ale cit P450ale cit P450 1717

InhibitoriiInhibitorii citocromilorcitocromilor P450P450

utilizatiutilizati pentrupentru a a demonstrademonstra rolulrolul unuiunui anumitanumit P450 P450 intrintr--oo calecale metabolicametabolica

COCO –– puternicputernic inhibitor inhibitor –– se se leagaleaga in in locullocul O2 la Fe O2 la Fe hemichemic –– inhinh nespecificanespecifica

AnticorpiiAnticorpii monoclonalimonoclonali sisi policlonalipoliclonali la un la un anumitanumit P450 P450 –– inhibitor inhibitor maimaispecific, specific, dardar aparapar reactivitatireactivitati incrucisateincrucisate datoritadatorita similitudiniisimilitudinii structuralestructuralecu cu altialti P450 P450 inhibitoriinhibitori suicidesuicide contincontin gruparigrupari functionalefunctionale care se care se leagaleaga covalent, covalent, ireversibilireversibil la un la un anumitanumit citocromcitocrom

1818

SistemeSisteme transportortransportor de de electronielectroni P450 P450 dependentedependente

SistemulSistemul din REdin RE: : NADPHNADPH doneazădonează electroniielectroniiuneiunei FADFAD--enzimeenzime de 78 de 78 kDakDa ((NADPHNADPH--citcit. . P450 P450 reductazareductaza)), ce , ce conconţţineine caca grupărigrupăriprosteticeprostetice atatîîtt FAD FAD ccîîtt şşi FMN i FMN –– inglobatainglobata in in RE RE prinprin capătulcapătul NN--terminalterminal alal enzimeienzimei

In In RE RE –– existaexista un al un al doileadoilea sistemsistemtransportortransportor care care continecontine NADHNADH, , altaaltaFADFAD--enzimaenzima NADHNADH--cit. b cit. b reductazareductaza sisiunun citocromcitocrom b5 b5 care care catalizeazacatalizeazadesaturareadesaturarea aciziloracizilor grasigrasi

RR--CH2 CH2 -- CH2 CH2 -- (CH2 )(CH2 )77 --COOH + COOH + NADH +H+NADH +H+ + + O2O2

RR--CH = CH CH = CH -- (CH2 )(CH2 )77 --COOH + NADCOOH + NAD++ + H2+ H2OO + + H2H2OO

1919

SistemeSisteme transportortransportor de de electronielectroni P450 P450 dependentedependente mitocondrialemitocondriale

In In mitocondriimitocondrii, exista o , exista o FADFAD--reductazareductaza, de 51 , de 51 kDakDa, , acceptoracceptor de de electronielectroni de la NADPH de la NADPH -- numitănumităNADPH: NADPH: adrenodoxinadrenodoxin reductazareductaza ((izolataizolata pentrupentru prima dată prima dată izolatăizolată dindin glgl suprarenalesuprarenale) ) ––asociatăasociatăslabslab la la mediulmediul membanarmembanar sprespre deosebiredeosebire de de componentulcomponentul corespunzătorcorespunzător dindin membranelemembranele RERE

O O proteinăproteină mică mică, , adrenodoxinaadrenodoxina (12,5 (12,5 kDakDa) ) slabslabasociatăasociată cucu membrmembr mitocondrialămitocondrială internă internă; contine

două două clustereclustere FeFe--SS care care servescservesc caca centre redox centre redox îîntrentre adrenodoxinadrenodoxin reductazăreductază şşi i citocromiicitocromii P450 P450 mitocondrialimitocondriali..

undeunde sideside chainchain cleavagecleavage cytochrome P 450cytochrome P 450 ((P450SCCP450SCC) )

2020

2121

2222

2323

2424

GenerareaGenerarea de de carcinogenicarcinogeni de de catrecatre izoformeleizoformele P450P450

AflatoxinaAflatoxina B1B1 -- micotoxinamicotoxina produsaprodusa de de multemulte speciispecii din din genulgenul AspergillusAspergillus ––dupadupa intrareaintrarea in organism in organism esteeste metabolizatametabolizata de de ficatficat la la epoxidepoxid -- carcinogencarcinogen

2525

cancerigencancerigen pentrupentru animale animale şşi i mutagenmutagen pentrupentru bacteriibacterii: : bezobezo [a] piren[a] piren--7,87,8--dihidrodioldihidrodiol--9,109,10--epoxidepoxid

BenzoBenzo [a] [a] pirenulpirenul este un este un carcinogencarcinogen slabslab ce ce asemeneaasemenea majoritămajorităţţiiiicarcinogenilorcarcinogenilor necesitănecesită o o activareactivare metabolicămetabolică pentrupentru a forma a forma compucompuşşiicarcinogenicarcinogeni puterniciputernici

Benzo[a]pirenulBenzo[a]pirenul –– xenobioxenobio--tic, contaminant tic, contaminant frecventfrecvent din din mediumediu, , rezultatrezultat dindin ardereaardereacărbunilorcărbunilor, a , a tutunuluitutunului sausau a a subproduselorsubproduselor industrialeindustriale

--se se leagăleagă la un la un receptorreceptor arilarilhidrocarburăhidrocarbură îîii induceinduce sintesinte--zaza de P450, de P450, activactivîîndnd propriapropriametabolizaremetabolizare

--metabolizatmetabolizat la un la un produsprodus

2626