cultura de protoplasti

CULTURA DE CULTURA DE PROTOPLAŞTIPROTOPLAŞTI

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaşti Din sistematica vegetală şi animală se cunoaşte Din sistematica vegetală şi animală se cunoaşte faptul că speciile sunt delimitate prin bariere de faptul că speciile sunt delimitate prin bariere de incompatibilitate sexuală, ceea ce reduce incompatibilitate sexuală, ceea ce reduce posibilităţile de încrucişări interspecifice.posibilităţile de încrucişări interspecifice.Creşterea variabilităţii geneticeCreşterea variabilităţii genetice, atât de necesară , atât de necesară în lucrările de ameliorare şi selecţie, implică în lucrările de ameliorare şi selecţie, implică găsirea unor metode de rupere a barierelor de găsirea unor metode de rupere a barierelor de incompatibilitate care izolează speciile între ele.incompatibilitate care izolează speciile între ele.Aceasta Aceasta a devenit realizabilă prin crearea de a devenit realizabilă prin crearea de protoplaştiprotoplaşti din celulele somatice izolate şi fuziunea din celulele somatice izolate şi fuziunea lor, ca unic mijloc de amestecare a genomurilor lor, ca unic mijloc de amestecare a genomurilor cloroplastice şi mitocondriale.cloroplastice şi mitocondriale.

La ţesuturile vegetale, membrana celulozică şi stratul La ţesuturile vegetale, membrana celulozică şi stratul pectic care asigură sudura dintre celule face imposibilă pectic care asigură sudura dintre celule face imposibilă manipularea directă a celulelor în scopul fuzionării lor. manipularea directă a celulelor în scopul fuzionării lor.

De aceea s-a urmărit găsirea unor tehnici de De aceea s-a urmărit găsirea unor tehnici de dezagregare a membranei pectocelulozice, ajungând la dezagregare a membranei pectocelulozice, ajungând la forma de forma de protoplaştiprotoplaşti..

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaşti

Definiţie.Definiţie. Protoplaştii sunt celule somatice Protoplaştii sunt celule somatice „nude” lipsite de membrane pectocelulozice „nude” lipsite de membrane pectocelulozice rigide (perete celular) care au capacitatea rigide (perete celular) care au capacitatea de a fuziona, de a se divide în continuare şi de a fuziona, de a se divide în continuare şi de a da naştere la noi plante.de a da naştere la noi plante.

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaşti Primele încercări de Primele încercări de eliberareeliberare a protoplaştilor din ţesuturile a protoplaştilor din ţesuturile

vegetale au fost făcute de vegetale au fost făcute de KlerckerKlercker (1892) care a elaborat (1892) care a elaborat metoda mecanicămetoda mecanică de separare a celulelor prin plasmolizare de separare a celulelor prin plasmolizare totală şi microdisecţia membranelor. Această metodă era însă totală şi microdisecţia membranelor. Această metodă era însă traumatizantă şi puţin eficientă.traumatizantă şi puţin eficientă.

Mai târziu, în 1960, Mai târziu, în 1960, Cocking Cocking în Anglia, Otsuki şi Takebe (1969) în în Anglia, Otsuki şi Takebe (1969) în Japonia au elaborat Japonia au elaborat metoda enzimaticămetoda enzimatică de producere a de producere a protoplaştilor, metodă în care se folosesc enzime extrase din protoplaştilor, metodă în care se folosesc enzime extrase din microorganisme ce digeră peretele rigid al celulelor vegetale.microorganisme ce digeră peretele rigid al celulelor vegetale.

Metoda elaborată de Metoda elaborată de CockingCocking, utilizată până în prezent, permite , utilizată până în prezent, permite obţinerea unei cantităţi mari de material biologic modificat, cu obţinerea unei cantităţi mari de material biologic modificat, cu menţinerea viabilităţii şi structurii nealterate a celulelor.menţinerea viabilităţii şi structurii nealterate a celulelor.

TakebeTakebe (1971) a obţinut primii protoplaşti viabili, prin digerarea (1971) a obţinut primii protoplaşti viabili, prin digerarea enzimatică a membranelor celulozice de la celulele frunzelor de enzimatică a membranelor celulozice de la celulele frunzelor de tutun. Au urmat realizări privind obţinerea de protoplaşti la tutun. Au urmat realizări privind obţinerea de protoplaşti la Daucus Daucus carotacarota (Grambow, 1972) şi la (Grambow, 1972) şi la Petunia hybridaPetunia hybrida (Hess,1973). (Hess,1973).

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaşti Protoplaştii pot fi izolaţi din toate organele şi ţesuturile plantelorProtoplaştii pot fi izolaţi din toate organele şi ţesuturile plantelor::• mezofilul frunzelormezofilul frunzelor;;• ţesuturi epidermaleţesuturi epidermale;; • rădăcini şi nodozităţi ale rădăcinilorrădăcini şi nodozităţi ale rădăcinilor;;• muguri, petalemuguri, petale;;• grăuncioare de polen în curs de germinaregrăuncioare de polen în curs de germinare;;• fructe, seminţefructe, seminţe;;• ţesuturi cultivate „in vitro”. ţesuturi cultivate „in vitro”. Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care

se ia epidermă inferioară prin jupuire sau printr-un tratament se ia epidermă inferioară prin jupuire sau printr-un tratament enzimatic. Dintr-un gram de frunze proaspete se pot obţine circa enzimatic. Dintr-un gram de frunze proaspete se pot obţine circa un milion de protoplaşti şi câteva milioane de plante noi.un milion de protoplaşti şi câteva milioane de plante noi.

RRecent, au început să fie utilizate fragmente de calus, izolate din ecent, au început să fie utilizate fragmente de calus, izolate din culturi de ţesuturi „in vitro” (care au o creştere rapidă dacă sunt culturi de ţesuturi „in vitro” (care au o creştere rapidă dacă sunt asigurate condiţii riguros controlabile).asigurate condiţii riguros controlabile).

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaştiProtoplaştii se obţin de obicei prin Protoplaştii se obţin de obicei prin tratarea ţesuturilor vegetale tratarea ţesuturilor vegetale genitoare, secţionate în fragmente genitoare, secţionate în fragmente înguste, în condiţii aseptice, cu un înguste, în condiţii aseptice, cu un amestec de enzime, capabile să amestec de enzime, capabile să degradeze peretele celular, în soluţii degradeze peretele celular, în soluţii care conţin stabilizatori osmotici care conţin stabilizatori osmotici (protectori) necesari pentru a păstra (protectori) necesari pentru a păstra structura celulară şi a menţine structura celulară şi a menţine viabilitatea acestora. viabilitatea acestora. Principalii stabilizatori osmotici folosiţi Principalii stabilizatori osmotici folosiţi în doze reduse sunt: manitol, sorbitol, în doze reduse sunt: manitol, sorbitol, amestec de polivinilpirolidină (2%) cu amestec de polivinilpirolidină (2%) cu zaharoză.zaharoză.

Tehnologia culturilor deTehnologia culturilor de protoplaştiprotoplaşti

Tehnologia culturilor de Tehnologia culturilor de protoplaşti necesită cunoaştera protoplaşti necesită cunoaştera şi stăpânirea completă a şi stăpânirea completă a diferitelor diferitelor etapeetape care pornesc care pornesc de la explantul donor până la de la explantul donor până la planta regenerată: planta regenerată:

obţinerea de protoplaşti viabiliobţinerea de protoplaşti viabili;; regenerarea pereţilor celulariregenerarea pereţilor celulari;; inţierea diviziunilor celulareinţierea diviziunilor celulare;; menţinerea diviziunilor până la menţinerea diviziunilor până la

obţinerea microcalusurilorobţinerea microcalusurilor;; regenerarea plantelor din regenerarea plantelor din

aceste calusuri.aceste calusuri.

SurfaceSterilisation

Soak in water Preplasmolysis

Remove lower epidermis

Enzymes Cell wall

Protoplast

Enzyme treatment Isolated protoplasts

Washing process to remove debris

Cultureon agar


1. Izolarea protoplaştilor se realizează prin 2 1. Izolarea protoplaştilor se realizează prin 2 metode: metode:

- - metoda mecanicămetoda mecanică (presupune tăierea (presupune tăierea ţesutului vegetal plasmolizat în prealabil, în ţesutului vegetal plasmolizat în prealabil, în fâşii subţiri şi fâşii subţiri şi microdisecţia membranelor)microdisecţia membranelor)

- - metoda enzimaticămetoda enzimatică

2. Purificarea

3. Incubarea

Etape ale izolării şi cultivării protoplaştilorEtape ale izolării şi cultivării protoplaştilor


Izolarea protoplaştilor prin metoda enzimaticăIzolarea protoplaştilor prin metoda enzimatică În compoziţia peretelui celular au fost identificate 3 componente În compoziţia peretelui celular au fost identificate 3 componente

de bază: celuloză, hemiceluloză şi substanţe pectice. de bază: celuloză, hemiceluloză şi substanţe pectice. De aceea, după o plasmolizare uşoară, pentru izolarea De aceea, după o plasmolizare uşoară, pentru izolarea

protoplaştilor se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze, protoplaştilor se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze, celuloze şi hemiceluloze care sunt introduse în ţesuturi prin celuloze şi hemiceluloze care sunt introduse în ţesuturi prin metoda infiltraţiei „in vacuum”.metoda infiltraţiei „in vacuum”.

Aceste Aceste enzimeenzime cu activitate hidrolizantă sunt extrase din cu activitate hidrolizantă sunt extrase din microorganisme (microorganisme (Aspergilus niger, Trichoderma virideAspergilus niger, Trichoderma viride) şi ) şi dispersate în soluţii apoase cu concentraţii cunoscute.dispersate în soluţii apoase cu concentraţii cunoscute.

În prezent produsul comercial cel mai utilizat în tehnologia În prezent produsul comercial cel mai utilizat în tehnologia protoplaştilor este protoplaştilor este celuloza celuloza Onazuka R-10, iar dintre Onazuka R-10, iar dintre pectinazepectinaze o o largă utilizare o au preparatul Macerozyme R-10).largă utilizare o au preparatul Macerozyme R-10).

Tratamentul cu enzime se realizează timp de 4-18 ore, la Tratamentul cu enzime se realizează timp de 4-18 ore, la temperatura de 25-27 0C, pentru a asigura hidrolizarea temperatura de 25-27 0C, pentru a asigura hidrolizarea pectinelor şi a moleculelor de celuloză din membrane.pectinelor şi a moleculelor de celuloză din membrane.


1.1. Izolarea protoplaştilor prin metoda Izolarea protoplaştilor prin metoda

enzimaticăenzimatică Factorii implicaţi în izolarea cu succes a protoplaştilor vegetali:

tipul şi concentraţia enzimelor hidrolitice specia tipul şi concentraţia enzimelor hidrolitice specia vegetalăvegetală

explantul utilizat (frunze, cotiledoane, rădăcini, calus)explantul utilizat (frunze, cotiledoane, rădăcini, calus) alegerea agentului plasmolizant corespunzător, alegerea agentului plasmolizant corespunzător, mmetodeleetodele, , condiţiile de incubare (durată, tempcondiţiile de incubare (durată, temp.., ,

lumină)lumină) metodele de purificare.metodele de purificare.

Izolarea protoplaştilorIzolarea protoplaştilor din mediul de incubaţie se din mediul de incubaţie se face prin face prin 2-3 centrifugări2-3 centrifugări la viteze reduse, timp de la viteze reduse, timp de 7-10 minute (asigurând sedimentarea lor), după care 7-10 minute (asigurând sedimentarea lor), după care urmează urmează spălarea restului de enzimespălarea restului de enzime cu soluţie de cu soluţie de zaharoză (15-20 %) şi NaCl.zaharoză (15-20 %) şi NaCl.


1. Izolarea protoplaştilor 1. Izolarea protoplaştilor prin:prin:

- - metoda mecanicămetoda mecanică - - metoda enzimaticămetoda enzimatică

2. Purificarea2. Purificarea

3. Incubarea3. Incubarea



2.2. EEtapatapa de purificare de purificare

Procesul de izolare a protoplaştilor este Procesul de izolare a protoplaştilor este urmat de urmat de etapa de purificareetapa de purificare, , necesară pentru obţinerea unor suspensii necesară pentru obţinerea unor suspensii celulare pure, necontaminate cu resturi celulare pure, necontaminate cu resturi de celule distruse sau pereţi celulari de celule distruse sau pereţi celulari nedigeraţi. Purificarea se realizează prin nedigeraţi. Purificarea se realizează prin centrifugări şi resuspendări succesive în centrifugări şi resuspendări succesive în soluţia cu stabilizator osmotic.soluţia cu stabilizator osmotic.După centrifugare, la interfaţa dintre cele După centrifugare, la interfaţa dintre cele două soluţii se formează un inel de două soluţii se formează un inel de culoare verde în care sunt concentraţi culoare verde în care sunt concentraţi protoplaşti viabili, iar resturile nedigerate protoplaşti viabili, iar resturile nedigerate şi celulele moarte se depun la fundul şi celulele moarte se depun la fundul eprubetei.eprubetei.


1. Izolarea protoplaştilor se realizează prin 2 1. Izolarea protoplaştilor se realizează prin 2 metode: metode:

- - metoda mecanicămetoda mecanică - - metoda enzimaticămetoda enzimatică

2. Purificarea2. Purificarea

3. Incubarea3. Incubarea



3. 3. IncubareaIncubareaTimpul de incubare variază în funcţie de Timpul de incubare variază în funcţie de

natura şi vârsta materialului biologic iniţial utilizat natura şi vârsta materialului biologic iniţial utilizat pentru izolare.pentru izolare.

Cultura protoplaştilor poate fi făcută atât pe Cultura protoplaştilor poate fi făcută atât pe mediu lichid, medii semisolide sau pe medii mediu lichid, medii semisolide sau pe medii combinate lichide şi solide.combinate lichide şi solide.

Protoplaştii în stare purificată sunt Protoplaştii în stare purificată sunt trecuţi trecuţi în alte medii lichideîn alte medii lichide.. Mediul de cultură este Mediul de cultură este foarte complet, bogat în săruri minerale, foarte complet, bogat în săruri minerale, vitamine, substanţe stimulatoare de creştere, vitamine, substanţe stimulatoare de creştere, asigurând regenerarea unui nou perete celular.asigurând regenerarea unui nou perete celular.

La unele specii, protoplaştii regenerează peretele celular în 2-3 zile La unele specii, protoplaştii regenerează peretele celular în 2-3 zile şi concomitent intră în diviziune. După 20-25 zile se formează o şi concomitent intră în diviziune. După 20-25 zile se formează o colonie celulară, colonie celulară, din care va apare din care va apare un calusun calus (30-45 zile). Din calus (30-45 zile). Din calus vor genera lăstari vegetativi sau rădăcini, în funcţie de vor genera lăstari vegetativi sau rădăcini, în funcţie de suplimentarea mediului nutritiv cu citochinine sau auxine.suplimentarea mediului nutritiv cu citochinine sau auxine.Plantulele înrădăcinate (mature) se formează în 4-6 luni, după care Plantulele înrădăcinate (mature) se formează în 4-6 luni, după care sunt transplantate în seră.sunt transplantate în seră.


Testarea viabilităţii Testarea viabilităţii protoplaştilorprotoplaştilor

Înainte de a se efectua o cultură de Înainte de a se efectua o cultură de protoplaşti este necesar să se determine protoplaşti este necesar să se determine viabilitatea acestora. Se realizează viabilitatea acestora. Se realizează prin prin examinarea suspensieiexaminarea suspensiei de protoplaşti la de protoplaşti la microscopul opticmicroscopul optic. .

Protoplaştii viabiliProtoplaştii viabili prezintă curenţi prezintă curenţi citoplasmatici, evidenţiaţi prin deplasări citoplasmatici, evidenţiaţi prin deplasări ordonate ale mitocondriilor, au formă ordonate ale mitocondriilor, au formă perfect sferică, iar cloroplastele sunt perfect sferică, iar cloroplastele sunt aranjate ordonat în stratul citoplasmatic aranjate ordonat în stratul citoplasmatic periferic.periferic.

Protoplaştii morţiProtoplaştii morţi (distruşi) prezintă forme (distruşi) prezintă forme neregulate, iar cloroplastele formează neregulate, iar cloroplastele formează aglomerări la unul din polii celulei.aglomerări la unul din polii celulei.

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaşti AplicaAplicaţii la plantele floricoleţii la plantele floricole

În momentul de faţă lista speciilor de plante floricole de În momentul de faţă lista speciilor de plante floricole de interes economic la care s-a realizat regenerarea de plante interes economic la care s-a realizat regenerarea de plante de la protoplaşti este destul de cuprinzătoare.de la protoplaşti este destul de cuprinzătoare.

Ex.: Ex.: Digitalis lanata, D. purpurea, Helianthus annuus, Digitalis lanata, D. purpurea, Helianthus annuus, Ipomoea batatas, Lolium multiflorum, L. corniculatus, Ipomoea batatas, Lolium multiflorum, L. corniculatus, Nicotiana sp., etc.Nicotiana sp., etc. Această tehnică permite: Această tehnică permite:

cercetări aprofundate asupra funcţionării celulei; cercetări aprofundate asupra funcţionării celulei; aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate;aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate; obţinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci şi obţinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci şi

chiar dăunători; chiar dăunători; permite manipulări genetice ca introducerea sau permite manipulări genetice ca introducerea sau

substituirea de gene.substituirea de gene.

Cultura de protoplaştiCultura de protoplaşti

Protoplaştii sunt celule vegetale “nude” Protoplaştii sunt celule vegetale “nude” folosite pentru manipularea materialului folosite pentru manipularea materialului genetic:genetic:

hibridare somaticăhibridare somatică transformare cu ADN exogen transformare cu ADN exogen transferul de cromozomi, nuclee şi diverse transferul de cromozomi, nuclee şi diverse

organite celulareorganite celulare studiul virozelor vegetalestudiul virozelor vegetale elucidarea modului de acţiune al agenţilor elucidarea modului de acţiune al agenţilor

patogeni bacterieni şi fungici.patogeni bacterieni şi fungici.

Etapele procesului de izolare a protoplaştilor

cultura de protoplasti

Documents