compuŞi din specii ale genului paeonia l. Şi … doctorat/rezumat...asist. univ. ana maria balan...

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

"GRIGORE T. POPA" IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

COMPUŞI DIN SPECII ALE GENULUI PAEONIA L. ŞI

ANALOGI STRUCTURALI DE INTERES TERAPEUTIC

Rezumatul tezei de doctorat

Conducător ştiinţific,

Prof. univ. dr. Anca MIRON

Doctorand,

Asist. univ. Ana Maria Balan (Zbancioc)

2014

Prin decizia Rectorului nr. 551 din 10.01.2014 a fost numită comisia pentru susţinerea publică a tezei de doctorat intitulată "Compuşi

din specii ale genului Paeonia L. şi analogi structurali de interes

terapeutic", elaborată de asist. univ. Ana Maria Balan (Zbancioc), conducător ştiinţific Prof. univ. dr. Anca Miron, în vederea conferirii

titlului de Doctor în Ştiinţe Medicale, domeniul Farmacie.

Comisia de doctorat are următoarea componenţă:

PREŞEDINTE: Prof. univ. dr. Monica Hăncianu

Universitatea de Medicină şi Farmacie "Grigore T. Popa", Iaşi

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ. dr. Anca Miron


REFERENŢI OFICIALI:

Prof. univ. dr. Ilioara Oniga

Universitatea de Medicină şi Farmacie "Iuliu Haţieganu", Cluj-Napoca

Prof. univ. dr. Ionel Mangalagiu

Universitatea "Alexandru Ioan Cuza", Iaşi

Conf. univ. dr. Nela Bibire


Teza de doctorat cuprinde:

290 pagini (anexe – 65 pagini)

248 figuri

43 tabele

28 scheme

264 indicaţii bibliografice

În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins,

tabele, figuri şi scheme.

Cuvinte cheie: Paeonia mlokosewitschii Lomakin., analogi structurali

cu nucleu acetofenonic, acţiune antimicrobiană, acţiune antitumorală.

1

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ.................................................................................. ......5

CAPITOLUL 1. GENUL PAEONIA L. – GENERALITĂŢI................ ....5

1.1. Încadrare sistematică........................................................................ ....5

1.2. Răspândire...................................................................................... ....6

1.3. Descriere........................................................................................... ....6

1.4. Studii chimice................................................................................... ....7

1.4.1. Terpene izolate din diferite specii ale genului Paeonia L........ ....7

1.4.2. Polifenoli izolaţi din diferite specii ale genului Paeonia L...... ..15

1.5. Studii biologice................................................................................. ..20

1.5.1. Activitate antimicrobiană......................................................... ..21

1.5.2. Activitate antitumorală............................................................. ..23

1.5.3. Activitate antioxidantă............................................................. ..25

1.5.4. Activitate antiagregant plachetară şi anticoagulantă............... ..27

1.5.5. Activitate antiinflamatoare....................................................... ..28

1.5.6. Activitate antialergică.............................................................. ..28

1.5.7. Activitate hipolipemiantă......................................................... . 29

1.5.8. Activitate hipoglicemiantă....................................................... ..29

1.5.9. Activitate antiosteoporotică...................................................... . 30

1.5.10. Alte efecte biologice.............................................................. ..30

CAPITOLUL 2. COMPUŞI DIN SPECII DE PAEONIA ŞI

ANALOGI STRUCTURALI: SINTEZĂ, CARACTERIZARE,

EFECTE BIOLOGICE …………………………………………………. ..32

2.1. Peonolul şi analogii săi structurali.................................................... ..32

2.2. Peonilida........................................................................................... ..39

PARTEA PERSONALĂ................................................................................ ..44 MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI ŞI

OBIECTIVELE PROPUSE...................................................................... ..44 CAPITOLUL 3. IZOLAREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR

COMPUŞI DIN SPECIA PAEONIA MLOKOSEWITSCHII

LOMAKIN................................................................................................ ..50

3.1. Paeonia mlokosewitschii Lomakin. – generalităţi............................ ..50

3.2. Izolarea şi caracterizarea unor compuşi din frunze.......................... ..50

3.2.1. Obţinerea şi fracţionarea extractului metanolic brut................ ..51

3.2.2. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în eter etilic

(FPE).................................................................................................. ..52

3.2.3. Elucidarea structurii compuşilor izolaţi................................... ..56

3.2.4. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în acetat de

etil (FPA)........................................................................................... ..74


3.3. Izolarea şi caracterizarea unor compuşi din rădăcini........................ ..85

3.3.1. Obţinerea şi fracţionarea extractului metanolic brut................ ..85

3.3.2. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în eter etilic

(RPE)................................................................................................. ..86

2


3.3.4. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în acetat de

etil (RPA)........................................................................................... ..89

3.3.5. Elucidarea structurii compusului izolat.................................... ..92

3.4. Concluzii........................................................................................... ..93

CAPITOLUL 4. ANALOGI STRUCTURALI CU SCHELET

ACETOFENONIC: SINTEZĂ ŞI CARACTERIZARE FIZICO-

CHIMICĂ................................................................................................... ..94

4.1. Derivaţi alchilaţi............................................................................... ..94

4.1.1. Sinteză şi purificare................................................................. ..94

4.1.2. Caracterizare fizică................................................................... ..97

4.1.3. Elucidarea structurii derivaţilor alchilaţi.................................. ..97

4.2. Derivaţi dialchilaţi bromuraţi........................................................... 111

4.2.1. Sinteză şi purificare.................................................................. 111

4.2.2. Caracterizare fizică.................................................................. 112

4.2.3. Elucidarea structurii derivaţilor dialchilaţi bromuraţi.............. 113

4.3. Săruri de cicloimoniu........................................................................ 120

4.3.1. Bromuri de cicloimoniu........................................................... 120

4.3.1.1. Sinteză şi purificare......................................................... 120

4.3.1.2. Caracterizare fizică.......................................................... 121

4.3.1.3. Elucidarea structurii bromurilor de cicloimoniu.............. 121

4.3.2. Cloruri de cicloimoniu............................................................. 134

4.3.2.1. Sinteză şi purificare......................................................... 134

4.3.2.2. Caracterizare fizică.......................................................... 136

4.3.2.3. Elucidarea structurii clorurilor de cicloimoniu................ 136

4.4. Concluzii........................................................................................... 145

CAPITOLUL 5. EVALUAREA ACTIVITĂŢII

ANTIMICROBIENE................................................................................. 146

5.1. Activitatea antimicrobiană a 3-(3',5'-dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-

dihidroxi-benzoatului de metil................................................................. 146

5.1.1. Metoda difuzimetrică............................................................... 146

5.2. Activitatea antimicrobiană a analogilor structurali sintetizaţi.......... 148

5.2.1. Metoda difuzimetrică............................................................... 148

5.2.1.1. Activitatea antimicrobiană a derivaţilor alchilaţi............. 150

5.2.1.2. Activitatea antimicrobiană a derivaţilor dialchilaţi

bromuraţi………………………………………………………... 156

5.2.1.3. Activitatea antimicrobiană a sărurilor de cicloimoniu..... 159

5.2.2. Metoda microdiluţiilor în bulion.............................................. 165

5.3. Concluzii........................................................................................... 171

CAPITOLUL 6. EVALUAREA ACTIVITĂŢII ANTITUMORALE.. 173

6.1. Activitatea antitumorală a 3-(3',5'-dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-

dihidroxi-benzoatului de metil................................................................. 173

6.1.1. Pregătirea materialului biologic............................................... 173

6.1.2. Efectul 3-(3',5'-dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-dihidroxi-

benzoatului de metil asupra viabilităţii celulelor HeLa (metoda

MTT).................................................................................................. 174

3

6.2. Activitatea antitumorală a analogilor structurali sintetizaţi.............. 175

6.2.1. Efectele analogilor structurali sintetizaţi asupra viabilităţii

celulelor HeLa (metoda MTT) – screening preliminar.................... 175

6.2.1.1. Efectele derivaţilor alchilaţi asupra viabilităţii celulelor

HeLa…………………………………………………………..... 175

6.2.1.2. Efectele derivaţilor bromuraţi asupra viabilităţii

celulelor

HeLa............................................................................................. 176

6.2.1.3. Efectele sărurilor de cicloimoniu asupra viabilităţii

celulelor HeLa.............................................................................. 177

6.2.2. Efectele analogilor structurali sintetizaţi asupra sintezei

proteice în celulele HeLa................................................................. 180

6.2.2.1. Efectele derivaţilor alchilaţi asupra sintezei proteice...... 181

6.2.2.2. Efectele derivaţilor bromuraţi asupra sintezei proteice... 184

6.2.2.3. Efectele sărurilor cuaternare asupra sintezei proteice...... 186

6.2.3. Efectele derivaţilor bromuraţi asupra altor linii celulare

tumorale umane……………………………………………………. 191

6.2.3.1. Pregătirea materialului biologic....................................... 191

6.2.3.2. Efectele asupra viabilităţii celulare (metoda MTT)…… 192

6.2.3.2.1. Efectele asupra celulelor de adenocarcinom mamar uman MCF-7............................................................... 193

6.2.3.2.2. Efectele asupra celulelor de adenocarcinom

alveolar uman A549................................................................ 194


colorectal uman Caco2............................................................ 194

6.2.3.2.4. Efectele asupra celulelor de adenocarcinom uman

de prostată PC3........................................................................ 195

6.2.3.3. Capacitatea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi............ 196

6.2.3.3.1. Activitatea pro-oxidantă în celule de

adenocarcinom mamar MCF-7................................................ 198

6.2.3.3.2. Activitatea pro-oxidantă în celule de adenocarcinom alveolar A549................................................. 198


adenocarcinom colorectal Caco2............................................ 199


adenocarcinom de prostată PC3.............................................. 200

6.2.4. Efectele asupra celulelor normale epiteliale mamare,

imortalizate MCF-12F................................................................... 201

6.3. Concluzii.......................................................................................... 203

CONCLUZII GENERALE. GRADUL DE ORIGINALITATE.

PERSPECTIVE DE CERCETARE....................................................... 205

BIBLIOGRAFIE........................................................................................ 213

Anexa 1 Derivaţi alchilaţi – Analize spectrale............................................. 237 Anexa 2 Derivaţi bromuraţi – Analize spectrale......................................... 239

Anexa 3 Săruri de cicloimoniu – Analize spectrale..................................... 247

Anexa 4 ARTICOLE PUBLICATE DIN TEMATICA TEZEI ................ 267

5

MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI ŞI

OBIECTIVELE PROPUSE

Plantele oferă o diversitate foarte mare de compuşi şi, ca urmare, cu toate progresele făcute în domeniul chimiei de sinteză şi

semisinteză, rămân o sursă importantă de substanţe cu potenţial

terapeutic (165). Astfel de substanţe au fost izolate şi din diferite specii

ale genului Paeonia L.:

peonolul (P. suffruticosa Andr.), compus hidroxi-acetofenonic,

pentru care au fost evidenţiate numeroase proprietăţi biologice.

Activitatea antimicrobiană este remarcabilă, la concentraţii mici

inhibând dezvoltarea multor microorganisme (Aspergillus spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli) (76). Peonolul prezintă efecte

antitumorale reducând semnificativ viabilitatea celulelor HeLa

(adenocarcinom cervical), HT-29 (adenocarcinom colorectal), Bel-7404

(carcinom hepatocelular), K562 (leucemie mieloidă cronică), SEG-1 (adenocarcinom esofagian), Eca-109 (carcinom scuamos esofagian) (84,

85). De asemenea, are proprietăţi antiinflamatoare, antiagregant

plachetare, anticoagulante şi analgezice (102, 103).

peoniflorina (P. hybrida Pall., P. lactiflora Pall., P. delavayi

Franch.), monoterpenă glicozidată, prezintă efecte antioxidante,

anticonvulsivante, hipolipemiante şi antiosteoporotice (13, 44, 113,

166). De asemenea, pentru peoniflorină, au fost evidenţiate şi efecte antitumorale prin inducerea apoptozei în celulele tumorale HT-29, Hef

G2 şi SMMC-7721 (carcinom hepatocelular) (87, 88).

peoninolul şi peonina C (P. emodi Wall. ex Royle), polifenol

şi respectiv, monoterpenă glicozidată, inhibă lipoxigenaza (tip I-B) şi au

proprietăţi antioxidante (167).

Au fost sintetizaţi analogi structurali ai peonolului (baze

Schiff, peonol-oxima, liganzi baze Schiff, derivaţi halogenaţi) pentru

care au fost evidenţiate efecte antimicrobiene, antioxidante, antitumorale (127, 137, 138, 144, 154).

Având în vedere importanţa terapeutică a compuşilor de origine

vegetală, atât prin ei înşişi, cât şi prin posibilitatea de a-i folosi ca prototip structural pentru obţinerea de analogi cu activitate biologică,

principalele obiective ale cercetărilor prezentate în această teză de

doctorat au fost:

6

A.

izolarea unor compuşi în stare pură din frunzele şi rădăcinile

speciei Paeonia mlokosewitschii Lomakin. (specie nestudiată din punct de vedere chimic şi biologic până în prezent);

elucidarea structurii compuşilor izolaţi utilizând diferite tehnici

spectrale: spectrometrie de masă cu ionizare chimică (modul

pozitiv) şi spectrometrie de rezonanţă magnetică nucleară: 1H-

RMN, 13

C-RMN, spectre bidimensionale 2D-COSY și 2D-HETCOR (HMQC şi HMBC);

evaluarea unor efecte biologice ale compuşilor izolaţi:

antimicrobiene (faţă de bacterii Gram-pozitive, Gram-

negative şi fungi patogeni);

antitumorale (faţă de diferite linii celulare tumorale:

celule de adenocarcinom cervical HeLa, celule de adenocarcinom mamar MCF-7, celule de

adenocarcinom alveolar A549, celule de

adenocarcinom colorectal Caco2, celule de adenocarcinom de prostată PC3).

B.

sinteza unor analogi structurali ai compuşilor fenolici cu nucleu

acetofenonic izolaţi din specii de Paeonia, cu potenţială acţiune

antimicrobiană şi antitumorală. S-a urmărit sinteza de noi derivaţi alchilaţi cu schelet acetofenonic, derivaţi bromuraţi şi

săruri cuaternare cu diferiţi compuşi heterociclici având azotul

drept heteroatom (stabilirea metodelor de sinteză, optimizarea procedeelor de lucru);

caracterizarea fizico-chimică şi spectrală a analogilor

structurali sintetizaţi (determinarea punctului de topire, analiza

elementală, determinarea structurii prin spectroscopie în

infraroşu, spectrometrie de masă cu ionizare chimică (modul pozitiv) şi spectrometrie de rezonanţă magnetică nucleară:

1H-

RMN, 13

C-RMN, spectre bidimensionale 2D-COSY și 2D-

HETCOR: HMQC şi HMBC;

evaluarea unor efecte biologice ale analogilor structurali

sintetizaţi:

antimicrobiene (faţă de bacterii Gram-pozitive, Gram-

negative şi fungi patogeni);

antitumorale (faţă de celule de adenocarcinom cervical

HeLa, celule de adenocarcinom mamar MCF-7, celule de adenocarcinom alveolar A549, celule de

7

adenocarcinom colorectal Caco2, celule de

adenocarcinom de prostată PC3);

pro-oxidante în diferite linii celulare tumorale (MCF-7,

A549, Caco2, PC3);

citotoxice faţă de o linie celulară normală, imortalizată

(celule epiteliale mamare MCF-12F).

Până în prezent, din diferite specii de Paeonia, au fost izolaţi

peste 15 compuşi fenolici cu nucleu acetofenonic, mai studiat din punct de vedere al profilului farmacologic fiind peonolul.

În studiul de faţă, pentru sinteza analogilor structurali cu nucleu

acetofenonic s-au utilizat: 2',4'-, 2',5'-, 2',6'-, 3',4'-, 3',5'-dihidroxi-acetofenone, mai uşor de procurat şi mai accesibile în ceea ce priveşte

preţul de achiziţie decât peonolul sau alţi compuşi fenolici cu structură

acetofenonică izolaţi din specii de Paeonia.

peonol 2',4'-dihidroxi-acetofenona 2',5'-dihidroxi-acetofenona

2',6'-dihidroxi-acetofenona 3',4'-dihidroxi-acetofenona 3',5'-dihidroxi-acetofenona

În literatură sunt menţionate efecte antimicrobiene moderate şi chiar slabe pentru dihidroxi-acetofenonele utilizate în sinteza analogilor

structurali (tab. 1) (168). TABELUL 1.

Valorile CMI (mg/mL) ale dihidroxi-acetofenonelor testate

Microorganisme test Dihidroxi-acetofenone

2',4'- 2',5'- 2',6'- 3',4'- 3',5'-

Staphylococcus aureus FAD-209P 1,99 > 1,99 0,49 > 1,99 1,99

Bacillus subtilis PCI-219 1,99 > 1,99 0,19 > 1,99 1,99

Micrococcus litea ATCC-1001 1,99 0,49 0,49 > 1,99 1,99

Escherichia coli O-80 0,99 > 1,99 0,19 > 1,99 1,99

Sallmonela typhi H-901 1,99 > 1,99 0,49 > 1,99 1,99

Pseudomonas aeruginosa IFO-3080 > 1,99 > 1,99 0,99 > 1,99 1,99

Candida albicans ATCC-7491 0,49 > 1,99 0,49 > 1,99 > 4,99

8

Având în vedere potenţialul antibacterian şi antifungic deja

cunoscut al structurilor heterociclice cu azot, pentru potenţarea efectelor antimicrobiene, dihidroxi-acetofenonele au fost cuplate cu diverşi

heterocicli ce conţin azotul drept heteroatom (piridazina, ftalazina, p-

cloro-tolil-piridazina, p-cloro-tolil-pirimidina).

Săruri de tipul clorurii de 4-(4-metil-fenil)-1-[3',4'-dihidroxi-fenil)-2-oxo-etil-piridaziniu] s-au dovedit a fi mai active decât martorul

pozitiv (cloramfenicol, 30 µg/disc) faţă de: Staphylococcus aureus

ATCC 25923, Staphylococcus saprophyticus, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli ATCC 25922

şi Pseudomonas aeruginosa (169).

clorură de 4-(4-metil-fenil)-1-[3',4'-dihidroxi-fenil)-2-oxo-etil-piridaziniu] (III)

Bhuiyan et al. au testat activitatea antimicrobiană a unor derivaţi de pirimidină prin metoda difuzimetrică. Microorganismele test

au fost: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Shigella dysenteriae,

Salmonella typhi. Cel mai activ compus s-a dovedit a fi 4-(3,5-dimetil-pirazolil)-5,6-difenil-furo-[2,3-d]-pirimidina care, la o concentraţie de

1%, a fost mai activă decât ampicilina (25 µg/disc) faţă de Bacillus

cereus şi Shigella dysenteriae (170).

4-(3,5-dimetil-pirazolil)-5,6-difenil-furo-[2,3-d]-pirimidină

De asemenea, derivaţi de sinteză cu nucleu acetofenonic şi

pirimidinic, derivaţi bromuraţi cu nucleu chinolinic şi pirimidino-

9

chinolinic sunt cunoscuţi pentru efectele lor antitumorale (171-173). Ca

urmare, pentru sinteza unor derivaţi cu potenţială activitate antitumorală au fost utilizate reacţii de alchilare cu diferiţi heterocicli cu azot şi

reacţii de bromurare. Testaţi faţă de o serie de celule tumorale umane

(celule de adenocarcinom mamar MCF-7, celule de adenocarcinom

alveolar A549, celule de adenocarcinom de prostată PC3, celule de adenocarcinom colorectal HT-29), unii derivaţi cu nucleu acetofenonic

au prezentat efecte antitumorale semnificative (tab. 2) (174).

Compus R1

1,3-difenil-propenona -H

1-(4-hidroxi-fenil)-3-fenil-propenona -OH

3 -fenil-1-p-tolil-propenona -CH3

1-(4-metoxi-fenil)-3-fenil-propenona -OCH3

TABELUL 2.

Valorile CI50 (µM) ale compuşilor testaţi

Compus Linii celulare tumorale umane

MCF-7 A549 PC3 HT-29

1,3-difenil-propenona 6,87 16,76 9,10 10,10

1-(4-hidroxi-fenil)-3-fenil-propenona > 100 > 100 > 100 > 100

3 -fenil-1-p-tolil-propenona 13,62 36,58 17,30 19,10

1-(4-metoxi-fenil)-3-fenil-propenona 19,15 77,04 21,13 37,28

Jin et al. au sintetizat şi testat o serie de compuşi cu nucleu

acetofenonic şi pirimidinic pe diferite linii celulare tumorale umane:

celule de adenocarcinom nasofaringean CNE2, celule de adenocarcinom mamar MCF-7 şi celule leucemice K562. Unii dintre

compuşi s-au dovedit a fi mai activi decât 5-fluorouracilul (tab. 3)

(175).

3-(3-cloro-4-(4,6-dimetoxi-pirimidin-2-il-

oxi)-fenil)-1-fenil-2-propen-1-onă

3-(4-(4,6-dimetoxi-pirimidin-2-il-oxi)-3-metoxi-

fenil)-1-fenil-2-propen-1-onă

10

TABELUL 3.

Valorile CI50 (µM) ale compuşilor testaţi

Compus Linii celulare tumorale umane

CNE2 MCF-7 K562

3-(3-cloro-4-(4,6-dimetoxi-pirimidin-2-il-oxi)-fenil)-1-fenil-2-propen-1-onă

10,7 20,0 24,6

3-(4-(4,6-dimetoxi-pirimidin-2-il-oxi)-3-metoxi-fenil)-1-fenil-2-propen-1-onă

15,8 18,6 19,2

5-fluorouracil 13,1 10,5 > 50

Ghorab et al. au evidenţiat faptul că o serie de derivaţi bromuraţi cu nucleu chinolinic şi pirimidino-chinolinic acţionează

citotoxic in vitro faţă de celulele tumorale MCF-7. Dintre derivaţi, 2-

amino-1-(4-bromo-fenil)-7, 7-dimetil-5-oxo-4-p-tolil-1, 4, 5, 6, 7, 8-hexahidro-chinolin-3-carbonitrilul s-a dovedit a fi mai activ decât

doxorubicina (tab. 4) (176).

2-amino-1-(4-bromo-fenil)-

7,7-dimetil-5-oxo-4-p-tolil-

1,4,5,6,7,8-

hexahidrochinolin-3-

carbonitril

4-amino-10-(4-bromo-fenil)-

8,8-dimetil-5-p-tolil-7,8,9,10-

tetrahidropirimido-[4,5-d]-

chinolin-6-ona

10-(4-bromo-fenil)-8,8-dimetil-

5-p-tolil-7,8,9,10-

tetrahidropirimido-[4,5-d]-

chinolin-4,6-diona

TABELUL 4.

Valorile CI50 (µM) ale compuşilor testaţi faţă de celulele tumorale MCF-7

Compus CI50 (µM)

2-amino-1-(4-bromo-fenil)-7,7-dimetil-5-oxo-4-p-tolil-1,4,5,6,7,8-hexahidro-chinolin-3-carbonitril

8,5

4-amino-10-(4-bromo-fenil)-8,8-dimetil-5-p-tolil-7,8,9,10-tetrahidropirimido-[4,5-d]-chinolin-6-ona

36,4

10-(4-bromo-fenil)-8,8-dimetil-5-p-tolil-7,8,9,10-tetrahidropirimido-[4,5-d]-chinolin-4,6-diona

43,1

doxorubicin 32,02

11

Literatura de specialitate menţionează şi efecte pro-oxidante

pentru derivaţii de acetofenonă. Cel mai cunoscut exemplu este apocinina (4'-hidroxi-3'-metoxi-acetofenona, acetovanilona), izolată

iniţial din Picrorhiza kurroa, care inhibă specific NADPH oxidaza

(sistem enzimatic care catalizează reducerea oxigenului molecular la

radicalul anion superoxid). Efectul inhibitor faţă de NADPH oxidaza din celulele lipsite de activitate fagocitară este controversat. Numeroşi

cercetători susţin că apocinina inhibă NADPH oxidaza numai la nivelul

celulelor fagocitare, acţiunea fiind dependentă de prezenţa mieloperoxidazei.

În celelalte celule, apocinina nu inhibă activitatea

NADPH oxidazei şi, mai mult decât atât, acţionează

pro-oxidant prin diferite mecanisme (reducerea nivelului intracelular de glutation, creşterea

nivelului intracelular de H2O2, activarea proceselor apocinină

de peroxidare lipidică) (177, 178). Deşi nu a fost raportată capacitatea apocininei de a acţiona pro-

oxidant şi la nivelul celulelor tumorale, unul din obiectivele studiului de

faţă a fost reprezentat de evaluarea capacităţii analogilor structurali cu

nucleu acetofenonic sintetizaţi de a reduce viabilitatea celulelor tumorale prin inducerea stresului oxidativ.

Având în vedere creşterea incidenţei afecţiunilor de natură

infecţioasă şi a celor maligne, identificarea de noi agenţi antimicrobieni şi antitumorali cu eficienţă ridicată şi tolerabilitate bună reprezintă o

prioritate în cercetarea actuală.

12

PARTEA PERSONALĂ

CAPITOLUL 3. IZOLAREA ŞI CARACTERIZAREA

UNOR COMPUŞI DIN SPECIA

PAEONIA MLOKOSEWITSCHII LOMAKIN.

3.2. Izolarea şi caracterizarea unor compuşi din frunze

3.2.1. Obţinerea şi fracţionarea extractului metanolic brut

Extractul metanolic brut obţinut din frunze a fost fracţionat prin

extracţie lichid-lichid cu solvenţi de polarităţi diferite (eter etilic, acetat

de etil).

3.2.2. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în

eter etilic (FPE)

Rezultate şi discuţii

Din fracţiunea extractivă în eter etilic (FPE) s-au izolat următorii compuşi în stare pură: FPE-2-1 (127 mg); FPE-3-1-1 (26

mg); FPE-3-1-2-1 (56 mg); FPE-4-1-1-1 (11 mg); FPE-4-1-2 (12 mg).

Analiza CSS (metodele D1 şi D2) a evidenţiat faptul că toţi compuşii

izolaţi sunt puri.

Fig. 3.3. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în eter etilic (FPE)

13

3.2.3. Elucidarea structurii compuşilor izolaţi

Structura compuşilor izolaţi din frunzele de P. mlokosewitschii

Lomakin. a fost elucidată prin spectrometrie de rezonanţă magnetică

nucleară (1H-RMN,

13C-RMN, 2D-COSY, HMQC, HMBC) şi

spectrometrie de masă cu ionizare chimică (modul pozitiv).


Analizele spectrale efectuate au dovedit identitatea structurală între următorii compuşi:

FPE-2-1 şi FPE-3-1-1 (compusul 1);

FPE-3-1-2-1 şi FPE-4-1-2 (compusul 2).

Compusul 1

galat de metil

C8H8O5

M = 184 g/mol

Pulbere cristalină de culoare albă. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD-d4, δ, ppm, J, Hz): 3,81 s, 3H:

CH3; 7,04 s, 2H: H2, H6. 13

C-RMN (100 MHz, CD3OD -d4, δ, ppm): 52,4 C2' (CH3);

110,1 C2, C6; 121,6 C1; 139,9 C4; 146,6 C3, C5; 169,1 C1'.

SM (IC, m/z): 153 (35,5%), 184 (18,1%), 185 ((M+1)+, picul de

bază, 100%).

Compusul 2

3-(3',5'-dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-dihidroxi-

benzoat de metil

C15H12O8

M = 320 g/mol

Pulbere amorfă de culoare albă. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD-d4, δ, ppm, J, Hz): 3,84 s, 3H:

CH3; 7,10 s, 1H: H4'; 7,26-7,27 d, 1H: H6, JH6,H2=2 Hz; 7,38-7,39 d, 1H:

H2, JH2,H6=2 Hz.

14

13C-RMN (100 MHz, CD3OD -d4, δ, ppm): 52,4 C2''; 109,8 C4';

110,8 C2', C6'; 114,7 C2; 117,3 C6; 121,4 C1; 128,9 C1'; 140,1 C5; 144,3 C4; 146,5 C3', C5'; 151,7 C3; 166,5 C1''' (CO); 168,2 C1'' (CO).

SM (IC, m/z): 110 (18,5%), 260 (6,7%), 288 (18,5%), 304

(picul de bază, 100%), 319 ((M-1)+, 6,5%).

Compusul 3

di (2-etil-heptil) ftalat

C26H42O4

M = 418 g/mol

Masă uleioasă de culoare maro deschis. 1H-RMN (500 MHz, CDCl3-d1, δ, ppm, J, Hz): 0,86-0,93 m,

12H: 3H (CH3 din poziţia 7'), 3H (CH3 din poziţia 7''), 3H (CH3 din poziţia 9'), 3H (CH3 din poziţia 9''); 1,25-1,42 m, 20H: 2H3', 2H3'', 2H4',

2H4'', 2H5', 2H5'', 2H6', 2H6'', 2H8', 2H8''; 1,67-1,69 m, 2H: H2', H2''; 4,18-

4,34 m, 4H: 2H1', 2H1''; 7,52-7,54 dd, 2H: H4, H5, JH4,H3=JH5,H6=3 Hz; 7,69-7,71 dd, 2H: H3, H6, JH3,H4=JH6,H5=3 Hz.

13C-RMN (100 MHz, CDCl3-d1, δ, ppm): 11,1 C9', C9''; 14,1 C7',

C7''; 23,1 C6', C6''; 23,9 C8', C8''; 29,8 C4', C4''; 30,5 C5', C5''; 32,0 C3', C3'';

38,9 C2', C2''; 68,3 C1', C1''; 128,9 C4, C5; 131,0 C3, C6; 132,6 C1, C2; 167,9 2 × CO.

SM (IC, m/z): 71 (66,3%), 127 (81%), 149 (picul de bază,

100%), 293 (56,8%), 307 (31,5%), 391 (17,8%), 419 ((M+1)+; 4%).


acetat de etil (FPA)


Din fracţiunea extractivă în acetat de etil (FPA) s-au izolat

următorii compuşi în stare pură: FPA-2-1 (5 mg) şi FPA-2-2 (10 mg). Puritatea celor doi compuşi a fost confirmată prin analiză CSS.

15

Fig. 3.24. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în acetat de etil (FPA)


Rezultate şi discuţii Analizele spectrale efectuate au dovedit identitatea structurală

între compusul 1.

Compusul 4

penta-O-galoil-β-D-glucoză (PGG)

C41H32O26

M = 940 g/mol

Pulbere amorfă de culoare crem deschis. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD-d4, δ, ppm, J, Hz): 4,36-4,42 m,

2H: H6, H7; 4,50-4,53 d, 1H: H7, JH7,H6=11 Hz; 5,56-5,64 m, 2H: H3, H5; 5,88-5,92 t, 1H: H4, JH4,H5=JH4,H3=9,5 Hz; 6,22-6,24 d, 1H: H2, JH2,

H3=8,5 Hz; 6,90 s, 2H: H2', H6' (E); 6,95 s, 2H: H2', H6' (B); 6,98 s, 2H:

H2', H6' (C); 7,05 s, 2H: H2', H6' (D); 7,11 s, 2H: H2', H6' (A). 13

C-RMN (100 MHz, CD3OD-d4, δ, ppm): 63,1 C7; 69,8 C5;

72,2 C3; 74,1 C4; 74,4 C6; 93,8 C2; 110,3 C2', C6' (A); 110,4 C2', C6' (E);

110,4 C2', C6' (B); 110,4 C2', C6' (C); 110,6 C2', C6' (D); 119,7 C1' (D);

120,2 C1' (C); 120,2 C1' (B); 120,3 C1' (E); 121,0 C1' (A); 140,0 C4' (A); 140,1 C4' (E); 140,3 C4' (B); 140,4 C4' (C); 140,8 C4' (D); 146,2 C3', C5'

16

(E); 146,3 C3', C5' (B); 146,4 C3', C5' (C); 146,4 C3', C5' (A); 146,5 C3',

C5' (D); 166,2 CO (D); 166,9 CO (C); 167,0 CO (B); 167,3 CO (E); 167,9 CO (A).

SM (IC, m/z): 153 (41%), 170 (picul de bază, 100%), 184

(19,3%).

3.3. Izolarea şi caracterizarea unor compuşi din rădăcini

3.3.1. Obţinerea şi fracţionarea extractului metanolic brut


eter etilic (RPE)

Fig. 3.35. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în eter etilic (RPE)


Din fracţiunea extractivă în eter etilic (RPE) s-au izolat următorii compuşi în stare pură: RPE-1-3-1 (168,8 mg), RPE-1-4-1 (61

17

mg) şi RPE-1-4-2-1-1 (50 mg). Analiza CSS a evidenţiat faptul că toţi

compuşii izolaţi sunt puri.


Rezultate şi discuţii Analizele spectrale efectuate au dovedit identitatea structurală

între următorii compuşi:

RPE-1-3-1, RPE-1-4-1 şi compusul 1;

RPE-1-4-2-1-1 şi compusul 2.


acetat de etil (RPA)

Fig. 3.36. Izolarea unor compuşi din fracţiunea extractivă în acetat de etil (RPA)

Rezultate şi discuţii Din fracţiunea extractivă în acetat de etil (RPA) s-a izolat

compusul RPA-3-3-2-2. Analiza CSS a evidenţiat faptul că acest

compus este pur.

18

3.3.5. Elucidarea structurii compusului izolat


Analizele spectrale au dovedit identitatea structurală a

compusului RPA-3-3-2-2 cu unul dintre compuşii anterior izolaţi –

compusul 4.

CAPITOLUL 4. ANALOGI STRUCTURALI CU SCHELET

ACETOFENONIC: SINTEZĂ ŞI

CARACTERIZARE FIZICO-CHIMICĂ

4.1. Derivaţi alchilaţi

4.1.1. Sinteză şi purificare

Când sinteza a decurs în raport molar de 1:2, s-au obţinut compuşii alchilaţi la ambele grupări hidroxilice – derivaţi dialchilaţi,

iar când s-a folosit un raport molar de 1:1, s-au obţinut derivaţi

monoalchilaţi.

19

4.1.2. Caracterizare fizică


TABELUL 4.3.

Analogi alchilaţi cu schelet acetofenonic: aspect şi punct de topire

Compus Aspect P.t. (ºC) Compus Aspect P.t. (ºC)

3a Cristale albe 114-115 4a Cristale albe-crem 96-97

3b Cristale albe-crem 95-96 4b Cristale galbene-pai 77-78

3c Cristale galbene 80-81 4c Cristale galbene-pai 68-69

3d Cristale albe-crem 89-90

3e Cristale albe 102-103

4.1.3. Elucidarea structurii derivaţilor alchilaţi

Elucidarea structurii compuşilor sintetizaţi s-a realizat prin

analiză elementală, spectroscopie IR, spectroscopie de masă, spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară (

1H-RMN,

13C-RMN şi

spectre bidimensionale 2D-COSY, 2D-HETCOR: HMQC şi HMBC).

Compusul 3a

2', 4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-

acetofenona

C14H16O7

M=296,27 g/mol

Compusul 3b


acetofenona

C14H16O7

M=296,27 g/mol

Compusul 3c


acetofenona

C14H16O7

M=296,27 g/mol

Analiza elementală: calculat: C 56,76%, H 5,44%; determinat: C 56,71%, H 5,39%.

20

IR (KBr, cm-1

): 3100, 3048, 3011 (C-H arom.), 2957, 2917 (C-

H alif.), 1767, 1751 (C=O ester), 1697 (C=O cet.), 1599, 1470, 1441 (C=C), 1248, 1211, 1130, 1086 (C-O-C).

1H-RMN (DMSO-d6, δ, ppm, J, Hz): 2,45 s, 3H: 3 H1: CH3 din

gr. acetil, 3,69 s, 6H: 2×CH3 din gr. metoxi, poziţia 2' şi 6', 4,85 s, 4H:

2×CH2 din gr. metil-acetat, poziţia 2' şi 6', 6,65 d, JH3',H4 '=JH5',H4'=8,4 Hz, 2H: H3', H5', 7,25 t, JH4',H5'=JH4',H3'= 8,4 Hz, 1H: H4'.

13C-RMN (DMSO-d6, δ, ppm): 31,9 C1 din gr. acetil, 51,8

2×CH3 din gr. metoxi, poziţia 2' şi 6', 64,9 2×CH2 din gr. metil-acetat, poziţia 2' şi 6', 105,6 C3' şi C5', 120,8 C1', 130,4 C4', 154,3 C2' şi C6',

169,0 2 x CO ester, 200,6 C2 cetonic.

SM (IC, m/z): 91 (7,6%), 107 (5,7%), 195 (5,7%), 221 (9,4%),

237 (34%), 253 (20,8%), 255 (15,1%), 281 (picul de bază, 100%), 282 (15,1%), 296 (M

+·, 17%), 297 ((M+1)

+, 11,3%).

Compusul 3d


acetofenona

C14H16O7

M=296,27 g/mol

Compusul 3e


acetofenona

C14H16O7

M=296,27 g/mol

Compusul 4a

2'-hidroxi-4'-(2-metoxi-2-oxo-etoxi)-

acetofenona

C11H12O5

M=224,21 g/mol

Compusul 4b


acetofenona

C11H12O5

M=224,21 g/mol

21

Compusul 4c


acetofenona

C11H12O5

M=224,21 g/mol

4.2. Derivaţi dialchilaţi bromuraţi

4.2.1. Sinteză şi purificare

4.2.2. Caracterizare fizică


TABELUL 4.5.

Derivaţi dialchilaţi bromuraţi: aspect şi punct de topire

Compus Aspect P.t. (ºC)

5a Cristale crem 71-72

5b Cristale galbene deschis 84-85

5c Cristale maro deschis 57-58

5d Cristale albe 89-90

5e Cristale albe 75-76

4.2.3. Elucidarea structurii derivaţilor dialchilaţi bromuraţi

Compusul 5a

2-bromo-2', 4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-

acetofenona

C14H15O7Br

M=375,17 g/mol

Analiza elementală: calculat: C 44,82%, H 4,03%;

determinat: C 44,80%, H 4,00%.

IR (KBr, cm-1

): 3093, 3072, 3018 (C-H arom.), 2965, 2918 (C-H alif.), 1763, 1738 (C=O ester), 1674 (C=O cet.), 1606, 1502, 1452,

1433, 1417 (C=C), 1296, 1215, 1165, 1080 (C-O-C), 608 (C-Br).

22

1H-RMN (CDCl3-d1, δ, ppm, J, Hz): 3,71 s, 3H: CH3 din gr.

metoxi, poziţia 4', 3,74 s, 3H: CH3 din gr. metoxi, poziţia 2', 4,91 s, 2H: CH2 din gr. metil-acetat, poziţia 4', 4,91 s, 2H: CH2 din gr. metil-acetat,

poziţia 2', 4,98 s, 2H: CH2-Br, 6,68 dd, JH5',H6'=8,4 Hz, JH5',H3'=2,0 Hz,

1H: H5', 6,74 d, JH3',H5'=2,0 Hz, 1H: H3', 7,72 d, JH6',H5'=8,4 Hz, 1H: H6'. 13

C-RMN (CDCl3-d1, δ, ppm): 38,8 C1 din gr. acetil, 51,9 CH3 din gr. metoxi, poziţia 4', 52,0 CH3 din gr. metoxi, poziţia 2', 64,9 CH2

din gr. metil-acetat, poziţia 4', 65,8 CH2 din gr. metil-acetat, poziţia 2',

100,2 C3', 108,0 C5', 118,1 C1', 132,5 C6', 158,8 C2', 163,1 C4', 168,1 CO ester, poziţia 2’, 168,1 CO ester, poziţia 4’ 189,8 C2 cetonic.

SM (IC, m/z): 195 (9,4%), 253 (11,3%), 267 (5,7%), 281 (picul

de bază, 100%), 282 (15,1%), 315 (18,2%), 317 (17%), 374 ((M-1)+,

16%), 375 (M+·

, 11,3%), 376 ((M+1)+, 13,2%), 377 ((M+2)

+, 9,4%).

Compusul 5b


acetofenona

C14H15O7Br

M=375,17 g/mol

Compusul 5c


acetofenona

C14H15O7Br

M=375,17 g/mol

Compusul 5d


acetofenona

C14H15O7Br

M=375,17 g/mol Compusul 5e


acetofenona

C14H15O7Br

M=375,17 g/mol

23

4.3. Săruri de cicloimoniu

Pentru obţinerea sărurilor de cicloimoniu au fost trataţi diferiţi

compuşi heterociclici cu azot cu derivaţi halogenaţi cu schelet

acetofenonic cu reactivitate mărită.

4.3.1. Bromuri de cicloimoniu

4.3.1.1. Sinteză şi purificare

4.3.1.2. Caracterizare fizică


TABELUL 4.7.

Bromuri de cicloimoniu: aspect şi punct de topire

Compus Aspect P.t. (ºC) Compus Aspect P.t. (ºC)

7a Cristale portocalii 83-84 9a Cristale maro 90-91

7b Cristale maro 127-128 9b Cristale galbene muştar 130-131

7c Cristale maro 109-110 9c Cristale maro deschis 137-138

7d Cristale albe murdar 188-189 9d Cristale galbene deschis 151-152

7e Cristale cafenii-maro 100-101 9e Cristale albe-crem 165-166

24

4.3.1.3. Elucidarea structurii bromurilor de cicloimoniu

Compusul 7a

bromură de N-(2-(2',4'-bis (2-metoxi-2-

oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil) piridaziniu

C18H19O7N2Br

M=455,26 g/mol

Compusul 7b


oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-piridaziniu

C18H19O7N2Br

M=455,26 g/mol

Compusul 7c

bromură de N-(2-(2',6'-bis (2-metoxi-2-oxo-

etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-piridaziniu

C18H19O7N2Br

M=455,26 g/mol

Compusul 7d

bromură de N-(2-(3',4'-bis (2-

metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-

piridaziniu

C18H19O7N2Br

M=455,26 g/mol

Compusul 7e


oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-piridaziniu

C18H19O7N2Br

M=455,26 g/mol

Analiza elementală: calculat: C 47,49%, H 4,21%, N

6,15%; determinat: C 47,46%, H 4,19%, N 6,10%.

25

IR (KBr, cm-1

): 3096, 3065, 3018 (C-H arom.), 2978, 2955,

2931 (C-H alif.), 1749, 1732 (C=O ester), 1692 (C=O cet.), 1601, 1438, 1387 (C=C, C=N arom.), 1294, 1230, 1169 (C-O-C).

1H-RMN (DMSO-d6, δ, ppm, J, Hz): 3,72 s, 6H: 2×CH3 din gr.

metoxi, poziţii 3' şi 5', 4,94 s, 4H: 2×CH2 din gr. metil-acetat, poziţii 3'

şi 5', 6,81 s, 2H: H7, 7,00 d, J4',2'=J4',6'=1,6 Hz, 1H: H4', 7,26 d, J2',4'=J6',4'=1,6 Hz, 2H: H2', H6', 8,79 t, J4,3=4,4 Hz, J4,5=7,6 Hz, 1H: H4,

8,92 t, J5,6=6,0 Hz, J5,4=7,6 Hz, 1H: H5, 9,76 d, J3,4=4,4 Hz, 1H: H3,

9,99 d, J6,5=6,0 Hz, 1H: H6. 13

C-RMN (DMSO-d6, δ, ppm): 51,9 2×CH3 din gr. metoxi,

poziţii 3' şi 5', 65,0 2×CH2 din gr. metil-acetat, poziţii 3' şi 5', 70,4 C7,

107,5 C4', 107,6 C2', 107,6 C6', 135,2 C1', 136,0 C5, 137,5 C4, 151,9 C6,

154,7 C3, 159,1 C3', 159,1 C5', 168,9 2×CO ester, poziţii 3' şi 5', 189,9 C8 cetonic.

Compusul 9a

bromură de N-(2-(2',4'-bis (2-metoxi-

2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-

ftalaziniu

C22H21O7N2Br

M=505,32 g/mol

Compusul 9b


oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-ftalaziniu

C22H21O7N2Br

M=505,32 g/mol

Compusul 9c

bromură de N-(2-(2',6'-bis (2-metoxi-2-oxo-

etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-ftalaziniu

C22H21O7N2Br

M=505,32 g/mol

Compusul 9d



C22H21O7N2Br

M=505,32 g/mol

26

Compusul 9e



C22H21O7N2Br

M=505,32 g/mol

CAPITOLUL 5. EVALUAREA ACTIVITĂŢII

ANTIMICROBIENE

5.2. Activitatea antimicrobiană a analogilor structurali

sintetizaţi

Activitatea antimicrobiană a derivaţilor sintetizaţi a fost

evaluată calitativ prin metoda difuzimetrică. Substanţele care au

prezentat o activitate antimicrobiană bună în urma acestui screening preliminar au fost testate în vederea stabilirii CMI şi CMB/CMF prin

metoda microdiluţiilor în bulion.

5.2.2. Metoda microdiluţiilor în bulion


Faţă de toate bacteriile testate, cel mai activ s-a dovedit a fi derivatul bromurat 5e.

Fig. 5.59. Valori CMI şi CMB faţă de Staphyloccocus aureus ATCC 25923

(A = ampicilină)

27

Fig. 5.60. Valori CMI şi CMB faţă de Sarcina lutea ATCC 9341

(A = ampicilină)

Fig. 5.61. Valori CMI şi CMB faţă de Bacillus cereus ATCC 14579

(A = ampicilină)

Fig. 5.62. Valori CMI şi CMB faţă de Bacillus subtilis

(A = ampicilină)

28

Fig. 5.63. Valori CMI şi CMB faţă de Escherichia coli ATCC 25922

(A = ampicilină)

Fig. 5.64. Valori CMI şi CMB faţă de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

(A = ampicilină)

În ceea ce priveşte acţiunea antifungică faţă de Candida

albicans ATCC 10231, conform valorilor CMI şi CMF, cei mai activi

derivaţi au fost 3a, 4b, 5a, 5b, 5d, 5e (CMI = 1,25 mg/mL, CMF = 2,5 mg/mL), urmaţi de 3c, 9c (CMI = 1,25 mg/mL, CMF = 5 mg/mL) şi 5c,

7e (CMI = 2,5 mg/mL, CMF = 5 mg/mL) (fig. 5.65).

Fig. 5.65. Valori CMI şi CMF faţă de Candida albicans ATCC 10231 (N = nistatin)

29

CAPITOLUL 6. EVALUAREA ACTIVITĂŢII ANTITUMORALE

6.2. Activitatea antitumorală a analogilor structurali

sintetizaţi

Activitatea antitumorală a derivaţilor sintetizaţi a fost evaluată

in vitro faţă de diferite linii celulare tumorale umane: HeLa

(adenocarcinom cervical), MCF-7 (adenocarcinom mamar), A549

(adenocarcinom alveolar), Caco2 (adenocarcinom colorectal), PC3

(adenocarcinom de prostată). De asemenea, a fost evaluată şi

citotoxicitatea faţă de o linie celulară normală imortalizată: celule

epiteliale mamare umane MCF-12F. Pentru derivaţii bromuraţi 5a-e a fost investigată şi capacitatea de a reduce viabilitatea celulelor tumorale

prin creşterea nivelului intracelular de SRO (efect pro-oxidant).

6.2.2. Efectele analogilor structurali sintetizaţi asupra

sintezei proteice în celulele HeLa


6.2.2.1. Efectele derivaţilor alchilaţi asupra sintezei proteice

a. Derivaţi dialchilaţi

La 500 µg/mL compusul 3a (80,94 ± 3,40%), cel mai activ în

această serie, a prezentat un procent de inhibare a sintezei proteice superior metotrexatului (42,26 ± 2,95%) şi 5-fluorouracilului (71,45 ±

2,17%). De altfel, compusul 3a a prezentat o activitate superioară

metotrexatului la toate concentraţiile testate (fig. 6.9).

Fig. 6.9. Influenţa derivaţilor dialchilaţi 3a-e asupra sintezei proteice în celule HeLa (3a-e=derivaţii dialchilaţi; M=martor; E=etopozidă; 5FU=5-fluorouracil; Mx=metotrexat)

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

30

b. Derivaţi monoalchilaţi

La 500 µg/mL, activitatea compuşilor 4a (73,52 ± 3,63) şi 4c (80,25 ± 5,51) a fost net superioară metotrexatului (42,26 ± 2,95%) şi 5-

fluorouracilului (71,45 ± 2,17%) (fig. 6.11).

Fig. 6.11. Influenţa derivaţilor monoalchilaţi 4a-c

asupra sintezei proteice în celule HeLa (4a-c=derivaţii monoalchilaţi; M=martor; E=etopozidă; 5FU=5-fluorouracil; Mx=metotrexat)

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

6.2.2.2. Efectele derivaţilor bromuraţi asupra sintezei

proteice În cazul derivaţilor bromuraţi 5a-e, s-a observat o activitate mai

pronunţată de inhibare a sintezei proteice celulare decât în cazul

derivaţilor dialchilaţi, motiv pentru care au fost testaţi şi la concentraţii mai mici.

Fig. 6.13. Influenţa derivaţilor bromuraţi 5a-e (200-500 µg/mL)

asupra sintezei proteice în celule HeLa (5a-e=derivaţii bromuraţi; M=martor; E=etopozidă; 5FU=5-fluorouracil; Mx=metotrexat)

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

31

Fig. 6.15. Influenţa derivaţilor bromuraţi 5a-e (25-100 µg/mL)

asupra sintezei proteice în celule HeLa (5a-e=derivaţii bromuraţi; M=martor; E=etopozidă; 5FU=5-fluorouracil; Mx=metotrexat)

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

6.2.2.3. Efectele sărurilor de cicloimoniu asupra sintezei

proteice

a. Săruri de piridaziniu Sărurile de piridaziniu au fost mai slab active decât derivaţii

dialchilaţi şi bromuraţi.

Fig. 6.17. Influenţa sărurilor de piridaziniu 7a-e asupra sintezei proteice în celule HeLa (7a-e=săruri de piridaziniu; M=martor; E=etopozidă; 5FU=5-fluorouracil; Mx=metotrexat)

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

b. Săruri de ftalaziniu

Sărurile de ftalaziniu s-au dovedit a fi mai active decât cele de piridaziniu.

32

Fig. 6.19. Influenţa sărurilor de ftalaziniu 9a-e asupra sintezei proteice în celule HeLa (9a-e=săruri de ftalaziniu; M=martor; E=etopozidă; 5FU=5-fluorouracil; Mx=metotrexat)

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

6.2.3. Efectele derivaţilor bromuraţi asupra altor linii

celulare tumorale umane



mamar MCF-7

La 10 µg/mL, derivatul 5c a fost cel mai activ, prezentând o

citotoxicitate de 65,87 ± 3,57%, fiind urmat de 5d (33,58 ± 2,31%), 5b (8,99 ± 5,13%), 5e (7,06 ± 2,30%) şi 5a (4,74 ± 2,91%).

Fig. 6.21. Citotoxicitatea derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de celulele tumorale MCF-7

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

33


alveolar A549

La 10 µg/mL, cel mai activ a fost derivatul 5c care a prezentat o

citotoxicitate de 42,63 ± 4,99%.

Fig. 6.22. Citotoxicitatea derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de celulele tumorale A549

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)


colorectal Caco2

La 10, 25 şi 50 µg/mL cel mai activ s-a dovedit a fi derivatul 5c care a prezentat o citotoxicitate de 35,05 ± 3,72%, 59,72 ± 4,40% şi

respectiv, 67,88 ± 5,03%.

Fig. 6.23. Citotoxicitatea derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de celulele tumorale Caco2

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

34

6.2.3.2.4. Efectele asupra celulelor de adenocarcinom de

prostată PC3

Asupra liniei celulare tumorale PC3, toţi derivaţii bromuraţi

testaţi au prezentat efecte citotoxice remarcabile. La 10 µg/mL toţi

compuşii au prezentat efecte citotoxice de peste 83%, iar la 100 µg/mL, de peste 90% (fig. 6.24).

Fig. 6.24. Citotoxicitatea derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de celulele tumorale PC3

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

6.2.3.3. Capacitatea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi



adenocarcinom mamar MCF-7

Activitatea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi 5a-e în celulele

MCF-7, după trei ore de incubare, a variat astfel:

H2O2 (100%) > 5e (24,24 ± 2,00%) > 5d (11,36 ± 1,50%) > 5b

(9,21 ± 0,90%) > 5c (7,07 ± 0,36%) > 5a (4,41 ± 1,35%).

.

35

Fig. 6.26. Activitatea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi 5a-e

în celulele tumorale MCF-7 (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

Rezultatele înregistrate sugerează faptul că reducerea viabilităţii celulelor MCF-7 nu se datorează creşterii stresului oxidativ intracelular.


adenocarcinom alveolar A549

Activitatea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi 5a-e, în

celulele A549, după trei ore de incubare, a variat după cum urmează:

H2O2 (100%) > 5e (69,62 ± 4,13%) > 5d (52,26 ± 3,12%) > 5b

(33,21 ± 3,13%) > 5a (21,95 ± 2,76%) > 5c (10,32 ± 1,15%).

În celulele tumorale A549, derivaţii bromuraţi 5a-e au determinat o creştere a nivelului intracelular de SRO, efectul fiind mai

pregnant pentru derivatul 5e.


în celulele tumorale A549 (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

36


adenocarcinom colorectal Caco2

Toţi derivaţii bromuraţi testaţi au prezentat o activitate pro-

oxidantă remarcabilă în celulele Caco2. Cei mai activi au fost derivaţii

5d (67,89 ± 2,17%) şi 5e (58,89 ± 3,11%), urmaţi de 5b (47,79 ± 3,78%), 5a (45,27 ± 2,11%) şi 5c (31,08 ± 0,90%).


în celulele tumorale Caco2 (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)


adenocarcinom de prostată PC3

În linia celulară tumorală PC3 efectele pro-oxidante ale

derivaţilor bromuraţi 5a-e au fost nesemnificative. După trei ore de incubare, au fost determinate nivele ale SRO de numai 4,04 ± 0,03 -

22,05 ± 1,18%.

Fig. 6.29. Activitatea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi 5a-e în celulele tumorale PC3

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

37

6.2.4. Efectele asupra celulelor epiteliale mamare normale,

imortalizate MCF-12F


Asupra liniei celulare normale, imortalizate MCF-12F, la

concentraţia de 10 µg/mL derivaţii bromuraţi 5a-e testaţi au prezentat o citotoxicitate scăzută (2,59 ± 1,84% - 11,94 ± 3,03%).

Fig. 6.30. Citotoxicitatea derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de celulele normale MCF-12F

(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

Efectele citotoxice ale derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de liniile

celulare MCF-7, A549, Caco2, PC3 şi MCF-12F, exprimate prin

valorile CI50 (µg/mL), sunt reprezentate grafic în fig. 6.31.

Fig. 6.31. Efectele citotoxice ale derivaţilor bromuraţi 5a-e

*CI50 < 10 µg/mL;** CI50 > 100 µg/mL

Toţi derivaţii bromuraţi 5a-e au fost foarte activi faţă de

celulele de adenocarcinom de prostată PC3 (CI50 < 10 µg/mL). Derivatul 5c a fost puternic citotoxic faţă de toate liniile celulare

38

tumorale testate (CI50 < 18,4 µg/mL). Efectele citotoxice cele mai

pronunţate (CI50 < 10 µg/mL) au fost determinate faţă de liniile celulare tumorale MCF-7 şi PC3. Trebuie remarcat faptul că acest derivat a

prezentat o citotoxicitate redusă faţă de celulele normale MCF-12F

(CI50 > 100 µg/mL).

39

CONCLUZII GENERALE. GRADUL DE ORIGINALITATE.

PERSPECTIVE DE CERCETARE

În urma studiilor efectuate, se desprind următoarele concluzii:

Fracţionarea extractelor metanolice din frunzele şi

rădăcinile speciei Paeonia mlokosewitschii Lomakin., prin diferite metode cromatografice (cromatografie pe coloană deschisă,

cromatografie pe coloană la presiune redusă, cromatografie preparativă

în strat subţire, cromatografie semipreparativă în fază lichidă de înaltă performanţă) a condus la izolarea a patru compuşi puri:

galat de metil (compus 1)

3-(3',5'-dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-dihidroxi-benzoat de metil (compus 2)

OO

HO

H

H

O

OO

OO

OA

B

C

D

OH

OH

HOOHHO

HO

HO

HO

HO

HO OH

OH

OH

H

O

E OH

OHHO

H 1

234

56

77

1'2'

3'

4'

5'

6'

di (2-etil-heptil) ftalat

(compus 3) penta-O-galoil-β-D-glucoză

(compus 4)

Structura acestor compuşi a fost stabilită prin spectrometrie de

rezonanţă magnetică nucleară (spectre unidimensionale 1H-RMN,

13C-

RMN, spectre bidimensionale 2D-COSY, 2D-HETCOR: de corelaţie directă HMQC şi de corelaţie la distanţă HMBC) şi spectrometrie de

masă prin ionizare chimică (modul pozitiv).

Galatul de metil şi penta-O-galoil-β-D-glucoza au fost izolaţi

anterior din alte specii vegetale în timp ce di (2-etil-heptil) ftalatul a fost

40

izolat din organismul marin Hippocampus kuda Bleeler. Studiul de faţă

este primul studiu care raportează izolarea acestor trei compuşi din specia Paeonia mlokosewitschii Lomakin..

În literatura de specialitate consultată nu au fost găsite

informaţii privind prezenţa compusului 2 (3-(3',5'-dihidroxibenzoiloxi)-

4,5-dihidroxibenzoatul de metil) în specia studiată sau în alte specii vegetale.

Prin sinteză, s-au obţinut 31 de analogi structurali cu nucleu

acetofenonic:

derivaţi alchilaţi

derivaţi dialchilaţi 3a-e

- 2', 4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (3a);

- 2', 5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (3b);

- 2', 6'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (3c); - 3', 4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (3d);

- 3', 5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (3e).

derivaţi monoalchilaţi 4a-c

- 2'-hidroxi-4'-(2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (4a);

- 2'-hidroxi-5'-(2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (4b); - 2'-hidroxi-6'-(2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (4c).

derivaţi bromuraţi dialchilaţi 5a-e

- 2-bromo-2', 4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (5a);

- 2-bromo-2', 5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (5b);

- 2-bromo-2', 6'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (5c); - 2-bromo-3', 4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (5d);

- 2-bromo-3', 5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona (5e).

41

bromuri de cicloimoniu

bromuri de piridaziniu 7a-e

- bromură de N-(2-(2',4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)

piridaziniu (7a);

- bromură de N-(2-(2',5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-piridaziniu (7b);

- bromură de N-(2-(2',6'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-

piridaziniu (7c);

- bromură de N-(2-(3',4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-piridaziniu (7d);


piridaziniu (7e).

bromuri de ftalaziniu 9a-e


ftalaziniu (9a); - bromură de N-(2-(2',5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-

ftalaziniu (9b);


ftalaziniu (9c); - bromură de N-(2-(3',4'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-

ftalaziniu (9d);

- bromură de N-(2-(3',5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)fenil)-2-oxo-etil)-ftalaziniu (9e).

cloruri de cicloimoniu

cloruri de imidazoliu 13a,b, 15a,b

42

- clorură de N-(2-(3',4'-bis (2-cloro-acetat)-fenil)-2-oxo-etil)-N-

propionitril-imidazolil (13a);

- clorură de N-(2-(3',4'-bis (4-cloro-butanoat)-fenil)-2-oxo-etil)-N-

propionitril-imidazolil (13b); - clorură de N-(2-(3',4'-bis (2-cloro-acetat)-fenil)-2-oxo-etil)-N-

propionitril-benzimidazolil (15a);

- clorură de N-(2-(3',4'-bis (4-cloro-butanoat)-fenil)-2-oxo-etil)-N-propionitril-benzimidazolil (15b).

cloruri de piridaziniu 17a,b

- clorură de 3-(4-cloro-fenil)-N-(2-(3',4'-bis (2-cloro-acetat)-fenil)-2-

oxo-etil)-piridaziniu (17a);

- clorură de 3-(4-cloro-fenil)-N-(2-(3',4'-bis (4-cloro-butanoat)-fenil)-2-

oxo-etil)-piridaziniu (17b).

cloruri de pirimidiniu 19a,b

- clorură de 3-(4-cloro-fenil)-N-(2-(3',4'-bis (2-cloro-acetat)-fenil)-2-

oxo-etil)-pirimidiniu (19a);

43

- clorură de 3-(4-cloro-fenil)-N-(2-(3',4'-bis (4-cloro-butanoat)-fenil)-2-

oxo-etil)-pirimidiniu (19b).

Cu excepţia sării 15b, toţi derivaţii sintetizaţi sunt substanţe

originale, sinteza acestora nefiind raportată în literatura de specialitate.

Structura derivaţilor sintetizaţi a fost dovedită prin: analiză elementală, analiză spectrală în infraroşu, spectrometrie de rezonanţă

magnetică nucleară (1H-RMN,

13C-RMN şi spectre bidimensionale 2D-

COSY, 2D-HETCOR) şi spectrometrie de masă cu ionizare chimică (modul pozitiv). Toate aceste analize au confirmat structurile propuse.

Activitatea antimicrobiană a compusului 2 (3-(3',5'-

dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-dihidroxi-benzoatul de metil), izolat din

frunzele şi rădăcinile de Paeonia mlokosewitschii Lomakin., a fost evaluată numai calitativ prin metoda difuzimetrică. Acesta a fost

inactiv faţă de bacteriile Gram-pozitive şi fungii patogeni testaţi. În

schimb, a prezentat activitate antibacteriană bună faţă de bacteriile Gram-negative Escherichia coli ATCC 25922 (d = 15 ± 0 mm) şi

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (d = 14,66 ± 0,57 mm).

Activitatea antimicrobiană a analogilor structurali cu

nucleu acetofenonic sintetizaţi a fost evaluată atât calitativ prin

metoda difuzimetrică, cât şi cantitativ prin metoda microdiluţiilor în

bulion. Aceştia au prezentat, în general, o activitate antibacteriană bună

atât faţă de bacteriile Gram-pozitive, cât şi faţă de bacteriile Gram-negative care a variat astfel:

faţă de Staphylococcus aureus ATCC 25923:

5e (CMI = 0,31 mg/mL; CMB = 0,62 mg/mL) > 5a (CMI =

0,62 mg/mL; CMB = 2,5 mg/mL) > 3c, 4b, 5b, 5c, 5d, 7e (CMI = 1,25 mg/mL; CMB = 2,5 mg/mL) > 3a, 9c (CMI = 2,5

mg/mL; CMB = 5 mg/mL);

faţă de Sarcina lutea ATCC 9341:

5e (CMI = 0,31 mg/mL; CMB = 0,62 mg /mL) > 3a, 3c, 4b, 5c, 5d, 7e, 9c (CMI = 0,64 mg/mL; CMB = 1,25 mg/mL) > 5a, 5b

(CMI = 0,64 mg/mL; CMB = 2,5 mg/mL);

faţă de Bacillus cereus ATCC 14579:

5e (CMI = 0,31 mg/mL; CMB = 0,62 mg/mL) > 5b, 5d (CMI =

0,62 mg/mL; CMB = 1,25 mg/mL) > 4b, 5a, 7e (CMI = 1,25 mg/mL; CMB = 2,5 mg/mL) > 3a, 9c (CMI = 1,25 mg/mL;

44

CMB = 5 mg/mL) > 3c, 5c (CMI = 2,5 mg/mL; CMB = 5

mg/mL);

faţă de Bacillus subtilis:

5e (CMI = 0,62 mg/mL; CMB = 0,62 mg/mL) > 5d (CMI =

0,62 mg/mL; CMB = 1,25 mg/mL) > 3a, 4b, 5a, 5b, 5c (CMI =

1,25 mg/mL; CMB = 2,5 mg/mL) > 9c (CMI = 2,5 mg/mL;

CMB = 5 mg/mL);

faţă de Escherichia coli ATCC 25922:


1,25 mg/mL; CMB = 2,5 mg /mL) > 4b, 5a, 5b, 5c, 5d (CMI =

1,25 mg/mL; CMB = 1,25 mg/mL) > 3c, 7e, 9c (CMI = 2,5 mg/mL; CMB = 5 mg/mL);

faţă de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853:


1,25 mg/mL; CMB = 2,5 mg/mL) > 3c, 5a, 5b, 5c, 5d, 7e (CMI

= 2,5 mg/mL; CMB = 5 mg/mL) > 4b, 9c (CMI = 2,5 mg/mL; CMB = 10 mg/mL).

Dintre derivaţii sintetizaţi, derivatul bromurat 5e a fost cel mai

activ faţă de toate microorganismele testate. Trebuie menţionate efectele sale bactericide faţă de Escherichia coli ATCC 25922 şi

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, bacterii Gram-negative

rezistente la acţiunea antibioticelor datorită prezenţei lipopolizaharidelor în peretele celular.

Derivatul dialchilat 3a a prezentat, de asemenea, activitate

antibacteriană bună faţă de Escherichia coli ATCC 25922 şi

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, dar şi faţă de Sarcina lutea ATCC 9341.

Derivaţii sintetizaţi au prezentat activitate antifungică slabă faţă

de Candida albicans ATCC 10231 care a variat astfel:

3a, 4b, 5a, 5b, 5d, 5e (CMI = 1,25 mg/mL; CMF = 2,5 mg/mL)

> 3c, 9c (CMI = 1,25 mg/mL; CMF = 5 mg/mL) > 5c, 7e (CMI = 2,5

mg/mL; CMF = 5 mg/mL).

Evaluarea potenţialului antitumoral al compusului 2 (3-(3',5'-

dihidroxi-benzoil-oxi)-4,5-dihidroxi-benzoatul de metil), izolat din

frunzele şi rădăcinile de Paeonia mlokosewitschii Lomakin., s-a realizat

prin studiul influenţei asupra viabilităţii celulelor de adenocarcinom

45

cervical HeLa (metoda MTT). Compusul nu a prezentat activitate

citotoxică.

Potenţialul antitumoral al analogilor structurali cu nucleu

acetofenonic sintetizaţi a fost evaluat prin studiul efectelor acestora

asupra sintezei proteice în celule HeLa, viabilităţii celulelor HeLa,

MCF-7 (adenocarcinom mamar), A549 (adenocarcinom alveolar), Caco2 (adenocarcinom colorectal), PC3 (adenocarcinom de prostată) şi

stresului oxidativ în celulele MCF-7, A549, Caco2 şi PC3. De

asemenea, s-a testat şi potenţialul citotoxic faţă de celule normale, imortalizate MCF-12F.

Toţi derivaţii sintetizaţi au inhibat sinteza proteică în celulele

HeLa dependent de concentraţie. Activitatea de inhibare a sintezei

proteice a variat astfel:

5-fluorouracil (CI50 = 17,2 ± 3,8 µg/mL) > etopozidă (CI50 =

19,3 ± 2,1 µg/mL) > 5c (CI50 = 30,9 ± 7,2 µg/mL) > 5a (CI50 = 41,5 ±

1,3 µg/mL) > 5e (CI50 = 64,6 ± 8,0 µg/mL) > 5b (CI50 = 101,8 ± 9,1 µg/mL) > 5d (CI50 = 203,4 ± 11,6 µg/mL) > 4c (CI50 = 221,7 ± 48,4

µg/mL) > 9c (CI50 = 343,1 ± 10,2 µg/mL) > 3a (CI50 = 364,3 ± 17,5

µg/mL) > 3e (CI50 = 380,6 ± 15,3 µg/mL) > 3b (CI50 = 380,8 ± 16,7 µg/mL) > 4a (CI50 = 412,8 ± 15,2 µg/mL) > 9d (CI50 = 432,0 ± 7,3

µg/mL) > 3c (CI50 = 442,4 ± 27,7 µg/mL) > 9a (CI50 = 459,3 ± 5,5

µg/mL) > 4b (CI50 = 462,6 ± 15,5 µg/mL) > 9e (CI50 = 468,9 ± 13,7

µg/mL) > 3d (CI50 = 486,7 ± 18,0 µg/mL).

Deoarece derivaţii bromuraţi 5a-e au fost cei mai activi în testul

de inhibare a sintezei proteice în celulele HeLa (CI50 = 30,9 ± 7,2 –

203,4 ± 11,6 µg/mL), a fost testată citotoxicitatea lor faţă de alte linii celulare tumorale umane, precum şi faţă de o linie celulară normală.

Activitatea citotoxică a derivaţilor bromuraţi 5a-e a variat

astfel:

faţă de celulele MCF-7:

5c (CI50 < 10 µg/mL) > 5d (CI50 = 29,66 ± 2,24 µg/mL) > 5b

(CI50 = 33,20 ± 1,22 µg/mL) > 5a (CI50 = 52,33 ± 3,64 µg/mL) > 5e

(CI50 = 67,03 ± 1,38 µg/mL);

faţă de celulele A549:

5c (CI50 = 11,80 ± 0,89 µg/mL > 5d (CI50 = 36,30 ± 1,28 µg/mL) > 5b (CI50 = 41,50 ± 1,55 µg/mL) > 5e (CI50 = 59,86 ± 2,45

µg/mL) > 5a (CI50 = 60,93 ± 1,30 µg/mL);

46

faţă de celulele Caco2:

5c (CI50 = 18,40 ± 4,70 µg/mL) > 5e (CI50 = 64,50 ± 6,69

µg/mL) > 5d (CI50 = 69,46 ± 7,43 µg/mL) > 5b (CI50 = 76,16 ± 1,88 µg/mL) > 5a (CI50 = 84,50 ± 1,14 µg/mL);

Faţă de celulele PC3, toţi derivaţii bromuraţi 5a-e au prezentat

o citotoxicitate semnificativă de peste 80% la concentraţii de numai 10

µg/mL.

Deoarece efectele pro-oxidante pot explica, cel puţin parţial,

acţiunea citotoxică a multor substanţe, au fost evaluate efectele pro-

oxidante ale derivaţilor bromuraţi 5a-e în celulele MCF-7, A549, Caco2 şi PC3. Acţiunea pro-oxidantă a derivaţilor bromuraţi 5a-e (100

µg/mL), după trei ore de incubare, a variat astfel:

faţă de celulele MCF-7:

5e (24,24 ± 2,00%) > 5d (11,36 ± 1,50%) > 5b (9,21 ± 0,90%)

> 5c (7,07 ± 0,36%) > 5a (4,41 ± 1,35%);

faţă de celulele A549:

5e (69,62 ± 4,13%) > 5d (52,26 ± 3,12%) > 5b (33,21 ± 3,13%)

> 5a (21,95 ± 2,76%) > 5c (10,32 ± 1,15%);

faţă de celulele Caco2:

5d (67,89 ± 2,17%) > 5e (58,89 ± 3,11%) > 5b (47,79 ± 3,78%) > 5a (45,27 ± 2,11%) > 5c (31,08 ± 0,90%);

faţă de celulele PC3:

5e (22,05 ± 1,18%) > 5d (15,58 ± 2,07%) > 5b (11,64 ± 2,01%)

> 5a (7,25 ± 0,87%) > 5c (4,04 ± 0,03%).

Este evident faptul că, în cazul celulelor Caco2, unul din

mecanismele prin care derivaţii bromuraţi 5a-e reduc viabilitatea

celulară este creşterea stresului oxidativ intracelular (31,08 ± 0,90% -

67,89 ± 2,17%). Un efect similar a fost observat şi pentru derivaţii bromuraţi 5d şi 5e faţă de celulele A549 (52,26 ± 3,12% şi respectiv,

69,62 ± 4,13%). Citotoxicitatea derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă de

celulele MCF-7 şi PC3, precum şi a derivaţilor 5a-c faţă de celulele A549 este datorată, în principal, altor mecanisme decât creşterea

stresului oxidativ intracelular.

47

Faţă de celulele normale, imortalizate MCF-12F, cel mai puţin

nociv s-a dovedit a fi derivatul 5c care, la 100 μg/mL, a prezentat o citotoxicitate de numai 10,77±2,14%.

Un candidat promiţător pentru studiile in vivo este derivatul

bromurat 5c care a prezentat o citotoxicitate ridicată faţă de celulele

tumorale (CI50 < 10 µg/mL faţă de celulele MCF-7 şi PC3; CI50 = 11,80 ± 0,89 µg/mL faţă de celulele A549; CI50 = 18,4 ± 4,7 µg/mL faţă de

celulele Caco2) fiind mai puţin toxic faţă de celulele normale MCF-12F

(activitate citotoxică de numai 10,77 ± 2,14% la 100 µg/mL; CI50 > 100 µg/mL).

De remarcat este şi derivatul 5d care a prezentat o citotoxicitate

pronunţată faţă de celulele tumorale (CI50 < 10 µg/mL faţă de celulele

PC3; CI50 = 29,66 ± 2,24 µg/mL faţă de celulele MCF-7; CI50 = 36,30 ± 1,26 µg/mL faţă de celulele A549; CI50 = 69,46 ± 7,43 µg/mL faţă de

celulele Caco2) afectând, în măsură mai mică, viabilitatea celulelor

normale MCF-12F (CI50 = 95,30 ± 2,08 µg/mL).

Gradul de originalitate. Perspective de cercetare

Originalitatea tezei de doctorat constă în:

investigarea chimică şi biologică a unei specii (Paeonia

mlokosewitschii Lomakin.) care nu a fost studiată până în

prezent şi, ca urmare, nu este încă valorificată în terapeutică;

izolarea unor compuşi puri din frunze şi rădăcini a căror

prezenţă în specia studiată nu a mai fost menţionată; elucidarea

structurii acestor compuşi prin spectrometrie de masă şi

spectrometrie de rezonanţă magnetică nucleară: 1H-RMN,

13C-

RMN, spectre bidimensionale 2D-COSY şi 2D-HETCOR;

sinteza a 31 de analogi structurali cu nucleu acetofenonic,

dintre care 30 sunt substanţe originale a căror sinteză nu a mai

fost raportată în literatura de specialitate; caracterizarea fizico-

chimică şi spectrală a derivaţilor sintetizaţi (analiza elementală, analiză spectrală în infraroşu, spectrometrie de masă şi

spectrometrie de rezonanţă magnetică nucleară: 1H-RMN,

13C-

RMN, spectre bidimensionale 2D-COSY şi 2D-HETCOR);

evidenţierea, pentru derivatul bromurat de sinteză 5e (2-bromo-

3', 5'-bis (2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona), a unor efecte

bactericide faţă de bacteriile Gram-negative Escherichia coli

ATCC 25922 şi Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;

48

evidenţierea, pentru derivatul de sinteză 5c (2-bromo-2', 6'-bis

(2-metoxi-2-oxo-etoxi)-acetofenona), a unor efecte citostatice/

citotoxice faţă de mai multe linii celulare tumorale umane (HeLa, MCF-7, A549, Caco2, PC3) însoţite de o toxicitate

scăzută faţă de linia celulară normală umană MCF-12F.

Perspective de cercetare Rezultatele obţinute în cadrul acestei teze de doctorat justifică

continuarea studiilor în următoarele direcţii:

studiul in vitro al citotoxicităţii derivaţilor bromuraţi 5a-e faţă

de alte linii celulare tumorale umane;

elucidarea mecanismului acţiunii antitumorale a derivaţilor

bromuraţi 5a-e; investigarea capacităţii lor de a induce

apoptoza în diferite linii celulare tumorale umane;

studiul acţiunii antitumorale şi toxicităţii derivaţilor bromuraţi

5a-e, în special a derivaţilor 5c şi 5d (modele experimentale

animale);

studiul potenţialului antimicrobian şi toxicităţii derivatului 5e

(modele experimentale animale);

izolarea altor compuşi puri din frunzele şi rădăcinile de Paeonia

mlokosewitschii Lomakin., dar şi alte părţi ale plantei;

evaluarea, dependent de particularităţile structurale, a unor

efecte biologice ale compuşilor izolaţi şi elucidarea mecanismelor de acţiune;

obţinerea, prin sinteză, de analogi structurali ai compuşilor

izolaţi cu activitate biologică superioară şi toxicitate redusă.

49

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Yoshikawa M, Harada E, Minematsu T et al. Absolute

stereostructures of paeonisothujones, a novel skeletal monoterpene

ketone, and deoxypaeonisuffrone, and isopaeonisuffral, two new

monoterpenes, from Moutan Cortex. Chem Pharm Bull 1994; 42 (3): 736-738.

2. Murakami N, Saka M, Shimada H et al. New bioactive

monoterpene glycosides from Paeonia Radix. Chem Pharm Bull 1996; 44 (6): 1279-1281.

3. Wu SH, Luo XD, Ma YB et al. Monoterpenoid derivatives from

Paeonia delavayi. J of Asian Nat Prod 2002; 4 (2): 135-140.

4. Liu JK, Ma YB, Wu DG et al. Paeonilide, a novel anti-PAF-active monoterpenoid-derived metabolite from Paeonia delavayi. Biosci

Biotehnol Biochem 2000; 64 (7): 1511-1514.

5. Ding HY, Wu YC, Lin HC et al. Glycosides from Paeonia suffruticosa. Chem Pharm Bull 1999; 47 (5): 652-655.

6. Tanaka T, Kataoka M, Tsuboi N et al. New monoterpene glycoside

esters and phenolic constituents of Paeoniae Radix, and increase of water solubility of proanthocyanidins in the presence of

paeoniflorin. Chem Pharm Bull 2000; 48 (2): 201-207.

7. An RB, Kim HC, Lee SH et al. A new monoterpene glycoside and

antibacterial monoterpene glycosides from Paeonia suffruticosa. Arch Pharm Res 2006; 29 (10): 815-820.

8. Yoshikawa M, Uchida E, Kawaguchi A et al. Galoil-

oxipaeoniflorin, suffruticosides A, B, C and D, five new antioxidative glycosides, and suffruticoside E, a paeonol glycoside,

from Chinese Moutan Cortex. Chem Pharm Bull 1992; 40 (8):

2248-2250. 9. Lin HC, Ding HY, Wu YC. Two novel compounds from Paeonia

suffruticosa. J Nat Prod 1998; 61 (3): 343-346.

10. Sarker SD, Whiting P, Dinan L. Identification and ecdysteroid

antagonist activity of three resveratrol trimers (suffruticosols A, B and C) from Paeonia suffruticosa. Tetrahedron 1999; 55 (2): 513-

524.

11. Kwon OG, Kim SH, Chun BY et al. Isolation of antimicrobial components from moutan cortex. Kor J Pharmacogn 1999; 30 (3):

340-344.

12. Papandreou V, Magiatis P, Kalpoutzakis E et al. Paeonicluside, a

new salicylic glycoside from the Greek endemic species Paeonia clusii. Naturforsch C 2002; 57 (3-4): 235 238.

50

13. Ishida H, Takamatsu M, Tsuji K et al. Studies on active substances

in herbs used for oketsu ("stagnant blood") in Chinese medicine. VI. On the anticoagulative principle in Paeoniae Radix. Chem

Pharm Bull 1987; 35: 849-852.

14. Lin HC, Ding HY, Ko FN et al. Aggregation inhibitory activity of

minor acetophenons from Paeonia species. Planta Med 1999; 65: 595-599.

15. Tsuda T, Sugaya A, Ohguchi H et al. Protective effects of peony

root extract and its components on neuron damage in the hippocampus induced by the cobalt focus epilepsy model. Exp

Neurol 1997; 146: 518-525.

16. Nagasawa H, Iwabuchi T, Inatomi H. Protection by tree-peony

(Paeonia suffruticosa Andr.) of obesity in (SLNxC3H/He) F1 obese mice. In vivo 1991; 5: 115-118.

17. Sakai Y, Nagase H, Ose Y et al. Inhibitory action of paeony root

extract on the mutagenicity of benzo[a]pyrene. Mutat Res 1990; 244: 129-134.

18. Sun GP, Wang H, Xu SP et al. Anti-tumor effects of paeonol in

HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production. Eur J

Pharmacol 2008; 584: 246-252.

19. Wan XA, Sun GP, Wang H et al. Synergistic effect of paeonol and

cisplatin on oesophageal cancer cell lines. Digest Liver Dis 2008; 40: 531-539.

20. Kim SA, Lee HJ, Ahn KS et al. Paeonol exerts anti-angiogenic and

anti-metastasic activities through downmodulation of Akt activation and inactivation of matrix metalloproteinases. Biol Pharm Bull

2009; 32: 1142-1147.

21. Wang H, Zhou H, Wang CX et al. Paeoniflorin inhibits growth of human colorectal carcinoma HT 29 cells in vitro and in vivo. Food

Chem Toxicol 2012; 50 (5): 1560-1567.

22. Hu S, Sun W, Wei W et al. Involvement of the prostaglandin E

receptor EP2 in paeoniflorin-induced human hepatoma cell apoptosis. Anticancer Drugs 2013; 24 (2): 140-149.

23. Lee HJ, Kim SA, Lee HJ et al. Paeonol oxime inhibits bFGF-

induced angiogenesis and reduces VEGF levels in fibrosarcoma cells. PloS ONE 2010; 5 (8): 1-9.

24. Nelson AR, Fingleton B, Rothenberg ML et al. Matrix

metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J

Clin Oncol 2000; 18: 1135-1149.

51

25. Coussens LM, Fingleton B, Matrisian LM. Matrix

metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science 2002; 295: 2387-2392.

26. Appelmann I, Liersch R, Kessler T et al. Angiogenesis inhibition in

cancer therapy: platelet-derived growth factor (PDGF) and vascular

eddothelial growth factor (VEGF) and their receptors: biological functions and role in malignancy. Recent Results Cancer Res 2010;

180: 51-81.

27. Kim SJ, Jin M, Lee E et al. Effects of methyl gallate on arachidonic acid metabolizing enzymes: cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase

in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2006;

29: 874-878.

28. Choi JG, Kang OH, Lee YS et al. Antibacterial activity of methyl gallate isolated from Galla Rhois or carvacrol combined with

nalidixic acid against nalidixic acid resistant bacteria. Molecules

2009; 14: 1773-1780. 29. Lee SH, Kim JK, Kim DV et al. Antitumor activity of methyl

gallate by inhibition of focal adhesion formation and Akt

phosphorylation in glioma cells. Biochimica et Biophisica Acta 2013; 1830: 4017-4029.

30. Li Y, Qian ZJ, Kim SK. Cathepsin B inhibitory activities of three

new phthalate derivatives isolated from seahorse, Hippocampus

kuda Bleeler. Bioorg Med Chem Let 2008; 18: 6130-6134. 31. De Leon GP, Elowe NH, Koteva KP et al. An in vitro screen of

bacterial lipopolysaccharide biosynthetic enzymes identifies an

inhibitor of ADP-heptose biosynthesis. Chem Biol 2006; 13: 437-441.

32. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and

survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63.

33. Leiter J, Abbott BJ, Schepartz SA. Screening data from the cancer

chemotherapy national service center screening laboratoires. XXII.

Cancer Res 1965; 25: 1-206. 34. Takimoto CH. Anticancer drug development at the US National

Cancer Institute. Cancer Chemoter Pharmacol 2003; 52 (1): 29-33.

35. Roşu C, Aprotosoaie AC, Rotinberg P et al. The biochemical investigations of some claviceps purpurea bioproducts and their in

vitro citostatic potential. Farmacia 2011; 59 (5): 713-720.

36. Srivastava V, Negi AS, Kumar JK et al. Plant-based anticancer

molecules: a chemical and biological profile of some important leads. Bioorg Med Chem 2005; 13: 5892-5902.

52

37. Winnicka K, Bielawski K, Bielawska A. Cardiac glycosides in

cancer research and cancer therapy. Acta Pol Pharm 2006; 63 (2):109-115.

38. Longley DB, Harkin DP, Johnston PG. 5-Fluorouracil: mechanisms

of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer 2003; 3 (5):330-

338. 39. Segal R, Yaron M, Tartakovsky B. Methotrexate: mechanism of

action in rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum 1990; 20 (3):

190-200. 40. Zheng WY, Nie SP, Li WJ et al. Stimulatory effects of genistein

and quercetin on the proliferation of Mcf-7 cells. Food Biosci 2013;

2: 15-23

41. Han H, Sangeeta R, Mehendale C et al. Cisplatin's tumoricidal effect on human breast carcinoma MCF-7 cells was not attenuated

by American ginseng. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59 (3):

369–374. 42. Germain C, Niknejad N, Ma L et al. Cisplatin induces cytotoxicity

through the mitogen-activated protein kinase pathways and

activating transcription factor 3. Neoplasia 2010; 12 (7): 527–538. 43. Takeshi M, Takeshi Y. Simultaneous treatment of cancer cells lines

with the anticancer drug cisplatin and the antioxidant fucoxanthin.

British Journal of Pharmacology and Toxicology 2011; 2 (3): 127-

131. 44. Manuel M, Mario DC. Oxidative stress and diseases Rijeka:

InTech, 2012, 497-520.

45. Hahn WC, Meyerson M. Telomerase activation, cellular immortalization and cancer. Ann Med 2001; 33 (2): 123-129.

46. Aranda A, Sequedo L, Tolosa L et al. Dichloro-dihydro-fluorescein

diacetate (Dcfh-Da) assay: A quantitative method for oOxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicol In Vitro

2013; 27 (2): 954-963.

53

LISTĂ DE ARTICOLE PUBLICATE DIN TEMATICA

TEZEI DE DOCTORAT

Articole ştiinţifice publicate în reviste cotate ISI

1. Zbancioc Ana Maria, Miron Anca, Tuchiluş Cristina,

Rotinberg Pincu, Mihai Cosmin Teodor, Mangalagiu Ionel,

Zbancioc Gheorghiţă. Synthesis and in vitro analysis of novel dihydroxyacetophenone derivatives with antimicrobial and

antitumoral activities. Med Chem 2014; 10, acceptată spre

publicare. (FI=1,373)

2. Zbancioc Ana Maria, Miron Anca, Moldoveanu Costel, Zbancioc Gheorghiţă. Imidazolium Salts with

Dihydroxyacetophenone Skeleton with Anticipated Anticancer

Activity. Part II. Rev Chim 2013; 64 (6): 584-586. (FI=0,538)

3. Zbancioc Ana Maria, Zbancioc Gheorghiţă, Tănase Cătălin,

Miron Anca, Mangalagiu Ionel. Design, synthesis and in vitro

anticancer activity of a new class of dual DNA intercalators. Lett Drug Des Discov 2010; 7: 644-649. (FI=0,668)

4. Zbancioc Gheorghiţă, Zbancioc Ana-Maria, Mantu Dorina,

Miron Anca, Tanase Cătălin, Mangalagiu Ionel. Ultrasounds assisted synthesis of highly functionalized acetophenone

derivatives in heterogeneus catalysis. Rev Roum Chim 2010; 55

(11-12): 983-987. (FI=0,311)

Lucrări prezentate la conferinţe de specialitate naţionale şi

internaţionale apărute în rezumat

1. Zbancioc Ana Maria, Tătărînga Gabriela, Jităreanu Alexandra,

Rotinberg Pincu, Cosmin Teodor Mihai, Zbancioc Gheorghiţă,

Mangalagiu Ionel, Miron Anca. New compounds with acetophenone skeleton: synthesis and anticancer activity.

Proceedings la al 13-lea Panthellenic Pharmaceutical Congress,

Atena, Grecia, 2013.

2. Zbancioc Ana Maria, Tătărîngă Gabriela, Jităreanu Alexandra,

Miron Anca, Mangalagiu Ionel. Noi derivaţi de acetofenonă cu

citotoxicitate selectivă, "50 de ani de Învăţământ Universitar Farmaceutic", Iaşi: Ed. Grigore T. Popa, 2011; 172-174.

compuŞi din specii ale genului paeonia l. Şi … doctorat/rezumat...asist. univ. ana maria balan...

Documents