Slide 1

Sinteza chimic a oligonucleotidelorLab 10CUPRINSSinteza chimic a oligonucleotidelorModificri chimice ale oligonucleotidelorMecanismul de aciuneConceptul antisensActivarea RN-azei HConceptul de triplu helixARN-ul de interferen ( ARNi)

Acizii nucleici conin toate informaiile despre viaa fiecrei plante i fiecarui animal. Acizi nucleici sunt parte a fiecrei celule sau fiine vii. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) este format din dou lanuri dublu catenare de nucleotide.

Nucleotidele sunt compuse dintr-o parte glucidic (riboza pentru acidul ribonucleic (ARN) i 2-dezoxiriboza pentru a ADN), o grupare fosfat i o baz azotat. n general, doar patru baze azotate diferite pot fi gsite n ADN i ARN. Acestea sunt adenina, guanina, citozina i timina n ADN, i uracil n loc de timin n ARN. Lanurile de nucleotide, numite oligonucleotide sunt dublu catenare n nucleu. Aceste lanuri dublu catenare sunt meninute mpreun n principal, datorit legturilor de hydrogen dintre bazele azotate. Perechile de baze sunt ntotdeauna guanin-citozin i adenin- timin (uracil) (Informaiile nmagazinate n ADN trebuie s fie traduse n proteine. Prin urmare ADN-ul, trebuie mai nti s fie transcris n ARN mesager (ARNm), care prsete nucleul.ARNm va fi tradus n proteine la nivelul ribozomilor. Toate aceste procese sunt posibile puncte de atac ale medicamentelor bazate pe acizi nucleici. Mai multe concepte sau mecanisme de aciune ale medicamentelor pe baz de acizi nucleici sunt acum n curs de investigare. Cel mai important este conceptul antisens Alte concepte n curs de investigare sunt conceptul triplului helix (triplex), conceptul ARN-ului de interferen (ARNi) i conceptul ribozimelor ca medicamente. Oligonucleotidele sunt molecule cu lan lung construite n orice ordine a secvenei nucleotidelor. Sinteza chimic const n condensarea individual a nucleotidelor pn cnd secvena i lungimea cerut este atins. Nu este important pentru sintez dac nucleotidele sunt ADN, ARN sau blocuri modificate construite. Condiiile de reacie difer numai n ceea ce privete timpii de reacie i alegerea agenilor activatori. Sinteza oligonucleotidelor n faz solid a fost dezvoltat de Letsinger n 1975.Sinteza chimic a oligonucleotidelorPrincipalul avantaj al sintezei nucleotidelor n faz solid este c purificarea este implicat doar dup ultima etap de sintez, i nu dup fiecare reacie. n plus, este posibil s se sintetizeze mai mult de un oligonucleotid, n acelai timp cu un oligonucleotid sintetizator. De-a lungul ultimilor 25 de ani au fost puse la punct mai multe metode de sintez a oligonucleotidelor. Pentru fiecare metod este necesar producerea unor blocuri de nucleotide cu grupuri diferite de protecie. Aceste metode sunt: metoda fosfordiester, metoda fosfortriester, metoda fosfonat H i metoda fosforamidat. n zilele noastre, numai metoda pe baz de fosforamidai joac un rol important n sinteza n faz solid a oligonucleotidelorPrimul nucleotid fixat pe suport solid, este deprotejat/descoperit n poziia 5', cu ajutorul acidului tricloroacetic (TCA). Apoi, urmtorul bloc construit este adugat, activat cu un activator i cuplat la primul nucleotid. Tetrazolul sau un derivat al su este folosit ca un activator n cele mai multe cazuri. Gruprile hidroxil nereactive sunt acoperite cu anhidrid acetic, pentru a opri construirea lanului de la aceast poziie, i acoperirea evit sinteza de secvene nedorite. Dimerul cuplat este oxidat de un amestec de iod i ap Sinteza poate fi oprit dup acest pas sau nucleotidul final din lan poate fi descoperit pentru a ncepe un nou ciclu de cuplareToate grupurile de protecie, sunt clivate dup sfritul sintezei oligonucleotidului dorit. Purificarea poate fi realizat prin cromatografie lichid de inalt performan (HPLC) sau prin electroforez n gel. O alt posibilitate de a obine oligonucleotide este sinteza enzimatic, n special pentru oligonucleotidele lungi. Sinteza enzimatic utiliznd uniti construite modificat sunt o alternativ viabil la sinteza chimic. ncorporarea enzimatic a nucleotidelor trifosfat naturale sau modificate adecvat de ARN polimerazele bacteriofagilor (de exemplu T7) a fost folosit cu succes, dei aceast abordare este limitat de acceptarea polimerazei pentru zaharuri, scheletul de susinere al moleculei sau modificri ale bazei.Modificri chimice ale oligonucleotidelorn aceast subcapitol vom evidenia structura chimic i proprietile oligonucleotidelor derivate. Diversitatea chimic a structurii oligonucleotidelor naturale este necesar pentru a face aceste substane utile n sistemele biologice.Condiiile necesare pentru ca medicamentele pe baz de acizi nucleici s fie bune sunt urmtoarele:trebuie s fie suficient de stabile mpotriva nucleazelor din ser i din celule; ar trebui s intre n diferite organe din corp, iar dup distribuirea n esutul dorit, acestea trebuie s fie capabile s penetreze membrana celular pentru a ajunge la nivelul situsului lor de aciune; trebuie s formeze complexe Watson-Crick sau Hoogsteen stabile cu secvene int complementare sau complexe n condiii fiziologice.S-au efectuat modificri la nivelul scheletului moleculei, prin modificri ale zaharurilor sau substituia la nivelul prii fosfat, precum i ncorporarea bazelor azotate care sunt substituite sau complet schimbate. De asemenea, ar trebui s fie menionate: ncorporarea conjugailor la captul 3' sau 5' , precum i acizii nucleici ce modific complet scheletul macromoleculei ca acizii nucleici peptidici (ANPs) sau acizi nucleici inaccesibili (ANLs). n ultimii ani toi aceti acizi nucleici modificai au fost sintetizai i testai. Oligonucleotidele nemodificate sunt larg utilizate ca instrumente n biologia molecular. Cu toate acestea, n experimentele celulare i animale s-a observat c oligonucleotidele cu un fosfodiester natural internucleozid legat sunt degradate n ser n decurs de cteva ore, n principal, prin aciunea rapid a 3' exonucleazelor de clivare care sunt nsoite de endonucleaze de clivare lente. De asemenea, n anumite esuturi a fost observat o activitate semnificativ 5'-exonucleazic. Oligonucleotidele modificate chimic vor fi descrise n urmtoarele seciuni.Mecanismul de aciunenc de la descoperirea structurii ADN-ului de ctre Watson i Crick n 1953, mai multe idei diferite despre mecanismele de aciune ale medicamentelor pe baz de acizi nucleici au fost dezvoltate. Ele sunt concepte antisens, anti-gene (triplu helix) i conceptul ARNi, precum i conceptul utilizrii acizilor ribonucleici ca ribozime.Pn n prezent numai medicamentele pe baz de acizi nucleici ce urmeaz conceptul antisens i ribozime sunt pe pia sau n faze clinice de testare. Conceptul antisensConceptul antisens urmrete cea mai important modalitate de aciune pentru a modula transferul informaiei genetice n proteine. Unele mecanisme de aciune prin care un oligonucleotid poate induce un efect biologic sunt complexe. Oligonucleotidele antisens pot fi clasificate n dou mari clase, pe baza mecanismului lor de aciune: oligonucleotidele RNaz H-dependente, care induc degradarea ARNm de ctre RNaza H i oligonucleotide de blocaj steric, care previn fizic sau inhib splicing-ul sau aparatul translaional. Cele mai multe dintre oligonucleotidele antisens merg pe calea mecanismului RNaz H-dependent.Informaia genetic a vieii este stocat n ADN-ul dublu helix i ADN-ul trebuie s fie tradus n proteine, pentru a obine aceast informaie, adic ADN-ul va fi transcris n ARNm, care va fi tradus n proteine. Oligonucleotidele antisens interacioneaz cu aceste catene ARNm pentru a bloca translaia ARNm n proteine la nivelul ribozomilor. Prin urmare, oligonucleotidele antisens formeaz n mod special legturi de hidrogen cu bazele azotate pe baz de complementaritate dup modelul Watson-Crick. Legarea este specific de secven, astfel nct o mperechere greit reduce semnificativ stabilitatea duplexurilor formate. n cele mai multe cazuri, n condiii fiziologice, un duplex, cu una sau mai multe mperecheri greite va fi rapid clivat.Blocarea steric De aceea, este necesar s se cunoasc exact secvena ARNm care ar trebui s fie blocat. Acum multe secvene sunt cunoscute, iar odat cu secvenierea ntregului genom uman au devenit disponibile mai multe informaii cu privire la efectele produse de ARNm corespunztor. Aceast cunoatere face posibil sinteza oligonucleotidelor antisens specifice Cel de-al doilea i cel mai important mecanism de aciune al oligonucleotidelor antisens dup blocarea steric este activarea RNazei H RNaza H degradeaz n mod normal primeri ARN n timpul replicri ADN-ului sau excizeaz selectiv nucleotidele ARN ncorporate greit n catenele de ADN. n heteroduplexurile ADN-ARN, RNaza H hidrolizeaz selectiv catena ARN. ARNm clivat va fi imediat degradat de exonucleaze n timp ce ARNm intact este protejat de structuri specifice 5' i 3' mpotriva degradrii de exo-i endonucleaze. De asemenea, mecanismul RNazei H explic de ce ARN-ul antisens nu prezint nici un efect de inhibare a translaiei. Activitatea de clivare ARN a RNazei H nu va fi indus de ctre duplexurile ARN ARN Activarea RN-azei HConceptul de triplu helix Triplu helixurile/ helixurile triple constau dintr-o singur caten polipurinic i dou catene polipirimidinice. n timp ce triplu helixurile TxAT apar rar n celule, triplu helixurile CxGC nu sunt stabile n condiii fiziologice Citozina n a treia caten trebuie s fie protonat pentru a forma un triplu helix stabil. Pentru a protona citozina a fost necesar un pH de 6.0. Legarea celei de a treia caten la helixul dublu Watson-Crick este rezultatul legturilor de hidrogen Hoogsteen sau Hoogsteen inverse Acizii nucleici n triplu helix pot fi utilizai pentru a regla expresia genei in vivo. n conceptul triplu-helix (concept anti-gen), cea de-a treia caten a acidului nucleic ar trebui s hibridizeze cu ADN-ul n dublu helix din nucleu inhibnd translaia ADN-ului n ARNm corespunztor. Un avantaj major al conceptului de anti-gen comparativ cu conceptul antisens l constituie faptul c fiecare celul are doar un set diploid de cromozomi, astfel c ar trebui s fie inhibate numai dou secvene egale de ADN per celul i nu sute sau mii de catene ARNm .

Exist patru mecanisme posibile de aciune a acizilor nucleici n triplu helix:oligonucleotidele ce formeaz triplexuri pot interaciona cu poziia de legare al unui component al transcripiei sau secven de replicare;schimbarea conformaiei cauzat de formarea triplu helixului poate perturba legarea unei enzime importante pentru translaie; oligonucleotidele formatoare de triplex se leag n aval de o regiune promotor a ARN polimerazei care ar putea inhiba iniierea transcripiei; oligonucleotidele ce formeaz triplexuri se leag la ADN i pot aciona ca o barier pentru enzimele de transcripie sau replicare. Utilizarea in vivo a oligonucleotidelor formatoare de triplex sunt similare cu cele pentru oligonucleotidele antisens, adic asigur stabilitatea n medii biologice, absorbia la nivelul nucleului i farmacocinetica ARN-ul de interferen ( ARNi) Mecanismul ARNi implic iniial prelucrarea ARN-ului dublu catenar de lungime mare (n jur de 500-1000 nucleotide) n fragmente de declanare '' de 21 25 bp ' , de ctre un membru al familiei III de RNaze ale nucleazelor numite DICER Cnd sunt ncorporate ntr-un complex de nucleaze larg, multicomponent numit RISC (complex de silenionare ARN indus), catenele prelucrate formeaz ''o secven ghid'' care are int RISC la secvena ARNm dorit i contribuie la distrugerea sa ARNi a fost folosit cu succes pentru silenionarea genelor n diferite sisteme experimentale, incluznd petunia, planta de tutun, neurospora, Caenorhabditis elegans, insecte i petele zebr. Utilizarea de ARN dublu catenar lung pentru silenionarea expresiei n celulele de mamifere a fost ncercat, n mare msur fr succes