201117856-proiect-cromatografie

8/12/2019 201117856-Proiect-cromatografie

1/18

UNIVERSITATEA TEHNIC CLUJ-NAPOCA

CENTRUL UNIVERSITAR NORDBAIA MARE

METODE CROMATOGRAFICE DESEPARARE

Metode de analiza

2013

DETERMINAREA LIPOFILICIT II UNOR


2/18


3/18

Vitamine lipofile

Flavonoide

ndulcitori

Cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC)

Cromatografie pe strat sub ire de nalt performan (TLC)

Faze stationare cromatografice impregnate

Analiza componentelor principale (PCA)

Introducere

Lipofilicitatea este definit de IUPAC ca fiind afinitatea unei

molecule sau a unui amestecde compui pentru un mediu lipofil,

determinarea valoric a acesteia fiind o consecin a comportamentuluide distribuie ntr -un sistem bifazic, fie lichid-lichid, fie lichid-solid.

Importana acestui parametru se regsete n contextul monitorizrii

comportamentului n mediu biologic al unui compus dat, ntruct sconsider c valoarea lipofilicitii descrie indirect procesul de adsorbie,distribuie, metabolizare i eliminare (ADME). Exist mai multe

posibilit i de determinare a lipofilicit ii, ns tehnicile cromatograficesunt cudesvrire cele mai reprezentative. Posibilitatea abordrii maimultor tehnici cromatografice n vederea estimrii


4/18

lipofilicit ii prezint un avantaj semnificativ datorit faptului c

rezultatele ob inute prin mai multe metode pot s se valideze reciproc .

Scopul lucrrii

Scopul aceste lucrri este s ofere o caracterizare pertinent a unora

dintre cele maiimportante grupuri de compui cu o importan relevant n domeniul

alimentar i farmaceutic. De asemenea, cromatografia de lichide i

cromatografia pe strat subire vor fi analizate n contextual investigrii

lipofilicitii, determinndu -se particularitile specifice. Un numr largde indici de lipofilicitate teoretici i experimentali vor fi investigai,

caracterizai i compara i ntre ei.

Prin intermediul cromatrografiei pe strat subire, folosindu -se posibilitile de impregnare a plcilor normale de silicagel cu diverse

uleiuri i grsimi naturale, incluznd aici i grsimea uman, se dorete

elucidarea mai corect a modului de aciune biologic a acestor compui.

De asemenea, folosindu-se Analiza Componentelor Principale (PCA), sva efectua o analiz pertinent n vederea stabilirii nivelului caracterului

lipofil al grsimilor i a uleiurilor, pentru a arta care dintre grsimile i

uleiurile studiate sunt mai apropiate de grsimea uman.


5/18

Determinrile cromatografice a lipofilicitii au creat un fundament n experimentele QSAR, pornindu-se de la supoziia c fazele staionareinverse pot fi asociate cu membranele biologice reale. Totui,complexitatea real regsit la nivel celular nu poate fi reprodus, fapt

ce duce la necesitatea abordrii unor noi alternative. Aceast posibilitate

poate veni dintr-un domeniu cromatografic neexplorat n acest domeni

i anume cromatogra fia pe strat sub ire, folosindu-se plci impregnate.Posibilitatea de impregnare cu diverse uleiuri i grsimi a plcilor de

silicagel vine s susin i s ofere noi alternative. Rezultatele obinute pe grsimea uman vor susine relevan a experimentelor realizate.Aceste rezultate, alturi de cele obinute prin HPLC vor crea pentru

prima dat o ierarhie real, att a compuilor implicai n acest studiu,

ct i a fazelor staionare, inclusiv a uleiurilor, respectiv a grs imilorfolosite la impregnare. Literatura de specialitate nu prezint determinri

similare sau nrudite, astfel c trebuie apreciat faptul c att clasele de

compui investigate, folosirea de plci impregnate cu diverse materiale

lipofile, ct i o parte d in metodologiile de investigare a rezultatelorobinute au fost aplicate aici pentru prima dat.

Materiale i aparatur


6/18

Toate materialele folosite au respectat condi iile de calitate analitice.Cromatografia de lichide a vitaminelor i a flavonoidelor s -a realizat

folosindu-se un sistem cromatografic Agilent 1100 Series cuplat cu

spectrometru de mas MSD 1100, n timp ce ndulcitorii au fost analiza i pe un cromatograf de lichide Agilent 1200 Series cuplat la unspectrometru de mas n tandem 4000 Q TRAP LC -MS/MS.

Cromatografie

1.Vitaminele lipofileVitaminele lipofile au fost analizate prin HPLC i TLC folosindu -se

mai multe tipuri de faze sta ionare chimic legate, iar n cazul TLC s-au

introdus o serie de faze sta ionare ob inute n urma impregnrii cuuleiuri sintetice (parafin i trioxtilamina) i uleiuri vegetale (msline,

floarea soarelui i porumb). Condi iile de elu ie sunt prezentate nTabelul 1.

Tabel 1. Sistemele de faz mobil corespunztoare diferitelor faze staionare investigate.


7/18

Nr Faz staionar Faz mobil MeOH (%)

HPLC

1 Lichrosphere RP-18e 86-90: variabilitate de 1%2 Eclipse XDB-CS 86-90: variabilitate de 1%TLC

1 RP-18 95-99: variabilitate de 1%2 RP-18W 89-97: variabilitate de 2%3 CN 71-83: variabilitate de 3%4 Parafin 90-94: variabilitate de 1%5 TOA 92-98: variabilitate de 2%6 Msline 90-98: variabilitate de 2%7 Floarea Soarelui 90-98: variabilitate de 2%8 Porumb 90-98: variabilitate de 2%

2. FlavonoideleFlavonoidele au fost analizate prin HPLC i TLC folosindu -se un

numar mare de faze sta ionare, unele ob inute n urma impregnrii cuuleiuri sintetice (parafina i trioctilamina), uleiuri vegetale i produsederivate (msline, floarea soarelui, porumb i margarina) i grsimi

animale(ulei de cod, unt, grsime de oaie, grsime de gin, grs ime de

porc i grsime uman). Sistemele de faze mobile folosite pentru elu iafazelor sta ionare luate in considerare sunt prezentate n Tabelul 2.Tabel 2. Sistemele de faz mobile corespunztoare diferitelor faze staionare investigate.


8/18

Nr Faz staionar Faz mobil MeOH (%)

HPLC

1 LiChrosphere RP-lSe 70-80: variabilitate de 2.5%

2 Eclipse XDB-CS 70-80: variabilitate de 2.5%3 Lichrosphere 100CN 66-70: variabilitate de 1%

TLC

1 RP-18 65-85: variabilitate de 5%2 RP-18 W 55-75: variabilitate de 5%3 CN 50-70: variabilitate de 5%4 NH2 20-40: variabilitate de 5%5 Parafin 50-70: variabilitate de 5%6 TOA 50-70: variabilitate de 5%7 Msline 50-70: variabilitate de 5%8 Floarea Soarelui 50-70: variabilitate de 5%9 Porumb 50-70: variabilitate de 5%10 Margarina 50-70: variabilitate de 5%11 Unt 50-70: variabilitate de 5%12 Cod 50-70: variabilitate de 5%13 Porc 55-75: variabilitate de 5%14 Gin 55-75: variabilitate de 5%15 Oaie 55-75: variabilitate de 5%16 Om 50-70: variabilitate de 5%

3. ndulcitoriindulcitorii au fost analiza i n vederea investigrii lipofilicit ii prin

TLC pe faze sta ionare chimic legate (RP-18, RP-18W, RP-8, CN i NH2) i faze sta ionare impregnate (parafin, msline, floarea soarelui, porumb, ricin, margarin, unt, cod, porc, gin, oaie, om). Faza mobil a

fost amestecuri de acetonitril (ACN): apa, n care frac ia de ACN avariat ntre 85 i 95%, schimbate cu 15 incremente de 2.5%, cu excepia


9/18

plcilor de NH2, unde intervalul ales a fost ntre 65 i 85% schimbat cuincremente de 5% pentru fiecare pas. Pentru fazele staionare impregnate

procentul deACN a fost ntre 70 i 90%, schimbate cu incremente de5%.

Analiza HPLC a ndulcitorilor a avut ca scop modelarea reten ieicromatografice a zaharidelor. Pentru aceasta zaharidele au fost analizat

pe o coloan cromatografic Supelcosil NH2. Eluiile s -au realizat nmod izocratic cu cinci faze mobile constnd din amestecuri ACN: ap,

unde procentul de ACN a variat ntre 80-90%.

Studiul i caracterizarea cromatografic a vitaminelor, aflavonoidelor i a ndulcitorilor


10/18

1.Vitamine lipofile

A B

C D

Figurile 1-4.Reprezentarea grafic a variabilitii valorilor log k i n funcie de concentraia modificatorului organic. A: HPLC RP-18,B: RP-18W,C: TOA,

D: Msline.

Se observ clar faptul c -carotenul i licopenul au de departe celemai ridicate valori ale lipofilicitii. Structura simetric a acestor dou

molecule i faptul c prezint o mas molecular mare i fr grupriifunc ionale polare le susine ca fiind cele mai lipofile.


11/18

Chiar dac mrimea moleculelor este asemntoare carotenilor, prezena oxigenului n molecul cauzeaz un efect polar puternic, care

rezid n valorile indicilor de lipofilicitate.

Dintre compuii studia i n acest experiment, retinoidele prezint c elmai sczut caracter lipofil. Aceasta este o consecin a mrimii

moleculei i a prezenei gruprilor func ionale hidroxil, carboxil i

carbonil din molecule.Tendina compuilor de a interaciona sau nu cu faza staionar i

implicit variaia parametrilor cromatografici odat cu schimbarea procentului de modificator organic din fazamobil se poate observa dinextrasul din figurile de mai sus.

Analiznd n detaliu graficele expuse se observ c nu exist anomalii

n comportamentul cromatografic, acesta fiind unul liniar, respectndu

se o cretere propor ional a valorilor logk i n func ie de frac ia demodificator organic din faza mobil.

2. FlavonoideFlavonoidele studiate au fost compui metil, metoxi i hidroxi deriva i.

Indici de lipofilicitate ob inu i indic faptul c deriva i metil sunt cei


12/18

mai lipofili, urma i de cei metoxideriva i i de compui hidroxi deriva i.

Compui poli -hidroxi deriva i sunt mult mai hidrofili.

A B

C DFigurile 5-8. Reprezentarea grafic a variabilitii valorilor log k i RM n

funcie de concentraia modificatorului organic: A: HPLC RP-18,B: RP-18,C: Porumb,D: Om.

Comportamentul cromatografic al flavonoidelor odat cu schimbarea

raportului de faz mobil s -a artat a fi unul echilibrat, mecanismul deretenie fiind unul unitar pe tot intervalul de 25 faz mobil ales,indiferent dac fazele sta ionare au fost foarte diferite, remarcndu-se


13/18

similarit i ntre fazele sta ionare chimic legate i cele ob inute prinimpregnare.

Figura 9-12. Profilele de corelaie a valorilor R M0 obinuti prin TLC.

Se remarc similitudini ridicate intre diversele faze sta ionare, nsa

cele mai asementoare sunt uleiurile i grsimile, inluznd aici i

grsimea uman. Diagramele ob inute permit remarcarea unuicomportament diferit al compuilor pe plcile impregnate cu TOA,


14/18

care a facilitat interac iuni puternice cu flavonoidele ce prezint gruprifunc ionale metoxil i metil, i interac iuni mult mai slabe cu deriva i

hidroxil. Acest comportament observat sus ine nc odat aprecierile prezentate pentru vitamine.

Concluzii

Vitaminele lipofile

Indicii de lipofilicitate ob inu i pentru vitaminele lipofile au avutvalori foarte mari, distingndu-se dintre acetia carotenii ca fiind

cei mai lipofili ( -caroten > licopen), urma i de tocoferoli ( -

tocoferol > -tocoferol > -tocoferol), xantofile (lutein zeaxantin > astaxantin) i retinoide (all -trans retinal 9 -cisretinal > acid retinoic > retinol).

Lipofilicitatea vitaminelor depinde n foarte mare msur de prezen a gruprilor func ionale polare (hidroxil) n molecul, de

numrul i respectiv pozi ia acestora. Cei mai reprezentativi indici de lipofilicitate ob inu i au fostmediile parametrilor de reten ie i scorurile dup primele


15/18

componente principale ob inute n urma analizei componenetelor principale. Hr ile de lipofilicitate folosite pentru gruparea i estimarea

caracterului lipofil alvitaminelor lipofile au condus la grupuri iclusteri liniari care sunt n mare concordan cu particularit ilestructurale ale compuilor.

Flavonoidele

Flavonoidele au fost investigate din punct de vedere al

lipofilicit ii princromatografie de lichide de nalt eficien (RP -

18, RP-8 i CN) i prin cromatografie pe strat sub ire, folosindu-se plci chimic legate (RP -18, RP-18W, CN i NH2) i plciimpregnate cu uleiuri sintetice (ulei de parafin i TOA), uleiuri

vegetale i produse derivate (ulei de msline, ulei de floarea

soarelui, ulei de porumb i margarin) i grsimi animale (unt, ulei

de cod, grsime de om, grsime de porc, grsime de oaie, grsime

de gin).

Comportamentul cromatografic al flavonoidelor pe toate fazelesta ionare a fost unul uniform de cretere odat cu cretereaconcentra iei modificatorului organic din fazele sta ionare,excep ie fcnd comportamentul observat pe plcile NH2 unde


16/18

deriva ii hidrozil au artat un comportament cresctor, n timp cederiva i metoxila i i cei metila i au condus la valori mai mici ale

parametrilor de reten ie. Flavonoidele studiate au condus la indici de lipofilicitate grupa i nfunc ie de tehnica folosit (HPLC sau TLC) i n func ie de naturafazelor sta ionare (chimic legate sau impregnate).

Plcile impregnate cu TOA folosite la investigarea vitaminelor

lipofile i a flavonoidelor au condus la un comportament pu in

diferit fa de restul plcilor investigate. S -a remarcat faptul cinterac iunea compuilor cu faza sta ionar variaz foarte multodat cu creterea numrului de grupri hidroxil din molecule .

Bibliografie selective

http://goldbook.iupac.org/LT06965.html2. J. Sangster, Octanol-water partition coefficients of simple organic compounds J.

Phys. Chem. Ref. Data 1998, 18 , 1111-1229. 3. D. Casoni, A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Srbu, Lipophilicity data for some preservatives estimated by reversed-phase liquid chromatography and different


17/18

computation methods, J. Chromatogr. A , 2009, 1216 , 2456-2465.4. R.D. Bri ciu , A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Srbu, A comparative study of themolecular lipophilcity indices of citamins A and E and of some precursors of

vitamin A, estimated by HPLC and by different computation methods, ActaChromatogr . 2009, 21 , 237-250.5. L.R. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography , 2ndEd. John Wiley and Sons, New York, USA,1979.6. R.D. Bri ciu , D. Casoni, Lipophilicity estimation of some flavonoids by reverse phase thin-layer chromatography, Acta Universitatis Cibiniensis, Serie F Chemia ,2008, 11 , 71-81.7. D. Casoni,R.D. Bri ciu ,Lipophilicity of parabens estimated by reverse-phasehigh performance thin-layer chromatography and different computation methods

Acta Universitatis Cibiniensis, Serie F Chemia , 2008, 11 , 71-81.8. R. Kalizsan,Structure and Retention in Chromatography: A Chemometric

Approach,

Harwood Academic Publishers , Amsterdam, The Netherlands,1997.9. P. Haber, T. Bauczek, R. Kaliszan, L.R. Snyder, J.W. Dolan, C.T. Wehr,Computer simulation for the simultaneous optimization of any two variables andany chromatographic procedure, J. Chromatogr. Sci . 2000, 38, 386-392.10. K. Valko, R.L. Snyder, J.L. Glajch, Retention in reversed-phase liquidchromatography as a function of mobile-phase composition, J. Chromatogr. A ,1993, 656 , 501-520.

11. T. Kowalska, K Kaczmarski, W. Prus, Theory and mechanism in thin-layerchromatography, In J. Sherma, B. Fried (Eds.), Handbook of Thin LayerChromatography , Marcel Dekker, New York, USA,2003, pp. 47-80.


18/18

12. E.C. Bate-Smith, R.G. Westall, Chromatographic behavior and chemicalstructure I. Some naturally occuring phenolic substances, Biochem. Biophys. Acta1950, 4, 427-440.

13. E. Soczewinski, C.A. Wachtmeister , The retention between the composition ofcertain ternary two-phase solvent systems and RM values, J. Chromatogr.A. 1962,7 , 311-320.14. K. Valk, P. Segel , New chromatographic hydrophobicity indices (0) basedon the slope and the intercept of log k versus organic phase concentration plot, J.Chromatogr. A 1993,631 , 49-61.15. C.M. Du, K. Valk, C. Bevan, D. Reynolds , Rapid gradient RP-HPLC methodfor lipophilicity determination: A solvation equation based comparison withisocratic methods, Anal. Chem . 1997, 70, 4228-4234.16. I.V. Tetko, Prediction of phisicochemical properties, In S. Ekins (Eds.), Risk

Assessment for Pharmaceutical and Environmental Chemistry , John Wiley andSons, New Yersy, USA,2007, pp. 241-275. 17. R. Mannhold, G.I. Poda, C. Ostermann, I.V. Tetko, Calculation of molecularlipophilicity: State of the art nd comparison LogP methods on more than 96000compounds, J. Pharm. Sci. 2009, 98 , 861-893.18. G.L. Biagi, A.M. Barbaro, M.C. Guerra, G. Gantelli-Forti, M.E. FracassoRelation between and RM values of sulfonamides, J. Med. Chem. 1974, 17 , 28-33.

19. H. F. Pop, C. Srbu, A new fuzzy regression algorithm, Anal. Chem. 1996, 68 ,771-778.20. A. G. Gonzles, M. A. Herrador, A. G. Asuero, Intra-laboratory testing omethos accuracy from recovery assays,Talanta , 1999, 48, 729-736.

201117856-proiect-cromatografie

Documents