determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

10
Camelia ALBU BIRSAN 1 , Eugenia TEODOR 1 , 1. Centrul de Bioanaliza, Institutul National de Cercetare- Dezvoltare pentru Stiinte Biologice, Bucuresti "Bioanaliza versus Biotehnologia" decembrie 2007

Upload: buicong

Post on 29-Jan-2017

260 views

Category:

Documents


3 download

TRANSCRIPT

Page 1: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

Camelia ALBU BIRSAN1, Eugenia TEODOR 1,

1. Centrul de Bioanaliza, Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Stiinte Biologice, Bucuresti

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 2: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

INTRODUCERE

In ultimii ani termenul de probiotic se foloseste pentru adefini preparate microbiene vii, care consumate,amelioreaza sau vindeca unele boli, actionand prinmodificarea echilibrului gastro-intestinal, prinschimbarea metabolismului si interactia cu micro-organismele prezente in intestin. Acizii organicirezultati in procesele ce au loc la cultivarea bacteriilorlactice au diverse roluri, astfel incat este importantacuantificarea lor in obtinerea unor tulpini lactice cu rolprobiotic.

Scopul acestei lucrari este elaborarea unei metode deanaliza prin HPLC cu detectie UV a acizilor organicirezultati din cultivarea unor bacterii lactice.

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 3: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

MATERIALE SI METODE

acid acetic (Fluka), acid lactic (Fluka), acid fenillactic(Sigma), acid hidroxifenillactic (Sigma); toti ceilalţi reactivi, au fost de puritate analitica sau pentruuz cromatografic;

sistem HPLC SHIMADZU:-pompa LC-20AD sp Pump,-coloana TEKNOKROMA, Nucleosil 100 C18 10 μm 25 x 0.46,-degasor DGU-20As Degasser,-CTO-20AC Column oven,-detector SPD-M20A diode array detector-software LC solution;

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 4: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

ANALIZA HPLC

lungimea de unda a fost aleasa, in functie de spectrul deabsorbtie, de 210 nm.;

faza mobila a constat in 25 mM KH2PO4 89% si metanol 11%,pH de 3,5;

s-a folosit un gradient pentru debitul fazei mobile;

analizele au fost realizate la 250C;

timpul total de analiza a unei probe a fost de 45 de minute.

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

In experimentele noastre am adaptat o metoda, care sapermita determinarea simultana a acizilor organici de tip acidacetic, acid lactic, dar si a derivatilor aromatici ai acidului lactic,acidul fenillactic si hidroxi-fenillactic, ce apar in urma cresteriisi dezvoltarii unor bacterii lactice.

Page 5: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

REZULTATE SI DISCUTII

Fig. 1. Cromatogramele pentru amestecul de acizi organici (concentratia acizilor este de 100 mg/mL (A) si 25 mg/mL (B)) (coloana TEKNOKROMA, Nucleosil

100 C18 10 μm 25x 0,46 cm).

A B

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 6: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

Tabelul 1. Unele caracteristici de performanta ale metodei cromatografice dezvoltate pentru analiza acizilor organici.

AnalitTimp de retentie

Domeniul de liniaritate a răspunsului

Ecuaţia curbei de etalonare R2

Acid lactic tR1 = 5.2

1 m

g/m

L-1

00

mg

/mL

Y = 22468.18 X C -9275.911 0,9998

Acid acetic tR2 = 6.2 Y = 1255.024 X C + 35429.45 0,9997

Acid hidroxifenillactic

tR3 = 16.7 Y = 26497.71 X C - 13586.58 0,9998

Acid fenillactic tR4 = 34.4 Y = 34164.93 X C -26537.15 0,9997

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 7: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

Fig. 2. Cromatogramele obtinute pentru probele de microorganisme (diluate de 10 ori) (coloana TEKNOKROMA, Nucleosil 100 C18, 10 μm, 25x 0,46 cm).

GM3GM2

GM10 VL 43

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 8: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

Tabelul 2. Caracteristicile determinate cromatografic pentru acizi organici continuti

in supernatante (Lactobacillus paracasei (Y), Lactobacillus plantarum (GM1, GM2,

GM3, VL21), Enterococcus faecium (GM6, GM8, GM10, VL43, VL47)).

Proba AnalitTimp de retentie

Concentratie mg/mL Proba

AnalitTimp de retentie

Concentratie mg/mL

Y

Ac. lactic 4,8 11,2

GM8

Ac. lactic 4,8 3,1Ac. acetic 5,9 1031,2 Ac. acetic 5,9 308,3

Ac. hidroxifenillactic 15,5 256,3 Ac. hidroxifenillactic 15,6 3599,5Ac.fenillactic - - Ac.fenillactic - -

GM1

Ac. lactic 4,8 21,6

GM10

Ac. lactic 4,8 196,2

Ac. acetic 6,2 2707,6 Ac. acetic 6 875,4Ac. hidroxifenillactic 15,6 171,4Ac. hidroxifenillactic 15,6 237,2

Ac.fenillactic - -Ac.fenillactic 34 19,6

GM2

Ac. lactic 5 423,1

VL 43

Ac. lactic 5,3 782,5

Ac. acetic 6 1180,7 Ac. acetic 6,2 329,3

Ac. hidroxifenillactic 15,8 452,6Ac. hidroxifenillactic 15,6 156,6Ac.fenillactic 33,9 15,7 Ac.fenillactic - -

GM3

Ac. lactic 5 227,9

VL 21

Ac. lactic 4,9 13Ac. acetic 6,1 810,7 Ac. acetic 5,9 1138,3

Ac. hidroxifenillactic 15,6 115,9 Ac. hidroxifenillactic 15,5 245,6

Ac.fenillactic - -Ac.fenillactic 33,8 13,4

GM6

Ac. lactic 4,8 216,1

VL 47

Ac. lactic 4,7 5,7

Ac. acetic 5,8 2005,8Ac. acetic 6 1161Ac. hidroxifenillactic 15,6 226,4 Ac. hidroxifenillactic 15,5 329,1

Ac.fenillactic 33,6 8,9 Ac.fenillactic - -

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Page 9: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

CONCLUZII

Metoda de separare si cuantificare HPLC pentru aciziorganici din probe microbiologice este simpla, relativrapida, sensibila (limita de detectie este de 0,7–0,9 mg/mL)si permite o determinare simultana a acizilor organicirezultati din cresterea unor microorganisme. Ea a fostaplicata cu bune rezultate pe probe reale provenite de labacterii lactice.

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007

Lucrare a fost finantata din cadrul contractului BIOTECH CEEX 9/2005

Page 10: Determinarea continutului de acizii organici prin cromatografie de

VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!

"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007