cromatografie 1

7/24/2019 cromatografie 1

1/22

Pop Corina MonicaChimie didactica , anul II

Identificarea unor substane medicamentoaseprin separare cromatografic i confirmare

spectral

Cromatografia de lichide (LC) sau cromatografia de lichide denalt performan (HPLC) este una dintre tehnicile cele mai folositen prezent la separarea constituenilor unui amestec de sustane! "untprezentate unele dintre cele mai importante metode de analiz princromatografie de lichide de nalt performan (HPLC)! "e constatfaptul c marea ma#oritate a metodelor de determinare a $I%" prinHPLC folosesc ca faz staionar coloane de tipul C&' (n dierseariante constructie lungime, diametru intern, mrimeaparticulelor)! Ca faz moil se folosesc amestecuri de soleniformate n principal din Me*H, $C% sau amele mpreun ap sau cusoluii apoase a unor sruri (acetat de sodiu, acetat de amoniu, fosfatmonosodic, fosfat monopotasic etc!) aduse la alori dierse ale pH+

ului cu acizi cum sunt acidul formic, acidul acetic, acidul fosforicMetodele prezentate lucreaz n modul izocrat sau n gradient, nfuncie de numrul i tipul de componeni separai! -n ceea ce prietesistemele de detecie, marea ma#oritate a metodelor folosescspectrofotometria n ./, la alori ale lungimii de undcorespunztoare ma0imelor de asorie, sau la alori intermediarecorespunztor ma0imelor de asorie a componentelor separate! -n

alte metode se folosete ca sistem de detecie spectrometria de mas,fluorescena sau detecia electrochimic


2/22

determinrilor din medii iologice (urin, ser, plasm, esut) sefolosesc diferite ariante de purificare a proei (e0tracie n fazsolid, e0tracie n faz lichid folosind ca sisteme de e0traciedieri soleni cum sunt eterul, cloroformul, diclormetanul etc! saudeproteinizarea simpl cu $C%, Me*H sau acizi acid percloric, acid

tricloracetic etc!)!

Pentru instituirea unei metode de analiz se au n edere, de regul,urmtorii parametri1

(a) "pecificitatea 2 "electiitatea3() Linearitatea3(c) Limita de detecie (L*4)3

(d) Limita de cuantificare (L*5)3(e) Interalul (domeniul de lucru)3(f) Precizia (repetailitatea i precizia intermediar)3(g) $curateea(h) "tailitatea i rousteea!

-n literatura de specialitate nu e0ist o singur metodcromatografic de separare i determinare cantitati pentru $I%".nele dintre metodele pulicate descriu separri de amestecuri de$I%" sau $I%" mpreun cu sustane medicamentoase din alte clase

terapeutice, ns ma#oritatea separrilor pulicate sunt optimizatepentru fiecare compus n parte! $plicaiile descrise se pot mpri nc6tea categorii, i anume1 dozarea $I%" din materii primefarmaceutice, dozarea $I%" din forme farmaceutice, dozarea $I%"din proe iologice (n special s6nge, plasm, urin)!

/om prezenta modalitatea de elaorare a metodei pentrusepararea unui amestec de $I%" prin HPLC! %e om a0a n principalpe ariaiile spectrale i ale ariilor picurilor oinute ce apar n urma

difi ii i d l d i l i i i


3/22

oiectul prezentei cercetri, a6nd drept scop crearea unei metodesimple de separare cromatografic din amestec (metoda de8screening9), precum i a alidrii acestei metode sau a unoralternatie optimizate pentru determinri cantitatie indiiduale aleacestora! "+a urmrit crearea unei metode capaile s ruleze pe un

sistem cromatografic uzual, a6nd un detector economic (de tip ./+/I") i implic6nd o coloan de separare dintre cele mai rsp6ndite,cum este coloana cu faz staionar C&'!

Cele &7 $I%" luate n studiu sunt1& Nimesulid areiat NIM2 Meloxicam areiat MEL

: Piroxicam areiat PIR; Tenoxicam areiat TEN Ibuprofen areiat I!"# Indometacin areiat IN$% $iclofenac &odiu areiat $I'( )etoprofen areiat )TP* )etorolac areiat )ET&7 +enilbuta,on areiat +!

Pentru a putea concepe metoda de separare dorit, se orfolosi informaiile despre parametrii fizico+chimici disponiile nliteratura de specialitate! .rmrind informaiile releante pentru separarea

cromatografic, i anume1 soluilitatea, caracterul lipofil2hidrofi(nepolar sau polar), caracterul acid, azic sau neutru, ale moleculelorluate n studiu, i az6ndu+ne pe datele din literatura de specialitate,am considerat adecat s alegem ca modalitate de lucru separareacromatografic pe faz staionar iners (coloan C&'), folosinddrept faz moil un amestec de Me*H, $C% i ap sau soluietampon acetat, cu detecie n ./!

4up alorile coeficientului de partiie octanol2ap (logP)citate n literatura de specialitate i determinate e0perimental pentru


4/22

I%4, 4IC)! Celelalte trei $I%", respecti %IM, M?L i PI au aloridiferite i mprtiate ntre cele dou grupuri! $propierile remarcateconduc la predicia c analiii fiecruia din cele dou grupuri, dac segsesc mpreun n amestec, or fi foarte greu de separat n condiii deeluie izocrat!

"oluilitatea $I%" luate n studiu este mai mare n solenipolari (metanol, etanol) dec6t n ap! $6nd n edere faptul cspectrul de asorie al unei sustane poate suferi dierse modificri(deplasare atocrom sau hipsocrom, efect hipercromic sauhipocromic), am considerat necesar ca, n ceea ce priete alegereacompoziiei finale a fazei moile, primul pas s l constituie studiulspectrelor de asorie a antiinflamatoarelor n dieri soleni!

Pentru aceasta, au fost preparate soluii de concentraieapro0imati de 7,7&mg2mL, n c6tea ariante de solent1 apMe*H, $C% i soluie apoas tamponat (tampon acetat) de pH < D!Concentraia de 7,7&mg2mL este astfel aleas nc6t s permitdizolarea tuturor $I%" i n ap! 4up prepararea soluiilor de lucrus+a trecut la msurarea e0tinciei n ./+/I" folosind un

"pectrofotometru ./+/I" $gilent >echnologies, model ';D:Eermania! Msurtorile spectrale i de asoran (e0tincie) au fostefectuate pe domeniul &F7 D77nm, deoarece unele dintre $I%" luaten lucru asor radiaie luminoas i n zona spectral /I"! Pentrue0emplificare, prezentm spectrul pentru >?% msurat n cei ;soleni


5/22

"pectrele msurate pentru >?% n diferii soleni

"e constat mai multe aspecte! -n primul r6nd, pentru toicompuii studiai se oin mai multe ma0ime de asorie, cel maiputernic (ma0imul principal) la lungimi de und de p6n la G&7nm$cestea sunt succedate de ma0ime secundare sau teriare la lungimi de

und mai mari! 4eoarece n domeniul de lungimi de und &F7 G&7nm, specifice ma0imelor principale, asor puternic ma#oritateasolenilor organici utilizai n HPLC (Me*H, $C% etc!), utilitateaacestora pentru detectarea concentraiilor mici de analii estendoielnic! 4in acest moti, se or aea n edere ma0imele deasorie ce se oin la alori mai mari ale lungimii de und(ma0imele secundare) la stailirea parametrilor de detecie!

-n al doilea r6nd, se poate osera c efectele de deplasare alema0imelor spectrale (i ne referim acum strict la ma0imul secundar)nu au efect semnificati ntre ap i solentul apos tampon (ap sare acid) la pH < D, ceea ce nseamn c prin corecia de pH nu s+aalterat ma0imul secundar de asorie! $ceast constatare permite stratm tamponul apos din punct de edere al influenei spectrale,

similar cu apa! >otui, o alt influen este notail1 efectuhipocromic (reducerea intensitii de asorie) este semnificati la


6/22

>?%) iar, n cazul IBP, apare efectul iners, de hipercromie(intensificarea intensitii de asorie)!.n alt aspect interesant este specific spectrului o0icamilor! $cetiaprezint dou ma0ime secundare, unul de intensitate mai mic, ninteralul G;7 G7nm, i unul de intensitate mai mare, n domeniul

:D7 ;77nm! 4intre $I%"+urile studiate, o0icamii sunt singurii careau aceast particularitate i poate fi util n situaiile n care anumite$I%" au tendina s coelueze (din cauza alorii logP foarte apropiate)* soluie simpl de decelare este selecia spectral1 presupun6nd c@>P sau2i @?> or coelua cu >?% (toate au logP foarte apropiate de&), alegerea unei lungimi de und de detecie de :D7 :7nm apermite detecia i chiar cuantificarea e0clusi a >?%, deoarece @>P

i @?> nu asor deloc n aceast zon spectral!%u n ultimul r6nd, n cazul folosirii Me*H sau $C% ca solent,

lungimile de und rm6n la aceleai alori (pentru IBP) sau sedeplaseaz spre alori mai mari deplasare atocrom (pentru 4IC)sau mai mici deplasare hipsocrom (pentru @>P, PI, M?L i>?%)! $ceste deiaii or fi inestigate ulterior, pentru a edea

influena amestecurilor ap sau tampon apos2solent organic (Me*Hsau $C%) n dierse proporii, asupra poziiilor ma0imelor spectrale-n taelul D!: sunt prezentate sinoptic lungimile de und (poziiile) alema0imelor spectrale secundare cu utilitate n detecia cromatografic !


7/22

Lungimile de und corespunztoare ma0imelor spectrale secundarepentru 4IC, IBP, @>P, PI, M?L i >?%, n ap, Me*H, $C% itampon acetat pH < D

.rmrind aaterile ma0imelor spectrale secundare pentru $I%"studiate la dizolarea n soleni organici (Me*H i $C%), n taelul

D!:, se poate osera c alorile acestora sunt foarte apropiate (celmult :nm diferen), cu e0cepia M?L (ma0imul secundar n Me*H s+a nregistrat la :D=nm, fa de cel n $C% nregistrat la :;nm)Pentru a putea anticipa lungimile de und optime pentru deteciaHPLC n domeniul spectral ./+/I", $I%" luate n studiu au fosttestate spectrofotometric dup dizolarea n amestecuri tamponapos2Me*H cu procent de modificator organic ariail (7, :7, D7, =7&77J)! -n figura D!&G este reprezentat, pentru e0emplificaremodificrile spectrale suferite de >?% n funcie de compoziiaamestecului de solatare, ce simuleaz posiile compoziii ale fazeimoile HPLC!


8/22

"pectrele msurate pentru >?% n amestec tamponapos2Me*H

?0amin6nd spectrele analizate, se poate concluziona faptul caceti compui prezint modificri semnificatie ale asoranei nfuncie de raportul n care se afl solenii (tampon apos2Me*H) ianume alori mai mari ale asoranei pentru @>P i PI la dizolaren Me*H &77J, mai mici pentru 4IC (D7J) i >?% (:7J) irespecti, pentru IBP (7J)!

Compuii menionai au fost studiai i la dizolare n soluie

tampon acetat 7,&M (pH < :,) oser6ndu+se o uoar cretere aaasoranei fa de soluii tampon acetat pH < D! -n acest studiu aufost incluse i celelalte $I%"1 %IM, I%4, @?> i AB! .rmrindeoluia modificrilor spectrale n amestecuri similare fazelor moileHPLC, se recomand pentru detecia n ./ alegerea urmtoarelorsemnale (canale) de achiziie1 GDDnm, G=Dnm, :7nm i, cu totulspecial, GG7nm pentru IBP!

Pentru urmtoarele teste s+a utilizat un cromatograf de lichide modelHP &7F7 echipat cu detector cu ir de diode $nalizele au fost


9/22

Kora0 "taleBond "B+C&' ;, 0 &D7mm, D m la un deit de

7,=mL2min i cu o faz moil format din $C%2tampon acetat 7,& M(pH < :,)2Me*H n raport :D2;72GD! $ceast faz moil a fost iniiaaleas a aea pH < :, pentru a asigura trecerea 4IC (formasodic) n forma

acid! 4IC (forma

sodic) are un p@ a < ;! .lterior,

pH+ul a fi crescut la D,, aloare similar studiilor preliminare!

Pentru nregistrarea spectrelor celor &7 $I%" n edereaconstruirii iliotecii de spectre care a fi stocat de softare+ulHPLC+ului pe computerul sistemului cromatografic, s+a procedat lacromatografierea indiidual a fiecrui $I%"! "oluia aleas(construcia iliotecii de spectre n condiii dinamice) are drept scopfinal apropierea c6t mai puternic posiil de forma real a spectrelor ntimpul separrii! "tocarea unor spectre oinute n condiii statice ar fiputut aea consecine nedorite asupra confirmrii identiti

compuilor separai sau asupra puritii spectrale!-n plus, cromatografierea indiidual a $I%" n condiiile metodei cenu se modific permite determinarea timpilor de reteniecorespunztori fiecrui component n parte i stailirea ordinii deeluie n timpul separrii! 4easemeni, prin compararea timpilor deretenie se pot anticipa suprapunerile (coeluiile) nedorite! $ceastetap a fost finalizat cu a#utorul unei serii de soluii etalon de

concentraii cunoscute1 >?% (;Fg2ml)3 PI (;F,GDg2ml)3 M?L(;Fg2ml)3 4IC (;Fg2ml)3 @?> (;Fg2ml)3 @>P (D:,Dg2ml)3 IBP(D77g2ml)3 %IM (D7g2ml)3 AB (D7,=Dg2ml)3 I%4 (;,=Dg2ml)!

-n figura de mai #os sunt prezentate cromatograma ispectrul de asorie nregistrate pentru 4IC!


10/22

Conform timpilor de retenie determinai, se poate staili ordinea de

eluie a acestor $I%" n condiiile metodei utilizate!

-n urma separrii cromatografice la alori diferite aledeitului( fazei moile) se oin urmtoarele cromatograme1


11/22

"epararea unui amestec de apte $I%" la deit de7,=mL2min i 7,DmL2min

"pectrele de asorie ale PI i I%4 oinute n aceast fazmoil, la cele dou deite, sunt reprezentate n figura de mai #os! "eoser c, la reducerea deitului, are loc o micorare a aundeneisemnalului (efect hipocromic), iziil i n reprezentrile spectrale

e0emplificate mai #os!


12/22

"pectrele de asorie pentru PI i I%4, la dou deite diferite(n rou + 7,=mL2min, n alastru 7,DmL2min)

-n taelul de mai #os, sunt centralizate modificrile pe care leproduce asupra picurilor cromatografice de I%4 i PI scderea

deitului fazei moile de la 7,=mL2min la 7,DmL2min!

Influena modificrii deitului de faz moil asupra picurilorcromatografice ale PI i I%4

"e osera1

alura spectrelor i poziia ma0imelor de asorie nu se

modific, n schim asorana scade odat cu scderea

deitului fazei moile3d t d d it l i f i il t li i l


13/22

Pentru a studia influena compoziiei fazei organice din fazamoil asupra separrii cromatografice a amestecului celor apte$I%" e0emplificate (4IC, PI, @>P, %IM, AB, I%4 i IBP), s+a alesca faz moil un amestec format din $C%, Me*H i ap! -n

analizele efectuate, deitul a fost meninut constant, la o aloare de7,=mL2min, la fel i proporia de ap din compoziia fazei moile, la

;7J! $u fost modificate doar proporiile de Me*H i $C%, astfelnc6t coninutul n metanol s creasc n pai de c6te &7J, de la 7 la:7J! Cromatogramele oinute sunt reprezentate n figura careurmeaza!


14/22


15/22

"tudiind ariaiile spectrale se desprind urmtoareleconcluzii1

(+) indiferent de raportul dintre $C% i Me*H, poziia ma0imului de

asorie situat n #urul alorii de :G7nm este constant3(+) cu c6t coninutul n Me*H crete, poziia ma0imului de asoriesituat n interalul G7 G=7nm se deplaseaz treptat spre alori maimici ale lungimii de und3(+) indiferent de proporia dintre cei doi soleni organici, n spectrulde asorie al I%4 e0ist un platou relati constant n interalul G;7G7nm!

* dat cu creterea coninutului de Me*H n faza moil seconstat1

& creterea timpilor de retenie, fapt ce poate fi e0plicat printr+osoluilitate mai mic a acestor componente n Me*H dec6t n$C%3

G pentru primii trei compui aria picurilor este relati constant

n timp ce nlimea picurilor scade iar limea crete3: pentru cel de al patrulea compus aria i nlimea piculuiscade, n timp ce limea crete!

; pentru ultimii doi compui separai apare o anomalie, ianume1 aria, nlimea i limea picurilor nu prezint omodificare uniform!

$6nd n edere faptul c n aceast pro e0ist un numr de

componeni i a6nd n edere oseraiile (:) i (;) se poate afirmafaptul c dintre ultimii patru compui care elueaz, unul sufer odeplasare mai rapid prin coloan dec6t ceilali trei, n fiecare situaien parte oin6ndu+se picuri suprapuse, deci impure! -n consecinmetoda n cauz nu poate fi aplicat n situaia n care n proa deanalizat se gsesc toi aceti patru compui!

Conform datelor e0perimentale se pot desprinde unele


16/22

$ -n compoziia fazei moile este indicat s se foloseasc untampon de pH n loc de ap, oin6ndu+se o scdere a timpuluitotal de analiz i simetrie mai un a unor picuri3

B -n compoziia fazei moile este indicat s se foloseasc dreptmodificator organic un amestec de Me*H i $C%, nu doar unsingur solent, deoarece astfel crete rezoluia separrii3

C 4eitul fazei moile treuie s fie de 7,= 7,'mL2min3 laalori mai mici crete timpul total de analiz, iar la alori maimari scade rezoluia, apr6nd coeluii!

4 $nalizele se or efectua la mai multe lungimi de und(corespunztoare ma0imelor de asorie)3 n acest mod se or

oine sensiiliti ma0ime pentru fiecare component separatcreterea rezoluiei i a simetriei picurilor!.rmtoarele teste s+au realizat pe o coloan ?clipse N4B C&'

(&D7 0 ;,mm, D m)! Aaza moil (deit 7,'mL2min) este constituit

din amestec $C%2Me*H2tampon acetat pH < D (:72:72;7, 22)!4in cromatogramele nregistrate s+a determinat timpul de reteniepentru fiecare compus n parte i s+a nregistrat spectrul de asorie n./+/I"! Prin analiza spectral s+a determinat lungimea de undcorespunztoare ma0imului de asorie pentru fiecare component nparte! "pectrul de asorie nregistrat pentru fiecare component a fostinclus ntr+o iliotec de spectre, ce a seri la identificarea acestoradin amestecuri sau din proe reale! Eraficele care urmeazae0emplific cromatograma i spectrul pentru AB!


17/22

$naliz6nd datele e0perimentale astfel oinute, se aleglungimile de und la care se a face detecia (taelul urmator)!

Lungimile de und corespunztoare ma0imelor de asorie ilungimile de und alese pentru detecia n HPLC

-n continuare, au fost analizate amestecuri de mai mulicomponeni, la lungimi de und corespunztoare, pentru a eidenia


18/22


19/22


20/22

Performanta separarii la G:7 nm

Performanta separarii la G=7 nm


21/22


22/22

Performanta separarii la :=7 nm

cromatografie 1

Documents