Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)

Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)

HPLC metoda analitica utilizata in scopul separarii, identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie.

HPLC este cea mai extins metod cromatografic utilizat pentru analiza analiilor compui biologic activi, fiecare clas a acestora fiind testat separat. Spre deosebire de tehnica LC-MS, nu ofer o certitudine 100% cu privire la identificarea analiilor.HPLC este prescurtarea de la High Performance Liquid Chromatography (Cromatografie lichid de nalt performan), metod de analiz calitativ utilizat n biochimie i chimie analiticpentru separarea, identificarea i cuantificarea compuilor. HPLC folosete o coloan ncrcat cu diferite materiale (faza staionar), o pomp ce mpinge faza(ele) mobil(e) prin coloana i un detector care arat timpurile de retenie ale moleculelor. Timpul de retenie depinde de interaciunea dintre faza staionar, moleculele de analizat i solvenii utilizai.

Analiza

Proba de analizat este introdus n volum mic n fluxul fazei mobile. Trecerea analitului prin coloan este ncetinit de prezena unor interacii de natur chimic sau fizic in faza staionar, acestea trecnd de a lungul coloanei. Totalul ncetinirilor depinde de fiecare analit n parte, faza staionar i compoziia fazei mobile. Timpul la care un analit specific elueaz (iese afar din coloan) este numit timp de retenie; timpul de retenie sub condiii particulare este considerat o caracteristic unic de identificare a analitului dat. Folosirea unei coloane ncrcat cu particule mici (care creeaz o presiune de mpingere mai mare) crete viteza linear, acordnd compuilor timpul minim s difuzeze prin coloan, conducnd astfel la o mbuntire a rezoluiei cromatogramei rezultate. Solvenii comuni care se utilizeaz includ orice combinaie miscibil cu apa sau lichide organice variate (de obicei metanol sau acetonitril). Apa poate conine soluii tampon sau sruri care ajut la separarea componenilor de analizat sau componeni ca acid trifloroacetic care acioneaz ca agent de mperechere ionic.

O rafinare mai bun a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziia fazei mobile n timpul analizei; aceasta este cunoscut sub denumirea de gradient de eluie. Un gradient normal pentru o faz cromatografic invers poate se nceap cu 5% metanol i s creasc pn la 50% n 25 minute; gradientul ales depinde de ct de hidrofob este analitul. Gradientul separ amestecul de analii n funcie de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza staionar.

Fotografie a unui aparat HPLC. De la stnga la dreapta: Pompa de gradient, ce asigur fluxul de solvent, coloana cromatografic, aparat de nregistrare a absorbanei

O schem de flux pentru HPLC

Timp de retenie

Timpul necesar pentru un anumit compus de a cltori prin coloan la detector este cunoscut sub numele de timp de retenie . Acest timp este msurat din momentul n care proba este injectat la punctul n care pe ecran se afieaz o nlime maxim de vrf pentru acel compus.

Pentru un anumit compus, timpul de retenie va varia n funcie de:

presiunea folosit (pentru c afecteaz rata de curgere a solventului)

natura fazei staionare (nu numai materialul din care este confecionat, dar, de asemenea, dimensiunea particulelor)

compoziia exact a solventului

temperatura coloanei

Asta nseamn c, condiiile trebuie s fie atent controlate dac folosii timpi de retenie ca o modalitate de identificare a unor compui.

Detectorul

Exist mai multe metode de detectare atunci cnd o substan a trecut prin coloan. O metod comun, care este uor de explicat foloseste absorbie ultra-violet.

Muli compui organici absorb lumina UV de diferite lungimi de und. Dac avei un fascicul de lumina UV strlucete prin fluxul de lichid care iese din coloan, i un detector UV de pe partea opus a fluxului, putei obine o lectur direct de ct de mult din lumina este absorbit.

Cantitatea de lumin absorbit va depinde de cantitatea de un anumit compus care trece prin raza la momentul respectiv.

Metanol, de exemplu, absoarbe la lungimi de und sub 205 nm, i ap sub 190 nm. Dac ai folosind un amestec de metanol i ap ca solvent, prin urmare, ar trebui s utilizai o lungime de und mai mare de 205 nm, pentru a evita citirile false de solvent.

Interpretarea de ieire de la detectorul

Ieirea va fi nregistrat ca o serie de varfuri - fiecare dintre ele reprezentnd un compus n amestec trece prin detectorul i de a absorbi lumina UV. Atta timp ct ati fost atenti pentru a controla conditiile de pe coloana, ai putea folosi timpii de retentie pentru a ajuta la identificarea compuilor prezenti.Cromatografia lichid de nalt performan ( HPLC , denumite anterior cromatografie lichid de nalt presiune ), este o tehnic n chimie analitic utilizat pentru a separa componentele ntr-un amestec, pentru identificarea fiecrei componente, i de a cuantifica fiecare component. Ea se bazeaz pe pompe pentru a trece un lichid presurizat solventcare conine amestecul de prob printr-o coloan umplut cu un solid material adsorbant . Fiecare component n eantion interacioneaz uor diferit cu materialul adsorbant, provocnd debite diferite pentru diferite componente i care conduce la separarea componentelor, deoarece fluxul de coloana.

HPLC a fost utilizat n scopuri medicale (de exemplu, detectarea nivelurilor de vitamina D in serul sanguin), juridice (de exemplu, detectarea drogurilor de mbuntire a performanei n urin), cercetare (de exemplu, separarea componentelor unui eantion biologic complex, sau de produse chimice sintetice similare de la unul de altul), i de fabricaie (de exemplu, n timpul procesului de producie de produse farmaceutice si biologice) scopuri.

Cromatografia poate fi descris ca un transfer de mas proces care implic adsorbie . HPLC se bazeaz pe pompe pentru a trece un lichid sub presiune i un amestec de prob printr-o coloan umplut cu un adsorbant, care duce la separarea de componentele probei. Componenta activ a coloanei, adsorbant, este de obicei un material granular din particule solide (de exemplu, silice , polimeri, etc), 2-50 microni n dimensiune. Componentele amestecului prob sunt separate unul de altul, datorit diferitelor grade lor de interaciune cu particulele absorbante. Lichidul sub presiune este de obicei un amestec de solveni (de exemplu ap, acetonitril i / sau metanol) i este menionat ca o "faz mobil". Compoziie i de temperatura joac un rol major n procesul de separare prin influenarea interaciunilor care au loc ntre componente eantion i absorbant. Aceste interaciuni sunt de natur fizic, cum ar fi hidrofob (dispersiv), dipol-dipol i ionic, cel mai adesea o combinaie a acestora.

HPLC se distinge de tradiional ("presiune joas") cromatografia de lichide , deoarece presiunile de exploatare sunt semnificativ mai mari (50-350 bar), n timp ce cromatografia lichid obinuit se bazeaz de obicei pe fora de gravitaie pentru a trece faza mobil prin coloan. Avnd n vedere cantitatea mic de prob separat la HPLC analitic, dimensiunile tipice de coloan sunt cu diametrul de 2.1 - 4.6 mm, i 30 - 250 mm lungime. De asemenea coloane HPLC sunt realizate cu sorbent mici (2-50 micrometri n dimensiune medie a particulei).Acest lucru ofer HPLC superioar putere de rezoluie , atunci cnd separarea amestecurilor, care este de ce este o tehnica cromatografic popular.

Schema unui instrument HPLC include de obicei un sampler, pompe, i un detector. Prelevare aduce amestecul de prob n fluxul fazei mobile pe care o desfoar n coloan.Pompele realizat debitul dorit i compoziia fazei mobile prin coloan. Detectorul genereaz un semnal proporional cu cantitatea de component prob iese din coloan, permind astfel pentru cantitativ analiza componentele probei. O digitale microprocesor i software-ul de utilizator de control instrumentul HPLC i s ofere o analiz a datelor. Unele modele de pompe mecanice ntr-un instrument HPLC poate amesteca multiple solveni mpreun n proporii schimbare n timp, genernd o compoziie de gradient n faza mobil. Diferite detectoare sunt n uz comun, cum ar fi UV / Vis , fotodiod array (PDA) sau bazate pe spectrometrie de mas . Cele mai multe instrumente HPLC au, de asemenea, un cuptor coloan care permite reglarea temperaturii separarea se efectueaz la.

Operaiune

Amestecul de prob s fie separate i analizate este introdus, ntr-un volum mic discret (de obicei microlitri), n fluxul fazei mobile se scurge din coloan. Componentele probei deplasa prin coloan cu viteze diferite, care sunt funcie de interaciuni fizice specifice cu adsorbantul (numit i faz staionar). Viteza fiecrei componente depinde de natura sa chimic, de natura fazei staionare (coloan) i de compoziia fazei mobile. n momentul n care o anumit eluat de analizat (iese din coloana) este numit timpul de retenie.Timpul de retenie msurat n condiii speciale este considerat o caracteristic de identificare a unui anumit analit.

Multe tipuri diferite de coloane sunt disponibile, umplute cu sorbeni variind ca mrime a particulelor, i n natura suprafeei lor ("chimia de suprafa"). Utilizarea de materiale de ambalare mai mici dimensiuni a particulelor necesit utilizarea presiunii de funcionare mai mare ("contrapresiune") i mbuntete n mod tipic rezoluia cromatografic (adic gradul de separare ntre analii consecutive emergente din coloan). n ceea ce privete chimia de suprafa, particulele absorbante poate fi hidrofob polar sau n natur.

Faze mobile comune utilizate includ orice combinaie miscibil cu apa cu diveri solveni organici (cele mai comune sunt acetonitril i metanol ). Unele tehnici HPLC utiliza faze mobile lipsite de ap (a se vedea cromatografie Normal faz de mai jos). Componenta apoas a fazei mobile poate conine acizi (de exemplu, formic, fosforic sau acid trifluoracetic ) sau sruri pentru a ajuta la separarea de componentele probei. Compoziia fazei mobile poate fi meninut constant ("mod izocratic eluare") sau variate ("Mod gradient de eluare") n timpul analizei cromatografice. Eluare izocratic este de obicei eficient n separarea componentelor eantion care nu sunt foarte diferite n afinitatea lor pentru faza staionar. In gradient de eluie compoziia fazei mobile este variat n mod tipic de la mic la mare putere de eluie. Concentraia eluare al fazei mobile este reflectat de timpi de retenie analit cu rezisten ridicat eluie productoare de eluare rapid (= timpii de retenie scurt). Un profil tipic de gradient n cromatografia n faz invers ar putea ncepe de la 5% acetonitril (n ap sau tampon apos) i progresul liniar la 95% acetonitril timp de 5-25 minute. Perioadele de compoziia fazei mobile constant poate fi parte din orice profil de gradient. De exemplu, compoziia fazei mobile poate fi meninut constant la 5% acetonitril pentru 1-3 min, urmat de o schimbare liniar de pn la 95% acetonitril.

Compoziia ales al fazei mobile (de asemenea, numit eluant) depinde de intensitatea interaciunilor dintre diferitele componente de prob ("substane de analizat") i faza staionar (de exemplu, interaciunile hidrofobe din HPLC n faz invers).Acest proces de partiionare este similar cu cel care apare n timpul unei extracia lichid-lichid , dar este continuu, nu n etape. n acest exemplu, folosind un gradient de ap / acetonitril, componentele mai hidrofobi vor elua (intre pe coloana) trziu, odat faza mobil devine mai concentrat n acetonitril (adic ntr-o faz mobil de rezisten care elueaza mai sus).

Alegerea componentelor fazei mobile, aditivi (cum ar fi sruri sau acizi) i condiiile de gradient depinde de natura i de coloan prob componentele. Cromatografie de partiie

Coeficientul de partiie

Cromatografie de partiie a fost primul tip de cromatografie care chimisti dezvoltat. principiu a fost aplicat n cromatografie pe hrtie , cromatografie n strat subire , n faz de gaz i aplicaii lichid-lichid. 1952 Premiul Nobel pentru chimie a fost ctigat de ctre Archer John Porter Martin i Richard Laurence Millington Syngepentru dezvoltarea lor de tehnica, care a fost folosit pentru separarea lor de aminoacizi . Cromatografia de partiie folosete un solvent reinut, pe suprafaa sau n granule sau fibre de o matrice "inert" solid de sprijin i cu cromatografie pe hrtie ; sau profit de unele coulombice i / sau donor de hidrogen interaciune cu faza staionar. Analit molecule partiie ntre o faz staionar lichid i eluentul. La fel ca n hidrofil Interaciuni Cromatografia (HILIC, un sub-cadrul tehnica HPLC), aceast metod separ analii bazate pe diferene de polaritate lor. HILIC folosete cel mai adesea un polar lipite faz staionar i o faz mobil de acetonitril fcute n principal cu ap drept component puternic. Partiie HPLC a fost folosit istoric pe silice sau alumin suporturi nelegate. Fiecare funcioneaz n mod eficient pentru separarea compuilor prin diferenele relative polare. HILIC faze lipite au avantajul de a separa acide , de baz substane dizolvate i neutre ntr-o singur trecere cromatografic. [ 2 ]Analiilor polare difuzeaz ntr-un strat de ap staionar asociat cu faza staionar polar i sunt astfel reinute. Cu ct este mai interaciunile dintre analit polar i faza staionar polar (n raport cu faza mobil) este mai mare timpul de eluie. Concentraia interaciune depinde de partea grupe funcionale din structura molecular a unei substane analizate, cu grupuri mai polarizate (de exemplu hidroxil-) i grupri capabile s lege hidrogenul de inducere mai retenie. coulombice (electrostatice) interaciuni poate crete, de asemenea, de retenie. Utilizarea mai multor solveni polari n faza mobil se va reduce timpul de retenie al analiilor, n timp ce mai muli solveni hidrofobi tind s creasc timp de retenie.

HILIC Partition Tehnica Range utile

Cromatografie n faz normal

Cromatografia cu faz normal a fost unul dintre primele tipuri de HPLC care chimiti dezvoltate. De asemenea, cunoscut sub numele de faza normala HPLC (NP-HPLC) aceast metod separ analiilor pe baza afinitii lor pentru o suprafa staionar polar cum ar fi silice, prin urmare, se bazeaz pe capacitatea unei substane analizate pentru a se angaja n interaciuni polare (cum ar fi hidrogen-lipirea sau dipol- dipol tip de interaciuni) cu suprafaa adsorbantului. NP-HPLC folosete o, faz mobil neapos nepolar (de exemplu, cloroform ), i funcioneaz n mod eficient pentru separarea analiilor uor solubili n solveni nepolari. Asociailor de analizat cu i este reinut de faza staionar polar. Forte de absorbie crete cu creterea polaritate analit. Puterea interaciune depinde nu numai de gruprile funcionale prezente n structura moleculei analit, ci i de factori sterice . Efectul de mpiedicare steric pe puterea interaciune permite aceast metod pentru a rezolva (specifice) izomerii structurali .

Utilizarea mai multor solveni polari n faza mobil se va reduce timpul de retenie de analii, n timp ce mai muli solveni hidrofobi au tendina de a induce eluare mai lent (creterea timpilor de retenie). Foarte solveni polari cum ar fi urme de ap n faza mobil au tendina de adsorbie pe suprafaa solid a fazei staionare formnd un legat (apa) strat staionar, care este considerat a juca un rol activ n retenie. Acest comportament este oarecum specific chromatograhy faz normal fiind dominat aproape exclusiv de ctre un mecanism de adsorbie (de exemplu, substane de analizat s interacioneze cu o suprafa solid, mai degrab dect cu stratul solvatat unui ligand ataat la suprafaa de sorbent, a se vedea, de asemenea, HPLC cu faz invers de mai jos) . Cromatografia de absorbie este nc utilizat pe scar larg pentru separri de izomeri structurale, att n coloan i formate de cromatografie n strat subire pe activat (uscate), dioxid de siliciu sau alumin suporturi.

Partiia-i NP-HPLC a czut n dizgraie n 1970 cu dezvoltarea de faz invers HPLC cauza o reproductibilitate redus de timpi de retenie, datorit prezenei unui strat de ap sau solvent organic protic pe suprafaa silicei saualumina suporturi cromatografice . Acest strat se schimba cu orice modificri n compoziia fazei mobile (de exemplu, nivel de umiditate) care provoac n deriv timp de retenie.

Recent, cromatografia de partiie a devenit din nou popular cu dezvoltarea HILIC faze lipite care demonstreaz mbuntirea reproductibilitate, i ca urmare a unei mai bune nelegeri a gamei de utilitatea tehnicii.

Cromatografie de deplasare

Principiul de baz al cromatografiei de deplasare este: O molecul cu o mare afinitate pentru matricea cromatografie (de deplasare) va concura eficient pentru situsurile de legare, i astfel deplasa toate moleculele cu afiniti mai mici. [ 3 ] Exist diferene clare ntre deplasare i cromatografie de eluie . n modul de eluie, substane de obicei apar de la o coloan la vrfuri nguste, Gaussian. Separarea larg de vrfuri, de preferin la valoarea iniial, este de dorit pentru a realiza purificarea maxim. Viteza cu care orice component a unui amestec se deplaseaza in jos a coloanei n modul de eluie depinde de muli factori. Dar pentru dou substane s cltoreasc la viteze diferite, i, prin urmare, s fie rezolvate, trebuie s existe diferene substaniale n unele interaciune dintre biomolecule i matricea cromatografie. Parametrii de operare sunt ajustate pentru a maximiza efectul acestei diferene. In multe cazuri, separarea de baz a vrfurilor poate fi realizat numai cu gradient de eluie i ncrcri reduse de coloan. Astfel, dou dezavantaje la cromatografie n modul de eluie, n special la scara preparativ, sunt complexitatea operaional, datorit pompare gradient de solvent, i un randament foarte mic, datorit ncrcrilor coloan sczute. Cromatografie de deplasare are avantaje fata de cromatografie de eluie n care componentele sunt rezolvate n zone consecutive de substane pure, mai degrab dect "varfuri". Deoarece procesul profit de neliniaritatea izotermele, o coloan de alimentare mai mari pot fi separate ntr-o anumit coloan cu componentele purificate recuperate la o concentraie semnificativ mai mare.

Cromatografie n faz invers (RPC)

Un cromatogram de amestec complex (apa de parfum) obinut prin HPLC cu faz invers

Pentru mai multe detalii cu privire la acest subiect, a se vedea cromatografia de faz invers .

HPLC cu faz invers (RP-HPLC) are o faz staionar nepolar i o faz mobil apoas, moderat polar. O faz staionar comun este o silice care a fost modificat cu suprafa RME 2 SiCl, unde R este o grupare alchil cu caten linear, cum ar fi C 18 H 37 sau C 8 H 17 . Cu astfel de faze staionare, timpul de retenie este mai lung de molecule care sunt mai puin polar, n timp ce moleculele polare se elueaz mai repede (devreme n analiz). Un investigator poate crete timpii de retenie prin adugarea de mai mult ap la faza mobil; fcnd astfel afinitatea substanei de analizat hidrofob pentru hidrofob fazei staionare relativ puternic pentru faza mobil acum mai hidrofil. n mod similar, un investigator poate reduce timpul de retenie prin adugarea de solvent organic mai la eluent. RP-HPLC este att de frecvent utilizate, care este adesea incorect denumit "HPLC" fr specificare. Industria farmaceutic are n mod regulat RP-HPLC pentru a beneficia de droguri nainte de eliberarea lor.

RP-HPLC funcioneaz pe principiul de interaciuni hidrofobe, care provine de la simetria mare n structura de ap dipolar i joac rolul cel mai important in toate procesele n domeniul tiinei vieii. RP-HPLC permite msurarea acestor fore interactive. Legarea analitului la faza staionar este proporional cu aria suprafeei de contact jurul segmentului nepolar al moleculei analitului la asociere cu ligandul pe faza staionar. Acest solvophobic efect este dominat de fora apei pentru "cavitate-reducere" n jurul analit i C 18 -lan versus complexul de ambele. Energia eliberat n acest proces este proporional cu tensiunea superficial a eluentului (ap: 7,3 x 10 -6 J / cmp, metanol: 2,2 x 10 -6 J / cmp) i pe suprafaa hidrofob a analitului i ligandul respectiv . Retenia poate fi redus prin adugarea unui solvent mai puin polar (metanol, acetonitril ) n faza mobil pentru a reduce tensiunea superficial a apei. eluie gradient folosete acest efect prin reducerea n mod automat polaritatea i tensiunea superficial a fazei mobile apoas n timpul cursului analizei.

Proprieti structurale ale moleculei analit joac un rol important n caracteristicile de retenie. n general, un analit cu o suprafa mai mare suprafa hidrofob (CH, CC, i legturi atomice n general, non-polari, cum ar fi SS i alii) este reinut mai mult, deoarece acesta este nu interacioneaz cu structura de ap. Pe de alt parte, analii cu arie mai mare suprafa polar (conferit de prezena gruprilor polare, cum ar fi-OH,-NH 2 , COO - sau-NH 3 +n structura lor) sunt mai puin reinut ca acestea sunt mai bine integrate n ap . Astfel de interaciuni sunt supuse efectelor sterice n care molecule foarte mari poate fi restricionat numai accesul la porii faza staionar, n care interaciunile cu liganzi de suprafa (lanuri alchil) au loc. O astfel de obstacol suprafa de obicei rezultate in mai putin de retenie.

Timp de retenie crete cu hidrofob (non-polar) suprafa. Compui cu caten ramificat se elueaz mai rapid dect izomerii lor liniare corespunztoare, deoarece aria suprafeei totale este sczut. Compui organici cu un singur mod similar CC-obligaiuni elueaz mai trziu dect cele cu un C = C sau legtur tripl-CC, ca legtura dubl sau tripl este mai scurt dect o singur CC-legtur.

n afar de tensiune mobil suprafa faz (puterea de organizare n structura eluent), alte modificatori fazei mobile pot afecta retenie analit. De exemplu, adugarea de sruri anorganice determin o cretere liniar moderat a tensiunii superficiale a soluiilor apoase (cca. 1,5 x 10 -7 J / cm per Mol de NaCl, 2,5 x 10 -7 J / cm per Mol de (NH 4 ) 2 SO 4 ), i pentru c entropia a interfeei-analit de solvent este controlat de tensiune superficial, adugarea de sruri tind s creasc timpul de retenie. Aceast tehnic este utilizat pentru separarea i recuperarea uoar a proteinelor i protecie a activitii lor biologice n analiza proteinelor (cromatografie de interacie hidrofob, HIC).

Un alt factor important este faza mobil pH deoarece poate schimba caracterul hidrofob al analitului. Din acest motiv, cele mai multe metode folosesc un agent de tamponare , cum ar fi fosfat de sodiu , pentru a controla pH-ul.Tampoane servi unor scopuri multiple:. Controlul pH-ului, neutraliza sarcina pe suprafaa de silice a fazei staionare i acioneaz ca ageni de mperechere de ioni pentru a neutraliza sarcina analit amoniu formiat este frecvent adugat n spectrometrie de mas pentru a mbunti detectarea unor analii prin formarea de analit -amoniu aduci . Un acid organic volatil, cum ar fi acidul acetic , sau cel mai frecvent acid formic , este adesea adugat n faza mobil dac spectrometrie de mas sunt folosite pentru analiza efluentului coloanei. Acidul trifluoroacetic este frecvent utilizat n aplicaii de spectroscopie de mas datorit persistenei sale n detector i solvent sistem de livrare, dar poate fi eficient n mbuntirea reteniei de analii, cum ar fi acizii carboxilici n aplicaii care utilizeaz alte detectoare, deoarece este un acid organic destul de puternic. Efectele acizilor i tampoane variaz n funcie de aplicaie, dar mbunti, n general, rezoluie cromatografic.

Coloane cu faz invers sunt destul de dificil de daune, comparativ cu coloane normale de silice; cu toate acestea, numrul de coloane faz invers constau din alchil derivat particule de silice i trebuie niciodat utilizat cu apoase baze ca acestea vor distruge particula de baz de siliciu. Ele pot fi folosite cu acid apos, dar coloana nu trebuie expuse la acidul pentru prea mult timp, deoarece poate coroda piesele metalice ale echipamentului HPLC.RP-HPLC coloane trebuie splat cu solveni curat dup utilizare pentru ndeprtarea acizilor reziduali sau tampoane, i depozitate ntr-o compoziie corespunztoare de solvent. Coninutul de metale de coloane HPLC trebuie s fie pstrate sczut n cazul n care cel mai bine capacitatea de posibil s se separe de substane trebuie s fie pstrat. Un test bun pentru coninutul de metal al unei coloane este de a injecta o prob care este un amestec de 2,2 '- i 4,4' - bipiridina . Pentru ca 2,2 '-bipy poate chela metalul, forma vrfului de 2,2 '-bipy va fi denaturat (coada) atunci metalice

HYPERLINK "http://en.wikipedia.org/wiki/Ion"ioni sunt prezente pe suprafaa silicei . [ necesit citare ] ..

Cromatografie de excludere [ edit ]

Pentru mai multe detalii cu privire la acest subiect, a se vedea cromatografie de excludere .

Cromatografie de excludere (SEC), de asemenea cunoscut sub numele de cromatografie pe gel permeabil sau cromatografia cu filtrare pe gel , separ particulele pe baza dimensiunii moleculare (de fapt de o particul de raz Stokes ). Este, n general, o cromatografie rezoluie mic i, prin urmare, este de multe ori rezervat pentru finala, "lustruit" pas de purificare. De asemenea, este util pentru determinarea structurii teriare i cuaternare structura de proteine purificate. SEC este utilizat n principal pentru analiza de molecule mari, cum ar fi proteine sau polimeri. SEC functioneaza prin captarea acestor molecule mai mici, n porii unei particule. Moleculele mai mari, pur i simplu trece prin porii ca acestea sunt prea mari pentru a intra porii. Prin urmare, moleculele mai mari curge prin coloan rapid dect molecule mai mici, adic mai mici molecula, timpul de retenie mai lung.

Aceast tehnic este utilizat pe scar larg pentru determinarea greutii moleculare a polizaharidelor. SEC este tehnica oficial (sugerat de farmacopee european) pentru compararea greutate molecular de diferite disponibile comercial-greutate molecular mic heparine .

Cromatografia de schimb ionic

Pentru mai multe detalii cu privire la acest subiect, a se vedea cromatografie prin schimb de ioni .

In cromatografia cu schimb de ioni (IC), retenie se bazeaz pe atracia dintre ionii de solut i site-uri practicate legai la faza staionar. Ionii substanei dizolvate din aceeai sarcin ca i site-urile practicate pe coloana sunt excluse de la legarea, n timp ce ionii de solut de sarcin opus a siturilor ncrcate ale coloanei sunt reinute pe coloan. Ionii de solut care sunt reinute pe coloan poate fi eluat din coloan prin schimbarea condiiilor de solveni (de exemplu, creterea efectului de ioni de solvent prin creterea concentraiei de sare din soluie, crescnd temperatura coloanei, schimbarea pH-ului solventului, etc ..).

Tipuri de schimbtori de ioni includ:

Rini de polistiren - Acestea permit legtura transversal care crete stabilitatea lanului. Legtur cruce mai mare reduce dezechilibrul, care mrete timpul de echilibrare i n cele din urm imbunatateste selectivitate.

Celuloz i dextran ioni schimbtoare (geluri) - Aceste posed dimensiuni ale porilor mai mari i o densitate de ncrcare mici ceea ce le face potrivite pentru separare de proteine.

Sticl controlat cu pori sau siliciu poros

n general, schimbtori de ioni favorizeaz legarea ionilor de ncrcare mai mare i raz mic.

O cretere a contra ioni (n raport cu grupele funcionale rini) concentrarea, reduce timpul de retenie. O scdere a pH-ului se reduce timpul de retenie n schimb de cationi n timp ce o cretere a pH-ului se reduce timpul de retenie n schimb anionic. Prin scderea pH-ul solventului ntr-o coloan de schimb de cationi, de exemplu, mai multe ionii de hidrogen sunt disponibile pentru a concura pentru poziii de pe faza staionar anionic, eluare astfel cationi slab legate.

Aceast form de cromatografie este utilizat pe scar larg n urmtoarele aplicaii: purificarea apei, preconcentrare a componentelor n urme, cromatografia cu schimb de ligand, cromatografie cu schimb de ioni de proteine, cromatografie prin schimb anionic de nalt pH de glucide i oligozaharide, i altele.

Cromatografie Bioaffinity

Pentru mai multe detalii cu privire la acest subiect, a se vedea cromatografie de afinitate .

Acest proces cromatografic se bazeaz pe proprietatea de substane biologic active, pentru a forma compleci stabili, specifice, i reversibile. Formarea acestor complexe implic participarea forelor moleculare comune, cum ar fi Van der Waals interaciune , interaciunea electrostatic, interaciunea dipol-dipol, interaciunea hidrofob, iar legtura de hidrogen. O legtur eficient, biospecifice este format dintr-o aciune simultan i concertat a mai multor astfel fore n site-urile de legare complementare.

Cromatografie normal faz apoas

Apoas cromatografia cu faz normal (ANP) este o tehnic cromatografic care cuprinde regiunea faz mobil ntre cromatografia n faz invers (RP) i cromatografia n faz normal organic (FRD). Aceast tehnic este utilizat pentru a realiza selectivitatea unic pentru compuii hidrofili, artnd n faz normal utiliznd solveni de eluie cu faz invers.

Izocratic i gradient de eluare

O separare n care faza mobil compoziia rmne constant pe toat durata procedurii este numit izocratic (adica compoziie constant ). Cuvntul a fost inventat de ctre Csaba Horvath , care a fost unul dintre pionierii de HPLC.

Compoziia fazei mobile nu trebuie s rmn constant. O separare n care compoziia fazei mobile se modific pe parcursul procesului de separare este descris ca un gradient de eluie . [ 4 ] Un exemplu este un gradient pornind de la 10% metanol i se termin la 90% metanol n minutul 20. Cele dou componente ale fazei mobile sunt n general denumite "A" i "B", A este "slab" solvent care permite soluiei s se elueaz ncet, n timp ce B este "puternic" Solventul care elueaz rapid substanele dizolvate din coloana . In cromatografia cu faz invers , solvent A este adesea ap sau ap tampon, n timp ce B este un solvent organic miscibil cu apa, cum ar fi acetonitril , metanol, THF , sau izopropanol .

n eluare izocratic, limea de vrf crete cu timpul de retenie liniar n conformitate cu ecuaia de N, numrul de talere teoretice. Acest lucru conduce la dezavantajul c varfuri trziu elutie ajunge foarte plat i larg. Forma i limea lor le poate pstra de a fi recunoscut ca vrfuri.

Gradient de eluie scade pstrarea componentelor mai trziu de eluare, astfel nct acestea se elueaz mai repede, dnd mai nguste (i mai nalte) vrfuri de cele mai multe componente. Aceasta mbuntete, de asemenea, forma de vrf pentru vrfuri coada, pe msur ce concentraia n cretere a eluentului organice mpinge partea de decantare a unui vrf nainte. Acest lucru crete, de asemenea, nlimea vrfului (vrful arata "clar"), ceea ce este important n analiza urmelor. Programul de gradient poate include subite "pas" creterea procentului de component organic sau pante diferite momente diferite - toate conform dorinei de separare optim n timp minim.

n eluare izocratic, selectivitatea nu se schimb dac dimensiunile coloanelor (lungime i diametru interior), schimbare - adic, vrfurile elua n aceeai ordine. n gradient de eluare, ordinea de eluare se poate schimba ca dimensiunile sau fluxul de modificare a ratei. [ necesit citare ]

Fora motrice n cromatografia n faz invers are originea n ordinea mare a structurii de ap. Rolul componentei organice a fazei mobile este de a reduce aceast ordine de mare i, astfel, reduce puterea de ntrziere a componentei apoase.

Parametrii

Separri HPLC au parametrii teoretice i ecuaii pentru a descrie separarea componentelor n vrfuri de semnal cnd detectat de instrumente, cum ar fi printr-un detector de UV sau un spectrometru de mas. Parametrii sunt n mare parte derivat din dou seturi de teorii: teoria chromatagraphic plac (ca parte din cromatografia de partiie ), i teoria rata de cromatografie / ecuaiei Van Deemter . Desigur, ele pot fi puse n practic prin analiza de cromatogramele HPLC, dei teoria rata este considerat teoria mai precise.

Ei sunt analog cu calculul factorului de retenie pentru o cromatografie pe hrtie de separare, dar descrie ct de bine separ HPLC-un amestec n dou sau mai multe componente care sunt detectate ca vrfuri (benzi), pe o cromatogram. Parametrii HPLC sunt: factorul de eficien ( N ), factorul de retenie (kappa prime), i factorul de separare (alfa). mpreun factorii sunt variabile ntr-o ecuaie rezoluie, care descrie ct de bine vrfuri dou componente "separat sau suprapus reciproc. Aceti parametri sunt cele mai utilizate doar pentru a descrie HPLC cu faz invers i HPLC n faz normal, separri, deoarece aceste separri tind s fie mai subtile dect alte moduri HPLC (de exemplu, schimbtoare de ioni i de excludere dimensiune).

Volumul gol este cantitatea de spaiu ntr-o coloan care este ocupat de solvent. Este spaiul n coloan din afara materialului de ambalare interior coloanei. Volumul gol este msurat pe o cromatogram ca primul vrf component detectat, care este, de obicei, solventul care a fost prezent n amestecul de prob; n mod ideal, proba de solvent curge prin coloan fr a interaciona cu coloana, dar este nc detectabil separat de solventul HPLC. Volumul golului este folosit ca un factor de corecie.

Factorul de eficien ( N ) practic masoara cat vrfuri ascuite componente de pe cromatogram sunt, ca raport ntre suprafaa de vrf a componentei ("timp de retenie") n raport cu limea vrfurilor la cel mai larg punctul lor (la linia de baz). Vrfuri care sunt nalt, ascuit, i relativ ngust indic faptul c metoda de separare eliminat eficient o component dintr-un amestec; de nalt eficien. Eficiena este foarte dependent de coloana HPLC i metoda HPLC utilizat. Factorul de eficienta este sinonim cu numr de nmatriculare, precum i "numrul de talere teoretice".

Factor de retenie ( kappa prim msuri) ct timp o component a amestecului lipit de coloana, msurat prin aria de sub curba de vrf ntr-o cromatogram (din cromatogramele HPLC sunt n funcie de timp). Fiecare vrf cromatogram va avea propriul factor de retenie (de exemplu, kappa 1 pentru factorul de retenie de primul vrf). Acest factor poate fi corectat prin volumul gol al coloanei.

Factorul de separare ( alfa ) este o comparaie relativ de ct de bine dou componente vecine ale amestecului s-au separat (de exemplu, dou benzi vecine, pe o cromatogram). Acest factor este definit n termeni de proporie a factorilor de retenie ai o pereche de vrfuri cromatogramei vecine, i pot fi, de asemenea, corectate prin volumul gol al coloanei. Cu att mai mare valoarea factorului de separare este de peste 1,0, cu att mai bine separarea, pn la aproximativ 2,0 dincolo de care o metod HPLC este, probabil, nu este necesar pentru separare.

Ecuaii de rezoluie se refer cei trei factori, astfel nct eficien i de separare de mare de factori a mbunti rezoluia de vrfuri componente ntr-o separare HPLC.

Diametru interior

Diametrul interior (ID) al unei coloane HPLC este un parametru important care influeneaz sensibilitatea detectrii i selectivitatea de separare n gradient de eluare. Se determin, de asemenea, cantitatea de analit care poate fi ncrcat pe coloan. Coloane mai mari sunt, de obicei, observate n aplicaii industriale, cum ar fi purificarea unui produs medicamentos pentru utilizare ulterioar. Coloane-ID sczut s-au mbuntit de sensibilitate i de consum de solvent mai mic n detrimentul capacitii de ncrcare.

In coloane mari (peste 10 mm) sunt utilizate pentru a purifica cantiti refolosibile datorit capacitii lor de ncrcare mare

Coloane scar analitic (4,6 mm) au fost cel mai frecvent tip de coloane, dei coloane mai mici, sunt rapid ctig n popularitate. Ele sunt folosite n analiza tradiional cantitativ a probelor i de a folosi de multe ori un UV-Vis detector de absorbie .

Coloane nguste cu teava (1-2 mm) sunt utilizate pentru aplicaii atunci cnd se dorete sensibilitate mai fie cu UV-vis detectoare speciale, fluorescenta de detectare sau cu alte metode de detectare, cum ar fi spectrometrie de mas-cromatografie lichidColoane capilare (sub 0,3 mm) sunt utilizate aproape exclusiv cu detectare mijloace alternative, cum ar fi spectrometrie de masa . Ele sunt de obicei fabricate din silice topit capilare, mai degrab dect tuburile din oel inoxidabil, care folosesc coloane mari.

Dimensiunea particulelor

Cele mai HPLC tradiional se face cu faza staionar ataat la exteriorul mici sferice de silice particule (granule foarte mici). Aceste particule vin ntr-o varietate de dimensiuni, cu 5 microni margele fiind cele mai frecvente.Particulele mai mici ofer n general o arie mai mare i separri mai bune, dar presiunea necesar pentru creterea vitezei liniare optime de inversul diametrului particulei ptrat.

Aceasta nseamn c schimbarea la particule care sunt pe jumtate la fel de mare, pstrnd dimensiunile coloanei fel, va dubla performana, dar crete presiunea necesar cu un factor de patru. Particulele mai mari sunt folosite n HPLC preparativ (diametre de coloan de 5 cm pana la> 30 cm) i pentru aplicaii non-HPLC cum ar fi extracia n faz solid .

Dimensiunea porilor

Multe faze staionare sunt poroase pentru a oferi o suprafa mai mare. Pori mici ofer o suprafa mai mare n timp ce dimensiune mai mare a porilor are cinetic mai bune, n special pentru analii mai mari. De exemplu, o protein care este doar puin mai mic dect s-ar putea introduce un por porilor, dar nu las uor odat nuntru.

Pomp de presiune

Pompe variaz n capacitatea de presiune, dar performana lor este msurat pe capacitatea lor de a produce un consecvent i reproductibil debit . de presiune poate ajunge la fel de mare ca de 40 MPa (6000 lbf / in 2 ), sau aproximativ 400 de atmosfere. Sistemele moderne HPLC au fost mbuntite pentru a lucra la presiuni mult mai mari, i, prin urmare, sunt capabili de a utiliza particule cu dimensiuni mult mai mici n coloanele (