ELABORAREA METODEI HPLC PENTRU STUDIU FITOCHIMIC AL SPECIEI HZPERICUM PERFORATUM

CHIMIE GENERAL I FARMACEUTICTEHNOLOGIA MEDICAMENTELOR

ELABORAREA METODEI HPLC PENTRU STUDIU FITOCHIMIC AL SPECIEI HYPERICUM PERFORATUM L.Igor Casian, Ana Casian, Vladimir Valica

Centrul tiinific n domeniul Medicamentului al USMF Nicolae Testemianu

Summary

Elaboration of the HPLC method for the phytochemical study of Hypericum perforatum L. speciesThe HPLC method with multiwavelength UV-VIS detection has been developed for the quantification of pharmacologically active substances in herb of St. Johns Wort (Hypericum perforatum L.) and in extractive products.The procedure for preparation of raw material samples has been optimized, having in mind instability of some active substances in solutions.

It was confirmed, that the greatest part of active substances can be found in flowers, smaller amount - in leaves, but stems are practically deprived them.

Rezumat

S-a elaborat metoda HPLC cu detecia n UV-VIS cu mai multe lungimi de und pentru dozarea substanelor farmacologic active n herba de suntoare (Hypericum perforatum L.) i n produsele lor extractive.

Procedura de preparare a probelor de produs vegetal a fost optimizat, innd cont de instabilitatea unor substane active n soluii.

S-a confirmat, c cantitatea major a substanelor active se afl n flori, mai puine n frunze, iar tulpinile practic sunt lipsite de ele.

Actualitatea temei

Suntoarea (Hypericum perforatum L., familia Hypericaceae ) este o plant ce prezint n continuare interes pentru studiu din punct de vedere att farmacologic, ct i fitochimic. Preparatele din suntoare manifest un spectru larg de aciune farmacologic, inclusiv antidepresiv, adaptogen, hepatoprotectoare, antimicrobian, antiinflamatoare . a [2, 3, 4]. De asemenea componena chimic a plantei este destul de complex, incluznd substane din diferite grupe, n primul rnd, compui fenolici [3, 5]. Nectnd la faptul, c suntoarea se consider o plant suficient studiat, pn n prezent nu exist o prere unic despre componentul sau grupa de componeni, care sunt responsabili pentru aciunile farmacologice. Din aceasta cauz nu exist o abordare unic fa de standardizarea produselor farmaceutice obinute din herba de suntoare. n orice caz, n studiile fitochimice existente i farmacognostice se prefer maximum o descriere ct mai detaliat a compoziiei chimice i minimum determinarea substanelor potenial active i celor caracteristice pentru specia studiat.

Un aport considerabil n soluionarea acestei sarcinii pot servi metodele analitice universale i, n primul rnd, cromatografice. Alte metode, inclusiv i cele farmacopeice, destinate dozrii unor grupe chimice aparte, i aplicate n studiile de rutin complexe a plantei sunt incomode i ineficiente, cernd un volum enorm de operaiuni la etapele de preparare a probelor i de analiz propriu-zis [1].

Obiectivele lucrrii

Scopul prezentei lucrrii a constat n elaborarea metodei HPLC pentru dozarea mai multor substane din diferite grupe chimice ntr-o singur prob.

Materiale i metode

n lucru s-a utilizat cromatograful de lichide din seria Jasco LC-2000, alctuit din dou pompe, amestector dinamic de presiune nalt, injector manual, termostat de coloane i detector UV-VIS cu ir de diode (DAD). Separarea cromatografic s-a studiat pe coloane analitice cu faza invers. Componenii tamponului au fost de gradul de puritate chimic pur, iar acetonitrilul pentru HPLC. Substanele de referin au fost procurate de la Fluka i Sigma-Aldrich.

Rezultate i discuii

Alegerea condiiilor de separare a analizilor a fost dictat, mai nti de comportarea cromatografic a derivailor de antracen condensai (hipericin i pseudohipericin). Avnd molecule cu structura plat i dimensiuni majorate, aceti compui demonstreaz efecte de excluzie pe sorbenii cu mrimea porilor 60-80 , care sunt utilizai pe larg. Pe de alt parte, posednd cte 6 hidroxili fenolici ntr-o molecul, aceti compui fiind analizai pe coloane cu faza C-8 sau C-18 formeaz picuri cromatografice cu forma alterat, posibil din cauza aportului majorat de interaciuni nespecifice. Rezultate mai satisfctoare am obinut analiznd probele pe coloana cu sorbent Kromasil 100 C-4. mbuntirea ulterioar a formei picurilor s-a atins cu utilizarea concentraiilor nalte ale electrolitului puternic n faza mobil.

Fig. 1. Cromatograma extractului din herb de suntoare i forma gradientului programat la ntrarea n coloan i real (calculat) la ieirea din coloan. Componeni identificai: 1 acizi oxicinamici; 2 acid clorogenic; 3 catehin; 5 epicatehin; 4, 6-9 proantocianidine oligomerice; 10 rutozid; 11 hiperozid; 12 isocvercitrin; 13 glicozid flavonolic; 14 cvercetin; 15 biapigenin; 16 pseudohipericin; 17 hipericin; 18 hiperforin; 19 adhiperforin.

O alt dificultate este legat de diapazonul destul de larg a polaritii substanelor determinate, fapt ce nu permite efectuarea analizei n regim isocratic sau n gradient scurt, iar aplicarea gradientelor line mrete considerabil timpul analizei. Ca soluie de compromis am propus aplicarea gradientului cu mai multe trepte, n care sectoarele de gradient lin sau eluarea isocratic alterneaz cu sectoare de gradient abrupt, cum este redat n fig. 1.

Prezena componenilor chimici din diverse grupe cere i efectuarea deteciei la diferite lungimi de und pentru a asigura selectivitatea i sensibilitatea necesar. Pe fig. 2 sunt prezentate spectrele UV-VIS a unor substane din grupele principale, caracteristice pentru specia H. perforatum L. Spectrele sunt extrase din cromatogramele, nregistrate cu DAD. Lungimea de und 280 nm este preferabil pentru detecia proantocianidinelor i hiperforinei. Restul componenilor interesai, de asemenea, posed absorban suficient n aceasta regiune a spectrului, dar n acest caz selectivitatea determinrii lor va fi sczut, n special pentru hipericin. Astfel, se recomand de efectuat detecia hipericinei i pseudohipericinei la lungimea de und 592 nm, care este specific pentru grupa dat. Derivaii acidului cafeic se detecteaz la 328 nm, biapigenina la 340 nm, iar glicozide flavonolice la 360 nm. n cazul lipsei detectorului cu mai multe lungimi de und, se poate efectua detecia aplicnd detectorul cu scanare la cel puin 2 lungimi de und (280 i 592 nm), programnd schimbarea lor n timpul nregistrrii cromatogramelor.

Fig. 2. Spectrele n UV-Vis ale substanelor principale din specia H. perforatum L.

Ca rezultat al studiului efectuat, propunem urmtoarele condiii de separare cromatografic a componenilor principali ai extractelor din herba de suntoare: Coloana Kromasil 100 C-4, 5 (m, 100 x 4,6 mm. Faza mobil, pompat cu viteza volumetric 1,5 ml/min, se formeaz n amestectorul dinamic de presiune nalt din doi componeni: A acetonitril; B soluie KH2PO4 0,1 M + H3PO4 0,02 M. Programul gradientului: 5-32% A n B, 0-8 min; 32-73% A n B, 8-10 min; 73% A n B, 10-13 min; 73-87% A n B, 13-15 min; 87% A n B, 15-18 min. Apoi coloana se echilibreaz timp de 5 min cu faza iniial (5% A n B) nainte de a injecta proba urmtoare. Timpul total al unui ciclu cromatografic este 23 min. Soluia de etalonare Nr 1 conine 20 mg/l hipericin i cte 40 mg/l acid clorogenic, (-) epicatehin, hiperozid i apigenin n amestec acetonitril ap (1:1). Soluia de etalonare Nr 2 conine 80 mg/l hiperforin n faza mobil cu concentraia acetonitrilului 50%. La concentraii mai joase a acetonitrilului este posibil precipitarea hiperforinei, sau sorbia hipericinei pe suprafaa vaselor. Din lipsa substanei de referin biapigenin, n soluia de etalonare s-a folosit apigenina, care are spectru UV asemntor, dar elueaz cu 0,2 min naintea biapigeninei. n aceste condiii cromatografice picurile glicozidelor flavonolice sunt separate incomplet, ceea ce nu prezint o problem pentru standardizarea produselor dup suma glicozidelor n recalcul la hiperozid sau rutozid.

n cazul, cnd este necesar determinarea doar a unor grupe chimice aparte, se poate micora considerabil timpul analizei, cu eluarea n regim isocratic la concentraia acetonitrilului n faza mobil 18% pentru glicozide flavonolice, 72% pentru hipericin i pseudohipericin, sau 85% pentru hiperforin i adhiperforin. Cromatogramele corespunztoare sunt prezentate n fig. 3.

Fig. 3. Cromatoframele extractului din herb de suntoare n regim isocratic: a 18% acetonitril n tampon fosfat: 1 rutozid, 2 hiperozid, 3 isocvercitrin; b - 72% acetonitril n tampon fosfat: 1 pseudohipericin, 2 hipericin; c - 85% acetonitril n tampon fosfat: 1 hiperforin, 2 adhiperforin.

O alt sarcin important este optimizarea tehnicii de preparare a probelor de materie vegetal naintea separrii cromatografice. Exist doi factori care pot influena rezultatele analizei: instabilitatea hiperforinei i a derivailor de antracen n soluiile hidroalcoolice i legarea strns a hipericinei cu matricea vegetal.

Fig. 4. Curbele cinetice ale extraciei unor componeni principali la prepararea probelor de materie prim.

Instabilitatea hiperforinei este condiionat de oxidarea ei uoar cu oxigenul din aer, care se intensific n mediu bazic, de aceea se recomand acidularea extragentului. Pe de alt parte, n mediu acid scade stabilitatea hipericinei i, n special, a pseudohipericinei. Ca variant de compromis, s-a ajuns la utilizarea soluiei de acid citric 0,2% n alcool etilic 80% n calitate de extragent. Acidul citric posed proprieti antioxidande i de tampon; pH-ul extractelor obinute se afl n limitele 4,2-4,3. Concentraia nalt a etanolului micoreaz solubilitatea oxigenului n extragent i uureaz extragerea componenilor lipofili, cum ar fi hiperforina. nclzirea extragentului pn la 60C intensific procesul de extracie i, de asemenea, micoreaz solubilitatea oxigenului. Aceti factori influeneaz favorabil stabilitatea compuilor activi. La temperaturi mai ridicate de 60C crete pierderea extragentului din cauza evaporrii.

Din curbele cinetice (fig. 4) se vede, c timpul optim pentru o singur extracie este n jur de 40-45 min. Majorarea timpului de extracie duce la micorarea concentraiei hiperforinei. Dependena randamentului hipericinei i hiperforinei de numrul de extracii este prezentat n tabelul 1. Cu eviden variantele optime i timpul total necesar sunt 3 extracii cte 30 min sau 2 extracii cte 45 min. Ultima variant necesit mai puine operaiuni.

Tabelul 1Randamentul compuilor principali la extracia repetat a 0,5 g herb de suntoare cu poriuni a cte 50 ml extragent la temperatura 60C

Nr. de extracieRandamentul cumulativ, %

HipericinaHiperforinaGlicozide flavonolice

t=30 mint=45 mint=30 mint=45 mint=30 mint=45 min

176,088,788,091,087,390,4

291,896,996,798,796,198,2

397,098,098,899,698,699,5

Pe baza datelor, expuse mai sus, se propune urmtoarea tehnica de preparare a probelor de herba de suntoare pentru analiza cromatografic: Circa 0,5 g (masa exact) materie prim mrunit, care trece prin sita cu diametru orificiilor 1 mm, se introduce n balon cu capacitatea 100 ml, se adaug 50 ml soluie acid citric 0,2% n alcool etilic 80%, se nclzete pe baie de ap la temperatura 60 ( 2C timp de 45 min, amestecnd periodic. Coninutul balonului se filtreaz prin tampon de vat n balon cotat cu capacitatea 100 ml. Tamponul cu materia prim se rentoarce n primul balon i extracia se repet nc o dat n aceleai condiii. Extractul sumar se rcete pn la temperatura 20C i se completeaz pn la volumul de 100 ml cu extragent pur. Alicota se centrifugheaz 5 min la 3000-4000 g. Cte 10 (l prob i soluiei standard se injecteaz n sistemul cromatografic. Toate operaiunile de preparare a probelor trebuie efectuate n ncperi ntunecate pentru a preveni descompunerea hiperforinei sub influena luminii.

Produsele extractive din herba de suntoare pentru analiza cromatografic pot fi preparate n modul urmtor: Tincturile i extractele lichide se dilueaz de 20-100 ori (n dependena de concentraiile substanelor analizate) cu soluie acid citric 0,1-0,2% n alcool etilic 70-80%, sau cu faz mobil cu concentraia acetonitrilului 40-50%. Extractele uscate i formele farmaceutice solide se prepar prin dizolvarea probei de pulbere n unul din aceti solveni utiliznd baia cu ultrasunet. Masa probei i diluarea necesar se calcul, reieind din diapazonul optim al concentraiilor rezultante ale principalelor substane active: 10-50 mg/l pentru hipericin i 40-200 mg/l pentru hiperforin. Cu ajutorul metodei elaborate am studiat repartizarea substanelor potenial active n diferite pri ale plantei nflorite H. perforatum L.: flori, frunze i tulpini. Din rezultate (tabelul 2) se vede, c cantitatea major a acestor substane se afl n flori, mai puine n frunze, iar tulpinile practic nu conin componeni activi. Rezultatele obinute denot raionalitatea colectrii prii de sus a plantei nflorite, precum i necesitatea limitrii coninutului de tulpini n materia prim.Tabelul 2

Coninutul compuilor principali n diferite organe ale herbei de suntoareOrganul planteiConinutul, mg/g

Hipericina+ pseudohipericina1Hiperforina+ adhiperforina2Glicozide flavonolice3

Flori4,6348,030,8

Frunze1,824,2331,4

Tulpini0,080,885,1

Nota: 1 n recalcul la hipericin; 2 n recalcul la hiperforin; 3 n recalcul la hiperozid.

Concluzii

S-a elaborat metoda HPLC UV-Vis care s-a dovedit a fi rapid i eficient pentru dozarea diferitor grupe de substane farmacologic active n herba de suntoare i a produselor extractive. Metoda permite dozarea hipericinei, pseudohipericinei, hiperforinei, biapigeninei, glicozidelor flavonolici, acizilor oxicinamici, catehinilor i proantocianidinelor oligomerice ntr-o singur prob.

Optimizarea procedurii de preparare a probelor de materie prim, asigur stabilitatea substanelor active n timpul analizei.

S-a confirmat repartizarea neuniform a substanelor active ntre diferite organe ale plantei i necesitatea limitrii coninutului de tulpini n materia prim.

Metoda elaborat poate fi util pentru standardizarea materiei prime herba de suntoare, precum i ale preparatelor farmaceutice, ce conin produse extractive din specia dat.Bibliografie

1. European Pharmacopoeia 6.0, vol. 2, 2008, p. 2958-2959.

2. Ichim Daniela Luminia, Nicua Daniela, Cpraru Gabriela. HYPERICUM PERFORATUM L. in modern phytotherapy. Analele tiinifice ale Universitii Alexandru Ioan Cuza, Seciunea Genetic i Biologie Molecular, tom VIII, 2007, p. 253-257.

3. WHO Monographs on selected medicinal plants. Hyperici Herba. Vol. 2, 2004, p. 149-171.

4. .., .., .. : . , 6 (42), 2000.

5. .., .. . . 2008, 1, . 81-86.

APLICAREA METODELOR FIZICO-CHIMICE N STUDIUL CHIMICO-FARMACEUTIC AL COMPRIMATELOR DE SOMNOL

Tamara Cotelea1, Serghei Ermolaev1, Efim Arama2, Oleg Bolotin3, Iurii Tihon11Catedra Chimie farmaceutic i toxicologic USMF N.Testemianu

2 Catedra Biofizic, informatic i Fiziologia omului N.Testemianu

3Institutul de Chimie al A RM

Summary

Phisico-chemical methods applied in chemico pharmaceutical study of Somnol tablets

The chromatography method on a thin layer was worked out to identify the zopiclone ( an active principle of Somnol tablets) by utilizing four systems of solvents, the spectroscopy IR, thermic effects have been registered applying the thermogravimetrical method, the spectrophotometrical method of dosing in powders and tablets of 7,5mg as well as the HPLC method to identify in powder. Due to the fact that, these utilized methods are specific and reproductive , they are recommended for the study of zopiclone in biological fluids.

Rezumat

A fost elaborat metoda cromatografiei pe strat subire de identificare a zopiclonei (principul activ din comprimate de Somnol) utiliznd 4 sisteme de solveni,metoda spectroscopiei IR, au fost nregistrate efectele termice aplicnd metoda termogravimetric, metoda spectrofotometric de dozare n pulbere i comprimate 7,5 mg, precum i metoda HPLC de identificare n pulbere. Dat fiind faptul, c metodele folosite sunt specifice i reproductive ele se recomand pentru studierea zopiclonei n lichidele biologice.Actualitatea temei

Zopiclona se utilizeaz pe larg n medicin ca somnifer, anxiolitic, anticonvulsiv, migrelaxant. Zopiclona posed aciune nemijlocit asupra regiunilor de legtur a receptorilor 1, 2, 3 i 5 a acidului gama aminobutiric (AGAB). La fel contribue la creterea permeabilitii clorului n celul i provoac hiperpolarizarea membranelor i totodat frnarea puternic a neuronilor. Spre deosebire de benzdiazepine nu acioneaz la durata somnului pentru restabilirea funciei psihice, memoriei, dar prelungete faza latent a somnului important, pentru restabilirea fizic a organismului.

n prezent comprimatele de Somnol cu coninut de zopiclon se administreaz n tratamentul insomniei de situaie i cronic la maturi inclusnd dificulti la adormire i trezire preventiv. n procesul terapiei cu zopiclon se micoreaz perioada adormirii i crete durata somnului i eficacitatea.

Obiectivele lucrrii

Efectuarea studiului n vederea determinrii metodelor fizico-chimice de analiz, de identificare i dozare a acestei substane, care ar putea fi aplicate i dup extragerea din lichidele biologice.

Materiale i metode de cercetare

n cadrul cercetrilor s-a folosit zopiclon substana pur (cu grad de puritate pur pentru analiza i chimic pur), comprimate somnol 7,5 mg AO Gridex (Letonia). n calitate de reageni s-au folosit cloroform, acid clorhidric, alcool etilic, acetonitril, alcool metilic, hidroxid de sodiu.

Pentru determinarea identitii am aplicat metoda cromatografiei pe strat subire (CSS), folosind plci cromatografice cu coninut de silicagel G, n cadrul crui s-au utilizat 4 sisteme de solveni: cloroform dioxan aceton soluie amoniac 25 % (47,5 : 45 : 5 : 2,5); toluen aceton etanol - soluie amoniac 25 % (45 : 45 : 7,5 : 2,5); cloroform metanol (90 : 10); cloroform aceton (80 : 20), pentru care s-a determinat valoarea Rf egal cu 0,80; 0,49; 0,55; 0,60. respectiv.

Spoturile de zopiclon pe placa cromatografic fluorisceaz n razele UV n culoare verzue; cu reactivul Nessler culoare galben, cu Dragendorff i acid sulfuric rou-cafeniu. Pentru aceasta 0,0016 g substan pur (m.e.) se trece ntr-un balon cotat cu volumul de 25 ml, se dizolv n acid clorhidric 0,1 M i se aduce la cot cu acelai solvent (sol.A). 1 ml sol. A se trece ntr-un balon cotat cu volumul 50 ml i se aduce la cot cu acelai solvent (sol. B). 2l soluie B se aplic pe linia de start a plcii, placa se introduce n camera de cromatografiere, se cromatografiaz ascendent n sistemul de solveni corespunztor. Cnd frontul de solveni va parcurge 2/3 din lungimea total a plcii cromatografice ultima se scoate din vas, se usuc la aer i se pulverizeaz cu reactivele respective. Sensibilitatea reactivilor ne d posibilitate s aplicm aceast metod pentru cercetarea zopiclonei n extrasul organic din lichidul biologic.

n aspectul analizei, structurii moleculare a substanelor medicamentoase, identificarea i controlul puritii lor este metoda spectrofotometriei de absorbie n UV.Astfel pentru identificarea i aprecierea zopiclonei s-au nregistrat spectrele de absorbie n intervalul lungimilor de und 220-350 nm n cuv cu drumul optic 10 mm.

n extractul cloroformic se compar spectrele de absorbie a soluiei de analizat i soluiei standard. Spectrele au fost citite la spectrofotometru Perkin Elmer Lambda 400 n Soluia standard are maxim de absorbie la lungimea de und 308,93 nm. Soluia de cercetat la 308,79 nm.

Pentru acesta 0,015 g (m.ex.) zopiclon se trece n balon cotat, cu volumul 100 ml se dizolv n solventul respectiv (acid clorhidric, cloroform, metanol, hidroxid de sodiu 0,1 M) se agit pn la dizolvarea complet pe baia cu ultrasunet i se aduce la cot cu solventul corespunztor soluia A. 10 ml sol.A se plaseaz n alt balon cotat cu capacitatea de 100 ml i se aduce la cot cu solventul corespunztor (soluia B). Se citete absorbana soluiei de analizat la spectrofotometru Perkin Elmer Lambda 400 n cuv cu drumul optic 10 mm, n intervalul lungimii de und 220-350 nm .

Spectrele de absorbie a soluiei zopiclon (15 g/ml) n aceti solveni are urmtoarele maxime de absorbie: n acid clorhidric 0,1 M la lungimea de und 303 nm, n cloroform 305,5 nm, n metanol 304,0 nm, n hidroxid de sodiu 0,1 M 237 i 277,5 nm (fig.1,2,3,4).

Preventiv s-a cercetat dependena absorbanei de concentraia zopiclonei. Pentru aceasta 0,01 g zopiclon pulbere (masa exact) se plaseaz ntr-un balon cotat cu capacitatea de 50 ml se dizolv n cloroform i se completeaz pn la cot (soluia A) 10 ml soluie A se plaseaz n alt balon cotat cu capacitatea de 50 ml i se aduce cu cloroform pn la cot (soluia B 0,004 %). Din soluia B se pregtesc o serie de soluiei cu concentraiile corespunztoare 1,5,10,15,20,25,30 g/ml. Se citete absorbana acestor soluii la lungimea de und 305 nm n cuva cu drumul optic de 10 mm. n calitate de soluie de referin se utilizeaz cloroformul. n baza acestor date s-a construit graficul absorbanei n funcie de concentraia zopiclonei n soluie de cloroform Din curba de etalonare a zopiclonei reiese c legea Bouguer-Lambert-Beer se respect n intervalul de concentraie 0,1-30 g/ml. n aceast faz s-a elaborat tehnica de lucru pentru dozarea spectrofotometric n pulbere i comprimate. Eroarea relativ 1,48 %.

Fig.1Spectrul de absorbie al zopiclonei Fig.2 Spectrul de absorbie al zopiclonei n acid clorhidric 0,1M n cloroform

Fig.3 Spectrulde absobie al zopiclonei Fig,4 Spectrul de absorbie al zopiclonei n

n metanol hidroxid de sodiu 0,1M

A fost efectuat identificarea zopliconei prin metoda spectroscopiei IR n regiunea 400 4000cm. Spectrul IR al zopliconei a fost descifrat n baza datelor din literatur. Spectrele principale s-au evideniat la urmtoarele lungimi de und: 1372, 1225-1075, 1463, 1600-1500, 1150-1180, 810, 720 i 701cm 1.

n cadrul cercetrilor pentru o investigaie mai profund a fost aplicat metoda termogravimetric de analiz, metoda cercetrilor proceselor chimice i fizico chimice bazat pe nregistrarea efectelor termice nsoite de transformrile compuilor n condiiile de programare a temperaturii. Analiza termic este un instrument superior n determinarea componenei chimice a obiectelor de analizat, dar i studierea proceselor chimice, fizice i fizico-chimice n vederea stabilirii unor particulariti ale substanelor medicamentoase cu repercusiuni directe asupra efectelor lor biologice. Pentru cercetarea comportrii termice a zopiclonei am folosit derivatograful QD-102 (F. Paulik, V. Erdei) firma MOM (Ungaria ). S-au nregistrat curbele de temperatur (T), analiza termic diferinial (ATD), termogravimetric (TG) i termogravimetric diferinial.(TGD)

Condiiile de lucru: masa probei 20 mg. viteza temperaturii 10oC/min, sensibilitatea ATD 1/5, TGD 1/10. S-au utilizat locae pentru probe din platin. n calitate de etalon s-au utilizat oxidul de aluminiu.Rezultatele derivatogramei obinute relev faptul, c zopiclona este o substan relativ stabil termic. Pe curba ATD sunt nregistrate 2 efecte exotermice: termoefectul 1 n intervalul de temperatur 105 150oC cu maximul la 145oC i termoefectul 2 n intervalul 235 285oC, cu maxim la 165OC este condiionat de perderea n mas a substanei, (curba TG), descompunerea, trecerea n alte forme polimorfice.

Conform structurii chimice zoplicona este un compus ionic. Asemnrile de structur i proprietile chimice ale zopiclonei cu alcaloizii ne decid s aplicm metoda cromatografiei lichide de performan nalt (HPLC) folosind coloana. Zorbax eclipse XDB C 18, mrimea particulelor 150 mm x 4,6 mm, rata curentului 1,5 ml/min, to 30oC. Concentraia soluiei de analizat 12g/ml timpul de retenie 2,97 min., faza mobil soluia A (5g laurilsulfat sodic, 1g dihidrofosfat sodic ap pn la 1l. Se aduce la pH 3,4 cu acid fosforic 10%. Amestecul se filtreaz cu ajutorul aparatului Millipore XF 5423050) i acetonitril n raport 52:48. cromatograma zopliconei n concentraie 12g/ml se reprezint n figura 5.

n continuare am efectuat identificarea zopiclonei n mediul organic (cloroform) aplicnd metoda HPLC (fig.6). n calitate de eluent se folosete amestec de acetonitril i soluie A care const din laurilsulfat sodic i dihidrofosfat sodic la pH 3,4 n raport 52:48. Determinarea zopiclonei se efectuiaz cu ajutorul detectorului UV la lungimea de und 303nm.Timpul de retenie 2,58 min.

Metoda propus este exact i rapid n vederea identificrii zopliconei dup izolarea din lichidele biologice.

Fig.5 HPLC. Cromatograma zopiclonei

Fig. 6.HPLC. Cromatograma zopiclonei n cloroform.

Concluzii Pentru identificarea zopiclonei s-au propus metoda cromatografiei pe strat subire pe plci cu silicagel n 4 sisteme de solveni, spectrofotometria n UV cu determinarea maximului de absorbie n acid clorhidric 0,1 M metanol, hodroxid de sodiu 0,1M cloroform, metoda HPLC aplicnd coloana Zorbax Eclipse XDB C-18.

Dozarea zopliconei n comprimate somnol a fost efectuat prin metoda spectrofotometric UV. Greala relativ a rezultatelor cercetrilor constituie 1,48%.

Bibliografie

1. Bellomy L.J. The infrared spectra of complex molecules London, 1959 95 and New York, 1996 590p.

2. Bodoga B. Maria Virginia coman. Cromatografia pe strat subire Bucureti: Ed. Tehnic, 1995 160p.

3. Dorian P., Sellers Em., Kaplan H.Hamilton C. Evalation of zoplicone physical dependence liability in normal voleyiteers. Pharmacology 27. 1983; Suppl 2: 228 34p.

4. Holbrook AM., Crowther R., Lotter A., Cheng C., Meta analysis of bentodiazepine use in the treatment of insomnia CMAJ. 2002.

5. Holmgren., H. Druid S. Hollander J., Ahlner., Fatal and non-fatal consehtrations of newer antidepressants and hypnotics, post mortem femoral bload. Proccedings of 38 TIAFT Meeting, Helsinki, 13 17 August 200; - 62p.

6. Skerritt Jh., Johnston G. Enancement of GABA binding by benzodiazepines and related anxiolitics. European journal of pharmacologi 1983 May. 89 (34):193 8p.

7. Toniton Y. Sleep disorders and hypnotic agents : medical, social and economical impact. Ann Pharm Fr. Jyly 2007; 65 (4):230 8p.ANALIZA CHIMICO-TOXICOLOGIC A ZOPICLONEI

Tamara Cotelea1, Serghei Ermolaev1, Leonid Lsi2 Efim Arama3 1Catedra Chimie farmaceutic i toxicologic USMF N.Testemianu

2Catedra Biochimie i Biochimie clinic USMF N.Testemianu

3Catedra Biofizic, informatic i Fiziologia omului

Summary

Chemico-toxicological analysis of zopiclone

The optimum isolation and extraction conditions of zopiclonea from biological fluids. We used physico chemical methods to identify zopiclone : chromatography on a thin layer by utilizing four systems of solvents, spectrophotometrical method in UV, HPLCThe methods processed by us for zopiclone in biological tests in vitro are specific and reproductive, and they are recommended for the study of zopiclone in biological fluids.

Rezumat

Au fost determinate condiiile optime de izolare i extragere a zopiclonei din lichidele biologice Am aplicat metodele fizico-chimice de identificare a zopiclonei: cromatografia pe strat subire utiliznd patru sisteme de solveni, metoda spectrofotometric n UV, HPLC. Metodele prelucrate de noi pentru zopiclon n probele biologice in vitro sunt specifice i reproductive i ele se recomand pentru studierea zopiclonei n lichidele biologice.

Actualitatea temei

Zopiclona reprezentant din noua clas a compuilor chimici ciclopirolane. Spre deosebire de benzodiazepine se leag numai cu receptorii centrali i nu posed afinitate cu receptorii periferici. Proprietile farmacologice ale zopiclonei includ aciunea sedativ, anxiolitic, anticonvulsiv i relaxiv.

n prezent zopiclona se administreaz n tratamentul insomniei cronice pentru maturi. Cercetrile clinice au artat c zopiclona mbuntete indicii obiectivi i subiectivi ai somnului: micoreaz perioada adormirii, mrete longevitatea somnului micoreaz frecvena de trezire, mbuntete dinamica trezirii, calitatea somnului.

Metabolismul zopiclonei se petrece n ficat cu ajutorul citocromului P-450(3A i 2C). Metaboliii principali sunt derivaii N-oxid (activ) i N-dismetil metabolit cu aciunea anxiolitic i cu proprietile de inhibare a receptorilor nicotin-acetilcolinici, care protegaz dependena psihic i fizic. Perioada de njumtire este de 4 ore. Prin urin se elimin 80% , prin intestine -16% . Biotransformarea zopiclonei este redat n figura 1.

N desmetil zopiclon N oxid zopiclon

Fig. 1 .Biotransformarea zopiclonei

Zopiclon N-oxid posed efect slab tranchilizant i sedativ.Ali metabolii ai zopiclonei sunt lipsii de activitate.

Cercetrile rilor baltice marcheaz cazuri cu intoxicaii grave cu sfritul letal n urma supradozrii. Administrarea zopiclonei concomitent cu alcoolul etilic duce la euforie. Narcomanii primesc preparatul pentru a sinergiza aciunea narcoticelor. Simptomele de intoxicaii includ disfuncia sustemului nervos central i sistemului respirator, hiperkaliemia, hiperglicemia.Doza letal se consider 1,4-3,9 mg/l.

Cercetrile clinice din Bristol, Marea Britanie au artat, c pacienii cu disfuncii ale ficatului risc intoxicaii acute cu zopiclon.Dup administrarea unei doze la bolnavii cu ciroz, concentraia zopiclonei n snge este cu mult mai mare comparativ cu pacienii sntoi. La pacienii cu ciroz clearensul zopiclonei se micoreaz cu 40% n corespundere cu micorarea procesului de dismetilare Acesta se lmurete prin faptul c metabolismul i eliminarea zopiclonei din organism este cu mult mai ncetinit i n cele din urm are loc cumularea preparatului n organism. Totodat folosind preparate inhibitori ai citocromului ficatului se micoreaz clearensul zopiclonei, mrind concentraia preparatului n snge. n baza acestor date ne-am pus ca scop preculcrarea metodelor disponibile, specifice pentru determinarea zopiclonei n materialul biologic. Analiza chimico-toxicologic se bazeaz pe analiza chimico-farmaceutic a preparatului de determinare a calitii.Obiectivele lucrrii

De a efectua studiul determinrii condiiilor de izolare i separare a zopiclonei din lichidele biologice precum i aplicarea metodelor fizico-chimice de identificare i dozare.

Materiale i metode de cercetare

n cadrul cercetrilor s-a folosit zopiclon substana pur, comprimate somnol 7,5 mg.

A fost folosit plasma sanguin i urin ca lichide biologice. Au fost aplicate metode chimice i fizico-chimice de analiz. Rezultatele au fost prelucrate dup criteriul student. Ca reageni s-au utilizat n investigaiile experimentale cloroformul, acidul sulfuric, alcool etilic 95 %, acidul clorhidric, hidroxidul de sodiu, care au fost cu grad de puritate pur pentru analiza i chimic pur.

Izolarea i extragerea zopiclonei din materialul biologicOdat cu creterea numrului de intoxicaii n acela timp al intoxicaiilor cu zopiclon este necesar prelucrarea noilor metode de determinare a preparatelor n materialul biologic.

n literatur sunt descrise metode multiple de izolare, extragere i identificare a preparatelor din materialul biologic. Aceste principii de lucru au fost aplicate pentru determinarea zopiclonei din lichidele biologice.

Am prelucrat metoda de determinare a zopiclonei n plasma sanguin dup extragere cu cloroform i determinarea zopiclonei direct n plasm.

n scopul izolrii zopiclonei din lichidele biologice au fost folosite amestecuri modele din plasma sanguin. Pentru aceasta la 10 ml plasm sanguin am adugat 1 ml soluie zopiclon (1000 g), am agitat bine lsnd pe 1 or.

Metoda de izolare a zopiclonei

La 10 ml plasm sanguin cu coninut de zopiclon am adugnd 5 ml soluie acid sulfuric 10 % dup 2 ore am adugat 5 ml acid tricloracetic 30 %, lsndu-l nc 1 or. Apoi acest amestec se centrifugeaz timp de 10 minute (500 rot/min), sub controlul pH-ului (pH=2,0) i de 3 ori se extrage cu eter dietilic cte 5 ml. Soluia apoas se alcalinizeaz cu soluie hidroxid de sodiu la pH 11,0 i de 3 ori se extrage cu cloroform cte 10 ml. Extractele cloroformice se unesc i se filtreaz prin filtru cu 1 g de sulfat de sodiu n colb cu volumul de 25 ml, unde se adaug cloroform pn la cot.

n vederea identificrii zopiclonei n extrasul cloroformic am aplicat cromatografia pe strat subire folosind plci cromatografice cu coninut de silicagel G. Am utilizat 4 sisteme de solveni: cloroform dioxan aceton soluie amoniac 25 % (47,5 : 45 : 5 : 2,5); toluen aceton etanol - soluie amoniac 25 % (45 : 45 : 7,5 : 2,5); cloroform metanol (90 : 10); cloroform aceton (80 : 20), pentru care s-a determinat valoarea Rf egal cu 0,80; 0,49; 0,55; 0,60. Ca relevant s-a utilizat reactivul Dragendorff.Sensibilitatea reaciei este de 10-15 g/ml.

Spectrofotometria de absorbie n UV este o metod de identificare i apreciere a substanelor medicamentoase bazat pe compararea cu spectrele substanelor de referin sub aspectul analizei structurale. Astfel pentru identificarea zopiclonei n extractul cloroformic se compar spectrele de absorbie a soluiei de analizat i soluiei standard. Spectrele au fost citite la spectrofotometru Perkin Elmer Lambda 400 n regiunea 220-350 nm n cuv cu grosimea stratului 10 nm. Soluia standard are maxim de absorbie la lungimea de und 308,93 nm. Soluia de cercetat la 308,79 nm. Spectrul de absorbie a soluiei de analizat este redat n figura1.

Fig.1 Spectrul de absorbie al zopiclonei n extrasul cloroformicIdentificarea zopiclonei dup extragere din plasm sanguin aplicnd metoda cromatografiei lichide de performan naltIdentificarea zopiclonei n extractul cloroformic prin metoda Cromatografiei de performan nalt a fost efectuat la aparatul Agilent Tehnologies 1200, coloana Zorbax eclipse XDB-C 18, mrimea particulelor 150 nm x 4,6 cm. Rata curentului fazei mobile 1,5 ml/min, temperatura 300 C.

n calitate de eluent am folosit amestec acetonitril i soluia A, constituit din amestec de lauril sulfat i dihidrofosfat de sodiu la pH 3,4 n raport 52 : 48. Determinarea zopiclonei se efectueaz cu ajutorul detectorului UV la lungimea de und 303 nm.

Timpul de retenie a soluiei de analizat corespunde cu timpul de reinere a soluiei standard respectiv 2,6 min i 2,58 min. ( fig.2.).

Fig. 2. HPLC. Cromatograma zopiclonei dup extracie din plasma sanguin

Identificarea zopiclonei nemijlocit n plasma sanguin aplicnd metoda cromatografiei lichide de performan nalt s-a efectuat n coloanei Zorbax eclipse XDB-C 18, mrimea particulelor 150 nm x 4,6 cm ml/min la temperatura 300 C. n calitate de eluent s-a folosit amestec acetonitril i soluia A (amestec laurilsulfat sodic i dihidrofosfat sodic la pH 3,4 n raport 52: 48. S-a determinat cu ajutorul detectorului n UV la lungimea de und 303 nm.

Soluia de zopiclon (800 ng/ml) se adaug la plasma sanguin (1 : 1) i 2 ml acetonitril. Amestecul obinut se centrifugeaz 10 min i se filtreaz. 20 l soluie filtrat se injecteaz n precoloana cromatografului i se determin timpul de retenie(fig.3).

Soluia standard (1 ml sol.zopiclon i 3 ml acetonitril) se injecteaz la fel, obinnd picul) cu timpul de retenie respectiv .

Fig. 3. HPLC. Cromatograma zopiclonei n plasma sanguin

Concluzii

Izolarea zopiclonei din materialul biologic se efectueaz la pH 2,0-2,5, precipitnd proteinele cu soluie apoas acid tricloracetic 10 %, extragerea impuritilor cu eter dietilic la pH 2,0 i la pH 11,0 extragerea zopiclonei cu cloroform.

n scopul identificrii preparatului n extrasul cloroformic se propune CSS, metoda spectrofotometriei UV, HPLC.

Bibliografie

1. Br. J. The excretion of zoplicone info breast milk Clin. Pharmac. 1990; 30, 26727p.

2. Roschke J., Mann K., Aldenhoff Jb. Benkert O., Funcional properties of the brain during sleep under subchronic zoplicone administration in main. European neuropsychopharmacology: the journal of the European college of Neuropsychopharmacology. 2003 Aug.; 4(1): 21 30p.

3. Boniface P. J. And Russel S. G. Two cases of fatal zopiclone overdose. J. Analit. Toxicol. 1996; 20, 131 133p.

4. Caille G., Soush P. Spenard J., Iacasse I., Vezina M. Pharmacokinetic and trimipramine when administered simultaneosly to volunteers. Biopharmaceutics and dryg disposition 200 oct; 5(2): 117 25p.

5. Van Der Kleijn E. Effects of zopiclone and temazepam on sleep, behaviour and mood during the day. European journal of clinical pharmacology 1996 dec; 36(3): 247 51p.STUDIUL INFLUENEI RADIAIILOR EMISE DE TELEFONUL MOBIL ASUPRA PROPRIETILOR COLIGATIVE ALE SOLUIILOR

Mihail Anton

(Conductor tinific conf. univ., dr. n tiine chimice Vasile Srbu)

Catedra Chimie General USMF "Nicolae Testemianu"

Summary

The Study of the influence of emitted cell phone radiation

upon the colligative properties of solutions

Nowadays, the cell phone has become a mandatory attribute of everyday life. Although widely used, the actions this device can influence on the humans and the processes that happen inside it, are yet least studied. The human organism is a system organized so fine, that even the smallest external influences can essentially disorder its functionality. In this context, we proposed ourselves to study the influence of emitted cell phone's radiation on the colligative properties of the solutions, given that most biochemical processes of the human organism happen in the aqueous medium and the progress, speed and results of these processes depend on the colligative properties.

Rezumat

Actualmente, telefonul mobil a devenit un atribut obligatoriu al vietii cotidiene. i, dei utilizat pe larg, sunt deocamdat puin studiate aciunile pe care le poate determina aparatul dat asupra omului i proceselor ce se petrec n interiorul acestuia. Organismul uman este un sistem ntr-att de fin organizat, nct cele mai mici influene din exterior i pot deregla esenial funcionalitatea. n acest context, ne-am propus a studia cum influeneaz radiaiile emise de telefonul mobil asupra proprietilor coligative ale soluiilor, dat fiind faptul c majoritatea proceselor biochimice din organism se petrec n mediul apos.

Actualitatea temei

La 26 de ani dupa lansarea primei reele de telefonie mobil, numrul abonailor acestor servicii a ajuns la 3,3 miliarde la nivel mondial, echivalentul a 50% din populaia Globului [5]. n Republica Moldova, numrul persoanelor ce dein i utilizeaz activ telefonul mobil se ridic la 2-2,5 milioane de persoane [2]. Ce este telefonul mobil? Telefonul mobil prezint un captator-transmitor de radiaii electromagnetice, cu funcia de a menine legtura cu staiunea de baz. Ca i orice surs de radiaii electromagnetice, el creaz mprejurul su un cmp electromagnetic care, dup cum a fost demonstrat, are i aciune biologic. [3]Reieind din particularitile de funcionare i utilizare, telefonul mobil se afl permanent conectat n nemijlocita apropiere a corpului uman, ceea ce favorizeaz o eventual influen asupra organismului uman de ctre acest aparat. n acest context, sunt posibile devieri a unei game largi de reacii biochimice, inclusiv la capitolul farmacocinetic.La moment, sunt ntreprinse n lumea ntreag o serie de studii care au drept scop elucidarea riscurilor ce survin la utilizarea telefoanelor mobile. Exist suspiciuni privind faptul c acest aparat ar putea genera starea de toxicemie general a organismului, surditate uni- i bilateral, diferite tipuri de cancer, malformaii la nou-nscui etc. [3]

Obiectivul lucrrii

Ne-am propus a studia cum influeneaz radiaiile emise de telefonul mobil asupra proprietilor coligative ale soluiilor, dat fiind faptul c majoritatea proceselor biochimice din organism se petrec n mediul apos, iar de proprietile coligative depind mecanismul de petrecere, viteza i rezultatele acestor procese. Studiul nostru difer de celelalte din domeniul dat prin faptul c studiaz procesele ce au loc la nivel molecular, care se petrec i n afara organismului, este uor de realizat i este rapid.

Materiale i metodeDrept criteriu de studiu a fost luat constanta de ionizare a acidului acetic, care poate s se modifice sub aciunea diferitor factori exteriori. Constanta de ionizare a fost determinat prin metoda conductometric, utiliznd puntea reohordic R-38 pentru msurarea rezistenei soluiei de acid acetic cu concentraia molara c(CH3COOH) = 0,1 mol/l [4]. S-a procedat n felul urmtor:

S-a determinat constanta celulei electrolitice cu ajutorul soluiei standard de clorur de potasiu cu c(KCl) = 0,1 mol/l pregtit pe ap bidistilat, cu conductibilitatea electric specific cunoscut [4]. Constanta celulei electrolitice se calculeaz folosind expresia:

D = H (KCl)R(KCl) ,

unde R(KCl) rezistena medie aritmetic a soluiei standard de clorur de potasiu, ; H (KCl) conductibilitatea electric specific a soluiilor standard de clorur de potasiu, S/m.

S-a msurat rezistena soluiei de cercetat a acidului acetic n condiiile absenei radiaiilor electromagnetice ale telefonului mobil (telefonul mobil deconectat), a prezenei telefonului mobil n stare de ateptare i n stare de funcionare activ (n timpul convorbirilor). Drept surs de radiaii electromagnetice a servit telefonul mobil de marca Siemens, modelul C75, produs n anul 2004. Rezistena soluiei s-a calculat dup formula:

Rx =

EMBED Equation.3 Rm ,

unde Rm valorile de pe braul de comparare; - valorile de pe scara conductometrului.

Pe baza valorilor rezistenei soluiei i a constantei celulei electrolitice am calculat valoarea conductibilitii electrice specifice dup expresia:

H sol =

Cunoscnd valoarea conductibilitii specifice a soluiei de acid acetic, am calculat valorile conductibilitii electrice echivalente (c), iar folosind valorile conductibilitii electrice ionice la diluia infinit [4], am calculat conductibilitatea electric echivalent la diluia infinit (o):

c =; o = H+o + CH3COO-o ;

unde 1000 - coeficientul de trecere de la concentraia molar a echivalentului, exprimat n mol/l la mol/m3; Xsol - conductibilitatea electric specific a soluiei de acid acetic. Cunoscnd valorile conductibilitii electrice echivalente i valorile conductibilitii electrice echivalente limit, am calculat constanta de ionizare a acidului acetic n diferite condiii:

K =

Rezultate

La efectuarea calculelor s-au luat n consideraie urmtoarele date din ndrumar:

CH3COO-o = 40,9 ; H+o = 349,8 ; T = 298oKRezultatele obinute au fost incluse n Tab.1.

Tab.1Timp ,

sRm ,

R2/R1Rsol ,

H sol ,

S/mK(CH3COOH),

mol/l

Telefon mobil deconectat30101,7917,90,233,6810-4

901,7817,80,23

1501,7817,80,23

Telefon mobil n stare de ateptare301,8318,30,223,3510-4

901,8418,40,22

1501,8418,40,22

n timpul convorbirilor302,0520,50,22,7610-4

902,0620,60,2

1502,0520,50,2

Opinii i discuii

Dup cum reiese din rezultatele obinute, radiaiile electromaagnetice emise de telefonul mobil acioneaz ntro masur oarecare asupra principalelor proprieti coligative ale soluiilor, deci i asupra celulei i organismului n ansamblu. E de menionat faptul c multiple procese fiziologice depind de proprietile soluiilor care iau parte la aceste procese (cum ar fi transportul oxidului de carbon (IV) prin snge, filtrarea glomerular etc.) [1], de aceea nu putem neglija perturbrile pe care le poate provoaca telefonul mobil n derularea acestora.

n prezena telefonului mobil conectat n stare de ateptare se atest o modificare de circa 9% a constantei de ionizare a acidului acetic, ceea ce demonstreaz o influen nu chiar att de mare. ns atunci cnd telefonul mobil funcioneaz la maximum (n timpul convorbirilor) se atest o deviere a constantei de ionizare de circa 27% de la valoarea iniial, ceea ce presupune deja o influen simitoare asupra proceselor unde aceast constant ar juca un rol esenial (spre exemplu n procesele de transport transcelular [1]). Timpul expunerii la radiaiile electromagnitice nu a influenat rezultatele (la variaii de timp de la 30 la 150 secunde rezultatele intr n acelai diapazon al limitei de eroare), deci, putem afirma c timpul expunerii nu este un factor de risc. ns, am dori s atenionm c experienele au fost efectuate n afara organismului, unde nu se atest fenomenele de acumulare a factorului nociv. De aceea presupunem c n cadrul organismului timpul de expunere ar influena i el puternic proprietile soluiilor biologice.

Generaliznd, am putea conchide c radiaiile electromagnetice emise de telefoanele mobile nu au dus la schimbri radicale n sistema de analizat, ns modificrile induse sunt suficiente pentru a putea clasa aceste aparate printre factorii de risc ai sntii.

Concluzii

Efectund analiza i sinteza rezultatelor obinute, putem concluziona urmtoarele:

1. Radiaiile electromagnetice emise de telefonul mobil acioneaz asupra proprietilor coligative ale soluiilor;

2. Aciunea lor nu este ntr-att de puternic nct s fim nevoii s evitm aceste radiaii, ns destul de semnificativ pentru a o lua n consideraie;

3. O influen decisiv o are tipul de activitate al telefonului mobil (n special frecvena undelor electromagnetice) i nu durata acestei activiti;

4. Sunt necesare studii privind aciunea radiaiilor electromagnetice emise de telefoanele mobile asupra sistemelor biologice;

Bibliografie

[1] Babski B., Zubcov A., Fiziologia omului, Chiinu Lumina, 1991[2] Declaraia privind Internetul i telefonia mobil, Agenia Naional pentru Reglementare n Comunicaii Electronice i Tehnologia Informaiei (ANRCETI); [3] National Vulnerability Database http://www.securitylab.ru/news/302121.php

[4] Srbu V., Material didactic la chimia fizic. Electrochimia, Chiinu 1992

[5] Wall-Street, articol din 3 decembrie 2007, http://www.wall-street.ro/articol/IT-C-Tehnologie/35806/Numarul-abonatilor-la-telefonia-mobila-a-ajuns-la-3-3-mld-la-nivel-mondial.html;STUDIUL INTOXICAIILOR CU CLOZAPIN

Tamara Cotelea1, Ciorici Mihai1, Grigore Slonovschi2 Leonid Lsi31Catedra de Chimie farmaceutic i toxicologic USMF N. Testemianu

2Secia Toxico-Narcologic a Centrului de Medicin Legal

3Catedra Biochimie i biochimie clinic USMF N. Testemianu

Summary

The study of intoxication with clozapine

Clozapine is a neuroleptic- antipsyhotic atipical derivative of dibenzodiazepine which offered the patiens with schizophrenia the chance to a better life resistent to classic neuroleptics but its treatment made also victims from the momentof its introduction in the treatment due both to its side effets and interactions with other medicines. Clozapine has a strong neuroleptic action with a sedation effect which occurs immediately after its administration which determined an abuse of its taking as a drug to induce a narcotic intoxication state. Due to the close therapeutical concentration (0,2-0,8 g/ml) and of the toxic one (0,8-1,3 g/ml) in blood plasma, numerous cases of intoxication were described with this drug.

Rezumat

Clozapina este un neuroleptic- antipsihotic atipic, derivat de dibenzodiazepin i a oferit ansa la o via mai bun pacienilor schizofrenici rezisteni la neurolepticele clasice, dar tratamentul cu clozapin a fcut i victime din momentul introducerii n tratament att datorit efectelor adverse ct i interaciunilor cu alte substane medicamentoase. Clozapina posed o activitate neuroleptic puternic cu efect de sedare ce survine la scurt timp dup administrare ceea ce a determinat abuzul utilizrii ei n calitate de substan pentru inducerea strii de ebrietate narcotic. Datorit apropierii concentraiei terapeutice (0,2 - 0,8 g/ml) i a celei toxice (0,8 1,3 g/ml) n plasma sanguin, sunt descrise numeroase cazuri de intoxicaie cu aceast substan medicamentoas.Actualitatea temei

Clozapina a oferit ansa la o via normal bolnavilor de schizofrenie dar pe parcursul timpului tratamentul cu clozapin a fcut i victime n rezultatul intoxicaiilor sau datorit efectelor toxice i a reaciilor adverse. n acest context studiile mecanismului aciunii i a metabolismului clozapinei prezint interes pentru determinarea mecanismelor care stau la baza aciunii toxice i apariia reaciilor adverse.Rezultate

Preparatul manifest aciune slab de blocare a receptorilor pentru dopamin D1, D2, D3, D5 i manifest aciune puternic de blocare a receptorilor D4. n afar de aceasta posed proprieti puternice -adrenolitice, anticolinergice (asupra receptorilor muscarinici), antihistaminice i antiserotoninergice (blocheaz receptorii 5-HT2).

Efectul terapeutic i respectiv toxic sunt dependente de structura stereoelectronic a substanei medicamentoase, concentraia plasmatica, de fora interaciunii medicament receptor.Tabelul 1 Afinitatea fa de receptori pentru diferite neurolepticeClozapinaD4 = 1 > 5 HT2 > D2 = D1

HaloperidolD2 > D1 = D4 > 1 > 5 HT2

Clorpromazina1 = 5 HT2 > D2 > D1

Clozapina practic nu produce reacii extrapiramidale, cum ar fi distonia acut. Efectele secundare de tip Parkinson sunt rare. Tratamentul cu clozapin produce creteri mici sau nu crete de loc nivelul prolactininei, evitndu-se astfel efecte secundare ca: ginecomastie, amenoree, galactoree sau impoten [4,7].

Clozapina posed o cinetic linear n concentraii terapeutice. Aceasta nseamn c rata absorbiei i eliminrii sunt proporionale cu concentraia substanei medicamentoase. Biodisponibilitatea absolut a clozapinei este n mare msur variabil. Dupa administrare oral, de la 27 la 60 % din doza clozapinei ajunge n circulaia sistemic nemodificat. Picul concentraiei (Cmax) este atins ntre 0,4-4,2 ore, eliminarea este bifazic cu o perioad de njumtire (T1/2) terminal medie de 12 -14 ore. La obinerea regimului de stabilitate volumul mediu de distribuie (Vd) constituie de la 2-5 l/kg, iar clearance-ul (Cl) este de la 13 la 57 l/h. Dup administrarea dozei date de 75 mg ntr-o singur priz pe zi timpul de njumtire terminal medie constituie 7,9 ore. La obinerea regimului de stabilitate dup administrarea dozei date de 75 mg/zi, n decurs de 7 zile, acest indice crete pn la 14,2 ore. n perioada regimului de stabilitate obinut la creterea dozei de la 37,5 mg pn la 75 mg i 150 mg (administrat n 2 prize pe zi) s-a constatat o cretere doz-dependent a ariei de sub curb concentratie-timp(AUC); creterea concentraiei plasmatice att minimale, ct i maximale.

Clozapina este aproape complet metabolizat nainte de excreie. S-a constatat c doar unul dintre metaboliii principali metabolitul des-metil, este activ. Aciunile farmacologice ale acestui metabolit sunt asemntoare cu cele ale clozapinei, dar sunt mult mai slabe i de scurt durat. n urin i masele fecale se detecteaz doar urme slabe de substan medicamentoas nemodificat. Circa 50% din doza administrat este excretat n urin, iar 30% n fecale.

Clozapina n mare parte este biotransformat prin N-demetilare i N-oxidare a ciclului piperazinic obinndu-se N-desmetilclozapina i clozapina-N-oxid.

Clozapina este slab transportat de P-gp membranare , acest fapt este justificat de efectele minime a ctorva Pg-p inhibitori, precum i de Km in vitro egal cu 58 M pentru activitatea P-gp ATP-azei pentru clozapin. O serie de studii in vitro demonstreaz c n metabolismul clozapinei CYP1A2 este principala enzim ce catalizeaz formarea N-desmetil-clozapinei, iar CYP3A4 catalizeaz formarea clozapinei N-oxid.

Fig. 1 Cile de metabolizare a clozapinei Farmacocinetica clozapinei este variabil n dependen de organism. Conform unor studii Tmax pentru N-desmetilclozapin este ntre 1,5-40 ore i acest metabolit este eliminat paralel cu clozapina. Clearance-ul la brbai este mai mare dect la femei, fiind corectat n dependen de masa corporal i doz acesta este cu 40% mai mare. La copii i aduli (vrsta ntre 9-16 ani) n monoterapie cu clozapin clearanc-ul este similar cu cel al adulilor la efectuarea coreciei n dependen de masa corporal i doz. Concentraia plasmatic s-a dovedit a fi de 2 ori mare la ft dect cea din plasma matern sau lichidul amniotic, iar n laptele matern aproximativ de 3-4 ori mai mare. Afeciunile ficatului duc la creterea concentraiei plasmatice a clozapinei. Conform unui studiu, metastazele hepatice au fost asociate cu o cretere de 10 ori a concentraiei clozapinei. Din cauza posibilitii interaciunilor cu alte medicamente clozapina nu se administreaz mpreun cu medicamentele ce posed un potenial de deprimare a funciei mduvei osoase. Clozapina poate potena efectele centrale ele alcoolului, inhibitorilor de MAO i ale deprimantelor SNC cum ar fi narcoticele, antihistaminicele, benzodiazepinele. Este necesar o precizie deosebit la administrarea clozapinei la pacienii care sunt (sau au fost recent ) tratai cu benzodiazepine sau orice alte medicamente psihotrope deoarece acestea pot prezenta un risc de colps circulator, care, n rare cazuri poate, poate fi profund i poate duce la stop cardiac i/sau respirator. E necesar de luat msuri de precauie n cazul administrrii concomitente de medicamente cu efecte anticolinergice, hipotensive sau deprimante respiratorii. Deoarece clozapina se fixeaz n proporie mare de proteinele plasmatice, administrarea clozapinei unui pacient care primete un alt medicament care deasemenea se fixeaz n proporie mare de proteine (Ex. Warfarina), poate provoca o cretere a concentraiilor plasmatice ale acestui medicament, avnd ca rezultat potenial efecte adverse. Similar , efecte adverse pot rezulta din dislocarea clozapinei fixate pe proteine de ctre alte medimente care se fixeaz n proporie mare pe proteine [1,3].

Deoarece metabolismul clozapinei este mediat n mare parte de citocromul CYP 1A2 i posibil mai puin de CYP 2D6, administrarea de alte medicamente care posed afinitate fa de una sau ambele izoenzime, poate determina creterea concentraiei plasmatice att a clozapinei ct i a medicamentului dat. Administrarea concomitent a clozapinei cu antidepresivele triciclice, fenotiazina i remediile antiaritmice clasa IC, caracterizeaz afinitatea fa de cit P-450 2D6, nu a determinat interaciuni clinic relevante, dar teoretic este posibil creterea concentraiei plasmatice a acestor preparate, ce presupune micorarea dozei administrate.

Administrarea concomitent a cimetidinei, poate crete nivelurile plasmatice ale clozapinei, iar la adminisrarea concomitent a fluvoxaminei , concentraia plasmatic a clozapinei poate crete de 10 ori, iar ali inhibitori ai recaptrii serotoninei aa ca paroxetina, sertralina, fluoxetina sau citalopramul de 2 ori [3,5].

Medicamentele care induc sistemul enzimatic citocrom P-450 poate reduce nivelurile plasmatice ale clozapinei. Suspendarea carbamazepinei, administrat concomitent conduce la creterea concentraiei plasmatice a clozapinei, iar asocierea cu fenitoina conduce la scderea concentraiei plasmatice. De asemenea prin studii clinice s-a determinat c utilizarea concomitent a eritromicinei n tratamentul cu clozapin poate crete concentraia plasmatic a clozapinei care s conduc la creterea toxicitii. Eritromicina este un inhibitor relativ specific al CYP3A4. Pe de alt parte itraconazolul poate duce la creterea i mai semnificativ a concentraiei plasmatice a clozapinei. Influiena cafeinei asupra concentraiei plasmatice a clozapinei i N-desmetilclozapinei n care s-a determinat o cretere a concentraiei clozapinei i o scdere a concentraiei N-desmetilclozapinei ceea ce se explic prin reducerea activitii de ctre cafein a CYP1A2. Alte exemple de substane medicamentoase care servesc ca substrate pentru izoenzimele CYP1A3 i CYP3A4 i care pot influiena metabolizarea clozapinei ct i a concentraiei plasmatice snt aduse n tabelul 2.

n rezultatul evalurii supradozrii acute accidentale sau intenionate cu clozapin, incidena mortalitii a constituit 12%. Majoritatea deceselor au fost determinate de insuficiena cardiac sau pneumonia prin aspiraie n cazul tratamentului cu clozapin cu doze mai mari de 2000 mg. Sunt descrise cazuri cnd pacienii i-au revenit dup administrarea mai mult de 10000 mg preparat. Totui pentru aduli, care nu au administrat clozapin n antecedente, utilizarea dozei de 400 mg poate cauza dezvoltarea comei sau poate duce la efect fatal. La copii administrarea dozei de 50-200 mg clozapin provoac sedare marcat, sau dezvoltarea strii comatoase fr deces [6,7,8,9].

Datorit capacitii de sedare marcate ce posed o activitate neuroleptic puternic cu efect de sedare ce survine la scurt timp dup administrare ceea ce a determinat abuzul utilizrii ei n calitate de substan narcotic. Cu toate acestea, datorit apropierii concentraiei terapeutice (0,2 - 0,8g/ml) i a celei toxice (0,8 1,3 g/ml) n plasma sanguin, n literatur sunt descrise numeroase cazuri de intoxicaie cu aceast substan . Tabelul 2

IzoenzimaSubstrate pentru izoenzimele citocromului P450

CYP1A2 Acetaminofen Haloperidol

Amitriptilina Metadona

Cofeina Teofilina

Clomipramina Tioridazina

Clozapina R-Warfarina

CYP3A4 Acetaminofen Diazepam Midazolam

Alprazolam Diltiazem Nifedipina

Amiodarona Estradiol Omeprazol

Amitriptilina Eritromicina Quetiapina

Carbamazepina Etosuximida Testosteron

Claritromicina Felodipina Verapamil

Ciclosporina Imipramina

Clomipramina Lidocaina

Clonazepam Loratadina

Clozapina Lovastatina

Substrate pentru izoenzimele CYP1A2 i CYP3A4 a citocromului P450Prin cercetrile pe animalele de laborator s-au determinat DL50 pentru soareci: la administrare p/o este de 199 mg/kg, iar la administrare i/v 61 mg/kg. Pentru obolani acest indice este 260 mg/kg la administrare p/o i de 58 mg/kg la administrare i/v.Concluzii Lund n consideraie particularitaile aciunii farmacologice, a dependenei parametrilor farmacocinetici de organism, metabolizarea substanei i interaciunile posibile ale diferitor substane medicamentoase cu clozapina este necesar studiul complex al diferitor factori att pentru stabilirea tratamentului adecvat ct i n studiul reaciilor adverse i evitarea acestora, al intoxicaiilor ca rezultat al tratamentului sau celor accidentale.Bibliografie

1. Albers L.J., Hahn R.K., Reist K. Handbook of psyhiatric drugs.- Laguna Hills.- California.- 2004.- 72 p.2. Atkinson A.J., Abernethy D.R., Daniels Ch.E. Principles of clinical pharmacology.- Second edition

3. Burton M., Shaw L., Shentag J., Evans W. Applied pharmacokinetics and pharmacodynamics.- Fourth edition.- Lppincott Williams & Wilkins.- 2005.- 867 p.

4. Cristea Aurelia Nicoleta, Tratat de farmacologie.- Ed- Medical.- Ediia I.- Bucureti 2006.-

1332 p.

5. Kari Raaska Pharmacokinetic interactions of clozapine in hospitalized patiens // Academic dissertation.- Helsinki.-2003

6. Meltzer H., Okayli G. Reducting of suicidality during treatement of neuroleptic resistant schizophrenia: impact ou risk-benefit assessment // American journal of psychiatry.- 1995.- p. 152-192

7. .. .- .- .- 2002.- I.- . 71

8. .. .- I.- 596 .

9. .. .- -.- .- 736 .STEREOIZOMERIA I ACIUNEA FARMACOLOGIC A PREPARATELOR

MEDICAMENTOASE

Constantin Cheptnaru1, Mihai Ciorici2, Tamara Cotelea21Catedra Chimie general USMF N. Testemianu

2Catedra Chimie farmaceutic i toxicologic USMF N. TestemianuSummary

Stereoizomery and pharmaceutical action of medicinal substances

Due to the fact that the human body consists of many chiral compounds as: enzymes, receptors, ionic canals, the effect of many enanthiomers, various pharmacokinetic and pharmacodynamic features can take place which were demonstrated in various clinical studies. Only one of the molecular stereoisomers of the preparation can interact with the proteins receptor, while the other one can have a smaller activity due to the nonformation of complete chemical links with the receptor, in this case we speak about stereoselectivity. When we use a preparation as racemat , that means we use a mixture so we will obtain another effect that the expected one. Contemporary methods permit to obtain medicinal substances of a pure form (of one enanthiomer only) and the selection of the best pharmacological action and side effects with minimum toxicity at the same time. The expression of pharmacodynamic and pharmacoinetic properties of different isomers leads to the improvement of the existing medicinal substances.

Rezumat

Deoarece organismul uman este constituit dintr-o mulime de compui chiralici cum ar fi: enzime, receptori, canale ionice efectul diferitor enantiomeri poate avea diferite proprieti farmacocinetice i farmacodinamice demonstrate n diferite studii clinice. Doar unul din stereoizomerii moleculei preparatului poate interactiona cu receptorul proteinei, n timp ce alt izomer poate avea o activitate mai mic din cauza neformrii legturilor chimice complete cu receptorul, n acest caz se vorbete despre stereoselectivitate. Dac vom folosi un preparat n forma de racemat, nseamn c folosim un amestec, deci vom obine un alt efect dect cel ateptat. Metodele moderne permit de a obine sub form pur (a unui singur enantiomer) substanele medicamentoase, i alegerea celei cu cea mai bun aciune farmacologic, i totodat cu reacii adverse i toxicitate minim. Exprimarea proprietilor farmacodinamice, farmacocinetice a diferitor izomeri duce la perfecionarea substanelor medicamentoase deja existente.Actualitatea temei

La momentul actual se cunosc aproximativ 20 mln de compusi chimici precum i o mulime de izomeri ai lor. Food and Drug Administration din Statele Unite ale Americii a stabilit n 1992 c numai enantiomerii activi terapeutic s fie comercializai i c fiecare enantiomer al substanei medicamentoase chirale s fie testat farmacologic separat. Pentru comercializarea de substane chirale ca racemai este necesar o cerere riguros justificat.Obiectivele lucrriin legtur cu tendina companiilor farmaceutice de a crea medicamente noi dar i prin valorificarea celor deja existente considerm necesar atragerea ateniei asupra importanei cunoaterii structurii moleculelor i a activitii farmacologice a diferitor enantiomeri ai substanelor medicamentoase.

Materiale i metode de studiuIzomeri sunt compui chimici care au aceeai formul chimica dar se deosebesc dup poziionarea spaial ale atomilor. Deosebim dou grupe principale de izomeri: izomeri constitutionali si stereoizomeri. Partea de mister a compozitiei lor chimice este activitatea lor biologic adic capacitatea de a participa n reaciile biochimice din organism, i influiena lor asupra funciilor fiziologice. O grup important a compuilor biologic activi este reprezentat de substanele medicamentoase i medicamente. Stereochimia se ocup cu aranjarea n spaiu a atomilor componeni ai unei molecule i cu studiul proprietilor fizice i chimice care decurg din aceast aranjare n spaiu. Stereochimia este deci o parte integrant a teoriei structurii chimice; stereoizomeri sunt substanele care au aceeai compoziie molecular i ordine de legare ntre atomi dar o diferit dispunere spaial a atomilor; astfel, simpla cunoatere a modului de legare a atomilor ntre ei fr cunoaterea amplasrii spaiale a atomilor n molecul este astzi de neconceput.

Fig.1 Interaciunea enantiomerilor cu receptorii n natur moleculele se gsesc fie sub forma unui singur enantiomer, ca cele de proteine, hidrai de carbon i ADN, fie sub forma a doi enatiomeri, ca mentolul, limonenul, carvona, etc. Interacia cu organismul uman a enantiomerilor este diferit. Nu este surprinztor faptul c cei doi enantiomeri ai unui medicament au efecte foarte diferite asupra organismului. Majoritatea moleculelor naturale chirale folosite ca medicamente se gsesc n natur sub forma unui singur enantiomer. Moleculele de sintez, chirale, folosite ca medicamente se comercializeaz ca amestecuri racemice.

n aspect farmacocinetic stereoizomerii compuilor chimici se pot deosebi dup: absorbie, distribuie, excreie, metabolizare, iar in aspect farmacodinamic acetea pot manifesta aciune farmacologic diferit, aciune antagonist, pot s nu manifeste aciune farmacologic sau pot fi toxici.

Ca exemple pentru demonstrarea stereoselectivitii receptorilor este folosit unul din cei mai sensibili receptori ai organismului uman i anumereceptorii simului olfactiv: Exemplu 1: R-limonenul este prezent n fructele de portocal i ofer mirosul caracteristic de portocale, pe cnd L-limonenul posed miros de lamie i ofer mirosul specific acestor fructe. Un alt exemplu de stereoselectivitate a enantiomerilor poate fi observat n gustul a doi compui: R-carvona posed gust a uleiului de ment, pe cnd S-carvona posed gust de coriandru.

Fig.2 Deosebiri ntre substane enantiomere

Un alt exemplu este : losartan (inhibitor al angiotensinei II), doar R-enantiomerul posed aciune farmacologic. n cazul citalopramului (aciune antidepresant): S-citalopram inhib transportorul serotononei i este de 40 de ori mai activ dect R-citalopram. Deosebirile n timpul absorbiei se observ n cazul metotrexatului: D-metrotexat i L-metotrexat se absorb n cantiti mici din intestin dar L-metrotexatul este transportat activ prin pereii intestinului pe cnd D-metrotexat nu este transportat. In acest fel L-metrotexat este absorbit mai bine dect D-metrotexat. n cazul adrenalinei: R-(-)-adrenalina posed o absorbie mai mare ca S-(+)-adrenalina i totodat este de 11-20 de ori mai activ.

n timpul distribuiei n organism fomarea complexului D-propanololului cu albumina plasmatic are loc mai intens dect n cazul L-propanololului. S-warfarina se leag cu albuminele mai intens dar legtura cu proteinele este mai stabil n cazul R-warfarinei. Aceasta condiioneaz diferite viteze de distribuie i clearance pentru diferii enantiomeri. Ca exemplu de substane ce posed activitate farmacologic poate servi warfarina. Formele farmaceutice ale warfarinei constau din prezenta a S- i R- enantiomerilor n raport 50/50, dar S- forma este de 4 ori mai activ dect R-Warfarina, i totodat posed o toleran mai bun. Alt exemplu poate servi ibuprofenul. Forma S- a ibuprofenului posed proprieti analgezice i antiinflamatoare mai mari ca R-izomerul. Dar n organismul uman R-izomerul este modificat n S- forma.

Fig.3 Metabolizarea (R)-ibuprofenului Aciune antagonist a stereoizomerilor posed labetololul. S,R-labetolol manifest proprieti de blocant puternic al receptorilor -adrenergici, pe cnd R,R-labetolol blocheaz receptorii - adrenergici, iar S,S- i R,S- izomerii sunt inactivi, iar forma R,R-labetolol posed aciune hepatotoxic. Un alt exemplu este propanololul: forma S-propanolol are aciune antihipertensiv pe cnd R-propanolol posed aciune contraceptiv. Alte substane pot manifesta aciuni grave cum este n cazul etambutolului: S,S-etambutol posed aciune tuberculostatic iar R,R-etambutol provoac orbirea.

Metabolizarea streoizomerilor cu participarea diverselor izoenzime ale citocromului P 450 se ntlnete n cazul warfarinei: S-warfarina n organismul uman este metabolizat de ctre izoenzima CYP2C9, iar R-warfarina de catre CYP 1A2, CYP3A4.

Argumente ale necesitii cunoaterii profunde a aciunii substanelor medicamentoase mai ales a celor noi (originale) este cazul talidomidei care era utilizat n anii 60 ca hipnotic (impotriva insomniei). Prescris multor femei gravide, talidomida a provocat nou-nscuilor focomelii (malformatii ale membrelor, minile i picioarele fiind legate direct de trunchi). Astfel S-talidomida are aciune teratogene pe cnd R-talidomida posed proprieti hipnotice i sedative.

Fig.4 Copii cu focomelii ale membrelor Prin nomenclatura medicamentelor se poate de neles care sunt medicamentele existente sub forma unui singur enantiomer: dexametazon, dexamfetamin, dextrometorfan (substane dextrogire) sau levamisol, levonorgestrel, levodopa s.a. Producia de medicamente enantio-pure a crescut continuu ajungnd la vnzri de peste 100 mlrd de dolari SUA n cursul anului 2000. Multe medicamente se mai comercializeaz ca amestecuri racemice i n continuare. Concluzii

Exprimarea proprietilor farmacodinamice, farmacocinetice a diferitor izomeri duce la perfecionarea substanelor medicamentoase deja existente. Pe piaa european a medicamentelor numai 15% dintre substanele active sunt prezente sub forma de un singur enatiomer, restul (85%) reprezint amestec de izomeri. Totodat metodele moderne permit de a obine sub form pur (a unui singur enantiomer) substanele medicamentoase, i alegerea celei cu cea mai buna aciune farmacologic, i totodat cu reacii adverse i toxicitate minim.

Bibliografie 1. Andrew J. Hutt Stereochemistry and biological activity.-Departementof Pharmacy.- Kings College.- London.-2003

2. Andrew J. Hutt, Valentava J. The chiral swich: the development of single enantiomer drugsfrom racemates.- Departament of Pharmacy.- Kings College.-London, Departament of Chemical Theory of Drugs.- Faculty of Pharmacy.- Comenius University.-Bratislava.-2003

3. Chandra Sahajwalla Regulatory conciderations in drug development of stereoisomers.-Food and Drug Administration.- Rockville.-Marylan.-USA.-2004

4. Chimie.- Revista trimestrial pentru elevi.- Nr.2, martie.- Bucureti.-2003

5. Jonathan McConathy, Michael J. Owens Stereochemistry in drug action.- Department of Psychiatry and Behavior Science.- Emory University School of Medicine.- Atlanta.-2003

6. PhilipW. Salbutamolenantiomers: early clinical evidance in humans.- Division of Respiratory Medicine.-London.-20087. .. .- .- .- 1.-1998DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC A COEFICIENTULUI DE DISTRIBUIE AL NITRATULUI DE PROPICONAZOL N SISTEMUL BINAR OCTANOL AP LA VALORI DIFERITE ALE pH-ului FAZEI APOASE

Ghenadie Nistreanu1 , Petru Grosu21. Catedra Tehnologia medicamentelor,

2. Catedra Chimie farmaceutic i toxicologicAbstractThe spectrophotometric determination of distribution coefficient

of propiconazole nitrate in the binary system

octanol-water at different pH values of aqueous phase

In this paper is proposed and tested an UV spectrophotometric method for determination of constant distribution of propiconazole nitrate between an aqueous buffer phase with different pH value and a lipid phase(octanol). In the case of propiconazole nitrate incorporation in simple or multiple pharmaceutical emulsioned systems is needed to know the octanol/water partition coefficient of this substance because their liberation from this system is a result of the partitioning phenomena between aqueous and lipid phase. This method can be applied also for other active substances incorporated in various immiscible binary systems.Rezumat

In aceast lucrare se propune i se testeaz o metod spectrofotometric n UV n vederea determinrii coeficientului de partiie a nitratului de propiconazol ntre o faz apoas tamponat la valori diferite de pH i o faz lipidic (octanol). Cunoaterea coeficientului de partiie al nitratului de propiconazol n sistemul binar menionat este necesar n cazul ncorporrii acestuia n sisteme farmaceutice emulsionate (simple sau multiple) pentru c cedarea sa se realizeaz n urma fenomenelor de partiie ntre faza apoas i cea lipidic. Metoda prezentat n lucrare se poate aplica i pentru alte substane active ncorporate n diverse sisteme binare nemiscibile.Actualitatea temeiDin punct de vedere chimic, nitratul de propiconazol este (4-propil-2-(1H-1,2,4-triazol-1-metil)-2-(2,4-diclorfenil)-1,3-dioxolan nitrat). Se prezint ca o pulbere cristalin alb sau alb cu nuan glbuie fr miros; este uor solubil n dimetilsulfoxid, uor solubil n acid nitric diluat, solubil n alcool etilic, foarte puin solubil n ap i cloroform, practic insolubil n hexan, ciclohexan i tetraclorur de carbon [2]. Cunoaterea coeficientului de distribuie al nitratului de propiconazol n sistemul lipid/ap este important n cazul prezicerii transportului prin membrane biologice la nivelul tractului gastro-intestinal[1,3,4,5].

Scopul lucrrii a fost de a determina coeficientul de distribuie octanol/ap a nitratului de propiconazol la valori diferite ale pH-ului fazei apoase.Materiale i metodePrepararea soluiei saturateSe cntresc 1,5 g nitrat de propiconazol i se aduc ntr-un balon conic n care se adaug apoi 200 ml octanol. Dispersia are loc la temperatura camerei, agitnd continuu timp de 6 ore. Amestecul se filtreaz, iar soluia transparent obinut se pstreaz ntr-un recipient nchis, ferit de lumin.

Prepararea amestecurilor binareSe prepar 4 amestecuri binare, n baloane cotate cu capacitatea de 50 ml, prevzute cu dop. n fiecare recipient se introduc 5 ml soluie saturat de nitrat de propiconazol n octanol i urmtoarele volume de faz apoas: 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml, i 20,0 ml. Recipientele se nchid, se agit timp de 48 de ore. Dup ncetarea agitrii i separarea fazelor, se preleveaz probele de faz organic i dup diluiile corespunztoare se msoar absorbana la lungimea de und de 263 nm, la spectrofotometrul Agelent, utiliznd cuve de cuar cu grosimea de 1 cm, iar n calitatea de soluie de compensare se utilizeaz octanolul(Ph.Eur.).

Rezultate i discuiiDup separarea fazelor i prelevarea probelor din faza organic spectrofotometric se determin concentraiile de nitrat de propiconazol n faza organic.Concentraiile de echilibru ale nitratului de propiconazol n aceste probe sunt[c]oct(1), [c]oct(2), [c]oct(3), .[c]oct(i), . [c]oct(N)iar n fazele apoase corespunztoare[c]ap(1), [c]ap(2), [c]ap(3), .[c]ap(i), . [c]ap(N)Masa (m) de propiconazol, introdus n baloane (aceeai mas, avnd n vedere faptul c s-a introdus acelai volum de soluie stoc n fiecare balon), se poate exprima dup cum urmeaz:

mtot= m oct(i) + m ap(i)

m=[c]oct(i) Voct(i) Mpropic + [c]ap(i) Vap(i) Mpropic

(1)

n relaia (1) volumul fazei organice Voct este acelai pentru toate amestecurile seriei.Coeficientul de distribuie se poate exprima, n funcie de concentraiile stabilite n cele dou faze din balonul nr. "i", dup cum urmeaz:

D=[c]oct(i)

[c]ap(i)

Dac se exprim concentraia de echilibru [c]oct(i) din relaia (2) i se substituie n relaia (1), rezult:

mtot= m oct(i) + m ap(i)

(3)

masa total a nitratului de propiconazol din amestecul binar;

concetraia nitratului de propiconazol din amestecul binar;

volumul fazei apoase luat petru praparea amestecului binary;

volumul fazei organice luat petru praparea amestecului binary;

coeficientul de partiie;

masa molar a nitratului de propiconazol;

Relaia (3) este echivalent cu relaia (4), care are forma ecuaiei unei drepte dac se reprezint grafic valoarea reciproc a absorbanelor n funcie de volumele fazei apoase pentru toate cele n soluii ale seriei.

(4)prezentarea grafic a datelor menionate se determin panta (a) i ordonata la origine (b) a dreptei (5).

(5)

unde;

;

Raportul dintre mrimile b i a este proporional cu constanta de distribuie D.

(6)Cunoscnd mrimile a, b i Voct(i), relaia (6) permite calcularea constantei de distribuie D [2,4,6].Rezultate i discuiin tabelul 1 sunt prezentate valorile cantitilor de nitrat de propiconazol nitrat determinate n faza uleioas, pentru 5 valori de pH ale fazei apoase mpreun cu valorile lor reciproce i cu mrimile calculate conform celor prezentate mai sus.

Tabelul 1

Rezultatele obinute pentru 5 serii de determinri efectuate la 5 valori diferite ale pH-ului ale fazei apoase

pH=3,5pH=5pH=6pH=7pH=8

00,5060,5060,5060,5061,9751,9751,9751,9751,9751,975

50,5000,5000,5000,5001,9991,9991,9991,9991,9991,999

100,4920,4920,4920,4922,0332,0332,0332,0332,0332,033

150,4850,4850,4850,4852,0642,0642,0642,0642,0642,064

200,4870,4870,4870,4872,0542,0542,0542,0542,0542,054

a14,6214,3514,7415,2614,91

b76,92

D26,326,826,125,225,8

Figura 1 red reprezentrile grafice ale datelor n forma liniarizat la pH=5.

figura 1

reprezentarea grafic a variaiei valorilor cantitilor determinate de

propiconazol nitrat n funcie de volumul fazei apoase (pH= 5.0)

Dependena valorilor D de pH-ul fazei apoase este redat n figura 2.

Modul de lucru propus, aplicabil i n cazul altor sisteme ternare de tipul celui prezentat, posed cteva avantaje, dup cum urmeaz:

- chiar dac n fazele apoase, avnd pH-uri diferite, nitratul de propiconazol poate exista n diferite forme ionizate, forme pentru care absorbtivitile molare au valori diferite, aplicabilitatea metodei nu este afectat, avnd n vedere faptul c msurtorile se execut numai n faza organic, n care nitratul de propiconazol este n aceeai form molecular, indiferent de pH-ul fazei apoase.

- nu este necesar cunoaterea explicit a valorii absorbtivitii molare e a nitratului de propiconazol n faza organic.

- nu este necesar cunoaterea explicit a concentraiei nitratului de propiconazol n soluia stoc. Prin urmare, nu este necesar cunoaterea explicit a solubilitii nitratului de propiconazol n cele dou faze. Singura restricie la prepararea soluiei stoc este aceea de a se limita la concentraii suficient de mici pentru a asigura un comportament cvasi-ideal al sistemului. Reuita liniarizrii datelor conform relaiei (4) constituie confirmarea respectrii acestei restricii.

- la nceput substana de interes se dizolv n faza organic; n consecin se poate utiliza aceeai soluie stoc n cazul n care se execut determinri la pH-uri diferite ale fazei apoase sau la temperaturi diferite, deoarece nu este hotrtoare concentraia soluiei stoc.

- posibilitatea alegerii convenabile a volumului fazei organice (Vu) i a volumelor de faz apoas (VAi), ofer acestei metode flexibilitatea necesar pentru acoperirea unei game extinse de valori ale coeficientului de partiie D.

- n unele sisteme faza organic poate dizolva, ntr-o oarecare msur, apa din faza apoas. Efectul acestui fenomen se poate compensa prin saturarea n prealabil a fazei organice cu ap la temperatura de lucru i prin utilizarea fazei organice saturat cu ap drept referin la msurarea absorbantelor.ConcluziiReprezentnd grafic valoarea reciproc a absorbantei n funcie de volumele fazei apoase n form liniarizat, atest relaia liniar preconizat ntre aceste date precum i comportamentul cvasiideal al sistemului octanol nitrat de propiconazol - ap.

Din analiza valorilor coeficientului de partiie al nitratului de propiconazol n sistemul binar octanol - ap, obinute pentru cele 5 valori de pH diferite ale fazei apoase, se poate concluziona c echilibrul de distribuie al substanei medicamentoase nu poate fi deplasat spre faza apoas sau spre cea lipidic prin modificarea pH-ului fazei polare. Metoda de lucru propus poate fi aplicat i n cazul altor sisteme de tipul celui prezentat datorit avantajelor pe care le posed i care au fost menionate anterior.

Bibliografie1. Beetge E., du Plessis J., Miiller D.G., Goosen C, Rensburg F.J. - The influence of the physicochemical characteristics and pharmacokinetic properties of selected NSAID's on their transdermal absorption, InternationalJour nai of Pharmaceutics, 2000, 193, 261-264.

2. Dnil Gh. - Chimie farmaceutic, vol.l, Ed. AII, Bucureti, 1996.

3. Dross Karl P., Mannhold Raimund, Rekker Roelof F. - Drug lipophilicity in QSAR practice: II. Aspects of Rm - Determinations; critics of Rm - corrections; interrelations with partition coefficients, Quant. Struct.-Act. Reiat, 1992, 11, 36 - 44.

4. Goosen C., du Plessis J., Miiller D.G., Janse van Rensburg L.F. -Correlation between physicochemical characteristics, pharmacokinetic properties and transdermal absorption of NSAID's, International Journal of Pharmaceutics, 1998, 163, 203 - 209.

5. Grassi M., Coceani N., Magarotto L. - Modelling partitioning of sparingly soluble drugs in a two-phase liquid system, International Journal of Pharmaceutics, 2002, 239, 157 - 169.STUDIUL METODELOR DE DEZAGREGARE A COMPRIMATELOR ORODISPERSABILE CU SPIRONOLACTON

Allaa M. Fathi Baroud

Catedra Tehnologia medicamentelor

Summary

Study of the disintegration methods of orally disintegrating spironolactone tablets

An alternative disintegration method for orally orodispersable tablets has been proposed. This test is the nearest to in vivo conditions. The respective apparatus was proposed for this investigation. Rezumat

A fost elaborat o metod alternativ de evaluare a timpului de dezagregare a comprimatelor orodispersabile. Acest test este cel mai apropiat de condiiile in vivo. S-a propus dispozitivul respectiv pentru efectuarea acestei cercetri. Actualitatea temei

n ultimii ani tot mai multe substane medicamentoase din diferite clase farmaco-terapeutice sunt elaborate n comprimate orodispersabile, datorit avantajelor fa de comprimatele obinuite: dezagregare rapid n cavitatea bucal cu eliberarea imediat a substanei medicamentoase; lipsa efectului primului pasaj hepatic; nu este necesitate de ap; administrarea n caz de disfagii etc. n piaa farmaceutic actualmente sunt autorizate circa 150 de produse, din care: 40% sunt preparate utilizate n tratamentul maladiilor sistemului nervos central (depresii, migrene, insomnii, boala Alzheimer etc.); 34 % n tratamentul dereglrilor traectului gastro-intestinal; circa 10% n oncologie i 7% n trartamentul diabetului zaharat [4, 9, 10,11].

Formularea comprimatelor orodispersabile prevede o dezagregare rapid pentru cedarea imediat a substanei medicamentoase n cavitatea bucal. Timpul de dezagregare trebuie s fie n limitele de la 15 sec pn la 3 minute, care n mare msur depinde i de metoda folosit la determinare. Att n USP ct i Eur. Ph. nu sunt descrise meode de determinare a timpului de dezagregare pentru comprimatele orodispersabile [1, 2, 3, 8]. .

Metoda USP 29 disintegration test descris pentru comprimatele orale nu prevede o corelare exact cu datele in vivo, deoarece pentru dezagregare se folosesc 900 mL ap i n aparate energic oscilante, condiii care nu sunt apropiate de cele din cavitatea bucal (cantitatea de saliv circa 5 mL). n legtur cu aceasta sunt propuse diferite metode de evaluare a dezagregrii comprimatelor orodispersabile [5,6,7].

Este foarte important, ca metodele pentru evaluarea dezagregrrii acestor comprimate s posede atribute specifice: condiiile de testare s simuleze condiiile din cavitatea bucal, caracteristice pentru suprafaa umed a limbii i volumului de saliv; o bun reproductibilitate pentru diferii operatori; o corelare rezonabil in vitro/in vivo; evaluare rapid cu disozitive simple [12,13 ]. Obiectivul acestui studiu a fost de a elabor o metod simpl in vitro de evaluare a timpului de dezagregare a comprimatelor orodispersabile n comparaie cu unele existente.

Material i metode

Materiale

Substana activ: spironolacton (Ph.Eur.).

Substanele auxiliare folosite n studiu: sorbitol (C Sorbidex P, Cerestar); crospovidon (PVP K30, Ph. Eur.); lactoz fin (Pharmatose 110M, BASF); siliciu dioxid coloidal (Aerosil 200, Degussa AG); stearat de magneziu (Magnesium stearate, Barlocher GmbH). Metode

Comprimatele au fost obinute prin metoda de presare direct la presa hidraulic, la trei valori ale forei de comprimare: 80, 120, i 160 N, diametrul comprimatelor fiind de 6 mm, iar masa unui comprimat de 100 mg.

Rezistena mecanic a comprimatelor la rupere a fost determinat la dispozitivul hardnes tester TBH 28 ERWEKA Co. LTD.

Friabilitatea comprimatelor a fost evaluat la dispozitivul cu palete model AK-8.

Timpul de dezagregare a comprimatelor a fost evaluat la dispozitivul tablet disintegration tester ELECTROLAB ED 2 SAPO cu folosirea discurilor de ghidare (metoda Ph. Eur., 2004), metoda cu palet USP 29 (aparatul Erweka DT 6), testarea in vivo la voluntari (comprimate placebo) i metoda propus de autor (descris mai jos).Rezultate i discuii

Reieind din cele expuse, au fost formulate 3 loturi de comprimate, folosind crospovidona, lactoza, sorbitolul (excipieni de baz). Pentru mbuntirea calitii amestecului de comprimat s-a apelat i la alte substane auxiliare, precum siliciul dioxid coloidal (1%), n vederea sporirii proprietilor de legtur a particulelor i stearatul de magneziu ca lubrifiant (1%). Coninutul spironolactonei 25 mg. Formulele comprimatelor cercetate sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1

Formulele comprimatelor orodispersabile cu spironolactonDenumirea componentelorSaSbScPlacebo

Spironolacton25,025,025,0-

Crospovidon25,030,035,035,0

Lactoz fin10,010,015,030,0

Siliciu dioxid coloidal1,01,01,01,0

Stearat de magneziu1,01,01,01,0

Sorbitol q.s. pn la .... mg100,0100,0100,0100,0

Descrierea dispozitivului de determinare a timpuluii de dezagregare. Dispozitivul (fig.1) a fost asmblat folosind aparatul B de msurare a timpului de nmuiere a supozitoarelor lipofile Erweka. n tubul din sticl nchis la captul inferior cu un dop (2) se introdic comprimatul (5) i 5 ml ap distilat, nclzit la 37 0,50 C. Deasupra comprimatului se aplic tija (3) trecut prin tubul de ghidaj (4). Tubul 2 se introduce n baia de ap termostatat la 37 0,50 C a aparatului de evaluare a testului de dizolvare Erweka DT 6. Tija se cupleaz cu mecanismul de rotaie (1) a aparatului Erweka DT 6 cu o vitez de 100 turaii pe minut. Se msoar timpul ntre acest moment i momentul n care comprimatul este dezagregat n particule care trec prin partea ngustat a tubului.

Fig. 1. Dispozitivul de determinare a timpului de dezagregare a comprimatelor orodispersabile: 1 mecanism de cuplare la rotor; 2 tub de dezagregare; 3 tij din oel inoxidabil ; 4 tub de ghidaj din sticl; 5 comprimat; 6 particule dezagregate.

Comprimatele obinute la valoarea presiunii de 80 N nu au fost luate n lucru deoarece sunt fragile.

Rezultatele din tabel demonstreaz c, odat cu creterea concentraiei crospovidonei se micoreaz timpul necesar pentru dezagregarea comprimatelor, evaluat cu toate metodele de investigare. Astfel, la concentraia de 35 % (formula Sc), timpul este cel mai mic i constituie 2,03 0,19 min, timp evaluat cu metoda propus. De asemenea, cel mai mic timp se observ i la metoda in vivo, care constituie 1,88 0,15 min. Testul de evaluare a timpului de dezagregare propus este cel mai apropiat de condiiile in vivo (p