Secţia Stiinte MedicaleAnexa 1

Raportul Centrului de Imunologie al Academiei Române pentru anul 2015

1. Membrii Secţiei – lucrări publicate în anul 2015; cea mai importantă lucrare a fiecărui membru apărută în anul 2015.

2. Centrul de Imunologie a) Domenii de cercetare.

- Imunologie tumorala: Mecanisme celulare si moleculare implicate in progresia

tumorala; expresia genica/antigenica a moleculelor asociate tumoral, molecule de

adeziune tumorala, oncoproteine, molecule implicate in angiogeneza si rolul lor

functional;

- Biologie moleculara: biomarkeri asociati cancerelor umane (boli limfoproliferative,

cancer mamar, ovarian, colorectal, gastric, din sfera ORL, melanom);

- Imunoterapia cancerului: studii in vitro ale unor abordari imunoterapeutice in cancer;

rolul moleculelor reglatoare ale complementului in rezistenta tumorilor la tratament si

impactul in imunoterapia tumorala; efectul modulator al micromediului tumoral asupra

tintelor terapeutic.

- Preventia/chimiopreventia/rezistenta multipla la medicamente: efectele unor

modulatori (compusi biologic activi, citokine, medicamente, citostatice) asupra ciclului

celular, apoptozei, expresiei genice/antigenice si rolului functional al moleculelor

associate celulelor tumorale;

1

- Celule stem tumorale;

- Semnalizare intra- si inter-celulara: proteine fosforilate, MAPK-ze.

b) Programe de cercetare fundamentale (proiecte de cercetare curenta ale Academiei Romane)

Program I: “STUDIUL UNOR MECANISME CELULARE SI MOLECULARE IMPLICATE IN PROGRESIA TUMORALA SI CHIMIO-PREVENTIE” (coordonator program: dr. Lorelei I. Brasoveanu)

1.1. Tema “MODULAREA EXPRESIEI UNOR BIOMARKERI ASOCIATI PROCESULUI DE ANGIOGENEZA IN CANCERUL MAMAR DE CATRE CITOKINE” (Director proiect Drd. Camelia Hotnog, CS)

1.2. Tema „IMPLICAREA MOLECULEI STIMULATOARE A LIMFOCITELOR B (BlyS) IN APOPTOZA CELULELOR LEUCEMICE” (Director proiect Dr. Viviana Roman, CS II)

1.3. Tema „ANALIZA EFECTELOR UNOR COMPUSI NATURALI ASUPRA UNOR PROTEIN-KINAZE ACTIVATE DE MITOGENI CU ROL IN PROCESELE DE SEMNALIZARE INTRACELULARA IN CELULELE TUMORALE” (Director proiect Dr. Marinela Bostan, CSIII)

3. Resurse umane: cercetători, doctori, conducători de doctorate (vezi tabelul din anexa 2). cercetatori: 5 cercetatori stiintifici atestati

doctori: 4

conducatori de doctorate: 2 (1 angajat si 1 pensionar)

4. Activitate formare de tineri cercetători: doctoranzi, post-doctoranzi.

- 1 doctorand, cercetator angajat in Centrul de Imunologie, Institutul de Virusologie

„Ştefan S. Nicolau”, Camelia Mia Hotnog, cu tema de doctorat “Factori genetici si

imunologici implicati in progresia tumorala si angiogeneza” (coordonator: Dr. L.I.

Brasoveanu) in Centrul de Imunologie, IOD: Institutul de Virusologie „Ştefan S.

Nicolau” al Academiei Române:

2

- 9 doctoranzi externi aflati in faza finala a programului doctoral (6 doctoranzi -

coordonator: Dr. L.I. Brasoveanu; 3 doctoranzi - coordonator: Dr. C. Galatiuc/ CSI,

pensionata)

5. Infrastructură de cercetare nouă achiziţionată/completată în anul 2015: biblioteca de specialitate, echipamente de cercetare (cu valori peste 10 kEuro), etc.

a) Biblioteca de specialitate- Acces la baze de date nationale si la baze de date bibliografice internationale: prin Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau” si prin Biblioteca Centrala a Universitaţii de Medicină si Farmacie “Carol Davila” - Acces la 4 abonamente anuale CIB (reviste stiintifice de specialitate):

1) „Citometry” part A; 2) „Apoptosis”; 3) „Haematologica - The Hematology Journal”

b) Achizitie mobilier de laborator: in valoare de aprox 20000 Euro in Laboratorul de

Imunologie Tumorala din cadrul Centrului de Imunologie, parte integranta a Centrului

“ONCOVIR” creat prin programul POS-CCE 433/2012 - ONCOIVN (director dr. Gabriela

Anton, IVN)

6. Rezultatele cercetării desfăşurate în anul 2015 (vezi tabelul din anexa 2).- lucrări publicate:

a. în reviste ISI din străinătate: 2 lucrari in extenso (“Materials Letters”, “International

Journal of Pharmaceutics”)

b. reviste ISI din România:

c. reviste CNCSIS (B+): 2 (“Romanian Archives of Immunology and

Microbiology”, submitted)

d. volume conferinte internationale: 4 lucrari sub forma de rezumat

e. volume conferinte nationale: 7 lucrari sub forma de rezumat

- cărţi/ capitole carte publicate în străinătate/ în România - Editura Academiei

Române/alte edituri:

- 1 capitol acceptat, in curs de publicare (Coralia Bleotu, Demetra Socolov, Mariana Anton,

Anca Botezatu, Adriana Plesa, Iulia Virginia Iancu, Lorelei Irina Brasoveanu, Gabriela Anton,

Carmen Cristina Diaconu, “Interplay of epigenetics with gynecological cancer”, in „Gynecologic

Cancers - Basic Sciences, Clinical and Therapeutic Perspectives”, Ed.“InTech” - Croatia)

3

- 1 capitol trimis, in curs de evaluare (Marinela Bostan, Mirela Mihaila, Camelia Hotnog,

Coralia Bleotu, Gabriela Anton, Viviana Roman, Lorelei I. Brasoveanu, “Modulation of apoptosis in

colon cancer cells by bioactive compounds”, in “Colon Cancer”, Ed.“InTech” - Croatia)

- citări ale lucrărilor publicate anterior, în anul 2014: 23

7. Realizări excelente obţinute în anul 2015 (cca. 3 realizări), ale Secţiei şi

institutelor/centrelor coordinate:

- Cărţi (opere fundamentale);

- Lucrări ştiinţifice (publicate în reviste cu factor de impact ridicat):

Co-autor articol premiat in anul 2015 de catre ANCS/ UEFISCDI:

I. Lacatusu, N. Badea, G. Badea, O. Oprea, M.A.Mihaila, D.A. Kaya, R. Stan, A.

Meghea, „Lipid nanocarriers based on natural oils with high activity against oxygen free

radicals and tumor cell proliferation”, Materials Science and Engineering, vol. 56, pg.

88–94, 2015.

- Rapoarte/studii de mare interes national:

1) Raport faza 4 proiect PCCA 136/ 2012 (RUSYST)

- Alte realizări pe care le consideraţi excelente (dacă este cazul):

Dr. Lorelei I. Brasoveanu - evaluator in 2015 al unor articole reviste nationale (Romanian

Archives of Immunology and Microbiology, Romanian Journal of Oncology and

Hematology) si internationale (Extremophiles, Ed. Springer).

8. Cooperări ştiinţifice naţionale şi internationale, inclusiv în cadrul proiectelor (cu menţionarea numărul proiectului şi a partenerilor).

A. COOPERARI STIINTIFICE NATIONALE IN PROIECTE DE CERCETARE:

- Institutul Oncologic „Prof. Dr. Alex. Trestioreanu”;

- UMF “Carol Davila” Bucuresti

- Universitatea Bucuresti, Facultatea de Biologie

- Universitatea Bucuresti, Facultatea de Chimie

- Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti

4

- Spitalul Clinic Universitar “Sfantul Ioan”

- INCDI “Victor Babes”

- INCDI “I. Cantacuzino”

- ICECHIM

- Spitalul Clinic Panduri

a) PN-II - PCCA contract 136/2012 (Biotehnologie): “Conceperea si dezvoltarea unor

sisteme de transport si cedare pentru noi compusi de ruteniu cu actiune antitumorala (RuSYST)”,

iulie 2012 – decembrie 2016, responsabil proiect P3 Dr. Mirela Mihaila, CSIII (Coordonator proiect

UMF Bucuresti - Conf. Dr. Valentina Uivarosi; alti parteneri: Institutul Oncologic „Prof. Dr. Alex.

Trestioreanu”; Universitatea Bucuresti, Facultatea de Biologie);

b) PN-II-PT-PCCA-2013-4-1761 “Bio-produse dermato-cosmetice pe baza de uleiuri

vegetale si fitocomplecsi cu actiune anti-acneica“ (Dr. Mirela Mihaila - Colaborator extern;

Coordonator proiect : S.L. dr. Ioana Lacatusu, Universitatea Bucuresti, Facultatea de Chimie)

c) PROIECTE FINANŢATE DIN FONDURI STRUCTURALE

Contract nr. 433/21.12.2012 “MODERNIZAREA UNUI CENTRU PENTRU STUDIUL

ONCOGENEZEI SI AL UTILIZARII ONCOLIZEI VIRALE CA STRATEGIE

TERAPEUTICA” – cod 929 - 14049, coordonator Institutul de Virusologie “Stefan S. Nicolau”,

manager proiect dr. Gabriela Anton, durata proiect 32 luni (dec 2012 - august 2015); Centrul de

Imunologie – dr. Lorelei I. Brasoveanu, membru in Comitetul de Management al Proiectului;

membri proiect - dr. Mirela Mihaila, dr. Marinela Bostan, dr. Viviana Roman, drd. Camelia

Hotnog), participanti in comisiile de licitatii pentru achizitiile din cadrul proiectului

B. Cooperări ştiinţifice internaţionale:

1. Institutul Curie, U-365, Paris, Franta (Prof. Jean-Pierre Kolb)

2. Centro di Riferimento Oncologico Aviano, Italia (Dr. Luca Signorelli; dr. Sandra Coral)

3. Spitalul Universitar din Siena, Italia (Dr. Michele Maio, dr. Ester Fonsatti)

4. Cellular Technology, Cleaveland, SUA (Dr. Ioana Moldovan)

5. Universitatea din Pittsburgh (Dr. Iulia Popescu)

9. Conferinţe (simpozioane)/ manifestări ştiinţifice organizate de institutele/centrele coordinate.

5

Centrul de Imunologie a participat in 2015 in calitate de co-organizator la urmatoarele

manifestari stiintifice:

- Conferinta de inchidere a proiectului finanţat din fonduri structural, Contract nr.

433/21.12.2012 “MODERNIZAREA UNUI CENTRU PENTRU STUDIUL ONCOGENEZEI

SI AL UTILIZARII ONCOLIZEI VIRALE CA STRATEGIE TERAPEUTICA” – cod 929 -

14049, coordonator Institutul de Virusologie “Stefan S. Nicolau”, manager proiect dr. Gabriela

Anton, durata proiect 32 luni (dec 2012 - august 2015);

10. Alte activitati:- Participarea la programe/ workshopuri de perfectionare

11. Greutati intampinate in activitatea de cercetare:- Lipsa finantarii activitatilor de cercetare realizate in cadrul proiectelor de cercetare

fundamental/ curenta (fonduri pentru reactivi si materiale consumabile);

12. Concluzii şi propuneri:- In vederea realizarii in conditii optime a obiectivelor propuse in cadrul planului de

cercetare curenta al Academiei Romane, precum si a contractelor de cercetare finantate

de Ministerul Cercetarii, solicitam efectuarea de catre Academia Romana a demersurilor

necesare suplimentarii posturilor in cercetare din Institutul de Virusologie „Stefan S.

Nicolau”, respectiv Centrul de Imunologie. In acest moment exista o mare lipsa de

personal cu studii superioare, in special cercetatori tineri, dar si de personal calificat cu

studii medii.

- Propunem de asemenea: deschiderea finanţărilor pentru Granturile Academiei Romane in

anul 2016; alocarea de fonduri pentru contractele de cercetare curenta.

- Alocarea de fonduri pentru efectuarea unui studiu de rezistenta a cladirii in care

functioneaza Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”, respectiv Centrul de

Imunologie, avand in vedere vechimea de peste 50 de ani a acesteia.

- Alocarea de fonduri pentru efectuarea de reparatii ale cladirii in care functioneaza

Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”, respectiv Centrul de Imunologie, precum si

a instalatiilor electrice si sanitare, avand in vedere vechimea de peste 50 de ani a

acestora.

6

PROIECTE DE CERCETARE

Secţiunea 1 PROIECTE FINANŢATE DE CATRE ACADEMIA ROMÂNĂ

La realizarea planului de cercetare propus pentru 2015 de catre Centrul de Imunologie

Bucuresti a participat in cadrul programului si temelor propuse tot personalul angajat, atat cei cu

studii superioare, de la cercetatorii stiintifici gr. I pana la cercetatorii stiintifici, cat si personalul cu

studii medii. Rezultatele obtinute prin efectuarea studiilor din cadrul programului major de cercetare

curenta al Centrului de Imunologie, reprezentat prin trei teme, precum si prin proiectele cu finantare

suplimentara sau colaborarile stiintifice cu alte institutii, au fost valorificate prin comunicari la

manifestari stiintifice nationale si internationale, precum si prin publicatii in reviste de specialitate.

Programul 1 “STUDIUL UNOR MECANISME CELULARE SI MOLECULARE

IMPLICATE IN PROGRESIA TUMORALA SI CHIMIO-PREVENTIE”

1.1. Tema “Modularea expresiei unor biomarkeri asociati procesului de angiogeneza in

cancerul mamar de catre citokine” (Director proiect Drd. Camelia Hotnog, CS)

Obiectivul general al proiectului: Evaluarea prin citometrie in flux a influentei tratamentului cu

citokine asupra expresiei unor biomarkeri asociati procesului de angiogeneza in cancerul mamar.

Faza I: Stabilirea modelului experimental „in vitro”.

Cancerul mamar reprezinta una dintre cele mai comune maladii maligne la nivel mondial. In

ciuda progreselor realizate prin terapia sistemica, prognosticul continua sa fie unul nefavorabil, fapt

ce subliniaza necesitatea unor noi strategii pentru inhibarea cresterii tumorale in cancerele de san.

Angiogeneza tumorala reprezinta un proces esential in dezvoltarea si metastazarea cancerului de

san; acest proces include destabilizarea vaselor de sange existente, proliferarea celulelor endoteliale,

migrarea si tubulogeneza. In timpul progresiei tumorale, angiogeneza are loc atunci cand expresia

moleculelor pro-angiogenice este mai mare decat cea a inhibitorilor de angiogeneza. Expresia

moleculelor pro-angiogenice este crescuta de stimuli fiziologici, cum ar fi hipoxia - indusa de o

masa tisulara crescuta- si activarea oncogenelor sau mutatii ale genelor supresoare de tumori.

Principalii factori de crestere activatori ai angiogenezei sunt VEGF, bFGF si factorul de crestere 7

hepatocitar. Alti reglatori pozitivi sunt angiopoietina-1, angiotropina, angiogenina, factorul de

crestere epidermal, G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), IL-1, IL-6, IL-8, PDGF

(platelet-derived growth factor) si TNF-alfa (tumor necrosis factor).

Molecule cum ar fi factorul de crestere a endoteliului vascular (VEGF), moleculele de

adeziune celulara (ICAM-1, VCAM-1, E-caderina, endoglina/ CD105), mucinele (MUC-1, 2 3) sunt

considerate biomarkeri de interes si posibile tinte imunoterapeutice. Co-expresia in celulele

tumorale a unor molecule implicate in interactiunile celulare si modificarile ce intervin la nivelul

adeziunii si mobilitatii celulare pot influenta agresivitatea si potentialul metastatic al unei tumori. De

aceea, modularea expresiei acestor molecule si a receptorilor acestora in celulele tumorale, si

stabilirea inter-relatiei intre nivelul expresiei si progresia tumorala este de un real interes.

Ca prima etapa, a fost analizata expresia membranara constitutiva a unor molecule de adeziune

celulara sau factori de crestere implicate in progresia tumorala si/ sau angiogeneza (ICAM-1,

VCAM, E-caderina, beta-catenina, endoglina/CD105, VEGF) pe mai multe linii tumorale de san

(MCF-7, Sk-Br-3, MDA-MB-231, T47-D), prin imunofluorescenta indirecta (marcare cu anticorp

monoclonali sau policlonali specifici, iar apoi cu anticorpi secundari marcati fluorescent) urmata de

achizitia datelor si analiza acestora prin citometriei in flux. Celulele viabile (1x104 achizitionate cu

poarta) au fost colectate pentru analiza cu ajutorul citometrului în flux FACS Canto II (Becton

Dickinson, USA). Analizarea datelor si prelucrarea lor grafica s-a realizat prin utilizarea

programului DIVA 8. Datele obtinute au demostrat o expresie variabila a moleculelor studiate

asociata diferitelor linii celulare mamare.

Faza II: Evaluarea modularii de catre citokine a expresiei unor biomarkeri asociati

procesului de angiogeneza.

Procesul de angiogeneza poate fi reglat la nivel local de celulele endoteliale care produc factori

de crestere, citokine, enzime, molecule de adeziune. Astfel, interactiile intre celulele sistemului

imun si celulele endoteliale au un rol ce nu ar trebui neglijat. Celulele cu rol in procesele

inflamatorii, adica macrofagele, limfocitele T si monocitele, participa la procesul de angiogeneza

prin secretia de citokine pro- si/sau anti-inflamatoare care pot controla atat migrarea celulelor

endoteliale, cat si activarea si proliferarea acestora. Angiogeneza tumorala poate fi indusa de o

varietate de citokine pro-angiogenice, printre care se numara si IFN-gamma si TNF-alpha.

8

In urma analizei nivelului de expresie constitutiva a moleculelor de interes pe diferite linii celulare

tumorale de san, a fost aleasa pentru continuarea experimentelor linia de adenocarcinom mamar

MCF-7. Cultura celulara s-a realizat in mediu RPMI-1640 (Sigma), suplimentat cu 10% ser fetal de

vitel (FCS) decomplementat (Sigma) si 2mM L-glutamina (Sigma). Dupa stimularea cu citokinele

IFN-gamma si TNF-alpha, ambele cu concentratia finala de 1000 U/ml, celulele au fost desprinse

din placile de cultura si centrifugate la 300xg. Determinarea nivelului de expresie a antigenelor de

membrana (VEGF, ICAM-1, VCAM-1, MUC-1 si E-caderina) in urma tratamentului cu citokine s-a

realizat prin metoda de imunofluorescenta directa descrisa mai sus, iar achizitia si analiza

fluorescentei celulare s-a realizat folosind un flow-citometru FACSCanto II (Becton Dickinson).

Modularea expresiei VEGF asociat celulelor MCF-7 tratate cu IL-2 (verde), IFN-gamma (albastru) sau TNF-alpha (violet) comparativ cu celulele netratate (negru).

Modularea expresiei unor molecul de adeziune celulara asociate celulelor MCF-7 tratate cu IFN-gamma (verde) sau TNF-alpha (albastru) comparativ cu celulele netratate (negru).

9

In urma tratamentului cu citokine al celulelor din linia de adenocarcinom mamar MCF-7,

expresia ICAM-1 a fost semnificativ crescuta atat de catre u IFN-gamma, cat si de catre TNF-alpha,

in timp ce expresia VCAM-1 a fost crescuta semnificativ de catre TNF-alpha si usor crescuta in

urma tratamentului cu IFN-gamma.

Personal implicat: Drd. Mia Camelia Hotnog (director proiect), dr. Lorelei Irina Brasoveanu, dr.

Mirela Mihaila, dr. Marinela Bostan, dr. Viviana Roman, asist. Elena Nicolae, lab. Aneta Doncea

(colaboratori interni)

Diseminare:1. Camelia Hotnog, Mirela Mihaila, Marinela Bostan, Maria I. Gruia, Lorelei I. Brasoveanu, „Effects

of resveratrol treatment on angiogenic profile in human tumor breast cells”, Vol. rez. pg. 136, 4th

European Congress of Immunology (ECI), Vienna, Austria, 06 – 09 September 2015.

2. Camelia Hotnog, Mirela Mihaila, Viviana Roman, Maria Iuliana Gruia, Marinela Bostan, Lorelei

I. Brasoveanu, „Utilizarea analizei celulare in timp real (RTCA) in studiul modularii profilului

angiogenic al celulelor tumorale mamare”, Conferinta Societatii Romane de Radioterapie si Zilele

Medicale ale Institutului Oncologic "Prof. Dr. Alexandru Trestioreanu", Vol. rez. pg. 86, Bucuresti,

05 – 07 noiembrie 2015.

10

1.2. Tema „IMPLICAREA MOLECULEI STIMULATOARE A LIMFOCITELOR B (BlyS) IN APOPTOZA CELULELOR LEUCEMICE” (Director proiect Dr. Viviana Roman, CS II)

Obiectivul general al proiectului: Modularea expresiei unor proteine anti-apoptotice si corelarea

cu procesul de apoptoza, in urma tratarii celulelor leucemice cu inductori de apoptoza.

Faza I: Stabilirea protocolului de lucru utilizand linii celulare leucemice.

Amploarea continua a problemei cancerului si esecul chimioterapiei conventionale de a

reduce semnificativ rata de mortalitate pentru majoritatea formelor de cancer, indica faptul ca sunt

necesare noi abordari in controlul acestei boli. Prin urmare orice strategie terapeutica care

declanseaza in mod specific apoptoza in celulele canceroase ar putea avea valoare terapeutica.

Leucemia limfocitara cronica de tip B (LLC-B) este caracterizata de un mecanism de

apoptoza defectuos, aceste celule leucemice nu exprima in mod frecvent „receptori ai mortii”-

receptori implicati in declansarea apoptozei dar exprima o serie de proteine antiapoptotice (ex:

iNOS, Bcl-2) ce confera rezistenta la actiunea diverselor modalitati de tratament.BLys/BAFF (B

lymphocyte stimulator) desi este un ligand care face parte din familia receptorilor TNF (tumor

necrosis factor), prin actiunea lui este implicat in supravietuirea pe termen lung a limfocitelor B

normale, in diferentierea si maturarea acestora.

S-a demonstrat ca in LLC-B, BLys protejeaza aceste celule fata de fenomenul de apoptoza si

conduce la marirea supravietuirii acestora.In cadrul primei faze, in vederea stabilirii protocoalelor

de lucru si a conditiilor optime de tratament (concentratii, timpde actiune) s-au folosit linii celulare

tumorale tip LLC-B (e.g. EHEB).Informatiile optinute au fost folosite in experimentele urmatoare in

care s-au utilizat prize de sange recoltate de la pacienti diagnosticati cu LLC-B.

Faza II: Evaluarea modularii de catre citokine a expresiei unor biomarkeri asociati

procesului de angiogeneza.

In faza a doua s-au folosit informatiile obtinute anterior, dar testele s-au facut utilizand

celule leucemice obtinute de la pacientii diagnosticati cu leucemie cronica limfocitara conform

clasificarii WHO si in urma obtinerii consimtamantului pacientului.

Rezultatele obtinute arata ca prin actiunea sa, BLys poate salva celulele leucemice atat de la

apoptoza spontana cat si de la cea indusa de diversi inductori, printr-un proces autocrin sau paracrin.

De asemenea substantele biologic active (polifenoliii) utilizati pentru modularea nivelurilor de

expresie a unor proteine antiapoptotice, prin capacitatea lor antiproliferativa si proapoptotica, ar

putea fi folositi ca adjuvanti in terapia unor limfoproliferari.11

Personal implicat: Dr. Viviana Roman (Director proiect), Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, Dr. Marinela Bostan, Drd. Camelia Hotnog, Dr. Mirela Mihaila, asist. Elena Nicolae, lab. Doncea Aneta (colaboratori interni)

Diseminare:

1) Viviana Roman, Marinela Bostan, Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Lorelei I. Brasoveanu,

"Implicarea moleculei stimulatoare a limfocitelor B (Blys) in apoptoza celulelor leucemice",

Conferinta Societatii Romane de Radioterapie si Zilele Medicale ale Institutului Oncologic "Prof.

Dr. Alexandru Trestioreanu", Vol. rez. pg. 65, Bucuresti, 05 – 07 noiembrie 2015.

1.3. Tema „ANALIZA EFECTELOR UNOR COMPUSI NATURALI ASUPRA UNOR

PROTEIN-KINAZE ACTIVATE DE MITOGENI CU ROL IN PROCESELE DE

SEMNALIZARE INTRACELULARA IN CELULELE TUMORALE” (Director proiect Dr.

Marinela Bostan, CSIII)

Obiectivul general al proiectului: Modularea proceselor de semnalizare celulara in cancer de catre

compusi naturali.

Faza I: Studiul efectelor induse de compuși naturali asupra viabilităţii și a proceselor de

proliferare în culturi celulare tumorale.

Datorita dezavantajele asociate chimioterapiei conventionale aplicata in cancer (reactii

adverse, toxicitate mare, inducerea rezistentei la terapie) in ultima perioada s-a inregistrat o crestere

a interesului stiintific pentru utilizarea de compusi naturali ca tratament asociat sau complementar.

Compusii naturali prezinta un potențial anti-tumoral promițătoar, insa este esentiala optimizarea

dozelor si a cailor de administrare.

Protein-kinazele activate de mitogeni (MAPK) sunt o familie de serin/treonin kinaze, care

mediaza transmiterea semnalelor si coordoneaza realizarea raspunsul celular. Pana in prezent, s-au

descris trei subtipuri de MAPK: kinaze care mediaza semnalele extracelulare (ERK), p38MAPK si

c- Jun N-terminal kinaza (JNK). Cascada ERK pare sa medieze semnalele care promoveaza

proliferarea, diferentierea sau supravietuirea celulara, in timp ce cascadele p38MAPK si JNK sunt

implicate in realizarea raspunsului celular la stres. Numeroase date arata ca in functie de tipul de

celule implicat in realizarea raspunsului celular pot fi activate ERK, p38MAPK sau JNK

independent sau concomitent, de catre stimuli diferiti. Odata activate MAP Kinazele mediaza

12

transmiterea semnalelor si coordoneaza realizarea raspunsului celular, fiind posibil sa intervina in

anumite etape ale evolutiei proceselor neoplazice.

Astfel, obiectivul general al Temei III a fost modularea proceselor de semnalizare celulara in cancer

de catre compusi naturali. Pentru a analiza rolul unor compusi naturali cum ar fi Resveratrolul (Res)

sau Ganoderma lucidum (GL) asupra statusului de activare al MAPK-zelor in cancerul sferei ORL

in prima faza s-au studiat efectelor induse de compusii naturali mentionati asupra viabilitatii si a

proceselor de proliferare in culturi celulare tumorale. Influenta tratamentului Res sau GL a fost

studiat pe linia celulara tumorala standardizate PE-CA/PJ49 (celule de carcinom scuamos din sfera

orala) prin utilizarea testului de proliferare celulara non-radioactiva. Analiza rezultatelor obtinute

prin tratarea celulelor tumorale cu GL sau Res a aratat o scadere semnificativa a proliferarii celulare

intr-un mod dependent de doză. Aceste date au permis selectarea concentratiilor de lucru pentru

experimentele din faza a doua (100 ug / ml de Res sau 100 ug / ml GL).

Faza II: Analiza efectelor unor compusi naturali în modularea activării unor protein- kinaze

(MAPK-ze) cu rol în reglarea procesele de semnalizare intracelulară în celulele tumorale.

Analiza efectelor unor compusi naturali în modularea activarii unor protein - kinaze (MAPK-ze) cu

rol in reglarea procesele de semnalizare intracelulara in celulele tumorale s-a realizat prin tehnica

ELISA prin utilizarea unor kituri specifice. Celulele tumorale au fost tratate cu Res sau GL in

prezenta sau absenta unor inhibitori specifici ai MAPK-zelor. SB203580 (inhibitor pentru p38-

MAPK) a restaurat viabilitatea celulara in cazul tratamentelor cu GL sau Res, dar PD98059

(inhibitor pentru ERK) a influentat pozitiv doar viabilitatea celulelor tratate cu Res. Tratamentul cu

100 ug / ml GL (la 24h de la tratament) a stimulat fosforilarea p38MAPK, fara a afecta fosforilarea

ERK, in timp ce tratamentul cu Res a determinat o crestere a nivelului de fosforilare atat a

p38MAPK cat si a ERK. Rezultatele obtinute vor asigura suportul dezvotarii unor noi agenti

terapeutici capabili sa moduleze activarea protein kinazelor.

Personal implicat: Dr. Marinela Bostan (Director proiect), Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, Dr. Viviana Roman, Dr. Mirela Mihaila, Drd. Camelia Hotnog, As. Nicolae Elena, lab. Aneta Doncea (colaboratori interni)

Diseminare:

1) Georgiana G. Matei-Petrica, Marinela Bostan, Camelia Hotnog, Mirela Mihaila, Viviana Roman,

Lorelei Irina Brasoveanu, “Efectele antiproliferative induse de unii compusi naturali in cancerul

sferei orl sunt dependente de procesul de generare al speciilor reactive de oxygen”, Conferinta

13

Societatii Romane de Radioterapie si Zilele Medicale ale Institutului Oncologic "Prof. Dr.

Alexandru Trestioreanu", Vol. rez. pg. 64, Bucuresti, 05 – 07 noiembrie 2015.

2) Marinela Bostan, Georgiana Gabriela Matei, Camelia Hotnog, Mirela Mihaila, Viviana Roman,

Lorelei Irina Brasoveanu, “Study of the role of Mitogen-Activated Protein Kinases activation in

proliferation and apoptosis processes of the pharyngeal tumour cells”, Vol. rez. pg. 198, 4th

European Congress of Immunology (ECI), Vienna, Austria, 06 – 09 September 2015.

Sectiunea 2: PROIECTE FINANTATE DIN FONDURI EXTRABUGETARE

1. Program PCCA contract 136/2012 (Biotehnologie): “Conceperea si dezvoltarea unor

sisteme de transport si cedare pentru noi compusi de ruteniu cu actiune antitumorala

(RuSYST)”, iulie 2012 – decembrie 2016, responsabil proiect P3 Dr. Mirela Mihaila, CSIII

(Coordonator proiect UMF Bucuresti - Conf. Dr. Valentina Uivarosi; alti parteneri: Institutul

Oncologic „Prof. Dr. Alex. Trestioreanu”; Universitatea Bucuresti, Facultatea de Biologie);

(Finantare totala: 200.000 RON, Finantare 2015 – 20.377 RON)

Personal implicat: Dr. Mirela Mihaila (Responsabil proiect P3), Dr. Lorelei Irina

Brasoveanu, Dr. Marinela Bostan, Dr. Viviana Roman, Drd. Mia Camelia Hotnog, Asist.

Elena Nicolae, Ec. Gabriela Nebunu.

Obiectivul general al proiectului: Studiul isi propune investigarea la nivel celular si

molecular, pe linii celulare tumorale standardizate ale unor compusi pe baza de ruteniu in vederea

evaluarii potentialului lor terapeutic. Proiectul isi propune testarea efectului acestor compusi de

ruteniu si a citostaticelor asupra proliferarii tumorale, apoptozei si progresiei ciclului celular.

Obiectivul fazei IV / 2015: Conceperea si dezvoltarea de complecsi cu ciclodextrine pentru

transportul si cedarea pentru 3 compusi de ruteniu cu actiune antitumorala

Etiologia cancerelor implica mai multi factori genetici, imunologici si biochimici.

Principalul obstacol in succesul terapiei pare a fi imposibilitatea eradicarii tuturor celulelor

tumorale. Chimioterapia tumorilor solide este limitata de lipsa selectivitatii medicamentelor anti-

canceroase si recurenta tumorilor rezistente la tratament. Terapiile traditionale anti-cancer au efecte

limitate, de aceea actiunea citotoxica exercitata de citostaticele clasice in tumori ar putea fi potentata

14

de noi medicamente care pot afecta mai multe tinte majore si mecanisme moleculare. Utilizarea

clinica a cisplatinului (Cis-Pt) este limitata de rezistenta tumorii la medicamente si efectele adverse,

deci alti compusi cu ioni metalici poseda activitate anti-tumorala. Combinatiile complexe ale unor

metale tranzitionale reprezinta o clasa distincta de agenti chimioterapeutici, utilizati pe scara larga ca

agenti antitumorali si antivirali in practica clinica. Instalarea rezistentei tumorilor la medicament si

efectele adverse, au limitat utilizarea clinica a compusilor chimioterapeutici. Comparativ cu

cisplatinul, complexele pe baza de ruteniu sunt considerate ca fiind mai putin toxice si capabile sa

depaseasca rezistenta indusa de medicamente de platina in celulele canceroase. Ruteniu are

numeroase proprietati care o califica drept un pretendent medicament antineoplazic. Scopul

principal al proiectului este acela de a dezvolta noi compusi pe baza de ruteniu, substante potente, cu

efecte secundare reduse, o potentiala alternativa la terapia cu citostatice.

Activitatile fazei actuale a proiectului s-au axat pe determinarea citotoxicitatii induse de

catre compusi cu ruteniu cu ciclodextrine, in paralel cu evaluarea proliferarii prin analiza fazelor

ciclului celular si a evenimentelor apoptotice, utilizand cisplatinul drept substanta de referinta.

Sensibilitatea celulelor tumorale la tratamentul cu diferite concentratii de cisplatin (Cis-Pt) si

compusi cu ruteniu cu ciclodextrine (Ru-of, Ru-levo, Ru-nf) a fost evaluata prin determinarea

citotoxicitatii prin tehnica MTS si prin sistemul xCELLigence. Acest sistem in care se utilizeaza

instrumentul RTCA DP, a fost folosit pentru a evalua citotoxicitatea mediata a compusilor, in scopul

de a monitoriza viabilitatea / toxicitatea continuu pentru a indica punctele optime de timp si de

concentratie pentru efectuarea testelor. Curbele de proliferare / citotoxicitate sunt specifice pentru

compusul utilizat la tratament si depind de mecanismul biologic de actiune al compusului respectiv.

Monitorizarea citotoxicitatii vs. proliferarii celulare permite calcularea valorilor IC50 dependente de

timp, astfel incat se pot selecta timpii si concentratiile optime pentru atingerea raspunsului maxim.

Citotoxicitatea indusa de catre compusii cu ruteniu cu ciclodextrine in linii celulare tumorale umane

a fost analizata in paralel cu evaluarea proliferarii celulare prin analiza fazelor ciclului celular si a

evenimentelor apoptotice, utilizand cisplatinul drept substanta de referinta.

Rezultatele obtinute prin testarea efectului proliferativ vs. citotoxic al compusilor de Ruteniu au

variat functie de compusul utilizat, concentratie, perioada de timp de tratare.

In paralel cu compusii de sinteza testati s-a masurat si citotoxicitatea concentratiilor de DMSO, de la

2% la 0.25% in mediu de cultura. Masuratorile efectuate au aratat ca DMSO in concentratiile

utilizate nu a avut un efect citotoxic asupra liniilor celulare.

15

Efectele tratamentului cu Cis-Pt sau cu compusii cu ruteniu asupra proliferarii a fost investigat prin

evaluarea potentialului apoptotic, prin tehnica dublei marcari cu anexina V si iodura de propidiu

(PI), urmata de analiza prin citometrie in flux.

Substanta Apoptoza

timpurie (%)

Apoptoza tarzie /

secundara (%)

Apoptoza

totala (%)

NT 7.7 2.4 10.1

Cis-Pt (10 uM) 16 11.6 27.6

Cis-Pt (25 uM) 14.6 8.7 23.3

Cis-Pt (50 uM) 26.4 5.6 32

Ru-of + HPbetaCD (10 uM) 23.2 1.3 24.5

Ru-of + HPbetaCD (50 uM) 22.3 2.3 24.6

Ru-levo + HPbetaCD (10 uM) 26.6 1.4 28

Ru-levo + HPbetaCD (50 uM) 25.6 1 26.6

Ru-nf + HPbetaCD (10 uM) 24.5 0.9 25.4

Ru-nf + HPbetaCD (50 uM) 22.6 0.8 23.4

Rezultatele obtinute ar putea fi folosite in viitor in elaborarea unor noi strategii bioimunoterapeutice antitumorale in scopul diminuarii tumorii primare si controlului/eliminarii metastazelor.

Diseminare:

1. Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Marinela Bostan, Viviana Roman, Valentina Uivarosi, Lorelei Irina Brasoveanu, „Anti-proliferative activity of ruthenium (III) compounds on human colon tumor cell growth”, pg. 385, 4th European Congress of Immunology (ECI), Vienna, Austria, 06 – 09 September 2015.

2. Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Marinela Bostan, Valentina Uivarosi, Lorelei I. Brasoveanu, „Biological effects of ruthenium (III) compounds in LoVo human tumor cell growth”, pg. 374-375, Conferinta Institutului Regional Iasi, Iasi, 26 - 29 noiembrie 2015.

3. Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Marinela Bostan, Valentina Uivarosi, Lorelei I. Brasoveanu, „Efectul modulator al unor compusi cu ruteniu (III) asupra proliferarii si apoptozei celulelor

16

LoVo”, Conferinta Societatii Romane de Radioterapie si Zilele Medicale ale Institutului Oncologic "Prof. Dr. Alexandru Trestioreanu", pg. 90, Bucuresti, 05 – 07 noiembrie 2015.

2. PN-II-PT-PCCA-2013-4-1761 “Bio-produse dermato-cosmetice pe baza de uleiuri vegetale

si fitocomplecsi cu actiune anti-acneica“ (Director proiect : S.L. dr. Ioana Lacatusu,

Universitatea Bucuresti, Facultatea de Chimie; Dr. Mirela Mihaila - Colaborator extern)

Activitatile desfasurate de catre colectivul Centrului de Imunologie din Institutul de Virusologie

“Stefan S. Nicolau” au urmarit evaluarea eficientei biologice in vitro a unor compusi dezvoltati de

catre coordonatorul de proiect, ce includ extracte vegetale, cum ar fi uleiul de zmeura (UZ), uleiul

de orez (UO), extract de salcie (ES), dar si compusi anti-inflamatori de sinteza, indometacinul

(IND). Testarea activitatii biologice s-a facut prin evaluarea efectului proliferativ vs. citotoxic al

acestor compusi prin tehnici colorimetrice (tehnica MTS) si prin analiza activitatii celulare in timp

real (RTCA), utilizand linia celulara murina L929 (derivata din fibroblaste). Activitatea anti-

inflamatorie a compusilor studiati a fost investigata prin evaluarea apoptozei prin citometrie in flux

si a producerii de citokine pro-inflamatorii (IL-6, TNF-alpha) intr-un model experimental

reprezentat de celule L929 in care s-a Indus efectul inflamator prin tratament cu peroxid de

hidrogen.

Diseminare:

1. I. Lacatusu, N. Badea, G. Badea, O. Oprea, M.A.Mihaila, D.A. Kaya, R. Stan, A.Meghea, „Lipid

nanocarriers based on natural oils with high activity against oxygen free radicals and tumor cell

proliferation”, Materials Science and Engineering, vol. 56, pg. 88–94, 2015. (articol premiat de

ANCS/ UEFISCDI pe anul 2015)

17

Sectiunea 3: PROIECTE FINANŢATE DIN FONDURI STRUCTURALE

Contract nr. 433/21.12.2012 “MODERNIZAREA UNUI CENTRU PENTRU STUDIUL ONCOGENEZEI SI AL UTILIZARII ONCOLIZEI VIRALE CA STRATEGIE TERAPEUTICA” – cod 929 - 14049, coordinator Institutulde Virusologie “Stefan S. Nicolau”, manager proiect dr. Gabriela Anton, durata proiect 32 luni (dec 2012 – decembrie 2015)

In cadrul proiectului Centrul de Imunologie participa prin cercetatorii sai in calitate de:

- membru in Comitetul de Management al Proiectului (dr. Lorelei Irina Brasoveanu)

- membri proiect (dr. Mirela Mihaila, dr. Marinela Bostan, dr. Viviana Roman, drd.

Camelia Hotnog), participanti in comisiile de licitatii pentru achizitiile din cadrul

proiectului

Prin activitatile desfasurate in cadrul proiectului structural s-a modernizat si echipat un laborator din

cadrul CIB – “Laboratorul de Imunologie Tumorala”

Coordonator Centrul de Imunologie,

Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, CSI

18